Polinesočiųjų riebalų rūgščių trūkumas pelių neurodegramos metu modeliuoja prodrominę šizofrenijos būklę per epigenetinius branduolinių receptorių genų pokyčius | vertimo psichiatrija

Polinesočiųjų riebalų rūgščių trūkumas pelių neurodegramos metu modeliuoja prodrominę šizofrenijos būklę per epigenetinius branduolinių receptorių genų pokyčius | vertimo psichiatrija

Anonim

Dalykai

  • Neuromokslas
  • Šizofrenija

Anotacija

Šizofrenijos rizika padidėja palikuonims, kurių motinos nėštumo metu patiria netinkamą mitybą. Polinesočiosios riebalų rūgštys (PUFA) yra dietiniai komponentai, kurie turi lemiamą reikšmę neuroninių ląstelių struktūriniam ir funkciniam vientisumui, be to, įrodyta, kad PUFA trūkumas yra šizofrenijos rizikos veiksnys. Čia parodyta, kad nėštumo ir ankstyvas postnatalinis dviejų PUFA - arachidono rūgšties (AA) ir dokozaheksaeno rūgšties (DHA) - atėmimas iš dietos pelių palikuonims sukėlė į šizofreniją panašius fenotipus. PUFA neturinčių pelių grupėje pastebėjome mažesnę motyvaciją ir didesnį jautrumą haliucinogeniniam vaistui, primenančiam prodrominius simptomus šizofrenijoje. Be to, stebėtas darbinės atminties sukeliamas hiperneuroninis aktyvumas medialinėje prefrontalinėje žievėje, taip pat sumažėjo prefrontalinėje žievėje esančių genų, susijusių su oligodendrocitų vientisumu, ir gama-aminosviesto rūgšties (GABA) -erginės sistemos genai. Šių genų reguliavimą skatino branduolinių receptorių genai Rxr ir Ppar , kurių promotoriai buvo hipermetilinami atimant dietinius AA ir DHA. Be to, RXR agonistas beksarotinas padidino su oligodendrocitais ir GABA susijusią genų raišką ir slopino pelių jautrumą haliucinogeniniam vaistui. Pažymėtina, kad šių branduolinių receptorių genų ekspresija taip pat buvo sumažinta šizofrenija sergančių pacientų plaukų folikulų ląstelėse. Šie rezultatai leidžia manyti, kad pelių PUFA trūkumas ankstyvuoju neurodeformaciniu laikotarpiu galėtų modeliuoti prodrominę šizofrenijos būklę per branduolinių receptorių genų epigenetinio reguliavimo pokyčius.

Įvadas

Tarp gerai žinomų šizofrenijos rizikos veiksnių, turinčių įtakos ankstyvam nervų vystymuisi, žinoma, kad mitybos nepakankamumas daro didelį poveikį. 1 Pavyzdžiui, epidemiologiniai duomenys rodo, kad badas ankstyvuoju nėštumo laikotarpiu apytikriai padidina šizofrenijos riziką palikuonims, kaip pastebėta po Olandijos bado žiemos (1944–1945) 2 ir Didžiojo kinų bado (1959–1961). 3, 4 Taigi, nepalankios nėštumo sąlygos gali turėti ilgalaikį poveikį tolesnei sveikatai arba sukelti suaugusiųjų ligas, atsirandančias dėl vaisiaus programavimo, kuris paprastai vadinamas sveikatos ir ligų vystymosi kilme (DOHaD). 5, 6 Nustatyta, kad DOHaD teorija taikoma daugeliui sindromų ir sutrikimų, įskaitant šizofreniją. 2 Be to, ilgalaikės epigenetinės permainos pastebimos moterų, kurios patiria badą per pirmąjį nėštumo trimestrą, palikuonių, bet jos nėra toms, kurios nei patiria badą, nei patiria vėlesnį nėštumo periodą. 7 Taigi nėščių motinų mityba, ypač ankstyvosiose vystymosi stadijose, daro įtaką epigenetiniams vaisiaus pokyčiams, tokiems kaip DNR metilinimas, ir taip daro įtaką vystymuisi reguliuojamų genų raiškai. 8

Kelių maistinių medžiagų, įskaitant folio rūgštis, nepakeičiamąsias riebalų rūgštis, retinoidus, vitaminą D ir geležį, trūkumai buvo priskirti šizofrenijos rizikai, atsirandančiai dėl nėštumo bado. 1 Tarp maistinių medžiagų svarbiausios polinesočiosios riebiosios rūgštys (PUFA) - arachidono rūgštis (AA) (20: 4 n – 6) ir dokozaheksaeno rūgštis (DHA) (22: 6 n – 3) - turi lemiamą reikšmę smegenų vystymuisi. 9 DHA ir AA yra pagrindiniai membranų fosfolipidų komponentai, prisidedantys prie neuronų, gliaudinių ląstelių ir endotelio ląstelių struktūrinio vientisumo smegenyse 10, be to, jie taip pat turi įtakos neurotransmisijai, ląstelių išgyvenimui ir neuroinfekcijai. Pradėta įrodinėti ryšį tarp prenatalinio DHA trūkumo ir nenormalių neurotransmisijų bei neurokognityvinių sutrikimų. 11, 12

Atsižvelgdami į esminį PUFA vaidmenį, mes iškėlėme hipotezę, kad dėl sumažėjusios mitybos PUFA galimybės gali turėti įtakos ankstyvam neurozės vystymuisi ir taip turėti polinkį į šizofrenijos vystymąsi. Todėl šiame tyrime mes siekėme išsiaiškinti, ar būtinų riebalų rūgščių AA ir DHA nepriteklius ankstyvojo vystymosi metu (nėštumo ir ankstyvosios pogimdyminės) pelėms sukelia šizofrenijai būdingus fenotipus suaugusiems palikuonims. Patvirtinę šį reiškinį, mes stengėmės nustatyti jo signalines kaskadas. Mūsų rezultatai nustatė, kad RXR ir PPAR branduolinių receptorių signalizacijos sistema yra aukščiau esantis mechanizmas, dėl kurio PUFA trūkumas lemia į šizofreniją panašius fenotipus. Kiek mums yra žinoma, tai yra pirmoji ataskaita, parodanti, kad branduolinių receptorių genų epigenetinė modifikacija turi pagrindinį vaidmenį šizofrenijos prodrominėje būsenoje, kurią sąlygoja PUFA trūkumas ankstyvosiose neurologinio vystymosi stadijose.

