Postransliacinis p53 funkcijos reguliavimas per 20-ies proteasomų sukeltą skaidymą | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Postransliacinis p53 funkcijos reguliavimas per 20-ies proteasomų sukeltą skaidymą | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių biologija
  • Proteolizė

Anotacija

Naviko slopintuvas p53 yra transkripcijos faktorius, kuris reguliuoja tikslinių genų raišką, reaguodamas į ląstelių stresą. Savo ląstelinės funkcijos supratimą dar labiau apsunkina tai, kad be viso ilgio baltymo, žmogaus organizme gaminasi keletas p53 izoformų, turinčių įvairius raiškos būdus ir funkcijas. Buvo parodyta, kad viena izoforma, Δ40p53, kuriai trūksta pirmojo transaktyvacijos domeno, įskaitant neigiamo reguliatoriaus MDM2 surišimo sritį, yra alternatyvios transliacijos iniciacijos produktas. Pateikiame alternatyvaus ląstelinio mechanizmo, skirto Δ40p53 susidarymui, atradimą. Mes parodome, kad 20S proteasoma specifiškai suskaido viso ilgio baltymą (FLp53), kad susidarytų 4040p53 izoforma. Be to, mes parodome, kad FLp53 dimeris sąveikauja su Δ40p53 dimeriu, sukurdamas funkcinį hetero-tetramerą. Taigi abiejų izoformų bendra raiška silpnina FLp53 transkripcinį aktyvumą dominuojančiu neigiamu būdu. Galiausiai parodome, kad po oksidacinio streso, kai 20S proteasoma tampa pagrindine skilimo mašina ir suaktyvinamas FLp53, sustiprėja Δ40p53 formavimasis, sukuriant neigiamą grįžtamąjį ryšį, kuris subalansuoja FLp53 aktyvaciją. Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad Δ40p53 gali būti sugeneruotas naudojant 20S proteasomų tarpininkaujantį transliacijos mechanizmą, kad būtų galima kontroliuoti p53 funkciją. Apskritai, 20S proteasomos specifinės skilimo funkcijos atradimas gali reikšti bendresnį ląstelių reguliavimo mechanizmą, kad būtų galima gaminti baltymus, turinčius aiškias funkcines savybes.

Pagrindinis

Naviko slopintuvas p53 yra streso atsako baltymas, kuris pirmiausia veikia kaip transkripcijos faktorius, reguliuojantis daugiau nei 300 genų lygį. 1 p53 aktyvumą griežtai reguliuoja sudėtingas grįžtamojo ryšio kilpų tinklas, kontroliuojantis jo ląstelių lygius. Pagrindinėmis sąlygomis p53 lygis yra žemas dėl nuolatinio skilimo. 2 Tačiau po ląstelių įžeidimų, įskaitant onkogeno aktyvaciją ir DNR pažeidimą, baltymas yra plačiai modifikuotas po transliacijos, todėl stabilizuojamas ir aktyvuojamas. 3, 4, 5, 6 Tai savo ruožtu sukelia p53 atsako genų, kurie gali sukelti augimo sustojimą, apoptozę, DNR atstatymą ir diferenciaciją, 7, tarpininkaujant apsaugą nuo navikogenezės, indukciją.

Aktyvusis p53 egzistuoja kaip homo-tetrameras, apimantis dvi sulankstytas sritis: tetramerizacijos domeną ir pagrindinę DNR surišančią sritį (apžvelgtas Joerger ir Fersht 8 ). Šie struktūriniai elementai yra N-ir C-gale sujungtų natūraliai išskleistų domenų pusėje. Iš esmės netvarkingas N-galinis regionas apima transaktyvumo pajėgumą su dviem tranzaktyvacijos domenais; TADI (1–40 liekanos) ir TADII (40–61 liekanos). TAD domenai sąveikauja su daugybe baltymų, įskaitant transkripcijos mechanizmo komponentus, ir neigiamą reguliatorių MDM2. Pastaroji funkcionuoja ir kaip E3 ubikvitino ligazė, tarpininkaujanti p53 ubikvitinacijai, ir po to einantis 26S proteasominis skilimas, ir kaip p53 transkripcijos aktyvacijos inhibitorius. 9, 10 Iš esmės netvarkingos N-galo savybės taip pat yra atsakingos už baltymų jautrumą 20S proteasomų sukeltam skilimui - procesui, kuris nepriklauso nuo p53 visur esančio. 11

Papildomas mechanizmas, išsivystęs reguliuoti p53 funkciją, yra 12 skirtingų izoformų susidarymas. 12, 13 Jie sukuriami keliais mechanizmais, tokiais kaip alternatyvūs sujungimai, modifikuojantys baltymo C-galinę sritį (p53 β , p53 γ ), taip pat naudojant alternatyvius promotorius ir alternatyvias transliacijos inicijavimo vietas, dėl kurių atsiranda p53 izoformos. N-galas (Δ40p53, Δ133p53, Δ160p53). Be to, gaminami daugybiniai N- ir C-galinių variantų deriniai (Δ40p53 β , Δ40p53 γ , Δ133p53 β , Δ133p53 γ , Δ160p53 β , Δ160p53 γ ). 13, 14 Įvairios p53 izoformos turi skirtingą biologinį aktyvumą, kuris gali specialiai sureguliuoti viso ilgio p53 (FLp53) funkciją arba savarankiškai reguliuoti įvairius ląstelių procesus. 15, 16, 17, 18 Taigi, be plačiai pripažintos nuomonės, kad ~ 50% žmogaus vėžio atvejų yra dėl p53 mutacijų, yra požymių, kad p53 izoformų lygių pusiausvyra taip pat gali turėti įtakos kancerogenezei.

Čia pagrindinis dėmesys skiriamas Δ40p53, vienai iš p53 izoformų, kuriai trūksta pirmųjų 39 aminorūgščių. Šis p53 variantas, kuris aptinkamas ir vėžio ląstelėse, ir sveikuose audiniuose, gaunamas inicijuojant alternatyvų vertimą - procesą, kuris yra išsaugotas tarp pelių ir žmonių. 18, 19, 20, 21 Šioje izoformoje nėra TADI domeno, kuriame yra jungtis su svarbiausiu neigiamu p53 reguliatoriumi, MDM2. Todėl jam nedaromas MDM2 tarpininkavimas ir 26S proteasomų skilimas, išskyrus atvejus, kai jis yra prijungtas prie FLp53. 18 Įrodyta, kad Δ40p53 izoforma daro įtaką p53 aktyvumui, kai ji išreiškiama kartu su laukinio tipo (WT) p53 baltymu, ypač sukeldama dominuojantį neigiamą poveikį. 18, 22, 23, 24 Iš viso atrodo, kad 40p53 raiška gali turėti įtakos vėžio formavimuisi, todėl svarbu atskleisti molekulinius mechanizmus, kurie koordinuoja jo ląstelių lygius ir funkcijas.

