Post-transliacinis l-fenilalanino inkorporavimas į α-tubulino c-galą kaip galima neuronų disfunkcijos priežastis | mokslinės ataskaitos

Post-transliacinis l-fenilalanino inkorporavimas į α-tubulino c-galą kaip galima neuronų disfunkcijos priežastis | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Citoskeletiniai baltymai
  • Mikrotubulės

Anotacija

α-Tubulino C galas patiria po transliacijos, ciklinę tirozinaciją / detirozinaciją, o vietoje tirozino gali būti įterptas L-fenilalaninas (Phe). Naudodami kultivuojamas pelių smegenų išvestas ląsteles ir antikūnus, būdingus Phe-tubulinui, mes parodėme, kad: (i) Phe inkorporacija į tubuliną yra grįžtamoji; ii) toks įsiskverbimas neįvyksta dėl de novo sintezės; iii) modifikuoto tubulino dalis yra reikšminga; (iv) Phe inkorporacija sumažina ląstelių dauginimąsi nepaveikdama ląstelių gyvybingumo; v) neurito atitraukimo greitis mažėja didėjant C-galo Phe inkorporacijos lygiui; (vi) šį slopinantį Phe poveikį neurito atitraukimui blokuoja kartu esantis tirozinas; vii) mikrotubulų dinamika sumažėja, kai Phe-tubulino lygis ląstelėse yra aukštas dėl eksogeninio Phe pridėjimo, ir grįžtama prie normalių verčių, kai Phe pašalinamas; be to, mikrotubulų dinamika taip pat sumažėja, kai ekspresuojamas Phe-tubulinas (plazmidės transfekcija). Yra žinoma, kad fenilketonurija (PKU) sergančių pacientų kraujyje labai padidėja Phe koncentracija. PKU būdingas smegenų disfunkcijos molekulinis mechanizmas nežinomas. Be žmogaus ir pelės ląstelių skirtumų, įsivaizduojama galimybė, kad Phe inkorporacija į tubuliną yra pirmasis įvykis (arba vienas iš pradinių įvykių) molekuliniuose keliuose, sukeliančiuose smegenų disfunkcijas, apibūdinančias PKU.

Įvadas

Mikrotubulėliai yra gijinės struktūros, randamos visose eukariotinėse ląstelėse, einančiose per visą citoplazmą ir sudarytas daugiausia iš tubulino, α- ir β-subvienetų sudaryto dimerinio baltymo. Daugybė svarbių ląstelių funkcijų apima mikrotubules. Teisinga mikrotubulų struktūra ir kinetinės savybės yra būtinos atliekant daugybę neuronų procesų, vykstančių smegenų vystymosi metu: mitozė, neuronų architektūra, teisingas vadovavimas, genėjimas, sinapsė ir laikinai bei erdvėje reguliuojamas įvairių krovinių, gabenamų molekuliniais varikliais ( pvz. , Miozinai, dyneinai), pristatymas., kinesinai) 1, 2, 3 . Daugybė ir tiksliai sureguliuotų biocheminių įvykių, kurie yra šių sudėtingų procesų pagrindas, yra kontroliuojami branduolinių ir išorinių signalų. Tubulino baltymo modifikacijos po transliacijos yra vienas iš reguliavimo veiksnių tipų. Aštuntajame dešimtmetyje mes aprašėme tirozino (Tyr) inkorporavimą į translaciją į tubulino α-subvieneto C galą. Α-tubulino grandinė yra biosintetinta Tyr kaip C-galinė aminorūgštis. Tyrimas, sujungtas su β-subvienetu ir sujungus į mikrotubules, pašalinamas tubulino karboksipeptidazės (TCP) būdu. Gaunant tubulino izospecifines rūšis, vadinamas Glu-tubulinu (arba detirozinuotu tubulinu), veikiant glutamino rūgštį (Glu) kaip C -termino aminorūgštis. Vykdydamas mikrotubulų ir (arba) tubulino pusiausvyros procesą, Gli-tubulinas patenka į nesusietą baseiną, kur jis greitai vėl tirozinamas tubulino tirozino ligaze (TTL). Šis po vertimo atliktas tubulino modifikavimas vadinamas „tirozinimo / detirozinimo ciklu“ 6 . Į tubuliną vietoje Tyr toje pačioje vietoje gali būti įterpti įvairūs Tyr analogai, įskaitant L-fenilalaniną (Phe), L-3, 4-dihidroksifenilalaniną (L-Dopa) 7, 3-nitro-tirozinas 8 ir azatyrosine 9 .

Fenilketonurija (PKU) sergantiems pacientams Phe koncentracija kraujyje yra 20–40 10, 11 didesnė nei normali. Šis padidėjimas atsiranda dėl fenilalanino hidroksilazės arba, kai kuriais atvejais, dėl pagrindinio fermento kofaktoriaus, trūkumo. PKU sukelia nenormalų smegenų vystymąsi ir protinį atsilikimą, išskyrus atvejus, kai naujagimis greitai gydomas dieta, kurioje mažai Phe 12 . Eksperimento su žiurkėmis PKU modelyje Rodriguezas ir Borisy 13 nustatė, kad smegenų tubulino procentas su Phe kaip C-galine aminorūgštimi buvo ~ 30%, tuo tarpu kontrolinių gyvūnų procentas buvo ~ 3%. Šie duomenys rodo, kad ši tubulino modifikacija yra susijusi su protinio atsilikimo geneze. Tačiau iki šiol jokiais tyrimais nebuvo tiriamas ryšys tarp šios tubulino modifikacijos ir smegenų disfunkcijos, pastebėtos žmonėms, sergantiems PKU.

