Teigiama darvininė atranka įspaustame medea lokuse augaluose gamta

Teigiama darvininė atranka įspaustame medea lokuse augaluose gamta

Anonim
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2007 m. Lapkričio 15 d

Anotacija

Žinduose ir sėkliniuose augaluose genų pogrupis yra reguliuojamas genomo įspaudimu, kai alelio aktyvumas priklauso nuo jo kilmės. Tėvų konflikto teorija leidžia manyti, kad genomo įspaudas išsivystė po embrioną maitinančio audinio (placentos ir endospermo) atsiradimo, dėl to kilo intragenominis tėvų konfliktas dėl maistinių medžiagų paskirstymo iš motinos palikuonims 1, 2 . Buvo prognozuojama, kad atspausti genai, atsiradę dėl antagonistinės kogeneracijos, kurią sukelia tėvų konfliktas, turėtų būti pozityviai įvertinti darvinuose 3 . Čia parodome, kad įspaustas augalų genas MEDEA ( MEA ) 4, 5, kuris yra būtinas sėklai vystytis, atsirado viso genomo dubliavimosi metu prieš 35–85 milijonus metų. Po dubliavimo MEA buvo atlikta teigiama darvininė atranka, atitinkanti neofunkcionalizaciją ir tėvų konfliktų teoriją. MEA toliau sparčiai vystosi neperžengiančiose Arabidopsis lyrata rūšyse, bet ne savaime tręšiančiose Arabidopsis thaliana rūšyse, kur sumažėja tėvų konfliktai. MEA paralogas SWINGER ( SWN ; taip pat vadinamas EZA1 ) 6 nėra įspaustas ir vystosi stipriai gryninant atranką, nes tikriausiai jis išlaikė bendro pirmtako geno protėvių funkciją. MEA raida rodo, kad vėlyvasis genominių įspaudų kilmė yra Brassicaceae, o manoma, kad atspaudai atsirado anksti žinduolių kilmės 7 .

Pagrindinis

Dėl įspausto Arabidopsis MEA geno, kuris koduoja su su Zeste [E (z)] susijusio baltymo stiprikliu, sutrikimo atsiranda embriono ir endospermo vystymasis ir per didelis proliferacija 4, 8 . Kartu su SWN ir CURLY LEAF ( CLF ) MEA sudaro E (z) tipo genų šeimą Arabidopsis 9, 10 . Norėdami gauti įžvalgos apie jų evoliucinius ryšius, mes ištyrėme, ar Arabidopsis E (z) tipo genai atsirado dubliuojant didelius genomo blokus 11 . MEA (At1g02580) yra neseniai išvestas SWN paralogas (At4g02020), esantis bloko dubliavimosi metu, apimant 39 paralogus 1 chromosomoje ir 41 paralogus 4 chromosomoje (1a pav.). Daugialypis dubliavimas, kuriame gyvena MEA ir SWN paralelai, atsirado maždaug prieš 35–85 milijonus metų (Myr) dėl viso genomo dubliavimosi Brassicaceae linijoje 11, 12, 13 . Priešingai, CLF genas (At2g23380) yra genominiame regione, kuris neturi netiesiškumo su regionais, kuriuose yra SWN ir MEA , nei Arabidopsis (1a pav.), Nei ryžiai (duomenys nepateikti).

Image

a, įspaustas MEA genas ir jo paralelinis SWN guli ant dubliuotų blokų, kurių atitinkamai yra 0, 457 megabazės (Mb) ir 0, 690 Mb, atitinkamai 1 ir 4 chromosomose. Paragono blokas apima 39 paralelinius genus (mėlynuosius blokus), įskaitant MEA , 1 chromosomoje ir 41 paralogą, įskaitant SWN , 4 chromosomoje. CLF yra 2 chromosomoje genomo srityje, neturinčioje kolineariškumo su MEA ir SWN. paragono blokai. b) E (z) - panašių genų filogenetinė analizė aukštesniuose augaluose. Medis buvo pagamintas kartu su protml paketu ir įsišaknijęs CLF - SWN dubliavimui. c, MEA filogenetinis medis ir dviskilčių rūšių SWN tipo genai. Medžio topologija buvo gauta naudojant protml, o šakos ilgis (pakaitai vienam kodonui) buvo apskaičiuotas naudojant codeml naudojant M0 modelį. Skaičiai virš šakų rodo ω- santykį ir jie buvo apskaičiuoti naudojant laisvojo santykio modelį. Atminkite, kad medis nėra šaknis.