Šiame tyrime parodytas alternatyvus ląstelių mechanizmas Δ40p53 susidarymui, kurį sąlygoja 20S proteasomų skilimas. Tiksliau, derindami natūraliosios masės spektrometriją (MS), biocheminę ir ląstelinę analizę, mes parodome, kad 20S proteasoma neskaido p53 iki galo, o greičiau skaido baltymą tiksliai 40 padėtyje, sukurdama produktą, homologišką Δ40p53. Be to, mes parodome, kad FLp53 ir Δ40p53 sudaro aktyvius hetero-tetramerius, kurie moduliuoja p53 transkripcinį aktyvumą. Mūsų duomenys taip pat rodo, kad oksidacinėmis sąlygomis sustiprėja Δ40p53 formavimasis, dėl kurio sumažėja p53 transkripcijos aktyvumas. Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad, be transliacijos inicijavimo 40 padėtyje, Δ40p53 sukuriamas po transliacijos įvykio per 20S proteasomą ir kad šis procesas yra reikšmingas oksidacinėmis sąlygomis, kai yra pakenkta MDM2 tarpininkaujamam p53 reguliavimui.

Rezultatai

Išgryninti FLp53 ir Δ40p53 baltymai sudaro aktyvius homo-tetramerus

Aprašyti p53 du alternatyvūs proteasominio skilimo mechanizmai, kurie vienas kito neatmeta: nuo ubikvitino priklausomas skilimas 26S proteasomos metu ir nuo ubikvitino nepriklausomas skaidymasis 20S proteasomos būdu. 9, 10, 11 Skirtingai nuo 26S proteasomos skilimo, kuris yra aktyvus procesas, kurį reguliuoja daugybė ubiquitination fermentų, nuo ubiquitin nepriklausomas kelias yra pasyvus procesas, atsirandantis dėl įgimto N-galo sutrikimo. p53 regionas. Čia, norėdami įvertinti žmogaus FLp53 ir Δ40p53 jautrumą 20S proteasomų skilimui, sukūrėme in vitro sistemą, susidedančią iš izoliuotų 20S proteasomų ir rekombinantinių žmogaus FLp53 bei Δ40p53 baltymų. Pirmiausia mes patikrinome kiekvieno išgryninto p53 baltymo surinkimo būseną ir funkcionalumą atlikdami gimtosios MS analizę tokiomis sąlygomis, kurios išsaugo nekovalentinę sąveiką. 25 Abiejų baltymų masės spektrai, nesant DNR, parodė monomerinių, dimerinių ir tetramerinių formų sambūvį (1a pav.). Abiejų dimerų ir tetraimerų egzistavimas yra suderinamas su p53 surinkimu kaip dimerų dimeris. Pridedant DNR prie abiejų p53 izoformų, atsirado nauja dominuojanti krūvių serija, atitinkanti tetramerinių p53 / DNR kompleksų masę (1b pav.). Šiuose spektruose nebuvo aptikta ne tik monomerinė baltymo forma, bet ir žymiai sumažėjo dimerinės formos intensyvumas, atspindintis padidėjusį tetramerinio p53 / DNR komplekso stabilumą. Be to, esant DNR, buvo aptiktos tik prie DNR surištos Δ40p53 rūšys, skirtingai nei FLp53 / DNR spektras, kuriose stebimos laisvos dimerinės ir tetramerinės formos, kas rodo didesnį Δ40p53 afinitetą DNR. Apskritai, MS rezultatai patvirtino, kad išgryninti FLp53 ir Δ40p53 baltymai yra tinkamai sulankstyti ir sugeba sudaryti DNR tetramerinį kompleksą.

Image

Funkciniai FLp53 ir Δ40p53 buvo išskirti iš Escherichia coli . Gimtoji išgrynintų FLp53 ir Δ40p53 MS prieš ( a ) ir po ( b ) pridedant DNR. Abiem atvejais buvo naudojamas p53r2 atsako elementas. p53 jungtys, surištos su DNR, nurodomos šiltesnėmis spalvomis, o laisvos p53 formos žymimos šaltesnėmis spalvomis. Įkrovos būsenos, apjuodintos juoda rėmeliu, atitinka Δ40p53 izoformą. Bakterijų Hsp70 homologas Dnakas, kuris, kaip žinoma, jungiasi p53, 61, buvo išgrynintas su p53 formomis. Apskritai, spektrai rodo, kad rekombinantinės FLp53 ir Δ40p53 formos yra pajėgios surinkti į homoimerus ir -temerius, kurie suriša DNR. c ) FLp53 ir Δ40p53, sujungtų su p53 atsako elementu, EMSA rezultato autoradiogramos, rodančios sekai būdingą DNR jungimosi aktyvumą

Visas dydis

Norėdami patikrinti savo gimtosios MS duomenis, dviejų baltymų jungimosi su DNR eksperimentai buvo atlikti naudojant elektroforezinį judėjimo poslinkio testą (EMSA), naudojant radioaktyviuoju p53 atsako elemento DNR. Abiejų baltymų jungimosi prieraišumas yra 300–600 nM, remiantis p53 – DNR kompleksų atsiradimu kaip baltymų koncentracijos funkcija (1c paveikslas). Pasislinkęs 4040p53 / DNR kompleksas atrodo esant mažesnei baltymų koncentracijai nei FLp53, rodantis didesnį surišimo afinitetą. Remiantis 1b paveikslu, šis pastebėjimas rodo, kad neigiamai įkrauto N-galo nebuvimas A40p53 lemia sustiprintą sąveiką su neigiamai įkrauta DNR, palyginti su FLp53. Ši išvada sutinka su ankstesniu tyrimu, kuriame nurodoma, kad N-galo maskavimas monokloniniais antikūnais stabilizuoja p53 – DNR sąveiką. 28