Šis tyrimas buvo sutelktas į Phe inkorporacijos į α-tubulino C galą poveikį įvairiems ląstelių parametrams, kurie galbūt yra susiję su smegenų disfunkcija PKU pacientams. Kaip eksperimentinę sistemą panaudojome pelių neuronų išvestą ląstelių liniją (CAD) ir naujai sukurtą antikūną, specifišką fenilalaninuotam tubulinui (Phe-tubulinui). CAD ląstelės dauginasi, kai serumo yra kultūrinėje terpėje, ir diferencijuojasi (išskiria neuritus), kai serumas pašalinamas. Pakartotinis serumo pridėjimas prie diferencijuotų ląstelių skatina greitą neurito atsitraukimą 14 . Mes pastebėjome, kad Phe inkorporavimas į α-tubulino C-galą buvo susijęs su: (i) sumažėjusiu ląstelių proliferacijos greičiu; (ii) serumo sukeltų išaugintų ląstelių neuritų įtraukimo slopinimas (Tyr buvimas neutralizavo šį poveikį); (iii) sumažinta mikrotubulų dinamika augimo kūgiuose.

Rezultatai

Anti-Phe-tubulino antikūnų specifiškumas

Ankstesniuose mūsų tyrimuose dėl Phe įsitvirtinimo α-tubulino C gale mes panaudojome tirpius ekstraktus iš žiurkių smegenų ir radioaktyviai pažymėtą Phe 15 . Mūsų dabartiniais tikslais radioaktyviuoju ženklu pažymėtas Phe nebuvo naudingas tyrinėjant Phe inkorporavimą į gyvų ląstelių tubuliną dėl nepakankamo specifinio radioaktyvumo ir mažo tubulino kiekio auginamose ląstelėse. Vietoj to, buvo reikalingas antikūnas, specifinis Phe-tubulinui. Ankstesniuose tyrimuose mes panaudojome imunizacijos protokolą (aprašytą papildomoje medžiagoje), kuris sėkmingai sudarė triušių antiserumus nuo kitų antigenų. Tokiu būdu buvo sukurtas antiserumas (antikūnas), būdingas Phe-tubulinui (1 pav.). Tirpus žiurkių smegenų ekstraktas ( juosta SN ) buvo apdorotas karboksipeptidaze A, kad būtų pašalintas visas C-galinis Tyras, fermentas buvo slopinamas, o po to inkubuojamos dvi atskiros alikvotinės dalys, kad Tyr arba Phe būtų įterptas į α-tubulino C galą. Preparatų, kurių sudėtyje yra Tyr-tubulino ( 1 juosta ) arba Phe-tubulino ( 2 juostos ), alikvotinės dalys buvo atliktos Western blot tyrimu. Abu preparatai buvo teigiamai nuspalvinti anti-Total-tubulino antikūnais. 1 juostos buvo dažytos anti-Tyr-tubulino antikūnais, bet ne anti-Phe-tubulino antikūnais; priešingai, buvo ties 2 juostomis. Dažymas buvo slopinamas iš anksto inkubuojant anti-Phe-tubulino antikūną laisvu Phe, bet ne laisvu Tyr. Tirpiuose smegenų ekstraktuose yra trys tubulino izospecifinės rūšys: Tyr-, Glu- ir Δ2-tubulinas. Taigi mūsų naujasis anti-Phe-tubulino antikūnas yra labai specifinis; y. , atpažįsta Phe-tubuliną, bet ne Tyr-, Glu- ar Δ2-tubuliną ir kitus baltymus, esančius tirpiuose žiurkių smegenų ekstrakte.

Phe yra įtrauktas į tubuliną CAD ląstelėse

Norint įvertinti Phe įsiskverbimą į gyvų ląstelių tubuliną, CAD ląstelės buvo kultivuojamos nesant ar neturint 4 mM Phe 3 arba 24 valandas, po to atliktas Western blot tyrimas ir dažymas antikūnais, nukreiptais į Total-, Tyr-, Glu- ir Phe-tubulinas. Tiesiogiai vizualizuojant Western blotus, Phe-tubulino juosta (tik silpnai matoma 0 metu) padidėjo kaip inkubacijos laikas, tuo tarpu Tyr- ir Glu-tubulino juostos sumažėjo (1a pav.). Ši išvada buvo patvirtinta matuojant tubulino izospecifinį optinį tankį, standartizuotą Total-tubulinui. Po 24 val. Phe-tubulinas padidėjo ~ 12 kartų, o Tyr ir Glu-tubulinas sumažėjo atitinkamai ~ 20% ir ~ 40% (1b pav.). Šio Phe įsiskverbimo į CAD ląstelių tubuliną neužblokavo cikloheksimidas (1c pav.), Tai rodo, kad Phe buvimas tubulino C gale atsiranda ne dėl de novo tubulino biosintezės, o dėl aukščiau aprašyto posttransliacinio mechanizmo. Remdamiesi Western blotting ir densitometrijos matavimų rezultatais, mes sukūrėme standartinius viso-, Tyr- ir Glu-tubulino kreives. Phe-tubulino kiekis CAD ląstelėse po 48 valandų inkubacijos su 4 mM Phe buvo 46 ± 4% viso tubulino kiekio ir 4 ± 1% kontrolinės ląstelės vertės (2 pav.; 2 pried. 1 lentelė).