medžiagos ir metodai

Gyvūnai ir dietos

Inbredinės C57BL / 6NCrlj (B6) pelės buvo gautos iš Charles River Laboratories (Tokijas, Japonija). Būsto sąlygos aprašytos kitur. RIKEN gyvūnų etikos komitetas patvirtino 13 eksperimentinių procedūrų. Tėvų peles auginome laikydamiesi keturių skirtingų dietų, pridėdami AA ir (arba) DHA (arba nė vieno) į maistą AIN-76, kuriame nebuvo nei AA, nei DHA: (1) AA (+) / DHA (+), (2) AA (+) / DHA (-), (3) AA (-) / DHA (+) ir (4) AA (-) / DHA (-) (1 papildoma lentelė). Dietos buvo skiriamos nuo 2 savaičių iki poravimosi iki 3 savaičių po šuniukų gimimo (nujunkymo taškas). Po nujunkymo pelės buvo užaugintos įprastine dieta (CRF-1) (Charles River formulė; įsigyta iš Oriental Yeast, Tokijas, Japonija). Visas maistas buvo laikomas 4 ° C temperatūroje ir iki naudojimo buvo apsaugotas nuo šviesos, kad būtų išvengta oksidacijos ir denatūracijos. Maistas nebuvo apdorotas gama spinduliais ar autoklave. Mes tyrėme pelių patinus, išskyrus pieno tyrimą.

Riebalų rūgščių analizė

Buvo tiriama motinos pieno (8 pogimdyminę dieną) ir žievės audinių (3 savaičių ir 6 mėnesių amžiaus) riebalų rūgščių sudėtis, gauta iš keturių dietos grupių palikuonių. Bendras lipidų kiekis buvo ekstrahuotas Bligh ir Dyer metodais. 14 Bendros fosfolipidų frakcijos buvo atskirtos plonasluoksne chromatografija. Kiekvienos riebiosios rūgšties kiekis buvo išreikštas procentiniu visų riebalų rūgščių plotu. Riebalų rūgščių analizės protokolai yra aprašyti kitur 15, 16 ir Papildomuose metoduose.

Elgesio analizė

Elgesys buvo vertinamas naudojant šiuos testus: atviro lauko testą, uodegos pakabos testą, Y labirinto testą, priešimpulsinio slopinimo (PPI) testą, priverstinio plaukimo testą, šviesos ir tamsiosios dėžės testą, padidinto pliuso labirintą, namų narvo veiklos testą. ir MK-801 jautrumo testas nuo 2 iki 6 mėnesių amžiaus. Elgesio testų protokolai buvo aprašyti kitur 17 ir Papildomuose metoduose.

Mangano sustiprintas magnetinio rezonanso vaizdas

Buvo atlikti mangano (Mn) sustiprinto magnetinio rezonanso tomografijos (MRT) eksperimentai, skirti palyginti su užduotimi (darbine atmintimi) susijusią nervų veiklą pelių grupėse 6 mėnesių amžiaus. Protokolai buvo aprašyti kitur 18 ir yra parodyti papildomuose metoduose ir papildomame 1 paveiksle.

Genų ekspresijos analizė naudojant cDNR mikro matricą ir kiekybinį realaus laiko PGR

Iš 6 mėnesių amžiaus AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) pelių prefrontalinių žievių (PFC) buvo ekstrahuota visa RNR (Isogen RNA ekstrahavimo rinkinys, Nippon Gene, Tokijas, Japonija) ( n = 6 kiekvienam). Transkripcijos profiliavimui pagal gamintojo instrukcijas buvo naudojami „GeneChip Mouse Genome 430 2.0“ masyvai (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV). Duomenų analizė atlikta naudojant „GeneSpring GX“ („Agilent Technologies“, Santa Klara, Kalifornija, JAV). Skirtingai reguliuojamų genų funkcinė anotacija buvo atlikta naudojant išradingumo kelio analizę (IPA) (Qiagen, Venlo, Nyderlandai). Kiekybinė realaus laiko (RT) -PCR analizė buvo tokia, kaip aprašyta kitur. 19 Norėdami gauti išsamesnės informacijos, žiūrėkite papildomus metodus.

Imunohistochemija

Imunohistochemija buvo atlikta, kaip aprašyta kitur 20 (ir papildomuose metoduose bei 2 papildomoje lentelėje), siekiant vizualizuoti branduolinių receptorių ekspresiją pelių PFC, kai jos yra 6 mėnesių amžiaus, ir kartu nustatyti branduolinius receptorius oligodendrocituose ar GABAerginiuose neuronuose.

Gama-aminosviesto rūgšties biocheminė analizė

Gama-aminosviesto rūgšties (GABA) koncentracija žievėje po 6 mėnesių buvo išmatuota atliekant efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) analizę, kaip aprašyta kitur 21 ir papildomuose metoduose.

Galvos odos folikulų mėginiai

Galvos odos folikulų analizė buvo atlikta, kaip aprašyta ankstesniame mūsų darbe 19 ir Papildomuose metoduose bei 3 papildomoje lentelėje. Šis tyrimas buvo patvirtintas RIKEN etikos komitetų ir visų dalyvaujančių institutų ir buvo atliktas vadovaujantis deklaracijoje išdėstytais principais. iš Helsinkio. Visi kontrolės subjektai ir pacientai davė rašytinį, informuotą sutikimą dalyvauti tyrime, paaiškinus tyrimo protokolus ir tikslus.