20S proteasomos pašalinimas dėl FLp53 sukuria baltymą, homologišką Δ40p53

Norėdami ištirti FLp53 ir Δ40p53 jautrumą 20S proteasominei proteolizei, atlikome skilimo tyrimus, nesant (2a paveikslas) ir nėra (2b paveikslas) DNR. Rezultatai parodė, kad abi p53 formos yra skaidomos 20S proteasomos (2a – c pav.); tačiau, palyginti su Δ40p53, FLp53 yra jautresnis proteolizei. Be to, nors DNR neturėjo jokios įtakos FLp53 skaidymui, pridėjus DNR, Δ40p53 yra žymiai mažiau skaidomas. Pažymėtina, kad p53 skilimas nepastebėtas esant išgrynintoms 26S proteasomoms, o tai atitinka ankstesnius duomenis 29 (papildomas 1 paveikslas). Apskritai šie rezultatai patvirtina požiūrį, kad nestruktūrizuotas FLp53 N-galinis domenas yra atsakingas už jautrumą 20S proteasominiam skilimui. 11 Be to, jie rodo, kad prisijungdamas prie DNR (1 pav.), Δ40p53 įgyja struktūrinį stabilumą 30, o tai savo ruožtu sumažina jo jautrumą 20S proteasomų skilimui.

Image

Δ40p53 susidaro skaidydamas 20S proteasomą. Skaidymo tyrimai buvo atlikti ( a ) nesant arba b ) esant DNR ( p53r2 dupleksas B), naudojant išgrynintus p53 substratus ir 20S proteasomas. FLp53 ir Δ40p53 buvo inkubuoti su nuosekliai praskiestomis 20S proteasomomis. Rodyklės rodo atskirus p53 skilimo produktus, kurie susidaro perdirbant proteasomą. Šių kylančių juostų nėra, kai į mišinį pridedama proteasomų inhibitoriaus MG132. c ) SDS-PAGE rezultatų densitometrinė kiekybinė analizė. Klaidų juostos nurodo trijų pakartojimų SD. ( d ) Gimtosios MS analizė, naudojant FLp53, apdorojant 20S proteasomą. P53 / 20S proteasomų mišinys buvo inkubuotas ant ledo. Mėginio alikvotė buvo analizuojama VN nurodytais laiko momentais. Tarp įkrovos eilučių, atitinkančių nepažeistą FLp53 monomerą, atsirado papildomų smailių, atitinkančių pirmųjų 40 aminorūgščių skilimą. e ) Pažymėta skilimo vieta parodyta geltona rodykle ant p53 sekos

Visas dydis

Pažymėtina, kad abiejuose eksperimentuose FLp53 ir Δ40p53 nebuvo visiškai suskaidyti, o greičiau perdirbti į atskirus produktus: du skilimo produktus FLp53 ir vieną produktą Δ40p53 (2d ir e paveikslai). Be to, tariamo didesnio iš FLp53 gauto produkto dydis buvo labai artimas Δ40p53. Šio tyrimo tikslas - apibūdinti pastarąjį produktą, kuris leidžia manyti, kad Δ40p53 izoforma gali būti gaminama naudojant FLS53, veikiant proteosomų būdu 20S.

Norėdami ištirti į Δ40p53 panašų skilimo produktą, taikėme gimtosios MS metodą, kuriame buvo stebimas FLp53 skilimo produkto susidarymas priklausomai nuo laiko (2d pav.). Pirmuoju metu buvo pastebėtos penkios pagrindinės smailės, atitinkančios nepažeistos FLp53 11 + –15 + įkrovos būsenas. Po 90 min. Atsirado ir papildoma vieno įkrovimo seka, nukreipta ties ~ 3450 m / z, o jos santykinis intensyvumas padidėjo iki 180 min. Laiko. Išmatuota šios besiformuojančios krūvio eilės masė yra 39 185 ± 7 Da, atsižvelgiant į aiškų skilimo produktą tarp FLp53 40 ir 41 liekanų (kai teorinė masė yra 39 189 Da). Ši rūšis tiksliai atitinka Δ40p53 seką, kurioje nėra pirmosios metionino liekanos (2e paveikslas). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad 20S proteasoma gali generuoti Δ40p53 per specifinį FLp53 skilimą.

Postransliacinis FLp53 apdorojimas 20S proteasoma sukuria Δ40p53 izoformą

Norėdami įvertinti mūsų hipotezę, kad Δ40p53 gali būti sugeneruotas 20S proteasomų sukelto ląstelių skaidymo būdu, mes įterpėme į nesmulkialąstelines plaučių karcinomos ląsteles H1299, kurioms trūksta p53, WT FLp53. 31 Ląstelių ekstraktai buvo inkubuojami didėjant išgryninto 20S proteasomos kiekiui. Tada p53 formos buvo aptiktos naudojant anti-p53 polikloninį antikūną. Kaip ir tikėtasi, juosta, atitinkanti A40p53, egzistavo dar prieš pridedant 20S proteasomas (3a paveikslas). Nepaisant to, jo lygis buvo aiškiai padidintas priklausomai nuo 20S proteasomų koncentracijos (3a paveikslas), kas rodo, kad ląstelėje Δ40p53 gali būti sugeneruotas 20S proteasomų skaidymas. Norėdami patvirtinti, kad 20S proteolitinis produktas yra Δ40p53, o ne kita p53 izoforma, kurios molekulinė masė yra panaši, mes atlikome tą patį eksperimentą, aptikdami p53 formas monokloniniu antikūnu, išaugintu prieš p53 N-galinį epitopą, kurio nėra Δ40p53 (DO). -1). Kaip ir tikėtasi, buvo aptiktas tik FLp53 (2 papildomas paveikslas), patvirtinantis mūsų hipotezę, kad Δ40p53 sukuria 20S proteolizė.