Visas dydis

Norėdami toliau tirti šias dubliavimus, į filogenetinę analizę įtraukėme visus žinomus augalų E (z) tipo genus (1b pav.). CLF ir SWN tipo genų buvimas tiek vienaląsčiuose, tiek dviskilčiuose rodo CLP ir SWN bei MEA bendro protėvio atskyrimą prieš šių taksonų skirtumą ∼ 200 Myr. Sutikdami su dubliavimo dubliavimo duomenimis, nerastume tiesioginių MEA ortologų (priešingai nei MEA, ir SWN koortoologai ) turimose sekose (įskaitant išreikštas sekų žymes) iš kitų rūšių, išskyrus Arabidopsis thaliana. Tačiau gavome ir MEA, ir SWN ortologus Arabidopsis lyrata (papildomas 1 pav.). Visi ankstesni augalų E (z) tipo genų filogenetiniai tyrimai parodė, kad MEA yra pagrindinis CLF ir SWN 6, 10, 14, 15, 16, 17 pogrupis . Priešingai, mūsų duomenys rodo seną CLF ir MEA / SWN linijų dubliavimąsi, o vėliau - naujausią dubliavimą, iš kurio susidarė MEA ir SWN (1b pav.).

Norėdami išanalizuoti E (z) tipo genų funkcinį įvairinimą Arabidopsis tyrime , jų raišką ir funkcijas reprodukcinio vystymosi metu. MEA yra išreikštas embriono maišelio sinergiduose, kiaušiniuose ir centrinėse ląstelėse prieš apvaisinimą, o embrionuose ir endosperme - sėklos vystymosi metu 5 . Norėdami nustatyti, ar MEA , SWN ir CLF embriono maišelyje ir besivystančioje sėkloje nėra persidengiančių raiškos modelių, atlikome lyginamąją in situ hibridizacijos analizę, naudodami genui specifinius zondus (2 pav. Ir papildomas 2 pav.). Nors trys genai iš esmės sutampa su raiškos modeliais, yra svarbių skirtumų: sinergiduose ir kiaušinių ląstelėse buvo aptikti visi trys nuorašai (2a pav., C, e); tačiau SWN raiška buvo smarkiai sumažinta, o CLF - neaptinkama centrinėje ląstelėje, palyginti su MEA , kuri parodė stiprią išraišką (2a pav.). Šis skirtumas buvo išlaikytas ankstyvojo sėklų vystymosi metu, kai laisvojo branduolio endosperme buvo aptikta MEA (papildomas 2a pav.), Bet SWN ir CLF nebuvo (papildomas 2e, i pav.). Po apvaisinimo buvo aptikti visų trijų genų nuorašai rutuliniame embriono ir mikropoliariniame endosperme, tik suspensijoje aptikti MEA nuorašai (2b, d, f pav.). Visų trijų genų ekspresija sumažėjo širdies stadijoje (duomenys nepateikti) ir torpedos stadijos embrionuose jų nebebuvo galima aptikti (papildomas 2o pav., S, w). Taigi, palyginti su savo paragonais SWN ir CLF , MEA turi diferencinę ekspresijos sritį centrinėje ląstelėje ir laisvojoje branduolio endosperme, taip pat suspensore, abu audiniai, kaip manoma, dalyvauja maistinių medžiagų perkėlime į besivystantį embrioną.

Image

a, b, skyriai tiriami anti-sense MEA . c, d, skyriai zonduojami naudojant antissens SWN . e, f, skyriai buvo tiriami naudojant antissens CLF . a, c, e, MEA ( a ), SWN ( c ) ir CLF ( e ) nuorašai kaupiasi sinergiuose (sy) ir kiaušialąstelėse (ec), tuo tarpu centrinėje ląstelėje (cc) tik MEA yra išreikšta stipriai. . b, d, f, MEA , SWN ir CLF nuorašai buvo aptikti apvaliajame embrione ir mikropoliariniame endosperme (mce). b ) Globuliniame etape MEA nuorašai aptinkami suspensore (su), priešingai nei SWN ir CLF . Stiprus endotelio dažymas yra artefaktas, stebimas ir jutimo kontrolės priemonėse. Dėl jutimo kontrolės ir išsamesnio MEA , SWN ir CLF raiškos modelių aprašymo embriono maišelyje ir besivystančioje sėkloje žr. Papildomą 2 pav.

Visas dydis

MEA ir kitų „ TRISLINIMO NEPRIKLAUSOMOS SĖKLOS“ ( FIS ) klasės genų mutacijos rodo būdingus prieš ir po apvaisinimo vykstančius fenotipus: endospermo proliferacija nesant tręšimo ( fis fenotipas) ir motinos poveikis sėklų abortui 4, 18, 19, 20, 21 . Kadangi MEA yra motiniškai išreikštas įspaustas genas, Arabidopsis mea mutantuose motinos poveikio sėklų abortas gali vykti heterozigotinėse sėklose, kurios iš motinos paveldėjo mutantinį mea alelį, tačiau turi laukinio tėvo MEA alelio, kuris nėra išreikštas. Norėdami patikrinti, ar A. lyrata MEA ortologo tėvo aleliai taip pat nėra ekspresuojami sėklomis, mes išanalizavome motinos ir tėvo MEA alelių santykinius ekspresijos lygius sėklose, susidarančius kryžminant tarp A. thaliana ir A. lyrata (kaip žiedadulkių tėvų) ). Panašiai kaip įspaustas MEA lokusas A. thaliana , MEA ortologas A. lyrata nėra išreikštas iš tėvo alelio besivystančiose sėklose (1 papildoma lentelė). Šis rezultatas atitinka mūsų išvadas, kad paterniškai paveldėtas A. lyrata MEA alelis negali išgelbėti mea sėklos aborto fenotipo (duomenys nepateikti), ir rodo, kad MEA įspaustas abiejose seserų rūšyse - A. thaliana ir A. lyrata .