Ląstelių kultūra ir in vitro branduolinių receptorių agonistų aktyvumo tyrimas

OLP6 ląstelės („RIKEN BioResource Center Cell Bank“, Tsukuba, Japonija) buvo inkubuojamos drėkintoje atmosferoje su 5% CO 2, esant 33 ° C, proliferacijos stadijoje. Tada jie buvo inkubuojami su 5% CO2 2 dienas 39 ° C temperatūroje 4 dienas, norint sukelti diferenciaciją. KATO-III ląstelės (Japonijos mokslinių tyrimų bioresursų ląstelių bankas, Osaka, Japonija) buvo inkubuotos drėgnoje atmosferoje su 5% CO 2, esant 37 ° C. Bezafibrato (Ppar / PPAR (peroksisomų proliferatorių suaktyvinto receptoriaus) pan-agonistas: Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir beksaroteno (Rxr / RXR (retinoidų X receptorių)) pan-agonistas: LC Laboratories, Woburn, MA, JAV) buvo ištirpinti DMSO (dimetilsulfokside). 10 mm pradiniai tirpalai iki naudojimo buvo laikomi –20 ° C temperatūroje. Pradiniai tirpalai buvo dedami į ląstelių auginimo terpę, kad galutinės darbinės koncentracijos būtų 0, 1, 0, 3 ir 1 μm (beksarotenas; OLP6), 5, 15 ir 50 μm (bezafibratas; OLP6), 3, 10 ir 30 μm (beksarotenas; KATO-III) ir 15 ir 150 μm (bezafibrato; KATO-III). Norėdami gauti išsamesnės informacijos, žiūrėkite papildomus metodus.

Branduolio receptorių agonisto in vivo tyrimas

B6 pelėms buvo skiriama nešiklis (vanduo) arba beksarotenas, kuris gali prasiskverbti pro kraujo ir smegenų barjerą 22 arba 30 mg kg – 1 arba 100 mg kg – 1 kartą per parą (po) 3 savaites (6–9 savaičių amžiaus). . Po gydymo beksarotenu buvo atlikta genų ekspresijos analizė ir jautrumo testas MK-801.

DNR metilinimo analizė, naudojant bisulfito seką

Mes ištyrėme atskirų CpG vietų metilinimo lygius pagrindiniuose Rxra promotoriaus regionuose (300 bp intervalas nuo transkripcijos pradžios vietos) ir Ppara (280 bp intervalas nuo transkripcijos pradžios vietos), atlikdami žievės mėginių AA bisulfito sekos analizę (+). / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) grupės 6 mėnesių amžiaus. Bisulfito seka buvo atliekama taip, kaip aprašyta kitur. 23 pradmenų sekos yra išvardytos papildomuose metoduose.

Statistinė analizė

Duomenys buvo analizuojami naudojant „Prism 5“ („GraphPad“, La Jolla, CA, JAV). Nepertraukiamų kintamųjų skirtumai buvo vertinami nesuporuotu t- testu (patvirtinus normalų pasiskirstymą) arba atliekant vienpusį ANOVA arba pakartotinį matavimą ANOVA, po to sekant Dunnett'io arba Mann – Whitney U testus kaip post hoc testą. Dviejų variacijų koreliacijos analizė buvo atlikta naudojant Spearmano rango testą. P reikšmės <0, 05 buvo laikomos reikšmingomis. Išorės apibrėžimas yra bet kuris duomenų taškas, didesnis nei 1, 5 tarpkvartilinių intervalų (IQR) žemiau pirmojo kvartilio arba virš trečiojo kvartilio.

Rezultatai

Pelių, kurioms netaikomas dietinis PUFA, elgesio fenotipai nėštumo ir ankstyvuoju pogimdyminiu laikotarpiu

Pirmiausia mes ištyrėme riebalų rūgščių sudėtį motinos piene ir mažylių smegenyse (žievėje). Palyginus su AA (+) / DHA (+) grupe, AA motinos piene buvo sumažinta AA (-) / DHA (-) ir AA (-) / DHA (+) grupėse, o DHA sumažėjo AA (-) / DHA (-) ir AA (+) / DHA (-) grupės (4 papildomos lentelės). Šie pokyčiai taip pat buvo pastebėti po pogimdyminės 15 dienos (duomenys nepateikti). 3 savaičių žievėje 'AA turiniui būdingi indeksai' [ n −6 PUFA / n −3 PUFA santykis ir AA / ( n −6 PUFA + n −3 PUFA)] buvo pakeisti pagal prognozę po papildymo arba AA išbraukimas iš dietos (5 papildoma lentelė, taip pat žr. 6 papildomą lentelę). Panašūs numatomi pokyčiai buvo 'DHA su indeksu susijusių indeksų' [ n – 3 PUFA / n – 6 PUFA santykis ir DHA / ( n – 6 PUFA + n – 3 PUFA)] (5 papildomos lentelės). Laukiami pokyčiai taip pat buvo stebimi DHA / AA santykyje (5 papildomos lentelės), o šių pokyčių žievėje nebuvo 6 mėnesių amžiaus (7 papildoma lentelė).

Norėdami įvertinti, ar motinos AA ir (arba) DHA apribojimai neuro išsivystymo metu sukelia elgesio pokyčius, rodančius šizofreniją ar jos prodrominius fenotipus suaugusiems palikuonims, mes atlikome daugybę elgesio testų, kad įvertintume motinoms gimusių pelių motyvaciją, emocines būsenas ir darbinės atminties funkcijas. kurios nėštumo metu ir laktacijos metu vartojo vieną iš keturių skirtingų dietų, turinčių AA ir (arba) DHA, derinius (1a pav.).

Image

Įvairių arachidono rūgšties (AA) / dokozaheksaeno rūgšties (DHA) dietų grupių elgesio analizė. a ) Eksperimentinis įvairių AA / DHA dietų skyrimas ir elgesio testai. Parodyti uodegos pakabos bandymo b, Y labirinto bandymo c ir atviro lauko bandymo d rezultatai. e ) (kairysis) Lokomotorinis aktyvumas matuojamas prieš vieną fiziologinio tirpalo arba MK-801 (0, 15 mg kg −1 ) injekciją, jos metu ir po jos. (dešinėje) kaupiamasis lokomotorinis aktyvumas (3 val.) po MK-801 injekcijos. Visose plokštėse reikšmės yra vidurkiai ± se ( b, c ) P vertės buvo apskaičiuotos naudojant dvipusį pakartotinį matavimą ANOVA, po kurio sekė Dunnett post-hoc testas keliems palyginimams [palyginti su AA (+) / DHA (+) ] ( d ) P vertės buvo apskaičiuotos naudojant Dunnett testą daugybiniams palyginimams [palyginti su AA (+) / DHA (+) ]. e ) P vertės buvo apskaičiuotos naudojant dvipusį pakartotinį matavimą ANOVA, po kurio sekė dvipusis post hoc Manno – Whitney U testas [AA (+) / DHA (+) ir MK-801 prieš AA (-) / DHA (-). ) ir MK-801]. # P <0, 1, * P <0, 05, ** P <0, 01. Klaidų juostos žymi standartinę vidurkio paklaidą.