Image

20S proteasomos atliktas ląstelių FLp53 perdirbimas po transliacijos sukuria Δ40p53 izoformą. ( a ) Nesmulkialąstelinė plaučių karcinomos ląstelių linija H1299, kuriai trūksta p53, buvo laikinai transfekuota pC53-SN3 vektoriu, išreiškiančiu FLp53, ir po to atlikta ląstelių lizė. Ląstelių ekstraktai buvo inkubuojami su nurodytomis padidintomis 20S proteasomų koncentracijomis 120 min. 37 ° C temperatūroje, o p53 formos buvo aptiktos SDS-PAGE. ( b ) H1299 ląstelės buvo laikinai transfekuotos pC53-SN3 vektoriu, išreiškiančiu FLp53, po kurio sekė ląstelių lizė. Ląstelių ekstraktai buvo inkubuojami su 20S proteasoma (10 μg ), esant arba nesant proteasomų inhibitoriaus MG132 (50 μM ) 120 min., Esant 37 ° C, ir p53 formos buvo aptiktos SDS-PAGE. ( c ) H1299 ląstelės buvo laikinai transfekuotos pC53-SN3 vektoriu, ekspresuojančiu FLp53. Po 24 valandų ląstelės 6 valandas buvo gydomos proteasomų inhibitoriumi MG132 (10 μM ). Ląstelės buvo lizuotos ir ląstelių ekstraktai buvo įpilti į SDS-PAGE gelį. Ląstelės, išreiškiančios tuščią vektorių (Con), buvo naudojamos kaip neigiamos kontrolinės medžiagos. ( d ) H1299 ląstelės buvo laikinai transfekuotos šiais vektoriais: pC53-SN3 vektoriais (FLp53), pC53-SN3 vektoriais, turinčiais vieną rėmelio mutaciją, metioniną (ATG) 40 padėtyje pakeisdami izoleucinu (ATA) (p53M40I) į. pašalinti vertimo inicijavimą iš alternatyvios vietos ir tuščią vektorių (Con). Ląstelės buvo lizuotos ir ląstelių ekstraktai buvo įpilti į SDS-PAGE gelį. ( e ) HEK293T ląstelės buvo laikinai perkeltos, kad nutildytų Rpn2. Kaip kontrolė buvo naudojama netikslinė siRNR (NT). Po 48 valandų ląstelės 3 valandas buvo gydomos proteasomų inhibitoriumi MG132 (40 μM ). Ląstelės lizuojamos ir ląstelių ekstraktai buvo užpilti ant SDS-PAGE gelių, išanalizuoti Western blot būdu ir vizualizuoti naudojant įvairius antikūnus. Visuose eksperimentuose p53 formoms aptikti buvo naudojamas polikloninis anti-p53 antikūnas. Namų tvarkymo baltymas GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Išvalytas A40p53 buvo dedamas į gelius kaip kontrolinis. Blotai yra tipinis eksperimentas. Kiekybinis įvertinimas parodo keturių ( a, c - e ) arba penkių ( b ) nepriklausomų eksperimentų vidurkį. Matavimai buvo tiriami Studento t- teste, * P 0, 05, ** P 0, 01. Klaidų juostos žymi SE ND, neaptinkamos

Visas dydis

Norint patikrinti, ar Δ40p53 generavimas priklauso nuo proteolizės, H1299 ląstelės buvo įvestos su FLp53, o ląstelių ekstraktai buvo inkubuoti su išgryninta 20S proteasoma, esant arba nesant proteasomų inhibitoriaus MG132. Iš tikrųjų 3b paveikslas parodo, kad pridėjus MG132 sumažėjo Δ40p53 lygiai. Panašiai, slopindamas 20S proteasomas, apdorodamas ląsteles MG132, sumažino 4040p53 izoformos susidarymą in vivo (3c paveikslas). Visi šie duomenys patvirtina mūsų požiūrį, kad Δ40p53 gali būti 20S proteolizės produktas.

Turėdami omenyje, kad alternatyvi transliacijos inicijacija 40 kodone yra priimtas Δ40p53 formavimo mechanizmas, 18, 19, 20, 21, norėjome užkirsti kelią šiam procesui įterpdami vieną rėmo mutaciją į FLp53 per daug ekspresuojančią plazmidę, kad pakeistume Met kodoną Ile (p53 M40I ). WT ir p53 M40I konstrukcijos parodė nedidelius jų migravimo savybių skirtumus, kaip ir ankstesnėje vieno mutanto analizėje (3d pav.). Nepaisant to, kad alternatyvi vertimo vieta buvo pašalinta, Western blot analizė parodė, kad susidaro Δ40p53 forma. Iš viso šie rezultatai leidžia manyti, kad perdirbimas 20S proteasomoje yra alternatyvus Δ40p53 izoformos generavimo po FLp53 transliacijos mechanizmas. Lieka nustatyti, kiek kiekvienas iš šių procesų prisideda prie Δ40p53 ląstelių lygio.

Atsižvelgiant į tai, kad p53 gali būti skaidomas per 20S ir 26S proteasomas, 29 reikėjo paaiškinti, kad 40405 formavimasis ląstelėse yra susijęs būtent su 20S, o ne su 26S proteolize. Todėl nutildėme Rpn2 (PSMD1), ne ATPazės 19S proteasomos subvienetą, HEK293T ląstelėse, naudodami trumpą trukdančią RNR (siRNR). Anksčiau buvo įrodyta, kad Rpn2 sumažėjimas sukelia reikšmingą 26S proteasomų aktyvumo sumažėjimą, kartu padidėjusį 20S proteasomų funkciją. 11, 33 Rezultatai parodė, kad Rpn2 numušimas sąlygojo ubiquitino ir baltymo konjugatų kaupimąsi, kaip buvo tikėtasi dėl sumažėjusio 26S proteasomų aktyvumo (3e pav.). Nepaisant Rpn2 išeikvojimo, Δ40p53 vis tiek buvo aptiktas. Pridėjus MG132, sumažinus Δ40p53 lygį, su Rpn2 nutildymu arba be jo. Visi šie duomenys rodo, kad 20S, o ne 26S proteasomas, palengvina Δ40p53 formavimąsi.