Image

Ląstelės buvo auginamos 0, 3 arba 24 valandas terpėje, kurioje yra 4 mM Phe, ir po to analizuojamos atliekant Western blot analizę antikūnais, nukreiptais į Phe-tubuliną (Phe-tubą), Tyr-tubuliną (Tyr-tubą), Glu-tubuliną (Glu -tubas) ir „Total-tubulin“ („Total-tub“). a ) Reprezentaciniai blotai. b ) Kiekvienos tubulino izosopos optinis tankis buvo standartizuotas, palyginti su viso tubulino kiekiu. Pateikti duomenys yra vidurkis ± SD. ( c ) Ląstelės buvo inkubuojamos 3 valandas, esant (+) arba neturint (-) 4 mM Phe ir 100 μM cikloheksimido, ir analizuojamos Western blot metodu.

Visas dydis

Phe inkorporavimas į translaciją į α-tubulino C-galą yra grįžtamas

Norėdami nustatyti, ar Phe inkorporavimas į C tubulino galą buvo grįžtamas, mes kultivavome CAD ląsteles kintama diena iš dienos, kai trūko 4 mM Phe, ir kontrolė buvo lygiagreti Phe neturinti kultūra. Ląstelės buvo renkamos kiekvieną dieną ir analizuojamos atliekant Western blot analizę su anti-Phe-, anti-Tyr-, anti-Glu- ir anti-Total-tubulino antikūnais. Kiekybinė juostų analizė po pradinės 24 val. Phe (+) terpėje parodė reikšmingą Phe inkorporavimą į α-tubulino C galą vietoje Tyr (2a pav.). Vėlesnis 24 valandų inkubavimas Phe (-) terpėje sumažino Phe-tubulino kiekį ir atitinkamai padidino Tyr- ir Glu-tubulino kiekį. Po 24 valandų inkubacijos Phe (+) terpėje atsirado nauja Phe inkorporacijos smailė. Šie radiniai rodo, kad į ląstelę patenkantis Phe yra inkorporuotas į α-tubulino C galą ir kad šis procesas yra grįžtamasis. Panašius rezultatus gavome naudodami C6 gliomos ląsteles (2b pav.), Kas rodo, kad Phe inkorporacijos grįžtamumas yra bendras reiškinys.

Image

( a ) CAD ląstelės buvo kultivuojamos pakaitomis esant / neturint 4 mM Phe, pradedant Phe (+) terpe. 1 dienos pabaigoje terpė buvo pakeista į Phe (-) terpę. 2 dienos pabaigoje terpė buvo pakeista į Phe (+) terpę. Phe-, Tyr-, Glu- ir Total-tubo lygiai buvo nustatyti atliekant Western blot analizę su specifiniais antikūnais 0, 1, 2 ir 3 dienomis. Kiekvienos tubulino izosopos optinis tankis buvo standartizuotas, palyginti su Total-tub. ( b ) C6 ląstelės buvo apdorotos ir išanalizuotos kaip a punkte, išskyrus tai, kad terpė buvo keičiama kas 2 dienas.

Visas dydis

Phe-tubulinas formuoja mikrotubules CAD ląstelėse

Norėdami ištirti galimybę, kad Phe-tubulinas gali būti polimerizuotas į mikrotubules, keletą dienų auginome CAD ląsteles skirtingomis sąlygomis tiek 4 mM Phe (+), tiek (-) terpėse. Tada ląstelės buvo fiksuotos šaltu metanoliu ir atlikta dviguba imunofluorescencinė analizė, naudojant antikūnus prieš Phe-tubuliną (raudonas dažymas) ir bendrą tubuliną (žalias dažymas). Konfokaliniai vaizdai parodė, kad Phe (-) kultūra iš esmės nepadėjo anti-Phe-tubulino antikūnų dažymo, tuo tarpu Phe (+) kultūra lėmė stiprų teigiamą mikrotubulų tinklo dažymą (3 pav.). Sujungti vaizdai parodė visišką Phe-tubulino ir Total-tubulino lokalizaciją. Šie duomenys rodo, kad Phe-tubulinas gali sudaryti citoskeletinius mikrotubules be erdvinio pasirinkimo, palyginti su kitomis tubulino izospecifinėmis rūšimis.

Image

CAD ląstelės buvo kultivuojamos diferencijuotomis sąlygomis (be FBS), esant arba neturint 4 mM Phe, 24 valandas, ir po to pritvirtintos šaltu metanoliu. Citoskeletams buvo imuninis žymėjimas antikūnais, nukreiptais į Phe-tub (raudonas dažymas) ir Total-tub (žalias dažymas).

Visas dydis

Phe gydymas sulėtina CAD ląstelių dauginimąsi, nepaveikdamas ląstelių gyvybingumo

Phe apdorojimo poveikis CAD ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai buvo įvertintas auginant ląsteles, kai nebuvo arba nebuvo 4 mM ir 8 mM Phe, ir išmatuojant proliferacijos greitį Trypan Blue išskyrimo tyrimu 24, 48 ir 72 val. Ląstelių skaičius Phe (+) sąlygomis esant abiem koncentracijoms buvo mažesnis už kontrolinę vertę. Šis poveikis buvo akivaizdus per 48 valandas kultūros ir ryškesnis po 72 valandų (4 pav.), Rodantis, kad proliferacijos greitį sumažino aukšta Phe koncentracija.

