Trombocitų kilmės augimo faktoriaus receptorių ekspresija ir amplifikacija choroidinio rezginio karcinomose | šiuolaikinė patologija

Trombocitų kilmės augimo faktoriaus receptorių ekspresija ir amplifikacija choroidinio rezginio karcinomose | šiuolaikinė patologija

Anonim

Anotacija

Trombocitų išvestų augimo faktorių (PDGF) receptorių signalizavimas buvo susijęs su gliaudinių navikų vystymusi, tačiau dar nebuvo ištirtas choroidinio rezginio karcinomos, vaikų auglių, turinčių niūrią prognozę, kuriems būtų pageidautinos naujos gydymo galimybės. Todėl ištirta 22 pacientų, sergančių choroidinio rezginio karcinoma, sergant 22 pacientais, turinčiais choroidinio rezginio karcinoma, baltymų ekspresija α ir β ir baltymų raiška, taip pat atitinkamų genų, PDGFRA ir PDGFRB , amplifikacijos būsena, naudojant imunohistochemiją ir chromogeninę in situ hibridizaciją (CISH). Didžioji dalis choroidinio rezginio karcinomų išreiškė PDGF receptorius: 6 atvejai (27%) parodė aukštą PDGF receptoriaus α dažymo balą ir 13 atvejų (59%) rodo aukštą PDGF receptoriaus β dažymo rezultatą. Atitinkamai, PDGFRA kopijų skaičiaus padidėjimas buvo stebimas 8 atvejais iš 12 CISH atvejų ir 1 atvejo amplifikacija (šeši ar daugiau signalų vienam branduoliui). Choroidinio rezginio karcinomų, padaugėjus PDGFRB, dalis buvo dar didesnė (5/12 atvejų). PDGFRB amplifikacijos būklė ir PDGF receptoriaus β baltymų ekspresijos balai buvo reikšmingai koreliuojami ( P = 0, 01, Spearman). Α PDGF receptoriaus arba β PDGF receptoriaus ekspresijos būklė nebuvo reikšmingai susijusi su išgyvenimu be ligos progresavimo. Pabaigoje galima pasakyti, kad PDGF receptorių, ypač PDGF receptorių β , raiška ir amplifikacija yra dažni choroidinio rezginio karcinomose, nes tai yra pirmasis pagrindimas gydymo, nukreipto į PDGF receptorių signalizavimą, vystymuisi šiuose retuose piktybiniuose vaikų navikuose.

Pagrindinis

Choroidinio rezginio navikai yra reti intraventrikuliniai navikai, kurie sudaro tik 0, 4–0, 6% visų intrakranijinių navikų, tačiau sudaro iki 13% smegenų auglių, kurie pasireiškia pirmaisiais gyvenimo metais. 1 Priešingai nei gerybinės choroidinio rezginio papilomos, choroidinio rezginio karcinomos turi blogą prognozę 2, 3, 4 ir histologiškai pasižymi akivaizdžiais piktybinių navikų požymiais, tai yra, ryškus mitozinis aktyvumas, branduolinis pleomorfizmas, padidėjęs ląstelių tankis, papiliarų augimo susilpnėjimas. modelis ir nekrozė. 1, 2, 4 chirurgija tebėra pagrindinis gydymo pagrindas, 3, 5, tačiau dėl infiltratinio augimo ir didelio šių navikų kraujagyslių dažnio bendrosios rezekcijos dažnai neįmanoma pasiekti. Chemoterapija ir kaukolės švitinimas pagerina išgyvenamumą, 6, 7, tačiau pastarasis dažniausiai nėra labai mažų vaikų pasirinkimas. Todėl pageidautina sukurti naujus terapinius metodus.

Trombocitų kilmės augimo faktoriaus (PDGF) receptoriai yra ekspresuojami besivystančiose smegenyse. 8, 9 PDGFRA niekiniai pelių embrionai rodo nervinio vamzdelio defektus, leidžiančius manyti, kad PDGF receptoriaus α signalizacija yra esminė nervų sistemos raidai. Įdomu tai, kad PDGF receptorių α , taip pat struktūriškai susijusio receptoriaus potipio PDGF receptoriaus β vaidmuo gali būti svarbus graužikų choroidinio rezginio vystymuisi. Čia nustatyta, kad PDGF receptoriaus α yra labai ekspresuojamas choroidinio rezginio epitelio ląstelėse 8, 9, tuo tarpu aprašyta, kad PDGF receptoriaus β yra ekspresuojamas besivystančiose choroidinio rezginio kraujagyslėse. 11