Kadangi MEA rodo sutampančią SWN ir CLF raiškos struktūrą, mes išbandėme, ar embriono maišelyje, ar sėklos vystymesi nenukenčia swn ar clf mutantai. Neseniai buvo parodyta, kad SWN ir MEA atlieka nereikalingą funkciją prieš pradedant tręšti fis fenotipu 22 . Atvirkščiai, mūsų atlikta vien tik pasėtų ir Clf mutantų analizė neparodė nei sėklų vystymosi po apvaisinimo, nei mea sėklos aborto fenotipo sustiprėjimo (2 papildoma lentelė). Kaip nusėtas ; dvigubi mutantai su clf taip pat gamina normalias sėklas 6, šie rezultatai rodo, kad nei SWN, nei CLF neturi įtakos sėklos vystymuisi. Kadangi nei SWN, nei CLF nėra būtinos sėklų vystymuisi po apvaisinimo, siūlome, kad naujas MEA vaidmuo po apvaisinimo sėklų vystymuisi būtų įgytas praeityje ∼ 35–85 m.

Mes taip pat pasiūlėme, kad MEA baltymų seka greitai išsivystytų atsiradus dėl aminorūgščių pakeitimų, susijusių su selekcija. Priešingai, SWN būtų išsaugojęs protėvių funkciją ir tikimasi, kad jis vystėsi gryninant atranką. Mes ištyrėme neofunkcionalizacijos hipotezę ištyrę, ar nesinoniminių ( d N ) ir sinoniminių ( d S ) divergencijos 23 santykis ω = d N / d S yra didesnis linijinės protėvių MEA atžvilgiu nei SWN (1c pav. ). E (z) - kaip tuopų ir petunijų genai - prieš SWN - MEA dubliavimąsi ir buvo priimti kaip ortologai, sensu ref. 24. Dviejų santykio šakų modelis, įvertinantis vieningą ω santykį šakose, vedančiose proortologus ir SWN (atspindinčias funkcijų išsaugojimą), ir antrasis ω santykis MEA (leidžiančioje funkcijų įvairinimą), suteikė reikšmingą reikšmingą reikšmę. geriau tinka duomenims, nei vieno santykio modelis su vienu ω -santykiu visai filogenijai ( P <0, 0001; 3 papildomoji lentelė). Trijų ir laisvojo santykio modeliai nebuvo geresni už dviejų santykių modelį ( P > 0, 05), o tai rodo, kad daugiausia atrankinio suvaržymo skirtumų atsirado po SWN ir MEA skirtumų.

Kadangi E (z) tipo baltymai susideda iš konservuotų ir skirtingų domenų mozaikų, mes analizavome, kurios aminorūgšties liekanos išsiskyrė teigiamos atrankos metu funkcinės diversifikacijos metu, naudodamos šakos vietos modelius (papildoma 4 lentelė). Ši analizė nerodė teigiamo SWN atrankos įrodymų ( P = 0, 99), tačiau buvo labai reikšminga MEA ( P <0, 0001). Įvertinta, kad teigiamai parinktų kodonų MEA protėvių šakoje ω- santykis yra 1, 68, o tai skiriasi nuo neutralaus modelio, kurio ω yra fiksuotas iki 1, 00 ( P = 0, 026). Todėl aukštas ω santykis atsiranda ne dėl sušvelnintų apribojimų, o dėl teigiamo MEA pasirinkimo. 74 kodonai, kurių užpakalinė teigiamos selekcijos tikimybė yra> 0, 95, yra išdėstyti visoje kodavimo sekoje (papildomas 3 pav.), Kas rodo, kad teigiamas atranka neapsiribojo jokiu konkrečiu MEA baltymo domenu. Daugybė aminorūgščių intarpų ir delecijų taip pat gali prisidėti prie funkcinių skirtumų.