Image

CAD ląstelės buvo pasėtos (2 × 104 ląstelių kiekviename 35 mm lėkštelėje), inkubuotos 24, 48 arba 72 valandas, nesant ar nebuvo 4 mM ar 8 mM Phe, dažytos Trypan Blue, perkeltos į Neubauerio kamerą, ir skaičiuojamas naudojant optinį apverstą mikroskopą. Pateikti duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD.

Visas dydis

Didelės koncentracijos gydymas Phe sulėtina neurito įtraukimąsi ir Tyrą blokuoja šis poveikis

Kadangi CAD ląstelių proliferacijos greitis buvo sumažintas apdorojant Phe, mes apsvarstėme galimybę, kad šis procesas turi įtakos ir kitoms ląstelių savybėms; ypač neuritų atitraukimas reaguojant į FBS. Ląstelės, auginamos 30 val. Diferencijavimo sąlygomis, buvo apdorotos 8 mM Phe, 8 mM Tyr, dviejų aminorūgščių deriniu arba tik nešikliu. Vėliau FBS buvo įpilama į terpę ir auginimas tęsiamas 15 min. Fotografijos buvo padarytos t = 0 ir t = 15 min., O bendras ląstelių skaičius ir neurito ilgis buvo išmatuoti, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Tipiniai vaizdai parodyti 5a pav. Kontroliuojant nešiklį (nepridėta Phe ar Tyr), pridėjus FBS ( 1 ir 1 ′ plokštės ), buvo pastebėta aiški neurito atitraukimas. Panašus neurito atitraukimas įvyko 8 mM Tyr (+) grupėje ( 2 ir 2 ′ plokštės ). 8 mM Phe (+) grupėje ( 3 ir 3 ′ plokštės ) labai slopino atitraukimą. Šį slopinantį 8 mM Phe poveikį atitraukimui blokavo kartu veikiantis 8 mM Tyr ( 4 ir 4 skydai ). Šie duomenys buvo patvirtinti kiekybinėmis neurito ilgio analizėmis aukščiau nurodytomis sąlygomis. Kai t = 15 min. Po FBS pridėjimo, neurito ilgis sumažėjo iki 15% pradinės vertės kontrolinėje grupėje, bet iki 40% pradinės vertės 8 mM Phe (+) grupėje (5b pav.). Tyrimą vėl blokavo slopinantis Phe poveikis; ty Phe / Tyr (+) grupės atitraukimas buvo panašus kaip kontrolinės grupės (5b pav.). Norėdami įvertinti galimą šių stebėjimų ryšį su Phe buvimu ar nebuvimu α-tubulino C-gale, išmatuojome Phe-tubulino kiekį atsitraukimo proceso pabaigoje įvairiomis eksperimentinėmis sąlygomis. Phe-tubulino buvo tik silpnai kontrolinėje ir Phe / Tyr (+) grupėse, tačiau gausu Phe (+) grupėje (5c pav.). Šie duomenys rodo, kad neurito įtraukimo slopinimas atsirado dėl Phe buvimo Tyr vietoje α-tubulino C gale CAD ląstelėse.

Image

CAD ląstelės buvo kultivuojamos 30 val., Nesant arba esant 8 mM Phe diferencijuotomis sąlygomis. ( a ) Pasibaigus šiam laikotarpiui, bet prieš pridedant FBS (t = 0), buvo imami fazinio kontrasto vaizdai. Tada FBS buvo įpilta į terpę (galutinė koncentracija 10%) ir vaizdai buvo nufotografuoti t = 15 min. Iš vaizdų gautas bendras ląstelių skaičius ir neurito ilgis. b ) Kiekvieno gydymo metu visų neuritų ilgių suma buvo padalinta iš bendro ląstelių skaičiaus. Kiekvienam laiko taškui buvo suskaičiuoti penki ar daugiau atsitiktinai parinktų laukų. Pateikti duomenys yra vidurkis ± SD. ( c ) Po 15 minučių neurito atitraukimo ląstelės buvo atliktos Western blot tyrimu su antikūnais, nukreiptais į Phe-tub ir Total-tub. Parodyti taškai atspindi tris pakartotus eksperimentus.

Visas dydis

Gydymas Phe sumažina mikrotubulų dinamiką

Norėdami įvertinti galimą mikrotubulų dinamikos įsitraukimą į slopinantį aukšto Phe poveikį neurito atitraukimui, išanalizavome FRAP GFP tubuliną ekspresuojančiose CAD ląstelėse. Atlikdami preliminarius eksperimentus, mes nustatėme, kad apdorojant perkeltas ląsteles 8 mM Phe, Phe įterpiama į tubulino ir GFP-tubulino C galus (rezultatai neparodyti).