Be to, buvo įrodyta, kad PDGF receptorių signalizavimas prisideda prie daugelio su naviku susijusių procesų: PDGF receptoriai dalyvauja skirtinguose naviko augimo aspektuose, įskaitant piktybinių ląstelių autokrininę stimuliaciją, angiogenezę ir naviko 12, 13 navikų įdarbinimą , ir gali būti slopinami. baltymų tirozinkinazės inhibitoriais, tokiais kaip imatinibo mezilatas (Glivec). Iš tikrųjų ankstyvieji klinikiniai tyrimai rodo, kad imatinibo mezilatas kartu su hidroksikarbamidu yra efektyvus gliomų gydymui. 14, 15 bandomųjų tyrimų, kuriuose imatinibo mezilatas buvo naudojamas vaikų, turinčių kietus navikus 16, taip pat pasikartojančių piktybinių gliomų 17, rezultatai rodo, kad toje amžiaus grupėje imatinibo mezilatas yra saugus.

Todėl mes ištyrėme PDGF receptorių α ir β baltymų ekspresiją, taip pat atitinkamų genų, PDGFRA ir PDGFRB , amplifikacijos būklę didelėje retrospektyvinėje choroidinio rezginio karcinomos serijoje.

medžiagos ir metodai

Pacientų

Iš viso Miunsterio universitetinės ligoninės Neuropatologijos instituto archyvuose buvo paimta 22 pirminės choroidinio rezginio karcinomos. Visi atvejai buvo atsitiktiniai. Kai kurie vaikai buvo ištirti kaip Société Internationale d 'Oncologie Pédiatrique choroidinio rezginio naviko tyrimas (CPT-SIOP-2000). 18 Visi atvejai buvo pakartotinai įvertinti neuropatologiškai pagal dabartinius PSO 4 kriterijus, įskaitant imunohistochemiją INI1 19, 20, taip pat choroidinio rezginio specifinius žymenis. 20 Duomenys apie naviko vietą, chirurginės rezekcijos mastą, gydymą adjuvantu ir pooperacinį kursą buvo surinkti peržiūrint pacientų įrašus. Be to, buvo susisiekta su bendrosios praktikos gydytojais, pediatrais ir neurochirurgais, siekiant pateikti tolesnę informaciją apie pasikartojimą ir išgyvenimą.

Imunohistochemija

Skyriai buvo deparafinuoti, rehidratuoti ir po to išplauti distiliuotu H20. Antigeno gavimui stikleliai 2 × 7 minutes buvo mikrobanginiai, esant 650 W, antigeno paėmimo buferyje, kurio aukštas pH (S3307, Dako, Glostrup, Danija), skirtas PDGF receptoriui β. arba 1 mM EDTA, pH 8, esant α PDGF receptoriui. Po to sekcijos buvo paliekamos atvėsti mažiausiai 30 minučių ir po to plaunamos PBS su 0, 1% Tween 20 (PBT). Endogeninis peroksidazės aktyvumas buvo sustabdytas inkubuojant PBT, turinčiame 3% H2O2, 10 min., Po to plaunant PBT 3 x 5 min. Objektyvai buvo užblokuoti 20% ožkos serumu, praskiestu PBT 30 minučių, tada inkubuojami su anti-PDGF receptoriais β (Nr. 3169 triušio monokloniniai, 2 μg / ml (ląstelių signalizacijos technologija, Danvers, MA, JAV)) arba anti- PDGF receptoriaus α (Nr. 3164 triušio polikloninis, 1:50 (ląstelių signalizacijos technologija)). Po plovimo PBT, stiklinės buvo inkubuotos su biotiniluotu ožkų anti-triušio antriniu antikūnu (E0432, 1: 500 (Dako)) 45 minutes kambario temperatūroje po inkubacijos su ABC rinkiniu (SK6100, Vectastain ABC-HRP, Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV) 45 minutes po skalbimo PBT. Signalas buvo sukurtas naudojant DAB substrato rinkinį (SK4100, Vector Laboratories), o sekcijos buvo kontresuotos hematoksilinu. PDGF receptorių dažymas buvo vertinamas pusiau kokybiškai, įvertinant nudažytų ląstelių procentinę dalį (0 (nėra), 1 (<10%), 2 (10–50%), 3 (51–80%), 4 (81–100%). taip pat dažymo intensyvumas (0 (nėra), 1 (silpnas), 2 (ryškus), 3 (stiprus)). Tada abu balai buvo padauginti, kad maksimalus dažymo rezultatas būtų 12.