Arabidops genties sudėtyje MEA , bet ne SWN , toliau vystosi esant teigiamam atrankai. MEA poros ω (ω = 0, 75) santykis A. thaliana ir A. lyrata yra didesnis nei SWN ( ω = 0, 25, P <0, 0001; 5 papildoma lentelė). Laisvojo santykio modelis (1c pav.) Rodo, kad MEA vystosi esant teigiamai atrankai šakoje, vedančioje į A. lyratą ( ω = 2, 90), bet ne į A. thaliana šaką ( ω = 0, 10). Keturių proporcijų modelis su nepriklausomais t-santykiais A. thaliana ir A. lyrata MEA genais suteikia geresnį duomenų prieinamumą nei trijų santykių modelis, turintis vieną ω santykį abiem šakoms (2 = 6, 0, laipsniai laisvė = 1, P = 0, 014; 1c pav.), palaikanti teigiamą atranką A. lyrata šakoje. SWN skirtumų tarp A. thaliana ir A. lyrata testas nebuvo reikšmingas (duomenys nepateikti).

Šie rezultatai rodo, kad MEA dalyvauja genominiame konflikte A. lyrata , bet ne A. thaliana linijoje, kur stebimi panašūs SWN ( ω = 0, 09) ir MEA ( ω = 0, 10) ti santykiai (1c pav.) . Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes išanalizavome intraspecifinį sekos kitimą MEA ir SWN genuose A. thaliana ir MEA A. lyratoje ir jos artimame, taip pat ir kertančiame giminaičiui A. halleri (6 papildoma lentelė). A. thaliana mėginyje bendra nukleotidų įvairovė π yra 1, 5 karto didesnė MEA (0, 0037) nei SWN (0, 0022) ir mažesnė už viso genomo vidurkį (0, 007) 25 . Nesinoniminių ir sinoniminių polimorfizmų, π N / π S, santykis MEA (0, 259) yra panašus kaip SWN ( 0, 183 ) ir mažesnis nei 1, o tai rodo gryninantį pasirinkimą. Keli neutralios evoliucijos testai nepateikė teigiamo A. thaliana atrankos įrodymų (6 papildoma lentelė); atrodo, kad abu lokai vystosi neutraliai, laikydamiesi panašių evoliucijos suvaržymų. A. lyrata ir A. halleri panašūs MEA modeliai (6 papildoma lentelė). Π N / πS santykis yra atitinkamai 1, 25 ir 0, 58 A. lyrata ir A. halleri . Polimorfizmo lygis yra tame pačiame intervale, kaip ir stebint A. thaliana , tačiau žemas, palyginti su kitais A. lyrata genais, esančiais toje pačioje chromosomoje. Neutralios evoliucijos testai nėra reikšmingi, nors abiejose rūšyse yra šiek tiek daugiau nei vidutinio dažnio polimorfizmai (Tadžimos D > 1).

Teigiamas MEA darinistinis pasirinkimas, atsirandantis linijoje, vedančioje į A. lyrata, bet ne į A. thaliana , ir aukštas π N / π S, atitinka tėvų konfliktinę hipotezę dėl įspaudų raidos. Savaime tręšiančios A. thaliana tikimės, kad skirtingas selektyvus motinos ir tėvo alelių slėgis, kontroliuojantis išteklių paskirstymą motinai ir palikuonims (pvz., MEA ), bus silpnesnis. Kadangi intraspecifinės sekos kitimo modeliai neatmeta neutralaus modelio nei veisimosi, nei perėjimo tarp rūšių gyvūnams, selektyvusis MEA slėgis gali būti silpnas.

Žinduoliuose įspaustos genų grupės gali būti sujungtos viena ar keliomis protėvių chromosomomis, teigiančiomis dėl bendros mechanistinės įspaudimo kilmės pradžios žinduolių evoliucijos pradžioje 7 . Priešingai, MEA įspaudimas E (z) tipo genų šeimoje atsirado vėlyvame žydinčių augalų evoliucijos etape, nes į MEA panašūs genai yra tik Brassicaceae. Mes siūlome, kad MEA būtų įspausta po to, kai ji atsirado dėl dvigubo dubliavimo, galbūt todėl, kad įgijus naują funkciją, reikėjo kompensuoti dozę. SWN ir CLF daigams būdingas augimą reguliuojantis poveikis, kurį parodo nenormalus sėjos augimas; clf dvigubi mutantai po sudygimo. Mūsų E (z) tipo genų evoliucijos, funkcijos ir išraiškos tyrimai rodo, kad MEA įgijo naują funkciją reguliuojant augimą sėklos vystymosi metu. Griežtas MEA išraiškos lygio reguliavimas apvaisinimo metu yra esminis dalykas normaliam vystymuisi 26 . Todėl po dubliavimo įvykio gali reikėti pakoreguoti MEA ir SWN veiklos dubliavimo lygį. Gali būti pasamdyta jau egzistuojanti įspaudimo mašina, leidžianti sureguliuoti MEA raiškos lygius, o tai paskatino pastaruoju metu išsivysčiusį MEA lokuso reguliavimą naudojant genomo įspaudus.