Visas dydis

Ankstyvoji psichozė ir prodrominė šizofrenijos fazė yra susijusi su sumažėjusia motyvacija, depresijos simptomais ir sutrikusia kognityvine funkcija. 24, 25, palyginti su AA (+) / DHA (+) grupe, grupės, turinčios AA arba DHA trūkumą, parodė didesnį nejudrumą uodegos pakabos bandyme ir lėčiau atliko Y labirinto testą, ypač žymiai prastesnius rezultatus. „vėlyvosios fazės sesijos“ (1b ir c paveikslai). Šie elgesio pokyčiai rodo, kad yra sutrikimų palaikant motyvaciją ar polinkį į depresiją (abu testai) ir pažinimo užduoties atlikimo greitį (atliekant Y labirinto testą). Be to, lokomotorinis aktyvumas atliekant atviro lauko bandymą (bendras atstumas, vidutinis greitis ir judėjimo greitis) AA (-) / DHA (-) ir AA (-) / DHA (+) grupėse buvo žymiai mažesnis nei AA (+) / DHA (+) grupė (1d paveikslas). Šie rezultatai kartu parodo AA (-) / DHA (-) ir AA (-) / DHA (+) grupių hipotiminį elgesį, palyginti su AA (+) / DHA (+) grupių elgesiu. Kitų elgesio testų metu reikšmingų skirtumų nepastebėta (8 papildoma lentelė).

Tolesni bandymai parodė, kad, palyginti su AA (+) / DHA (+) grupe, AA (-) / DHA (-) grupė parodė hiper-lokomotyvo atsaką į haliucinogeninį vaistą MK-801 (NMDA receptorių antagonistą) (pav. 1e), rezultatas, primenantis kai kurias sveikų žmonių psichines būsenas arba šizofrenijos simptomų paūmėjimą pavartojus NMDA receptorių antagonistus. 26, 27 Kadangi AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) grupės parodė didžiausius skirtumus, vėlesnes analizes sutelkėme tik į jų palyginimus. Taigi mes parodėme, kad dietinis PUFA nepriteklius nėštumo ir ankstyvojo pogimdyminio periodo metu sumažina motyvaciją ir padidina jautrumą haliucinogeniniams vaistams, imituoja elgesio fenotipus šizofrenijoje (arba prodrominėje šizofrenijoje).

AA (-) / DHA (-) grupė, atlikdama darbinės atminties užduotį, rodė hiperneuroninį aktyvumą

Toliau paklausėme, ar nenormalūs elgesio fenotipai, kuriuos demonstruoja AA (-) / DHA (-) grupė, buvo susiję su pakitusiu neuronų aktyvumu smegenų regionuose, kurie buvo susieti su šizofrenija, pavyzdžiui, PFC. Atlikę Y labirinto testą, pelėms atlikome Mn padidintą MRT, kuris įvertina darbinės atminties galimybes, kurioms sutrikusi šizofrenija. AA (-) / DHA (-) ir AA (-) / DHA (+) grupės šiame bandyme buvo šiek tiek prastesnės (greičiu) nei AA (+) / DHA (+) grupės (1c paveikslas). MRT padidintame MRT manganas yra kontrastinė medžiaga, patenkanti į aktyvuotus neuronus per kalcio kanalus ir ten išliekanti. Taigi MR signalai, atspindintys naujausią neuronų veiklą, gali būti naudojami nustatant smegenų sritis, susijusias su konkrečiomis užduotimis. 18, 29, 30 Norėdami tiksliai palyginti neuronų aktyvumą tarp grupių, mes paruošėme plokščius kiekvieno regiono aktyvumo žemėlapius, vidurkindami atskirus regioninius MR signalus, kaip ir ankstesniame tyrime. 18 AA (-) / DHA (-) grupė parodė didesnius Mn sustiprintus MR signalus medialinėje priešfrontalinėje žievėje (mPFC) ir branduolio akumuliaciniame apvalkale nei AA (+) / DHA (+) grupėje (2a paveikslas ir papildomas paveikslas). 1a). Pranešama, kad mPFC neuronai dalyvauja koduojant darbinę atmintį didinant šaudymo dažnį ar sinchronizaciją, o mPFC glutamaterginiai neuronai siunčia projekcijas į branduolio akumuliatorių apvalkalą 31, 32 (papildomas 1b paveikslas, atitinkamos neuronų grandinės paaiškintos legendose). ). Dabartiniai MRT rezultatai rodo, kad egzistuoja kompensacinis mechanizmas sumažėjusiai vykdomai funkcijai mPFC, kurį sukėlė AA (-) / DHA (-) dieta, o tai sutinka su pranešimais apie klinikinius šizofrenijos atvejus. 33, 34, 35 Mes taip pat atlikome tūrinę analizę, naudodami MRT duomenis, tačiau nenustatėme visų smegenų, šoninių skilvelių ir hipokampo tūrio pokyčių tarp keturių skirtingų dietų grupių (9 papildoma lentelė).