Po 72 val. Ląstelių diferenciacijos, pasirinktos augimo kūgelių vietos buvo balintos balinimo būdu ir išmatuotas fluorescencijos atsistatymas, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Kontrolinės ląstelės fluorescencijos atsistatymo pusinės eliminacijos laikas (t 0, 5 ) buvo 210 ± 80 sek., Tai rodo aukštą mikrotubulų dinamikos lygį (6 pav.; Kontrolė). Priešingai, t 0, 5 8 mM Phe ląstelėse buvo> 600 sek (6 pav .; + Phe), tai rodo stiprų mikrotubulų dinamikos sumažėjimą. FRAP taip pat buvo atliktas praėjus 24 val. Po Phe pašalinimo iš auginimo terpės (6 pav.; 24 val. Po Phe pašalinimo), gaunant 0, 5 = 170 ± 101 sek., Rodantį, kad mikrotubulų dinamika augimo kūgiuose buvo atkurta. Kai t 0, 5 buvo išmatuotas ląstelių, apdorotų 10 μM taksoliu (mikrotubulius stabilizuojančiu agentu), augimo kūgiuose, po fotoelemento balinimo, kaip tikėtasi, fluorescencijos atkūrimo nepastebėta (rezultatai neparodyti).

Image

CAD ląstelės buvo transfekuotos pEGFP mėgintuvėliu ir kultivuojamos 72 valandas skirtingomis sąlygomis, kai nebuvo (kontrolė; kairioji kolonėlė) arba nebuvo (+ Phe; vidurinė kolonėlė) 8 mM Phe. Mėginių rinkinys, kultivuojamas esant Phe per 72 valandas, vėliau buvo inkubuojamas dar 24 valandas toje pačioje auginimo terpėje be Phe (24 val. Po Phe pašalinimo; dešinė skiltis). Atrinkti laukai, kuriuose yra augimo kūgių, neturinčių sąlyčio su kitomis struktūromis, buvo tiriami FRAP, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Vaizdai buvo imami 20 sekundžių intervalais per 10 minučių po balinimo. a ) vaizdai reprezentuoja tris pakartotus eksperimentus. b ) fluorescencijos intensyvumo kiekybinis įvertinimas. t 0.5 vertės buvo apskaičiuotos iš keturių nepriklausomų eksperimentų.

Visas dydis

Įdėjus Phe į α-tubulino C galą, sumažėja mikrotubulų dinamika

Norint nustatyti, ar Phe poveikis mikrotubulų dinamikai atsirado dėl jo inkorporavimo į α-tubulino C-galą ar dėl jo dalyvavimo kituose ląsteliniuose įvykiuose, prieš FRAP analizę ląstelės buvo transfekuotos EGFP-Tub-Phe plazmidėje (koduojančioje C- galinis Phe vietoj Tyr), arba pEGFP-mėgintuvėlis kaip kontrolė. Dviejų plazmidžių ekspresijos lygiai buvo panašūs, o GFP-Tub-Phe buvo aptiktas tik tada, kai buvo ekspresuota pEGFP-Tub-Phe (7 pav., Apatinė plokštė). Šiomis sąlygomis FRAP analizė parodė, kad t 0, 5 ląstelėms, ekspresuojančioms GFP-Tub-Phe, buvo 407 ± 85 s, tuo tarpu ląstelėms, kurios ekspresuoja GFP-Tub-Phe, buvo 180 ± 90 s (7 pav., Viršutinė ir vidurinė plokštės). Taigi mikrotubulų dinamiką reikšmingai sumažino transfekcija su plazmidėmis, turinčiomis GFP-α-tubulino-Phe, ir tai rodo, kad Phe-tubulino buvimas lemia pastebėtą mikrotubulų dinamikos sumažėjimą.

Image

CAD ląstelės buvo transfekuotos pEGFP-Tub arba pEGFP-Tub-Phe ir kultivuojamos 72 valandas skirtingomis sąlygomis. Atrinkti laukai, kuriuose yra augimo kūgių, neturinčių sąlyčio su kitomis struktūromis, buvo tiriami FRAP, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Vaizdai buvo imami 20 sekundžių intervalais per 10 minučių po balinimo. Viršutinė plokštė : vaizdai atspindi tris pakartojamus eksperimentus. Vidurinė plokštė : fluorescencijos intensyvumo kiekybinis įvertinimas. t 0, 5 vertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Apatinė plokštė : ląstelių, transfekuotų pEGFP mėgintuvėliu (1 juosta) arba pEGP-tub-Phe (2 juostos), Western blot analizė. Tam tikram „Total-tub“ (dugnas) kiekiui abi plazmidės buvo panašiai ekspresuotos (GFP vamzdelis aptiktas antikūnais prieš GFP), tuo tarpu GFP-tub-Phe buvo ekspresuojamas tik ląstelėse, transfekuotose pEGFP-tub-Phe (Phe- kubilas).