Metodų santrauka

Augalinė medžiaga

A. thaliana mea-1 ir swn-3 mutantai, naudojami vienkartiniams ir dvigubiems mutantams analizuoti, anksčiau buvo aprašyti 4, 6 . „ Swn-4“ mutantas yra „SIGNAL“ įterpimo linija SALK_109121 27 . A. lyrata ir A. halleri prieigas pateikė T. Mitchell-Olds, M. Clauss ir R. Oyama.

Išraiškos analizė

Embriono maišelio ir ankstyvųjų sėklinių audinių hibridizacija in situ buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau 5 . Buvo naudojami juostiniai bandymai, sukurti iš labiausiai skirtingų MEA , SWN ir CLF genų sekų sričių. A. lyrata tėvo MEA alelio ekspresijos analizė besivystančioje sėkloje buvo atlikta naudojant F 1 sėklą iš kryžių tarp A. thaliana ir A. lyrata (kur A. lyrata buvo naudojama kaip žiedadulkių pradinė dalis ) ir kiekybinę polimerazės grandininę reakciją atvirkščiai. kiekvienos rūšies MEA nuorašo specifiniai transkripcijos (qRT – PGR) zondai 26 .

Sekos analizė

MEA ir SWN genų, surinktų iš A. lyrata ir A. halleri, DNR sekos buvo atliktos didelio tikslumo PGR amplifikacijomis iš dalies sutampančių fragmentų iš genominės DNR ir seka penkis nepriklausomus klonus kiekvienam PGR amplifikuotam fragmentui. DNR sekos duomenys iš A. thaliana prisijungimų buvo pagrįsti tiesioginiu didelio tikslumo PGR amplifikuotų fragmentų sekos nustatymu.

Filogenetinės ir molekulinės evoliucijos analizės

Filogenetinė analizė buvo pagrįsta visomis CLF , SWN ir MEA sekomis, gautomis atlikus BLAST paieškas „GenBank“. Baltymų sekos buvo suderintos su CLUSTALW programa ir filogenetinis medis, sukonstruotas naudojant MOLPHY paketo protml programą 28 . Ω- santykio analizė buvo atlikta naudojant PAML paketo „codeml“ programą 29 . Molekulinės populiacijos genetinė analizė buvo atlikta naudojant „DnaSP“ programą 30, remiantis sekų duomenimis iš priedų, išvardytų 7 ir 8 papildomose lentelėse.

Internetiniai metodai

Germplasm, DNR seka, mutantai ir kryžmai

Šiame tyrime naudojamas mea-1 mutantas (L er -0) turi Ds intarpą MEA geno SET srityje (At1g02580) ir buvo aprašytas anksčiau 4 . Heterozigotinės arba homozigotinės mea-1 linijos buvo identifikuotos atliekant PGR genotipą, naudojant pradmenų derinius Ds5-1 / AS13 (yra mea-1 ) ir S20 / AS13 (yra MEA ), kaip aprašyta anksčiau. Swn / eza1 alelis ( swn-3 ), naudojamas vienkartiniam ir dvigubam mutantams analizuojant sėklų aborto po apvaisinimo fenotipą, buvo mutantų linija (SALK_050195 Col-0 fone) iš SIGNAL kolekcijos 27, kurioje yra intarpas. 15 egzonas EZA1 / SWN geno SET domene 6 . Panaudotas swn-4 alelis atitinka SIGNAL įterpimo liniją SALK_109121, kur T-DNR intarpas yra SWN geno 8 egzone . Clf-2 alelis buvo gautas iš J. Goodrich. Norėdami sukonstruoti dvigubus mea-1 ir swn-3 mutantus, mea-1 homozigotinės linijos žiedadulkės buvo naudojamos apdulkintiems swn-3 heterozigotiniams augalams ir F1 sėklų palikuonims, atrinktiems MS terpėje, turinčioje kanamicino. F 1 palikuonys, kurie buvo dvigubi heterozigotai ( mea-1 / MEA; swn-3 / SWN ), buvo identifikuoti atliekant PGR genotipą ir paimti į save, kad būtų sukurti F 2 palikuonių segregatai. Norint nustatyti genotipus tarp F 2 segregatų, buvo naudojamas PGR genotipas. A. lyrata ( Bish Bash) prisijungimą, naudotą kryžiams ir MEA bei SWN ortologų sekai nustatyti, pateikė T. Mitchell-Olds. A. lyrata ir A. halleri priedus molekulinės populiacijos genetiniams tyrimams pateikė M. Clauss ir R. Oyama.