Image

Makroskopiniai neuronų vaizdavimo ir genų ekspresijos tyrimai AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) grupėse. a ) Viršutinė plokštė: mangano (Mn) sustiprinto magnetinio rezonanso tomografijos (MRT) analizės grafikas. MRT signalai buvo gauti praėjus 4 val. Po Y labirinto tyrimo (po 6 val. Po intraperitoninės MnCl2 injekcijos). Apatinė plokštė: AA (-) / DHA (-) pelių medialiniuose prefrontaliniuose žievės (mPFC) ir branduolio akumuliatorių (NAc) apvalkalo Mn sustiprinto MRT signalo intensyvumas buvo žymiai didesnis nei AA (+). ) / DHA (+) pelė. b ) Skirtingai išreikšti genai pirmiausia buvo praturtinti „ligomis ir biologinėmis funkcijomis“ (išradingumo kelio analizė (IPA)). c ) kiekybinė realaus laiko (RT) -PCR analizė su oligodendrocitų ląstelėmis susijusiais genais (viršutinė plokštė) ir su GABAerginiais neuronais susijusiais genais (apatinė plokštė). Reikšmės yra vidurkis ± Gapdh buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. P vertės buvo apskaičiuotos naudojant neporinius t- testus. # P <0, 1, * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. d ) Branduolinių receptorių genų kiekybinė RT-PGR analizė. Reikšmės yra vidurkis ± Gapdh buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. P vertės buvo apskaičiuotos naudojant neporinius t- testus. # P <0, 1, * P <0, 05, ** P <0, 01. e ) Santykinių Rxra ar Ppara ir Olig2 arba Gad1 lygių koreliacijos analizė. Duomenys buvo įvertinti naudojant Spearman rango koreliacijos testus. f ) Imunohistologiniai tyrimai. Rxra ir Ppara buvo ekspresuojami Olig2 ir Gad67 teigiamose ląstelėse.

Visas dydis

AA (-) / DHA (-) grupės prefrontalinėje žievėje pastebėtas sumažėjęs su oligodendrocitais ir GABA susijusių genų ekspresijos lygis

Norėdami apibūdinti transkriptominius pokyčius, susijusius su pelių nėštumo ir ankstyvu postnataliniu mitybos PUFA atėmimu, ištyrėme AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) grupių PFC genų ekspresijos lygius. 6 mėnesių amžiaus, nes PFC disfunkcija susijusi su šizofrenija. Mikro matricos analizė atskleidė A4 (-) / DHA (-) grupės PFC 174 reikšmingai sumažintus ir 540 atnaujintus genus ( P 1, 3), palyginti su AA (+) / DHA (+) grupe (10 papildoma lentelė ir papildoma figūra). 2). Naudodamiesi IPA paklausėme skirtingai reguliuojamų genų viršutinėse „Ligų ir biologinių funkcijų“ anotacijose, iš kurių paaiškėjo, kad „Neurologinių ligų“, „Elgesio“ ir „Nervų sistemos vystymosi ir funkcijos“ kategorijų genai buvo praturtinti (11 papildoma lentelė). . Išsamios šių kategorijų anotacijos parodė „mielinizaciją (remielinizaciją ir baltosios medžiagos žalą)“, „įvairius su šizofrenija susijusius elgesio atvejus“ ir „interneuronus“ (2b paveikslas ir 12 papildoma lentelė).

Įrodyta, kad genų, susijusių su oligodendrocitų sistema 36, 37, 38, 39 ir GABA turinčia interneurono sistema 40, 41, ekspresijos lygis sumažėjo, palyginti su normalia šizofrenija sergančių žmonių smegenyse po mirties. Kiekybinė RT-PCR analizė PFC patvirtino, kad su oligodendrocitais susiję genai Cldn11 , Cspg4 , Mbp , Mobp , Mag ir su GABA susijęs genas Sst buvo išreikšti žymiai mažesniais AA (-) / DHA (-) grupės lygiais nei AA (+) / DHA (+) grupėje (2c paveikslas). Tolesnis tyrimas atskleidė kitų genų, išreikštų kaip nenormalus, ekspresijos lygio pokyčius šiam poemorteminėse smegenyse, apimančiose neurotransmiterių receptorių genus Drd1a , 42 Drd2 , 42 Htr1a , 43 Htr2a 43 ir Cnr1 44 (13 papildoma lentelė). .

Be to, kad buvo sumažintas genų reguliavimas , buvo pranešta, kad GABA-receptorių subvieneto GABRA2 mRNR raiška yra 14% didesnė 2-ojo šizofrenija sergančių asmenų dorsolateralinio prefrontalinio žievės sluoksnyje 45, o tai gali atspindėti kompensacinį priešpriešą reaguojant į sudrėkintą. GABAerginė sistema. 46 Mūsų pelėms „ Gabra2“ raiška sustiprėjo AA (-) / DHA (-) grupėje (2c paveikslas), parodant kitą AA (-) / DHA (-) grupės ir žmonių, sergančių šizofrenija, panašumą. Nors GABA kiekis žievėje nesiskyrė tarp dviejų grupių (14 papildoma lentelė), rezultatai atitiko klinikinius duomenis apie GABA koncentraciją šizofrenijoje, naudojant magnetinio rezonanso spektroskopiją. 47

Branduoliniai receptoriai reguliuoja su oligodendrocitais ir GABA susijusių genų ekspresiją

Toliau mes panaudojome IPA numatyti genų, kuriuos nustatėme kaip diferencijuotai išreikštus po dietos AA ir DHA, transkripcijos reguliatorius. Rezultatai parodė, kad praturtėjo genai, dalyvaujantys branduolinio receptoriaus transkripcijos kelyje (15 ir 16 papildomos lentelės; 3 papildomas paveikslas), įskaitant Rxra , Rxrb , Rxrg , Ppara , Pparb / d , Pparg , Rars ir Srebfs . Svarbu tai, kad šie transkripcijos faktoriaus genai yra susiję su mityba (ypač riebalų rūgštimis). 48 Mes patvirtinome, kad Rxra , Rxrb ir Ppara buvo sureguliuotas reikšmingai ir kad Pparb / d linkę link AA (-) / DHA (-) grupės PFC mažesnės ekspresijos nei ARA (+) / DHA (+) grupėje ( 2d pav.). Padidėjo Rara ekspresijos lygis ir sumažėjo Srebf1 ekspresijos lygis (17 papildoma lentelė).

Be to, Rxr arba Ppar jungimosi motyvai buvo identifikuoti pagrindiniuose 9- ojo promotoriaus regionuose ( Cldn11 , Olig2 , Cspg4 , Mbp , Mal , Mobp , Gad1 , Gabra2 ir Sst ) (18 papildoma lentelė) iš 14 oligodendrocitų ir GABAerginio interneurono. susiję genai (2c paveikslas). Įdomu ir svarbu, kad tokie motyvai yra ir atitinkamuose žmonių genų promotoriuose (19 papildoma lentelė), leidžiantys manyti, kad Rxr / RXR arba Ppar / PPAR gali tiesiogiai reguliuoti šių su oligodendrocitais arba GABA susijusių genų ekspresiją, o funkcija išsaugota. tarp pelių ir žmogaus.