Chromogeninė hibridizacija in situ

12 choroidinio rezginio karcinomų buvo šviežiai supjaustyti parafino pjūviai, skirti chromogeninei in situ hibridizacijai (CISH). CISH metodika išsamiai aprašyta kitur. 21 Trumpai tariant, digoksigeniinu pažymėti (DIG-Nick mišinys Roche, Manheimas, Vokietija) BAC zondai buvo naudojami PDGFRA (klonų mišinys, ID RP11-117E8 ir RP11-626H4) ir PDGFRB (klonas ID RP11-754J8, Invitrogen). Ltd, Paisley, JK). Genų kopijų skaičiai buvo įvertinti naudojant „Leica DM2000“ („Leica Microsystems GmbH“, Vokietija) su x 63 ir × 100 padidinimu. Įgytas genų kopijų skaičius (žemo lygio amplifikacija) buvo apibūdinamas kaip 3–5 signalai viename branduolyje. Amplifikacija buvo apibrėžta kaip šeši ar daugiau signalų viename branduolyje.

Statistika

Pacientų charakteristikų palyginimas buvo atliktas tiksliu Fisherio testu arba Manno – Whitney U- testu. Išgyvenimo tikimybės buvo įvertintos naudojant Kaplan-Meier metodą. PDGF receptorių ekspresijos būklės poveikis išgyvenamumo tikimybei buvo tiriamas atliekant vienfaktorinę analizę, naudojant log-rank testą. Koreliacijos buvo patikrintos naudojant Spearman testą. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS 13.0 versiją (SPSS Inc., Čikaga, IL, JAV).

Rezultatai

Pacientų

Vidutinis pacientų amžius buvo 2 metai (kvartiliai: 1–4 metai). Nors didžioji dauguma navikų buvo išsidėstę suprantoriškai (95%), bendrą auglių rezekciją buvo galima pasiekti tik 50% vaikų. Kitos paciento charakteristikos pateiktos 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

PDGF receptorių baltymų išraiška

Dauguma choroidinio rezginio karcinomų išreiškė PDGF receptorių potipius, ypač PDGF receptorių β . Kaip parodyta 1a paveiksle, 6 atvejais PDGF receptorių α dažymo balai buvo aukšti (27%); 3 atvejais buvo nustatyti vidutiniai dažymo balai (5–8), o žemi dažymo balai (0–4) buvo stebimi 13 atvejų (59%). Navikų, kurių PDGF receptoriaus β dažymo balai buvo aukšti, dalis buvo didesnė: 13 atvejų (59%) PDGF receptorių β dažymo balai buvo aukšti, tuo tarpu 6 atvejais buvo vidutinis dažymo balas (5–8) ir tik 3 atvejais (14%). rodomi maži dažymo balai (0–4; 1b paveikslas). Dviejų receptorių potipių dažymo balai nebuvo koreliuojami ( P = 0, 56); tik trimis atvejais abiejų receptorių potipių dažymo rodikliai buvo aukšti.

Image

Trombocitų kilmės augimo faktoriaus (PDGF) receptorių baltymų ekspresija ir amplifikacija. Choroidinio rezginio karcinomų, turinčių žemą (0–4), vidutinio (5–8) ar aukšto (9–12) dažymo procentinę dalį, taip pat reprezentatyvūs vaizdai, vaizduojantys aukštus imunohistocheminius dažymo balus pagal PDGF receptorių α ( a ir c ) ir PDGF receptorius β ( b ir d ), taip pat navikų dalis su kopijų skaičiaus padidėjimu ar amplifikacija, taip pat tipiški CISH atvaizdai PDGFRA ( e ) ir PDGFRB ( f ).

Visas dydis

PDGF receptorių stiprinimas

PDGFRA genų kopijų skaičius buvo stebimas 8 iš 12 atvejų, kai buvo galima ištirti PDGFRA amplifikacijos būklę (1e pav.). Vienu atveju buvo parodyta PDGFRA amplifikacija. Ši supratentorinė choroidinio rezginio karcinoma 12 metų berniukui taip pat parodė aukštą PDGF receptoriaus α dažymo rezultatą. Dviem atvejais PDGFRA CISH nedavė rezultatų. Kiekvienu atveju penkiais atvejais buvo užfiksuotas genų kopijų skaičius ar PDGFRB amplifikacija (1f pav.). PDGFRB amplifikacijos būklė ir PDGF receptoriaus β baltymų ekspresijos balai buvo reikšmingai koreliuojami ( P = 0, 01, Spearman). Visi PDGFRB amplifikacijos atvejai parodė didelius PDGFR receptoriaus β baltymų dažymo balus. Vienu metu tiek PDGFRA , tiek PDGFRB amplifikacija nepastebėta.