Hibridizacija in situ

Hibridizacija in situ buvo atlikta, kaip aprašyta 5, 31, 32, su modifikacijomis. A. thaliana augalų subrendusios gėlės ir silikatai buvo pritvirtinti 4% paraformaldehidu ir įterpti į „Paraplast Plus“ (Sigma). 10 μm storio dalys buvo supjaustytos „Leica“ mikrotomu (Leica RM 2145), pritvirtintu ant „ProbeOnPlus“ stiklelių („Fischer Biotech“). Sekcijos 30 minučių suardomos proteinaze K, 37 ° C temperatūroje, veikiamos acto rūgšties anhidridu, džiovinamos etanolyje, po to hibridizuojamos 11-digoksigeniinu-UTP (DIG) paženklintais zondais per naktį 55 ° C temperatūroje. Po plovimo 0, 2 × SSC 55 ° C temperatūroje, skaidrės buvo paruoštos atskleisti DIG antigeną. Tai buvo blokavimas DIG blokuojančiu reagentu ir BSA, po to inkubavimas su anti-DIG antikūnais, konjuguotais su šarmine fosfataze (Roche Diagnostics), plovimas blokuojančiu reagentu, po to spalva paaiškėjo inkubuojant NBT ir X-fosfatu 16 - 16 laikotarpių. 18 val. Reakcijos buvo sustabdytos TE buferiu (10 mM, pH 8, 0), po to įdėtos į TE / glicerolį (1: 4 v / v) prieš žiūrint. Hibridizavimui in situ naudojami riboprobai buvo susintetinti iš RT – PGR produktų, naudojant pradmenis, suprojektuotus remiantis turimais sekos duomenimis. Genai buvo CLF (At2g23380), SWN (At4g02020) ir MEA (At1g02580). Šie zondai buvo sukurti taip, kad apimtų analizuojamų genų kodavimo sritį ir išvengtų kryžminės hibridizacijos. DIG paženklintų zondų, kuriuose yra jutimai ir antisensenai, sintezei 350-bp fragmentai buvo klonuoti pBluescript SK-vektoriuje kiekvienam iš analizuotų genų. Hibridizacijos zondo projektavimui labiausiai išsiskyrę MEA , SWN ir CLF regionai buvo identifikuoti pagal „ClustalX“ sulygiuojant kiekvieno geno koduojančią seką. In situ zondo konstravimui pasirinkti šie skirtingi regionai: SWN (355–606 bp pasroviui nuo pradinio kodono Messenger RNR); MEA (608–955 bp pasroviui nuo pradinio kodono, mRNR); ir CLF (33–364 bp pasroviui nuo pradinio kodono mRNR). Šių sričių amplifikacijai ir klonavimui į ekspresijos vektorių (pBluescript SK-) riboprobo sintezei buvo naudojamos pradmenų poros: SWN ( SWN egzonas 4F, 5′-GCAGAAATTTGAGGCTAATAG-3 ′ ir SWN egzonas 4R, 5′-CCAGGTAGTGTATGGCGG-3 ′) ); MEA ( MEA in situ F, 5′-CGGTTGGGCCAGGACTATGG-3 ′ ir MEA in situ R, 5′ – CTTCTGTCACACTCCTCACC-3 ′); CLF ( CLF in situ F, 5′-CACCAGATCGGAGCCACC-3 ′ ir CLF in situ R, 5′-GACAGGGACACTAGATCC-3 ′). Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta naudojant AMV atvirkštinę transkriptazę (Clontech) ir bendrą RNR (1 μg), ekstrahuotą iš A. thaliana silikatų, naudojant triazolą (GIBCO-BRL).

A. lyrata tėvo MEA alelio ekspresijos analizė besivystančiose sėklose

Kryžminimai buvo atlikti tarp A. thaliana ir A. lyrata, kaip žiedadulkių. RNR buvo išgaunama tam tikrais laiko momentais prieš apdulkinimą arba po jo, naudojant trizolį, ir MEA nuorašų kaupimasis buvo matuojamas naudojant kiekybinį realaus laiko RT – PGR, kaip aprašyta anksčiau 26 . Kiekybinės transkripcijos lygių analizės buvo atliktos naudojant Taqman realaus laiko PGR tyrimus (Applied Biosystem). Kiekvienam cDNR mėginiui buvo atlikti trys PGR pakartojimai, o unikalaus amplifikacijos produkto specifiškumas ir kiekis buvo nustatyti pagal gamintojo instrukcijas (Applied Biosystems). Norėdami atskirti motinos ( A. thaliana ) ir tėvo ( A. lyrata ) MEA nuorašus, mes naudojome zondus, kurie specialiai atpažįsta skirtingus alelius. Visuose eksperimentuose stenogramos lygis buvo normalizuotas iki ACTIN-11 lygio, kuris yra išreikštas sėklos gametofitais ir zigotiniais produktais (embrionu ir endospermu), bet ne aplinkiniuose motinos audiniuose 33 . Praėjus 4 dienoms po apdulkinimo ( dap ), ACTIN-11 lygis sumažėja ir jo negalima naudoti normalizavimui (duomenys nepateikti). Realaus laiko tyrimui buvo naudojami šie pradmenys: (1) nustatant MEA alelį iš A. thaliana ( MEA-At ), į priekį 5′-TCTGATGTTCATGGATGGGG-3 ′; atvirkštinė 5′-GGTAGGAAGAACCAATCCGATCT-3 ′; zondas VIC 5′-TCACTCATGATGAAGCTAA-3 ′ MGB (ABI); (2) norint nustatyti MEA alelį iš A. lyrata ( MEA-Al ), į priekį 5′-ATCAAGGTTGTGTTTTTAATAAAGAGGC-3 ′; atvirkštinė 5′-CAGCTGGCTACTTTTGATGAAGAC-3 ′; zondas FAM 5′-ACCTTCCAGTTGTTGAGC-3 ′ MGB (ABI).