Be to, buvo pastebėta daug reikšmingų koreliacijų tarp genų, koduojančių transkripcijos faktorius (branduolinių receptorių genai) ir jų pasroviui taikomų objektų (oligodendrocitų ir GABAerginiai su interneuronu susijusių genų) išraiškos visų keturių dietų grupių pelių PFC ( N = 32). ) (20 papildoma lentelė), tokiu būdu siūlant branduolinių receptorių reguliavimą prieš srovę. Pabrėžtina , kad „ Rxra“ ir „ Ppara“ išraiškos lygiai buvo stipriai koreliuojami su „ Olig2“ („ Rxra“ ; „Spearman“ ρ = 0, 8892, P <0, 0001, „ Ppara“ ; „Spearman“ ρ = 0, 8937, P <0, 0001) ir „ Gad1“ ( Rxra ; „Spearman“ ρ = 0, 9099) raiškos lygiais., P <0, 0001, Ppara ; Spearmano ρ = 0, 8601, P <0, 0001) (2e paveikslas ir 20 papildoma lentelė). Norėdami ištirti, ar „Rxra“ ir „Ppara“ reguliuoja Olig2 ir Gad1 raišką tose pačiose ląstelėse, toliau imunohistochemiškai patvirtinome „Rxra“ ir „Ppara“ raišką Olig2 ir Gad1 (Gad67) ekspresuojančiose ląstelėse pelės PFC (2f pav.).

RXR pan-agonistas beksarotinas padidino su oligodendrocitais ir GABA susijusių genų ekspresiją

Kadangi branduolinių receptorių ekspresijos lygis, Rxra ir Ppara buvo labai koreliuojami su Olig2 ir Gad1 ekspresija; mes ketinome įvertinti atominių receptorių tarpininkaujamo pasrovės genų reguliavimo poveikį farmakologiškai. Mes analizavome RXR pan-agonisto beksaroteno ir PPAR pan-agonisto bezafibrato poveikį tikslinių genų ekspresijos lygiams, panaudodami oligodendrocitų ląstelių liniją OLP6 - gautą iš suprachiasmatinio branduolio ventrolateralinio regiono (žiurkės neuroninių ląstelių linijos). 49 - ir GABA turinčios KATO-III ląstelės, gautos iš žmogaus skrandžio vėžio ląstelių (žymų žiedinių ląstelių karcinoma). 50 Gydymas beksarotenu padidino su oligodendrocitais susijusių genų Olig2 , Cldn11 , Mal ir Mbp ilgio raišką OLP6 ląstelėse (3a pav.). Bezafibratas taip pat padidino Olig2 , Mal ir Mbp ilgio mRNR raišką (3a pav.). Beksarotenas padidino CCK ir CALB2 mRNR lygius 30 μm atstumu, tuo tarpu bezafibratas sumažino CALB2 mRNR ekspresiją abiem koncentracijomis (3b paveikslas). Gydymas nepakeitė kitų su oligodendrocitais susijusių genų arba su GABA susijusių genų ekspresijos lygio nė vienoje ląstelių linijoje (duomenys nepateikti). Šie rezultatai rodo, kad RXR ir PPAR reguliuoja su oligodendrocitais ir GABA susijusių genų ekspresiją in vitro .

Image

Ligandų poveikis branduoliniams receptoriams in vitro ir in vivo . a ) Viršutinė eilutė: eksperimento, naudojant OLP6 langelius, schema. Per pirmąsias 4 dienas ląstelės buvo kultivuojamos nediferencijuotai. Per kitas 4 dienas ląstelės buvo kultivuojamos diferencijuotai. 7 dieną kiekvienas ligandas buvo pridėtas. 8 dieną stenogramos lygiai buvo išmatuoti kiekybine RT-PGR. Apatinė eilutė: su oligodendrocitais susijusių genų kiekybinė RT-PGR analizė OLP6 ląstelėse, apdorotose 0, 1, 0, 3 arba 1 μm beksarotenu arba 5, 15 arba 50 μm bezafibratu. Šis tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais. b ) Viršutinė eilutė: eksperimento, naudojant KATO-III ląsteles, schema. Apatinė eilutė: CCK ir CALB2 genų ekspresija KATO-III ląstelėse, apdorotose 0, 1, 0, 3 arba 1 μm beksarotenu arba 5, 15 arba 50 μm bezafibratu, ir analizuojama kiekybine RT-PGR. Reikšmės yra vidurkis ± Gapdh / GAPDH buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. P vertės buvo apskaičiuotos naudojant Dunnett testą daugybiniams palyginimams (palyginti su DMSO). Šis tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais. c ) Viršutinė eilutė: eksperimentinis beksaroteno skyrimo planas. Pelėms buvo kasdien švirkščiama nuo 6 iki 9 savaičių (nešiklis arba beksarotenas, 30 arba 100 mg kg −1, vieną kartą per dieną). Apatinė eilutė: Olig2 ir Apc genų ekspresija pelių prefrontaliniame žieve (PFC), analizuojama kiekybine RT-PGR. Reikšmės yra vidurkis ± Gapdh buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. P vertės buvo apskaičiuotos naudojant Dunnett testą daugybiniams palyginimams (palyginti su nešikliu). Atminkite, kad vartojant 30 mg kg − 1 beksaroteno, reikšmingai padidėjo Olig2 ir Apc ekspresija. ( d, e ) Lokomotorinės reakcijos į MK-801 (0, 3 mg kg −1 ) sušvirkštimą tirpikliais, gautais tirpikliais ir beksarotenu (30 mg kg −1 ). Abiejoms grupėms paskutinis gydymas buvo atliktas 180 min. Prieš MK-801 injekciją. Vertės yra vidurkis ± se P vertės buvo apskaičiuotos naudojant dvipusį pakartotinį matavimą ANOVA, po kurio sekė Manto – Whitney U testas d . P vertės buvo apskaičiuotos naudojant neporinius t- testus e . # P <0, 1, * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, **** P <0, 0001.