Visas dydis

Diskusija

Antikūno, kuris atpažįsta Phe α-tubulino C gale, generavimas leido mums ištirti šio tubulino modifikavimo poveikį gyvoms ląstelėms, ty eksperimentinėms ląstelių kultūros sistemoms. Remdamiesi ankstesniais pranešimais apie Phe inkorporavimą į tubuliną in vitro ir in vivo 7, 13, 15, 16, mes parodėme, kad šis posttransliacinis modifikacija pasitaiko neuronų (1 ir 2 pav.) Ir glijos kilmės ląstelėse (2 pav.). Kai Phe koncentracija auginimo terpėje buvo aukšta, Phe-tubulino izospecifinės rūšys sudarė ~ 40% viso tubulino, o tai atspindi reikšmingą pasikeitimą tubulino tirozinimo būsenoje. Reakcija buvo grįžtama ir Phe-tubulino kiekis priklausė nuo Phe koncentracijos terpėje ir inkubacijos laiko. Phe-tubulino gebėjimas surinkti į mikrotubules buvo įrodytas diferencijuotose CAD ląstelėse (3 pav.), O ląstelių gyvybingumas nepakito įtraukiant Phe. Šie duomenys ir faktas, kad Phe inkorporavimas vietoj Tyr yra nedidelis, labai specifinis „Tyr-tubulino“ struktūros pakeitimas ( ty , kad nėra hidroksilo grupės), gali leisti manyti, kad tubulino fenilalaninacija neturi įtakos ląstelių funkcijoms. Tačiau padidėjus Phe koncentracijai ląstelių proliferacijos greitį sumažino (4 pav.). Platinimo slopinimo laipsnis buvo teigiamai koreliuojamas su Phe inkubacijos laiku, galbūt dėl ​​padidėjusio Phe įsiskverbimo į tubuliną (taigi ir į mikrotubules) kaip laiko funkcijos (1 pav.). Ekstrapoliuotas į žmogaus smegenų vystymąsi, šis reiškinys iš dalies galėtų paaiškinti padidėjusį mikrocefalijos pasireiškimą kūdikiams iš moterų, negydomų PKU 17 .

CAD ląstelėse, diferencijuotose pagal kultūrą FBS neturinčioje terpėje, papildytoje dideliu Phe (tokiose ląstelėse buvo didelis Phe-tubulino kiekis, įvertintas Western blot būdu), neurito atitraukimas po FBS pridėjimo buvo lėtesnis nei kontrolinių ląstelių dažnis (2 pav. 5a, b). Tokį sulėtėjimo greitį sustabdė didelės koncentracijos Tyr buvimas (ir susijęs Phe-tubulino nebuvimas; 5c pav.), Kas rodo, kad aukšto Phe poveikis, nesant Tyr, atsirado dėl Phe įsiskverbimo į tubuliną.

Neurito įtraukimas iš dalies gali priklausyti nuo mikrotubulų dinamikos. Todėl mes panaudojome FRAP, kad įvertintume Phe-tubulino poveikį mikrotubulų dinamikai, ir nustatėme, kad jis sumažėjo CAD ląstelių, apdorotų dideliu Phe, augimo kūgiuose (6 pav.). Kai ląstelėse esantis Phe-tubulinas buvo iš esmės sumažintas per 24 valandas inkubuojant terpėje be didelio Phe, dinamika normalizavosi. Mikrodalelių dinamikos sumažėjimas, stebimas, kai ląstelės buvo transfekuojamos pEGFP-Tub-Phe, labai rodo, kad tokį sumažėjimą lemia Phe buvimas α-tubulino C gale. Remiantis „dinaminio nestabilumo“ teorija, mikrotubulų dinamika in vitro priklauso nuo to, ar GTP arba BVP yra surišti su tubulinu mikrotubulų galiukuose. Kita vertus, gyvų ląstelių dinamiką veikia ir reguliuoja daugybė endogeninių veiksnių, įskaitant MAPS, molekulinių variklių ir pliusinių galų sekimo baltymų jungimąsi (+ patarimai) 1, 18 . Keletas posttransliacinių tubulino modifikacijų (acetilinimas, glutamilinimas, glicilinimas) taip pat turi įtakos mikrotubulų dinamikai 6, 19 . Nebuvo pranešta, kad tubulino tirozinimo būsena reguliuoja dinamiką; tačiau šie atradimai rodo, kad padidėjęs „anomalių“ tubulino izospektyvų (Phe-tubulino) lygis yra susijęs su proliferacijos greičio mažėjimu, neurito atitraukimo greičio mažinimu ir mikrotubulų dinamikos, pastebimos augimo kūgiuose, mažėjimu. Padidėjęs „Phe-mikrotubulų“ kiekis gali pakeisti sąveiką su įvairiais baltymais, apie kuriuos žinoma, kad jie reguliuoja mikrotubulų funkcijas.