Δ40p53 moduliuoja p53 geno raišką

Norėdami ištirti, ar Δ40p53 moduliuoja p53 transkripcinį aktyvumą, mes H1299 ląsteles kartu transfekavome su FLp53 ir Δ40p53. Kaip kontrolė, FLp53 ir Δ40p53 buvo transfekuoti atskirai. Ląstelės buvo surinktos ir RNR buvo ekstrahuota. Gerai apibūdintų tikslinių genų p21 ir BTG2 mRNR ekspresijos lygiai buvo išmatuoti kiekybine realaus laiko PGR. Kaip ir tikėtasi, FLp53 raiška paskatino tikslinių genų ekspresiją (4a ir b paveikslai). Priešingai, pridėjus Δ40p53 santykiu 1: 1 (FLp53 + Δ40p53), reikšmingai sumažėjo p21 ir BTG2 lygis. Šie rezultatai atitinka ankstesnes ataskaitas, leidžiančias manyti, kad Δ40p53 sukelia dominuojantį neigiamą poveikį WT FLp53 funkcijai. 18, 34, 35

Image

Δ40p53 susilpnina FLp53 transkripcinį aktyvumą . ( a, b ) H1299 ląstelės buvo laikinai kotransfekuotos naudojant 1 μg PSVL-p53 vektorių, išreiškiantį viso ilgio p53 (FLp53), ir 1 μg SV-p53Δ40 vektorių, išreiškiantį Δ40p53 (Δ40p53). Kaip kontroliniai, ląstelės buvo transfekuotos tik tuščiu vektoriu (Con), 1 μg PSVL-p53 (FLp53) ir 4 μg SV-p53Δ40 (Δ40p53) vektoriais. Po 48 h ląstelės lizuojamos ir RNR ekstrahuojama. P53 taikinių genų p21 ( a ) ir BTG2 ( b ) mRNR ekspresijos lygiai buvo išmatuoti kiekybiniu realaus laiko PGR, naudojant specifinius pradmenis. (c – e), kaip nurodyta, H1299 ląstelės buvo nuosekliai kotransfekuotos su 5 μg FLp53 ir Δ40p53, kaip nurodyta. Kaip kontroliniai, ląstelės buvo transfekuotos tuščiu vektoriu (Con) arba 5 μg FLp53. Išgrynintas A40p53 buvo naudojamas kaip teigiama baltymo dydžio kontrolė. Po 24 valandų ląstelės lizuojamos, o baltymai ir RNR buvo išgauti. c ) Vakarų blotai, rodantys FLp53 ir Δ40p53 baltymų lygius. GAPDH tarnavo kaip pakrovimo valdymas. Kaip matyti, stiprus 404055 SV40 promotorius sąlygojo aukštą baltymo ekspresijos lygį, palyginti su FLp53, kurį sudaro vėlyvasis SV40 promotorius. Todėl serijiniai Δ40p53 skiediniai buvo kartu transfekuoti su FLp53, o p21 ( d ) ir BTG2 ( e ) mRNR ekspresijos lygiai vėliau buvo išmatuoti kiekybiniu realaus laiko PGR, naudojant specifinius pradmenis. Rezultatai rodo, kad net žemo 40p53 lygio pakanka, kad susilpnėtų FLp53 funkcija ir sumažėtų p21 ir BTG2 raiškos lygiai. Genų ekspresijos lygis buvo normalizuotas iki GAPDH. Grafikai rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį. Klaidų juostos žymi SE

Visas dydis

Atsižvelgdami į santykinai didelę Δ40p53 baltymo ekspresiją, palyginti su FLp53 (4c pav.), Toliau ištyrėme, ar žemas 4040p53 lygis taip pat gali modifikuoti p53 transkripcinį aktyvumą. Šiuo tikslu mes H1299 ląsteles kartu su pastoviu FLp53 kiekiu ir Δ40p53 plazmidės praskiedimais iš bendrai transfekuotų iš FLp53 / Δ40p53 santykio 1: 0, 25–1: 0, 001 (4c paveikslas). Tada ląstelės buvo surinktos ir mRNR buvo ekstrahuota. Mūsų rezultatai parodė, kad nors FLp53 transfekcijos kiekiai nepasikeitė, baltymo lygis sumažėjo, koreliacijoje su mažesne 40p53 plazmidės doze (4c paveikslas). Tai rodo, kad Δ40p53 stabilizuoja FLp53, tikriausiai dėl to, kad nėra MDM2 jungimosi, kaip parodyta anksčiau. 36 Pažymėtina, kad mažinant p21 ir BTG2 ekspresijos lygius, pakanka nedidelių 40p53 skiedimų, kuriuose išreikšto baltymo net neįmanoma aptikti (4c paveikslas) (4d ir e paveikslai). Taigi p53 transkripcijos aktyvumui susilpninti pakanka žemo Δ40p53 lygio ląstelėse. Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad FLp53 / Δ40p53 sąveika moduliuoja p53 transkripcijos aktyvumą ir veikia kaip p53 neigiamas reguliatorius.

Pilno ilgio p53 ir Δ40p53 ląstelėse sudaro hetero-tetramerius

FLp53 ir Δ40p53 hetero-oligomerinių kompleksų susidarymas galėtų pateikti pagrįstą paaiškinimą, kodėl Δ40p53 slopinamas transaktyvacijos link FLp53. Iš pradžių mes išnagrinėjome šią galimybę taikydami gimtosios valstybės narės metodą. Spektrai buvo gauti sumaišius du p53 baltymus, esant DNR. P53 baltymų mišrios trimerinės ir tetramerinės formos buvo aptiktos be DNR (5a pav.). Pridėjus DNR, stabilizuojančią tetramerinę baltymo būseną (1b paveikslas), buvo stebimi tik homo- ir heterotetramerai: (FLp53) 4 DNR, (Δ40p53) 4 DNR ir (FLp53) 2 (Δ40p53) 2 DNR (pav. 5b). Pažymėtina, kad nors teoriškai buvo galima įsivaizduoti skirtingas tetramerinių FLp53 ir Δ40p53 kompleksų kompozicijas, esant DNR, buvo pastebėtas tik FLp53 dimeras, sujungtas su Δ40p53 dimeriu, ir tai rodo padidėjusį homodimerų susidarymo polinkį.