Visas dydis

Kadangi oligodendrocitų ir GABAergic sistemose po gydymo bexarotenu buvo pastebėtas ryškesnis poveikis in vitro nei su bezafibratu, toliau nagrinėjome bexaroteno poveikį in vivo . Pelėms 3 savaites skyrėme nešiklį arba beksaroteną (30 arba 100 mg kg −1 ). Tada mes ištyrėme su oligodendrocitais ir GABA susijusių genų raišką pelių PFC 24 val. Po paskutinės injekcijos. Gydymas 30 mg kg – 1 beksarotenu sąlygojo padidėjusią Olig2 ir Apc ekspresiją (3c paveikslas ir 21 papildoma lentelė). Elgesio metu gydymas beksarotenu (30 mg kg −1 ) 3 savaites buvo linkęs slopinti hiper-lokomotyvo reakcijas, kurias sukėlė MK-801 (0, 3 mg kg −1 ), sušvirkštas praėjus 24 valandoms po paskutinio beksaroteno vartojimo (3d ir e paveikslai). . Šie in vitro ir in vivo rezultatai patvirtino branduolinių receptorių sistemų vaidmenį atliekant su šizofrenija susijusią patofiziologiją.

Rxra ir Ppara ekspresijos lygiai buvo susiję su promotoriaus DNR metilinimu

Promootorinės DNR metilinimas yra žinomas kaip svarbus genų ekspresijos reguliavimo komponentas. Kadangi buvo nustatyti kardinalūs Rxra ir Ppara genų vaidmenys, reguliuojant su oligodendrocitais ir GABAerginiais interneuronais susijusius genus, mes paklausėme, ar šių branduolinių receptorių sumažėjusį reguliavimą PUFA trūkumu gali lemti DNR metilinimas Rxra ir Ppara genų promotoriuose. Šiuo tikslu mes ištyrėme atskirų CpG vietų metilinimo lygius pagrindiniuose Rxra ir Ppara promotorių regionuose, atlikdami bisulfito sekos analizę žievės mėginiams iš AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (- ) grupes (papildomas 4 paveikslas).

Rxra promotoriaus atveju CpG-3 vieta parodė žymiai aukštesnius metilinimo lygius AA (-) / DHA (-) grupėje nei AA (+) / DHA (+) grupėje ir CpG-10. parodė panašią tendenciją (4a pav.). Vidutinis Rxra metilinimo lygis per visą intervalą rodė didesnę tendenciją AA (-) / DHA (-) grupėje (3, 34%) nei AA (+) / DHA (+) grupėje (1, 35%) (4b paveikslas). ).

Image

Rxra ir Ppara promotorių DNR metilinimo analizė ir DNR metiltransferazės genų analizė. Parodyti atskirų CpG vietų metilinimo lygiai Rxra a, b ir Ppara promotoriuose c, d AA (+) / DHA (+) ir AA (-) / DHA (-) žievėje. e ) Dnmt1 , Dnmt3a-1 , Dnmt3a-2 ir Dnmt3b kiekybinė RT-PGR analizė. „Gapdh“ buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. P vertės buvo apskaičiuotos naudojant dvipusius Manno – Whitney U testus. # P <0, 1, * P <0, 05, ** P <0, 01.

Visas dydis

For the Ppara promoter, the CpG-20 site displayed significantly higher methylation levels in the AA (−) /DHA (−) group than in the AA (+) /DHA (+) group, and the CpG-4, -9 and -13 sites exhibited similar trends (Figure 4c). The mean methylation levels of the whole Ppara promoter region did not differ between the two groups (Figure 4d). Most of the differentially methylated sites in both genes were within putative transcriptional factor-binding motifs (Supplementary Figure 5), suggesting that alterations in the level of methylation of specific CpGs in the Rxra or Ppara promoters may induce negative relationships with their mRNA expression through the change of the response to the binding motifs.

As DNA methyltransferases mediate promoter DNA methylation, 51, 52 we also compared expression levels of Dnmt1 [DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1], Dnmt3a-1 , Dnmt3a-2 and Dnmt3b between the AA (+) /DHA (+) and AA (−) /DHA (−) groups in 3-week-old mice to complement the differential methylation levels observed in the Rxra and Ppara promoters. Dnmt3b was expressed significantly more in the AA (−) /DHA (−) group than in the AA (+) /DHA (+) group, Dnmt3a-2 expression followed a similar trend (Figure 4e). DNA methylation may therefore be one of the mechanisms that links dietary nutrition (in this case, the presence or absence of PUFAs in the diet) to long-lasting changes in gene-expression levels.

Low expression of nuclear receptor genes in hair-follicle cells from individuals with schizophrenia

To test whether expression levels of nuclear receptor genes are associated with the pathophysiology of schizophrenia in humans, we probed the transcript-expression levels of nuclear receptors ( RXRs and PPARs ) in hair-follicle cells from two cohorts of Japanese people with schizophrenia and in those without schizophrenia (controls). These samples were the same that was used in our prior study. 19 In the first cohort of samples (control, n =62; schizophrenia, n =52), RXRA, PPARA and PPARB/D were significantly downregulated ( P <0.05) in individuals with schizophrenia compared with the control subjects (Table 1). In an additional independent sample set (control, n =55; schizophrenia, n =42), the findings for PPARA and PPARB/D were replicated (Table 1), thus suggesting that these nuclear receptor genes are involved in the pathophysiology of schizophrenia. We also examined expression levels of myelin- and GABA- related genes in hair follicles, and correlations between the expression levels of nuclear receptor genes and GABA- or oligodendrocyte-related genes in the combined samples ( n =211) (Supplementary Table 22). These analyses revealed that the expression levels of specific nuclear receptor genes were correlated to the expression levels of target genes. For example, the expression level of RXRA was highly correlated with that of the oligodendrocyte-related gene CSPG4 (Spearman's ρ =0.54770, P <0.0001). These data also suggest that those nuclear receptors control gene expression of GABA- or oligodendrocyte-related genes.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

In the current study, we demonstrated that gestational and early postnatal dietary deprivation of PUFAs (AA and DHA) in mice elicited behavioral signs reminiscent of early psychosis (the prodromal state of schizophrenia) in humans, specifically: hypo-motivation, lowered cognitive task processing and hyper-sensitivity to MK-801. The greater immobility in the tail-suspension test is related to depressive symptoms observed in the prodromal state of schizophrenia. 53, 54 Concurrently, it is also reported that prenatal famine can lead to not only adult schizophrenia but also depression. 55 At the molecular level, the observed behavioral deficits were accompanied by dysregulated expression of genes associated with oligodendrocytes and GABAergic systems, which was also reported in postmortem shizophrenia brain. 36, 37, 38, 39, 40, 41 Our results suggest that dysregulation of oligodendrocyte- and GABA-related genes may have already occurred in an early phase of schizophrenia. In addition, the current mouse model exhibited altered neural activities in the mPFC during a cognitive task, which is seen in clinical cases of schizophrenia, 33, 34, 35 making this model further suitable for recapitulating key aspects of schizophrenia pathophysiology.