MEA ir SWN ortologų DNR sekos nustatymas A. lyrata ir A. halleri

Iš pradžių A. lyrata ( Bish Bash) MEA ir SWN genų sekos buvo nulemtos didelio tikslumo PGR amplifikacija iš dalies sutampančių fragmentų iš genominės DNR ir seka penkis nepriklausomus klonus (pGEM) kiekvienam PGR amplifikuotam fragmentui. Panaudotos pradmenų poros buvo sukonstruotos taip, kad būtų būdingos MEA arba SWN genams. MEA sekos nustatymui naudojami A. lyrata ir A. halleri prisijungimai nurodyti 8 papildomoje lentelėje. MEA geno amplifikavimui iš A. lyrata ir A. halleri prisijungimo buvo naudojamos šios sutampančios pradmenų poros. MEA ORF: MEA-F1 / MEA-R1, MEA-F2 / MEA-R2, MEA-F3 / MEA-R3, MEA-F4 / MEA-R4, MEA-F5 / MEA-R5, MEA-PF / MEA-PR, MEA-P1 / MEA-P2, MEA-P3 / MEA-P4. Norint amplifikuoti SWN ORF iš A. lyrata, buvo naudojamos šios sutampančios pradmenų poros: SWN-F1 / SWN-R1, SWN-F2 / SWN-R2, SWN-F3 / SWN-R4, SWN-F4 / SWN-R5. Gruntų sekos yra išvardytos papildomoje S9 lentelėje.

Filogenetinė analizė

Filogenetinė analizė buvo pagrįsta visomis CLF , MEA ir SWN tipo sekomis, gautomis atlikus BLAST paieškas „GenBank“. Medžio statybai naudojami baltymų ir genų ID buvo šie: A. thaliana , MEA (NP_563658 / NM_100139), SWN / EZA1 (AAL90954 / AY090293), CLF (AAC23781 / AC003040); A. lyrata , MEA (bankit835839), SWN / EZA1 (bankit842314); Zea mays , MEZ1 (AAM13420 / AF443596), MEZ2 (AAM13421 / AF443597), MEZ3 (AAM13422 / AF443598); „Oryza sativa“ , SET1 (AAN01115 / AF407010), EZ1 ( O. s. Indica ) (CAD18871 / AJ421722), CLF ( O. s. Japonica ) (NP_910690 / NM_185801), EZ1 ( O. s. Japonica ) (BAD69169 / AP005813 ); „Petunia x Hybrida“, PHCLF1 (BAC84950 / AB098523), PHCLF2 (BAC84951 / AB098524), PHCLF3 (BAC84952 / AB098525). Tuopų sekos buvo gautos ieškant tuopų genomo duomenų bazės JGI (//genome.jgi-psf.org/Poptr1/Poptr1.home.html) (baltymų ID: EZA1-like1, 731686; EZA1-like2, 348349; CLF) -like1, 719252; CLF-like2, 694432). Baltymų sekos buvo suderintos su CLUSTALW programa ir filogenetinis medis buvo sukonstruotas naudojant MOLPHY paketo protml programą, įgyvendinančią maksimalios tikimybės metodą 28 . Buvo naudojama „greito pridėjimo OTU paieškos“ strategija su JTT pakeitimo matrica ir buvo išsaugoti šeši geriausi medžiai. Vėliau kiekvienas medis buvo pakeistas ir iš naujo optimizuotas (vietinio pertvarkymo paieška), o paskutinės paieškos metu buvo apskaičiuotas šakos ilgis ir vietinės įkrovos tikimybės (LBP), todėl medis su didžiausia tikimybe, parodyta 1c pav.