Image

Hetero-tetramerinis p53 susidaro sujungus FLp53 ir Δ40p53 dimerus . FLp53 ir Δ40p53 buvo sumaišyti santykiu 1: 1, nesant ( a ) ir esant ( b ) DNR ( p53r2 RE), po to atlikta natūrinė MS analizė rūšių, gautų po vienos nakties inkubacijos 4 ° C temperatūroje. ( c ) H1299 ląstelės buvo laikinai transfekuotos pC53-SN3 vektoriu, ekspresuojančiu FLp53 (FLp53), arba tuščiu vektoriu kaip neigiama kontrolė (Con). Po 48 valandų ląstelės buvo lizuotos ir ląstelių ekstraktai buvo inkubuojami su monokloniniu antikūnu prieš p53 N-galą (DO-1), nukreiptu į epitopą, kuris neatsiranda Δ40p53 baltyme, kad būtų galima imunoprecipiduoti tik FLp53, arba su nespecifinis IgG antikūnas kaip neigiama kontrolė. Imuniniai nusėdimai buvo užpilti ant SDS-PAGE gelio, o p53 formos buvo aptiktos naudojant ožkų polikloninį anti-p53 krienų peroksidazės konjuguotą antikūną (p53HRP). Norėdami ištirti p53 raišką, buvo įkelti neimunifikuoti mėginiai (įvestis). Išgrynintas A40p53 buvo įdėtas kaip teigiama kontrolė. Šis paveikslas sujungia dvi to paties gelio ekspozicijas, kurias skiria vertikali linija; ilgas imunoprecipifuotų mėginių ekspozicija parodytas kairėje, o trumpas labai koncentruoto išgryninto 40p53 baltymo ekspozicija - dešinėje. Du originalūs vaizdai pateikiami papildomame 3 paveiksle. D ) HEK293T ląstelės buvo lizuotos ir ląstelių ekstraktai buvo inkubuoti su bet kokiu DO-1 antikūnu, kad imuninis nusėdimas būtų FLp53, arba su nespecifiniu IgG antikūnu kaip neigiama kontrolė. Imuniniai nusėdimai buvo užpilti ant SDS-PAGE gelio, o p53 formos buvo aptiktos naudojant p53HRP antikūną. Norėdami ištirti p53 raišką, buvo įkelti neimunifikuoti mėginiai (įvestis). Išgrynintas A40p53 buvo įdėtas kaip teigiama kontrolė. Rezultatai yra reprezentatyvus bent trijų nepriklausomų eksperimentų eksperimentas

Visas dydis

Norint ištirti, ar FLp53 / Δ40p53 heterokompleksai egzistuoja ląstelių aplinkoje, buvo atliktas bendras imunoprecipitacija, naudojant neigiamą kontrolę naudojant H1299 ląstelių ekstraktus, transfekuotus naudojant FLp53 arba tuščią vektorių. FLp53, bet ne Δ40p53, buvo imunoprecipipuotas naudojant DO-1 antikūną. Imuninės sistemos baltymai buvo aptikti Western blot metodu, naudojant p53 polikloninį antikūną. Kaip ir tikėtasi, įvedus ląstelę FLp53, galima aptikti ir FLp53, ir Δ40p53 (5c paveikslas; papildomas 3 paveikslas). Be to, Δ40p53 buvo nugriautas kartu su FLp53, tai rodo, kad 40405 prisijungia prie FLp53 baltymo. Toliau šią sąveiką patvirtinome HEK293T, endogeniškai išreikšdami FLp53 ir Δ40p53 tais pačiais eksperimentiniais nustatymais. 5d pav. Parodyta, kad endogeniniu būdu ekspresuotas A40p53 buvo kartu imunoprecipituotas su FLp53. Visi rezultatai rodo, kad FLp53 ląstelėse sąveikauja su Δ40p53.

Δ40p53 kartos padidėja oksidacinėmis sąlygomis

Oksiduojančiomis sąlygomis 20S proteasoma buvo nustatyta kaip pagrindinė skilimo mašina. 37, 38, 39, 40, 41 Todėl tikėjomės, kad tokiomis sąlygomis bus pastebimas Δ40p53 lygio padidėjimas. Norėdami patvirtinti, kad Δ40p53 susidarymas yra susijęs būtent su 20S, o ne su 26S proteosoma, mes panaudojome A31N-ts20 BALB / c pelių ląstelių liniją, turinčią temperatūrai jautrų E1 variantą. Taigi, esant ribotai temperatūrai (39 ° C), fermentas E1 yra neaktyvinamas, o baltymų ubikvitinacija ir 26S proteasomų sukeliamas skilimas slopinamas. 42

Iš pradžių mes patvirtinome, kad Δ40p53 susidarymas A31N-ts20 ląstelėse priklauso nuo 20S proteasomų. Šiuo tikslu Rpn2 buvo numuštas A31N-ts20 ląstelėse, išaugintose leistinoje temperatūroje (32 ° C). Kaip ir tikėtasi, dėl susilpnėjusio 26S proteasomų aktyvumo, FLp53 stabilizavosi ir buvo stebimas ubiquitino konjugatų kaupimasis (6a pav.). Nepaisant 26S proteasomų slopinimo, Δ40p53 formavimasis išliko. Panašiai ląstelių perkėlimas į 39 ° C aplinką, kuri apsunkina ubikvitinimo procesą, 11, 29, 42 nepašalino 40p53 susidarymo. Priešingai, apdorojant ląsteles MG132, reduced40p53 lygis sumažėjo beveik iki bazinės būklės. Apskritai, rezultatai patvirtina mūsų požiūrį, kad Δ40p53 susidarymą skatina 20S proteasomų kompleksas.

Image

Dėl oksidacinio streso padidėja Δ40p53 susidarymas. ( a ) A31N-ts20 BALB / C pelių ląstelės buvo auginamos leistinoje temperatūroje (32 ° C). Siekiant sušvelninti 26S proteasomų skilimo kelią, ląstelės buvo laikinai perkraustytos trumpais trukdančiais RNR (siRNR), nukreipiančiais į Rpn2, kad nutildytų jo raišką, arba perkeltos į ribojančią temperatūrą (39 ° C). Kaip kontrolė buvo naudojama netikslinė siRNR (NT) arba MG132. Ląstelės lizuojamos ir ląstelių ekstraktai buvo dedami į SDS-PAGE gelį, analizuota Rpn2, p53, ubiquitin pažymėtų baltymų ir GAPDH (kaip kontrolinės) ekspresija atliekant Western blot analizę. Mėginiai buvo paimti tuo pačiu geliu, o pateiktos juostos yra iš tos pačios ekspozicijos. ( b, c ) Norėdami sukelti oksidacinį stresą, 39 ° C temperatūroje kultivuojamos ląstelės buvo apdorotos 100 μM DEM ir surinktos nurodytais laiko momentais. ( b ) Ląstelėms, paveiktoms oksidacinio streso, buvo atlikta Western blot analizė ir p53 lygis buvo patikrintas naudojant anti-p53 antikūną. Juostų kiekybinis įvertinimas rodo Δ40p53 lygio padidėjimą. Namų tvarkymo baltymas GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. c ) Po oksidacinio streso sukėlimo, RNR buvo išgauta ir MDM2 bei p21 mRNR lygiai buvo išmatuoti kiekybiniu realaus laiko PGR. Genų ekspresijos lygis buvo normalizuotas iki HPRT. Kiekybinis įvertinimas parodo trijų ( a, c ) arba septynių ( b ) nepriklausomų eksperimentų vidurkį. Matavimai buvo tiriami Studento t- teste, * P 0, 05, ** P 0, 01. Klaidų juostos žymi SE ND, neaptinkamos