Daugybė kultūrinių ląstelių ir smegenų tyrimų, kuriuose nagrinėjami PKU pacientų neuronų ir smegenų disfunkcijos molekuliniai mechanizmai, atskleidė įvairių ląstelių funkcijų pakitimus gydant dideliu Phe - 20, 21, 22, 23 . Tačiau nė vienas iš šių tyrimų neišaiškino patologinio mechanizmo molekuliniu pagrindu. Dabartiniai atradimai aiškiai parodo, kad Phe buvimas α-tubulino C gale yra susijęs su tuo pat metu vykstančiais ląstelių proliferacijos greičio, mikrotubulų dinamikos ir neurito atitraukimo pokyčiais. Pavyzdžiui, šie rezultatai gali paaiškinti Horling ir kt . Pastabas. 24 dėl sumažėjusio sinapsinio genėjimo hipokampoje PKU pelės modelyje, kai pažeidžiamas neuromediatorių išsiskyrimas ir sutrinka neuronų veikla. Šiuo metu negalime tvirtinti, kad ši tubulino modifikacija yra pagrindinė PKU pacientų smegenų disfunkcijos priežastis. Tačiau keli pastebėjimai atitinka šią mintį: (i) tiesioginį Phe dalyvavimą tokiame mechanizme patvirtina jo posttransliacinis įtraukimas į baltymą in vitro 7, 15, in vivo 13 ir į kultūrinių ląstelių sistemas ( 1 pav.). (ii) Phe neįsijungia jokiuose ląsteliniuose baltymuose, išskyrus tubuliną, pagrindinę mikrotubulų sudedamąją dalį. (iii) Phe-tubulinas susimaišo į mikrotubules, susidaro fenilalaninuoti mikrotubulai (3 pav.). (iv) Phe-tubulino buvimas neturi įtakos ląstelių gyvybingumui, tačiau sumažina proliferacijos greitį (4 pav.). (v) Padidėjęs Phe-tubulino lygis sumažina mikrotubulų dinamiką ir šis poveikis atstatomas mažinant Phe-tubuliną inkubuojant, kai nėra aukšto Phe (6 pav.). (vi) Padidėjęs Phe-tubulino lygis slopina neurito įtraukimą (procesą, kuris priklauso nuo mikrotubulų dinamikos), tuo tarpu tuo pačiu metu aukšta Tyr koncentracija blokuoja tokį slopinimą blokuodama Phe įsiskverbimą į tubuliną (5 pav.). vii) mikrotubuliai vaidina svarbų vaidmenį perduodant aksonų neurotransmiterius, neuronų receptorius, augimo faktorius, membranos formavimo lipidus ir sąveiką su įvairiais tirpiais ir membraniniais baltymais 1 . Bet kurio iš šių veiksnių modifikavimas ( pvz. , Įterpiant Phe į tubuliną) gali smarkiai pakeisti neuronų funkcijas ir smegenų vystymąsi.

Apibendrinant, kadangi aprašyti eksperimentai buvo atlikti su pelių neuronais, akivaizdu, kad mūsų rezultatai neleidžia tvirtai teigti, kad PKU smegenų disfunkcijos patogenezę lemia tubulino modifikacija. Tačiau šios idėjos negalima atsisakyti. Tiesą sakant, mūsų išvados yra suderinamos su hipoteze, kad Phe inkorporacija į α-tubulino C-galą gali būti pirmasis įvykis (arba tarp pradinių įvykių) molekuliniuose keliuose, vedančiuose į nervų ir smegenų disfunkcijas, apibūdinančias PKU. Be šio darbo apimties, toliau vykdomi eksperimentai, skirti nustatyti galimo Phe įsiskverbimo į tubuliną ir PKU ligos ryšio mechanizmą.

Medžiagos ir metodai

Chemikalai

Chemikalai, antikūnai ir kultūrinės terpės buvo iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV), jei nenurodyta kitaip. Triušio polikloniniai antikūnai, būdingi Glu-tubulinui, buvo paruošti mūsų laboratorijoje, kaip aprašė Gundersen ir kt . 25 IRDye 800CW ožkų antivirusinis IgG ir IRDye 800CW ožkų antivirusinis IgG buvo iš Li-Cor Biosciences (Linkolnas, NE, JAV). „Lipofectamine 2000“ buvo iš „Invitrogen“ (Didžioji sala, NY, JAV). Galvijų vaisiaus serumas (FBS) buvo iš Natocor (Kordoba, Argentina). Y-27632 ir FluorSave buvo iš Calbiochem (Billerica, MA, JAV).

Ląstelių kultūros

HeLa ir C6 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM, o CAD ląstelės buvo kultivuojamos DMEM / F12 (50:50, v / v); abi terpės buvo papildytos 10% (v / v) FBS, 10 vienetų · mL −1 penicilino ir 100 µg · mL −1 streptomicino. Visos auginamos ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje sudrėkintoje 5% CO 2 atmosferoje. CAD ląstelių diferenciacija buvo sužadinta pakeitus terpę terpe, kurioje nėra FBS, o diferenciacijos būsena (neurito augimas) įvertinta optiniu mikroskopiniu tyrimu. Kai kuriuose eksperimentuose ląstelės buvo inkubuojamos, esant įvairioms Phe ir (arba) Tyr koncentracijoms. Kadangi Tyr tirpumas vandenyje yra ribotas, buvo paruoštas pradinis Tyr tirpalas (230 mM) 1 M HCl. Šio tirpalo alikvotinė dalis buvo įpilama į auginimo terpę, norint gauti norimą Tyr koncentraciją, pH buvo nedelsiant sureguliuotas iki 7, 5, naudojant 1 M NaOH, ir modifikuota terpė buvo pridėta prie ląstelių.

Ląstelių gyvybingumas ir proliferacija

Gyvų ląstelių skaičiavimui ir ląstelių proliferacijos stebėjimui buvo naudojamas „Trypan Blue“ išskyrimo tyrimas. CAD ląstelės buvo sėjamos į 35 mm indus (2 x 10 4 ląstelės / lėkštelė) ir inkubuojamos 24, 48 arba 72 valandas, jei nėra arba nėra 4 mM arba 8 mM Phe. Tyrimui Trypan Blue tirpalas buvo pridėtas prie ląstelių kultūros (galutinė koncentracija 0, 75%) kambario temperatūroje 3 minutes, ląstelės buvo perkeltos į Neubauerio kamerą, o gyvos ir negyvos ląstelės buvo suskaičiuotos naudojant optinį apverstą mikroskopą (modelis Axiovert 135, Carlas Zeissas; Jena, Vokietija).