Natūraliosios atrankos evoliucinė analizė ir testai

Santykis ω = d N / d S - su d N kaip nesinoniminių pakaitų skaičių vienoje nesinoniminėje vietoje ir dS kaip su sinoniminių pakaitų skaičiumi vienoje sinoniminėje vietoje - buvo naudojamas norint patikrinti, ar baltymus koduojančios sekos vystosi pagal teigiama darvinizmo atranka 34 . Analizės buvo atliktos naudojant PAML 29 paketo „codeml“ programą, kurioje naudojamas maksimalus parametrų tikimybės įvertinimas. Norint patikrinti teigiamą ar gryninantį atranką, buvo įvertinti estimated santykiai skirtingose ​​koduojančių sekų vietų klasėse. Tada šio įvertinimo tikimybė buvo palyginta su kitų modelių, turinčių skirtingą parametrų skaičių, tikimybe. Tikimybių santykio testas buvo taikomas apskaičiuojant bandymo statistiką kaip dvigubą dviejų tikimybių skirtumą (2δ = 2 ( l 1 - l 2 )); kritinės vertės buvo ieškomos table 2 lentelėje su laisvės laipsniais, apskaičiuotais kaip kiekvieno modelio įvertintų parametrų skirtumas. Buvo išanalizuoti dviejų tipų modeliai. Šakų modeliai leidžia skirtingas ω- santykį skirtingose ​​filogenijos šakose ir gali būti naudojami nustatant, ar baltymų atrankos slėgis yra įvairus rūšių ar genų šeimos paralelių atžvilgiu. Mes naudojome šakų modelius su vienu (M0 modelis), dviem, trim, keturiais arba n (bendras šakų skaičius; laisvojo santykio modelis) ω- santykiai 35 . Antroji analizuotų modelių rūšis buvo šakos modeliai 34 . Šie modeliai leidžia patikrinti, ar tam tikroje filogenijos šakoje ('priešakinėje šakoje') kodonų pogrupyje buvo teigiama atranka, darant prielaidą, kad dviejų kodonų tipai yra 0 < ω <1 ir ω = 1 visame medyje ir papildoma kodonų klasė, kai ω > 1 priekiniame plane. Įvertinus ω- santykį, buvo naudojamas Bayjaus empirinis Bajeso algoritmas, skirtas nustatyti aminorūgščių liekanas, kurių užpakalinė tikimybė yra ω 1. Tarp galimų šakų modelių, mes panaudojome ref. 35, norėdami patikrinti, ar naujai dubliuotų genų funkcinę diversifikaciją paskatino teigiama atranka.

A. thaliana , A. lyrata ir A. halleri skirtingų prisijungimų sekos analizė

SWN ir MEA genų sekos buvo amplifikuotos iš 21 skirtingo A. thaliana kolekcijos prisijungimo (7 papildoma lentelė), naudojant sutampančius PGR pradmenis (9 papildoma lentelė). PGR produktai buvo tiesiogiai sekami naudojant automatinį ABI 3730xl sekoserį, naudojant dažų terminatoriaus chemiją. Sekos duomenys buvo surinkti ir suderinti su automatizuotu sekų analizės vamzdynu, kaip aprašyta 36 . MEA genas taip pat buvo gautas iš devynių asmenų, kilusių iš geografiškai tolimų A. lyrata populiacijų, ir iš dešimties asmenų iš artimo giminaičio A. halleri (8 papildoma lentelė). Didelio tikslumo PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant „Phusion High-Fidelity PCR Kit“ (FINNZYMES) ir sutampančius PGR pradmenis, aprašytus A. lyrata sekos nustatymui. Pirmasis PGR amplifikacijų rinkinys buvo tiesiogiai sekuotas, o antrasis nepriklausomų PGR amplifikacijų rinkinys buvo klonuotas prieš sekos nustatymą. Trumpai tariant, atlikus A-uodegos pakopą, PGR produktai buvo klonuoti į pGEM-T lengvą vektorių, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis (Promega). Kiekvienam PGR fragmentui sekos buvo suskaidytos dviem nepriklausomais klonais (Macrogen Inc.). Visos MEA geno sekos buvo analizuojamos naudojant DNASTAR programinės įrangos paketą (DNASTAR). Visi polimorfizmai buvo patikrinti vizualiai. Molekulinės populiacijos genetinė analizė buvo atlikta naudojant „DnaSP“ programą 30 . Nukleotidų įvairovė buvo apskaičiuota kaip vidutinė porų nukleotidų įvairovė, π tot ir haplotipų įvairovė, kaip Hd 37 . Keli neutralios evoliucijos testai, kur buvo naudojami polimorfizmo duomenys. Tadžimos D 38 tiria, ar nėra žemo ar aukšto dažnio polimorfizmų, ir buvo apskaičiuota naudojant tyliuosius (sinoniminius kodavimo ir nekodavimo) polimorfizmus; H ref. 39 išanalizuotas išvestinių polimorfizmų dažnių spektras ir taip pat apskaičiuotas tyliaisiais polimorfizmais; McDonald – Kreitman testas 40 lygina nesinoniminių ir sinoniminių polimorfizmų bei fiksuotų skirtumų santykį; Hudsono – Kreitmano – Aguade'o testas buvo naudojamas norint patikrinti, ar abiejų genų polimorfizmo ir divergencijos santykis reikšmingai skyrėsi vienas nuo kito, ko tikimasi, jei atranka veikia vieną geną, bet ne kitą 41 .

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Šioje byloje yra papildomos lentelės S1-S9 ir papildomos figūros S1-S3 su legendomis.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.