Visas dydis

Toliau, siekiant ištirti oksidacijos sąlygų poveikį Δ40p53 ląstelių lygiams, A31N-ts20 ląstelės buvo apdorotos dietilmaleatu (DEM) - glutationą ardančiu junginiu, sukeliančiu reaktyvių deguonies rūšių kaupimąsi ląstelėje. Tada laikui bėgant stebėjome endogeninius p53 formų lygius atlikdami imunobloto analizę, naudodami antikūną, nukreiptą į p53 C-galinę sritį, norėdami įsitikinti, kad susidariusios p53 formos atsiranda dėl N-galo, o ne nuo C- galas, skilimas (6b paveikslas). Mes nustatėme, kad, sukeliant oksidacinį stresą ribotoje temperatūroje, padidėjo Δ40p53 lygis, pasiekiantis maksimalų kaupimąsi po 1, 5 val. (6b pav.). Ši išvada sutinka su ankstesniais duomenimis, įrodančiais, kad padidėjus Δ40p53 lygiui po vandenilio peroksido poveikio. 44

Norėdami ištirti DEM sukeltos Δ40p53 įtaką p53 transaktivecijos aktyvumui, po gydymo išmatuojome p53 taikinių genų, p21 ir MDM2, mRNR lygius. Sukeliant oksidacinį stresą, kai Δ40p53 lygis padidėja (6b paveikslas), p21 ir MDM2 mRNR ekspresijos lygis buvo sumažintas (6c paveikslas). Pabrėžtina, kad p21 ir MDM2 ekspresija sumažėja esant skirtingai kinetikai. Tai gali būti dėl DNR struktūros skirtumų, chromatino struktūros ar reguliavimo dėl papildomų bendradarbiaujančių transkripcijos veiksnių. 3 Apibendrinant, šis rezultatas reiškia, kad esant oksidaciniam stresui, Δ40p53 silpnina FLp53 transkripcijos aktyvumą dominuojančiu neigiamu būdu.

Diskusija

Čia mes parodome, kad 20S proteasoma specifiškai skaido FLp53, kad susidarytų Δ40p53 izoforma, kurioje trūktų pirmųjų 40 aminorūgščių. Only one residue, Met40, differentiates between the Δ40p53 isoform generated through alternative translation initiation and the species produced by 20S proteasomal processing. However, as the first methionine residue tends to be removed after expression, the two Δ40p53 forms are actually similar proteins. In agreement with previous studies our results indicate that FLp53 oligomerizes with Δ40p53. 19, 20, 34, 45 Particularly, we suggest a defined stoichiometry wherein dimers of Δ40p53 interact with dimers of the full-length protein. Consequently, the transcriptional activity of p53 is modulated and the expression level of target genes is attenuated. Our data also reveal that under oxidative stress, Δ40p53 levels are increased in a 20S proteasome-dependent manner, leading to reduction in p53 transcriptional activity. Together our results suggest that an alternative post-translational mechanism mediated by the 20S proteasome is responsible for generating the Δ40p53 isoform so as to coordinate p53 function.

It has already been established that the cellular function of p53 is tightly controlled by numerous feedback loops. One major mechanism involves the E3 ubiquitin ligase, MDM2, which mediates p53 degradation via the ubiquitin 26S proteasome system. 46 An additional layer of functional coordination involves the existence of multiple isoforms of p53 itself and its family members, p63 and p73, which modulate the different biological activities of the protein. Here, we propose an additional mechanism for controlling p53 activation that involves 20S proteasome-mediated cleavage of p53, leading to the generation of the Δ40p53 isoform, which acts in a dominant negative manner toward FLp53. We observed decreased expression of p53 target genes when Δ40p53 was co-expressed together with FLp53, even upon low levels of Δ40p53. Moreover, under oxidative stress conditions, where the 20S proteasome is the major degradation machinery, the generation of Δ40p53 serves to attenuate p53 transcription and by that balances its activity. These results are in accordance with other studies demonstrating p53 transcriptional inhibition in a Δ40p53-dependent manner. 18, 34, 35 However, studies claiming gene-activating properties of Δ40p53 toward the p53 transcriptional response have been also reported. 20, 22 Hence, it is possible that Δ40p53 differently affects p53 activity under diverse cellular conditions, as was shown in response to DNA damage or proteotoxic stress. 19, 23, 34 Therefore, we conclude that the balance between Δ40p53 and FLp53 has an impact on the expression pattern of p53-inducible genes. Whether recruitment of diverse co-activators and chromatin remodeling factors, or different affinities toward DNA (as shown in Figure 1c) dictate Δ40p53 effect, remains elusive.

A key question that arises is why an alternative post-translational mechanism has evolved to generate Δ40p53. This may be due to the urgent need to regulate p53 function under stress conditions and following oxidative stress. Under these conditions, degradation precedes mainly through the 20S proteasome, while degradation by the 26S proteasome is compromised. 37, 38, 39, 40 Thus, 20S proteasome-mediated cleavage of p53-generating the Δ40p53 variant-may provide an immediate leverage for p53 functional coordination. Moreover, by eliminating the key binding platform for MDM2, the most stringent negative regulator of p53 abundance-the dominant negative effect of Δ40p53 on p53 transcriptional activity, may be sustained considerably. In addition, it is likely that Δ40p53 gains additional proteolytic stability through cognate DNA binding, however how this contributes to modulating p53 response remains to be investigated.

In response to low-level oxidative stress, p53 exhibits antioxidant activities promoting cell survival; high-level oxidative stress, however, leads to prooxidative p53 activities promoting cell death. 3 However, the mechanism that enables switching of p53 function from antioxidant to prooxidant remains unclear. Δ40p53 formation via the 20S proteasome may explain this paradoxical aspect of p53 activity. In this respect, it is important to note that many studies that assess p53 expression use the DO-1 antibody or alike, which are directed against p53 N-terminus. Because these antibodies do not recognize Δ40p53 it is unclear how frequent the expression of this isoform is. Thus, it remains to be examined whether other cellular stimuli also induce the 20S proteasome-mediated Δ40p53 formation.