PDGF receptorių būklė ir prognozė

20 pacientų, apie kuriuos buvo galima gauti informacijos apie tolesnę veiklą, prognozė buvo bloga: vidutinis išgyvenimas be pasikartojimo buvo tik 22 mėnesiai. Atliekant log-rank testą, PDGF receptorių α arba β baltymų ekspresijos būklė nebuvo reikšmingai susijusi su išgyvenimu be ligos progresavimo. Kadangi CISH atvejų skaičius buvo dar mažesnis, amplifikacijos būklės poveikis išgyvenamumui be ligos progresavimo nebuvo statistiškai vertinamas.

Diskusija

Kadangi PDGF receptorių signalizavimas yra stipriai susijęs su centrinės nervų sistemos ir choroidinio rezginio vystymusi ir buvo įrodyta, kad jis prisideda prie daugelio su naviku susijusių procesų, mes atlikome baltymų ekspresijos būklės ir PDGF receptorių geno kopijų skaičiaus analizę choroidinio rezginio karcinomose. Mūsų žiniomis, mūsų serija yra viena didžiausių iki šiol publikuotų ir pirmoji, kurioje pranešta apie PDGF receptorių α ir β baltymų ekspresiją, taip pat dėl PDGFRA ar PDGFRB kopijų skaičiaus padidėjimo daugumoje tirtų choroidinio rezginio karcinomų. Be to, PDGRB amplifikacija reikšmingai koreliavo su PDGF receptoriaus β baltymo ekspresija, ir tai rodo, kad padidėjęs kopijų skaičius gali sukelti nenormalų baltymo perraišką ir potencialiai skatinti piktybinio naviko augimą.

PDGF receptoriai ir jų ligadai vaidina svarbų vaidmenį formuojant ir progresuojant žmogaus gliomoms: PDGFRA genų amplifikacija ir per didelis ekspresija aptinkama iki 33% piktybinių gliomų 22, 23 ir gali paskatinti naviko augimą autokrininių PDGF receptorių signalizacijos būdu. 12, 13 Neseniai atliktame vaikų gliomų tyrime nustatyta, kad PDGFRA sustiprėja 2 iš 14 piktybinių gliomų, bet ne nė viename iš tirtų žemo laipsnio navikų. 24 PDGF receptorių ekspresija α ir β taip pat buvo aprašyta ependimomose 25, taip pat primityviuose neuroektoderminiuose navikuose ir medulloblastomose26, tačiau genų amplifikacija dar nebuvo aprašyta šiems vaikų navikams. Įdomu, tačiau įrodyta, kad PDGF receptoriai yra labiau išreikšti medulloblastomose, pasižyminčiose agresyviu biologiniu elgesiu su metastaziniu plitimu, 27, 28, kurie rodo ne tik vaidmenį skatinant naviko augimą, bet ir PDGF receptorių raiškos prognostinę reikšmę. Šioje retrospektyvinėje serijoje choroidinio rezginio karcinomų, ekspresuojančių PDGF receptorius, dalis buvo didelė, o gydymas buvo nevienalytis. Todėl PDGF receptorių ekspresijos būklės prognostinė vertė nėra per daug atgrasanti. PDGF receptoriaus statuso nustatymas tikrai bus naudingas būsimuose terapiniuose tyrimuose, kuriuose bus vertinamas gydymo, nukreipto į PDGF receptorių signalizavimą, choroidinio rezginio karcinomos efektyvumas.

Priešingai nei mieloproliferacinė liga, atrodo, kad 29 konstitucinės PDGF receptorių aktyvinančios mutacijos centrinės nervų sistemos navikuose yra retos. 30 Taigi, prieš darant aiškias išvadas apie PDGF receptorių funkcinį vaidmenį vystant choroidinio rezginio karcinomą, būtina atlikti tolesnius PDGF receptorių signalo vaidmens choroidinio rezginio karcinomų navikogenezėje tyrimus. Tačiau tokiems tyrimams trukdo tai, kad be nemirtingų žiurkių choroidinio rezginio epitelio ląstelių, dar nėra nustatyta 31 tikroji choroidinio rezginio karcinomos ląstelių linija.

Taigi, choroidinio rezginio karcinomose dažnai būna PDGF receptorių, ypač PDGF receptorių, ekspresija ir amplifikacija. Tai yra pirmasis pagrindimas plėtoti gydymą, nukreiptą į PDGF receptorių signalizavimą choroidinio rezginio karcinomose.

Atskleidimas / interesų konfliktas

Autoriai nenurodo interesų konflikto.