This study also revealed that the epigenetic silencing of nuclear receptor genes Rxr and Ppar is a molecular event upstream from the dysregulated expression of oligodendrocyte and GABAergic system genes. Our results indicating up-regulation of de novo DNA (cytosine-5)-methyltransferases, Dnmt3a-2 and Dnmt3b , in the AA (−) /DHA (−) group relative to the AA (+) /DHA (+) group are consistent with a scenario in which increased de novo methylation of nuclear receptor genes was induced by changes in the mother's diet.

Supplementation of PUFAs during the gestation and/or lactation period is known to influence DNA methylation. 56, 57, 58, 59 It was also reported that prostaglandin E2 (PGE2), a metabolite of AA, alters DNA methylation status. 60, 61 PUFAs and their metabolites might have a role in the epigenetic changes of nuclear receptor genes observed between the different diets. In parallel, the preformed AA and DHA are substrates for pro-inflammatory (for example, AA-PGE2) and anti-inflammatory (for example, DHA-D-resolvins) processes, respectively. 62 Thus, the involvement of pro- and anti-inflammatory mechanisms in the current model mice should be examined in a future study.

Mouse 63, 64 and human 65, 66 genetic studies have supported the potential roles of RXR or PPAR genes in the susceptibility to schizophrenia. The current findings showing that expression of RXRA, PPARA and PPARB/D is abnormally reduced in the hair-follicle cells of patients with schizophrenia not only support their putative role in schizophrenia pathogenesis but also suggest that this measure is a potential biomarker for schizophrenia. For example, scrutinizing the expression levels of genes for nuclear receptors in hair follicles would be useful to stratify complex schizophrenia pathophysiology. In addition, the combination of drugs and companion diagnostics by using hair follicles may bring potential value for patients.

Bexarotene (Targretin, LC Laboratories) is a third-generation retinoid drug that functions via activation of RXR receptors and is approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma by the US Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA). 67 In addition, bexarotene was evaluated as an antipsychotic-augmenting agent in a phase III clinical trial (NCT00535574). It was reported that add-on oral bexarotene to antipsychotic treatment in schizophrenia patients induced significant improvements in positive and negative symptoms with moderate effect size. 68, 69 On the basis of our results, we speculate that bexarotene's effects might be partly exerted by rectifying oligodendrocyte- and/or GABA- gene expression through nuclear receptor stimulation. Therefore, the current study could be a proof-of-concept (POC) for the use of bexarotene in clinical practice. Our results further suggest that the drug could be useful for subjects at risk for the schizophrenia mental state to prevent progression into evident psychosis.

Initially, n −3 PUFA supplementation was shown to be beneficial in disease prevention; 70, 71, 72 however, a recent double-blind, placebo-controlled randomized clinical trial did not find that supplementation prevented the transition to psychosis in young people at ultra-high risk for psychosis. 73 Our study suggests that stratifying schizophrenia in terms of subsets of principal pathophysiologies, if any (such as nuclear receptor gene expression in hair-follicle cells), could be helpful to draw a firm conclusion on the preventive effect of n −3 PUFA supplementation. In accord, it is known that elevated maternal DHA is associated with an increased risk for the development of schizophrenia in offspring. 74 Although the DHA (+) -dams had higher DHA contents in milk than the DHA (−) -dams, we did not find any worse scores in schizophrenia-related behaviors in the DHA (+) -offspring than in the DHA (−) -offspring.

Linoleic acid (18:2 n −6) and alpha-linolenic acid (18:3 n −3) can be converted to AA and DHA, respectively, in the rodent brain. 75, 76, 77, 78 In the current study, the contents of AA and DHA were significantly increased in the mother's milk of the AA (+) /DHA (+) group compared with that of the AA (−) /DHA (−) mice. Also, the 'AA content- and DHA content-related indices' were changed in an expected manner in the pups' cortex at 3 weeks old according to the diet formula. Therefore, supplementation or deletion of AA and DHA in the diet is thought to have a role in the alterations of behavioral outcomes, gene expression and DNA methylation status observed among mice fed the different diets. Given that the amount of preformed AA or DHA in the standard rodent chow (CRF-1) is small (Supplementary Table 1), the current results support the hypothesis of beneficial effects of supplementation of AA and DHA in neurodevelopmental stages.

However, the limitations of this study include the importance of future experiments to examine the contents of PUFAs, in particular AA and DHA, in earlier embryonic brain developmental stages. In our study, the embryonic cortex was too small to obtain reliable data but future experiments using new methods may better examine this prediction. Other unsolved issues include: (1) the distinct and/or combinatorial roles of AA and DHA, along with their critical doses, should be further clarified, and (2) the timing of the 'epigenetic window', a critical period for the generation of epigenetic changes, 79, 80 remains an important unanswered question.

In summary, we showed that PUFA deficiency during the early neurodevelopmental period in mice could model the prodromal state of schizophrenia most likely through epigenetic silencing of nuclear receptor genes, thereby dysregulating downstream neural gene expression. Our mouse model also provides an example strategy for elucidating how early-stage environmental insults are intertwined with the risk for schizophrenia.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

  4. 4.

    Papildomas 4 paveikslas

  5. 5.

    5 papildomas paveikslas

    Supplementary Information accompanies the paper on the Translational Psychiatry website (//www.nature.com/tp)