Neurito ilgis

Siekiant nustatyti neurito ilgį, buvo tiriami eksperimentų metu darytos mikrofotografijos. Kiekvienam laiko taškui ir gydymui buvo atsitiktinai parinktos penkios sritys ir išanalizuotos naudojant Fidžio programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai; Bethesda, MD, JAV). Buvo išmatuoti neurito ilgiai, o visų ilgių suma buvo padalinta iš bendro ląstelių skaičiaus duotame plote. Vaizdai buvo imami apverstu „Axiovert 135“ mikroskopu, kuriame įrengta „Olympus XM10“ kamera ir ląstelių „Sens Digital Imaging“ programinė įranga („Olympus“; „Center Valley“, PA, JAV). Rezultatai (trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD) buvo išreikšti kaip neurito ilgis (μm) / ląstelė.

Imunofluorescencija

Ląstelės buvo auginamos dangteliais, fiksuotos šaltu (–20 ° C) metanoliu 10 min., Rehidratuotos, praplautos NaCl / Pi, inkubuotos su 5% (m / t) BSA NaCl / P i 1 val., Inkubuotos su pirminis antikūnas anti-Phe (1: 1000) arba anti-totalinis tubulinas (1: 1000) 2 h 37 ° C temperatūroje, tris kartus plaunamas NaCl / P i ir 1 valandą inkubuojamas 37 ° C temperatūroje su Alexa Fluor. 488 ožkų anti-pelių IgG (1: 2000) ir Alexa Fluor 594 ožkų anti-triušių IgG (1: 2000). Dangtelio dangteliai buvo pritvirtinti „FluorSave“, o fluorescencija buvo stebima atliekant konokalinę mikroskopiją (modelis „FluoView 1000“, „Olympus“). Kai reikėjo palyginti skirtingus preparatus, buvo darytos tos pačios vertės vertės nuotraukos.

Fluorescencijos atkūrimas po fotobalinimo (FRAP)

Nediferencijuotos CAD ląstelės buvo išaugintos iki 80% santakos mikroschemų stiklinio dugno kameroje (Ibidi; Martinsried, Vokietija), perpiltoje pEGFP-Tub (Clontech; Mountain View, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą, auginamos 72 valandas diferencijuojamos sąlygos ir atliekama FRAP analizė, ty atliekamas GFP-tubulino arba GFP-tubulino-Phe fotobalinimas nustatytoje ląstelės vietoje, po to matuojamas fluorescencijos atkūrimas šioje srityje kaip laiko funkcija. Kaip kontrolė, fluorescencijos vertės taip pat buvo matuojamos fono srityje. FRAP eksperimentams buvo išanalizuota nuo 5 iki 7 augimo kūgelių kiekvienoje sąlygoje ir eksperimentas. Prieš ir po nuotraukų balinimo vaizdai buvo gaunami kas 20 sekundžių per 10 minučių, naudojant objektyvą su skaitmenine diafragma 20 × 0, 5 (Plan-Neofluar, Carl Zeiss), o mikroskopo konfokalinė anga buvo visiškai atidaryta. Atrankinis GFP fotografavimas buvo atliekamas lazeriu skenuojančiu konokaliniu mikroskopu („FluoView 1000“, „Olympus“). Gaunant vaizdą, gyvos ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 atmosferoje. Pasirinktuose dominančiuose regionuose fluorescencija buvo kiekybiškai įvertinta naudojant Fidžio programą.

Mutacijų įvedimas į pEGFP-mėgintuvėlį

Kaip mutagenezės pradžios tašką kaip šabloną naudojome pilno ilgio „PEGFP-Tub“. Taškinė mutacija (α-tubulino C-galas Tyr į Phe) buvo įvesta naudojant „QuikChange“ vietai nukreiptą mutagenezės rinkinį (Agilent Technologies; Santa Clara, CA, JAV). PGR reakcijos buvo atliktos naudojant plazmidę ir mutageninius pradmenis GTTCACCTCCCTGCTCATGGAACG ir CGGTCTAGATTAGAATTCCTCTCCTTCTTCCTCACCCTC (Invitrogen). Kolonijos, teigiamos norimai mutacijai, buvo auginamos standartinėmis sąlygomis LB sultinyje, ir plazmidės buvo išskirtos naudojant plazmidės DNR gryninimo rinkinį (Sigma-Aldrich). Visos mutacijos buvo patikrintos DNR seka.

SDS-PAGE and Western blotting

Proteins were separated by SDS-PAGE (10% gels) and transferred to nitrocellulose sheets. The sheets were blocked with 5% nonfat dried milk powder in NaCl/P i, incubated with primary antibodies directed to Total-, Tyr-, Glu-, or Phe-tubulin (1:1000) for 2 h at room temperature in 1% nonfat dried milk powder in NaCl/P i, washed three times, incubated with infrared fluorescent secondary antibodies for 1 h at room temperature (1:25000), washed, and scanned with an Odyssey infrared scanner (Li-Cor). Optical density of bands was quantified using the Scion Image software program (Scion Corp, USA).

Microscopy facilities

All microscopic observations, including those for FRAP analysis, were performed at the facilities of the Centro de Microscopía Óptica y Confocal de Avanzada (CIQUIBIC-CONICET; Córdoba, Argentina).

Papildoma informacija

How to cite this article : Ditamo, Y. et al . Post-Translational Incorporation of L-Phenylalanine into the C-Terminus of α-Tubulin as a Possible Cause of Neuronal Dysfunction. Mokslas. Rep. 6, 38140; doi: 10.1038/srep38140 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.