It has been demonstrated that the 20S proteasome specifically cleaves the translation initiation factors eIF4G, a subunit of eIF4F, and eIF3a, a subunit of eIF3. 47 Like Δ40p53, the processed proteins possessed distinct functional capabilities, that is, the proteasome-mediated cleavage of eIF4G or eIF3a affects the assembly of the ribosomal preinitiation complex on different cellular and viral mRNAs. 47 Similarly, processing of the NF- κ B1 precursor p105 into a functional p50 product by the 20S proteasome was also reported. 48 Along these lines, the 20S proteasome has been shown to specifically cleave more than 20% of all cellular proteins in mammalian lysates. 49 In these cases, unlike the ubiquitin 26S proteasome degradation system, proteolysis is not dependent on the enzymatic cascade required for ubiquitination, therefore substrates can be processed instantly (reviewed in Ben-Nissan and Sharon 50 ). In conclusion, these studies together with our results, hint at a more general biological principle in which specific cleavage of cellular proteins by the 20S proteasome may not be solely for degradation purpose but rather to regulate distinct functional properties. Considering that the majority of proteasomes in mammalian cells were found to be uncapped 20S, 51, 52 and that 44% of human protein-coding genes, including numerous signaling and regulatory proteins, are predicted to contain intrinsically disordered regions, 53 making them susceptible to 20S cleavage, we anticipate that the number of proteins identified to be functionally modulated by the 20S proteasome will increase.

medžiagos ir metodai

20S proteasomos išgryninimas

Žiurkės kepenys buvo pasirinktos kaip 20S proteasomų šaltinis, atsižvelgiant į aukštą evoliucinį subvienetų sekų, esančių tarp žmogaus ir žiurkės, išsaugojimą (> 96% tapatumas). Natūraliosios žiurkės 20S proteasomos gryninimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, žiurkių kepenys buvo homogenizuotos buferiniame tirpale, kuriame yra 20 mM Tris-HCL (pH 7, 5), 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolio (DTT) ir 250 mM sacharozės. Ekstraktas centrifuguojamas, pirmiausia 15 min. Naudojant 1000 x g . Tada supernatantas praskiedžiamas iki 400 ml iki galutinės 0, 5 M NaCl ir 1 mM DTT koncentracijos ir 2, 2 h ultracentrifuguojamas esant 145 000 × g . Supernatantas vėl buvo centrifuguojamas 150 000 x g 6 val. Granulės, turinčios proteasomas, buvo pakartotinai suspenduotos 20 mM Tris-HCl (pH 7, 5) ir supilstytos į 1, 8 l Sepharose 4B dervos. Frakcijos, turinčios 20S proteasomą, buvo identifikuojamos pagal jų sugebėjimą hidrolizuoti flurogeninį peptidą suc-LLVY-AMC, esant 0, 02% SDS. Tada baltymų turinčios frakcijos buvo sujungtos ir sukrautos į keturias iš eilės einančias anijonų kolonėles: „Source Q15“, „HiTrap DEAE FF“ ir „Mono Q 5/50 GL“ („GE Healthcare“, Čikaga, IL, JAV). Elucija buvo atlikta su 0–1 M NaCl gradientu. Aktyvios frakcijos buvo sujungtos ir buferis buvo pakeistas į 10 mM fosfato buferį (pH = 7, 4), kuriame yra 10 mM MgCl2, naudojant 10 kD „Vivaspin“ 20 ml kolonėles („GE Healthcare“). Tada mėginiai buvo įpilti į CHT keramikos hidroksiapatito koloną (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, JAV); eliucijai buvo naudojamas tiesinis 10–400 mM fosfato buferio gradientas. Išgrynintos 20S proteasomos buvo analizuojamos SDS-PAGE, aktyvumo ir MS analizėmis.

26S proteasomų valymas

26S protesomo gryninimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau. 54

Rekombinantinių FLp53 ir Δ40p53 ekspresija ir gryninimas

Norėdami padidinti tirpios p53 ekspresijos išeigą, lipoilo domeno žymė buvo klonuota WT FLp53 geno N-terminale, o po to - TEV proteazės skilimo vietoje, kaip padaryta anksčiau. 54 Δ40p53 ekspresijos konstruktas buvo sukurtas tokiu pačiu būdu. Tada p53 sulieti baltymai buvo ekspresuojami Escherichia coli BL21 (DE3) ląstelėse, kaip aprašyta anksčiau, 54 su kai kuriomis modifikacijomis. Trumpai tariant, 1, 5 l kultūros 2YT buvo auginamos 37 ° C temperatūroje iki logfazės, 30 minučių atvėsintos iki 16 ° C, indukuotos 1 mM IPTG ir kultūros, papildytos 0, 1 mM ZnCl 2. Ekspresija buvo vykdoma 16–22 h. esant 16 ° C.

Bakterijų ląstelių granulės lizuojamos lizės buferiu (50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 1 x Roche EDTA neturintis proteazės inhibitoriaus kokteilis, 10 mM β -merkaptoetanolio) ir išvalytas lizatas, įpiltas į nikelio afinitetinę dervą, išlygintą A buferiu. (50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolo, 10 mM β- merkaptoetanolio). Vėliau surišti baltymai išplaunami buferiniu tirpalu B (50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 300 mM imidazolo) ir per naktį dializuojami, naudojant dializės buferį (25 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 300 mM NaCl, 10% glicerolio (v / v), 5 mM DTT) su TEV proteaze. Dializuotas baltymas buvo praskiestas 10 kartų į skiedimo buferį (25 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 10% glicerolio (tūris / tūris), 5 mM DTT) ir supiltas į Q-Sefarozę, išlygintą buferiniu tirpalu A1 (25 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 30 mM NaCl, 10% glicerolio (tūris / tūris), 5 mM DTT). Elucija buvo atlikta tiesiniu NaCl gradientu iki 100% buferio B1 (25 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 1 M NaCl, 10% glicerolio (tūris / tūris), 5 mM DTT). Didžiosios frakcijos buvo sukoncentruotos iki 5–7 mg / ml ir supilamos į „Superdex200 10/30“ dydžio išskyrimo kolonėlę, subalansuotą su GF buferiu (50 mM natrio fosfato, pH 7, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0, 5 M arginino), kuris taip pat buvo buvimo ir saugojimo buferis.

Skaidymo tyrimai

Atsižvelgiant į ribinį išgryninto endogeninio FLp53 baltymo 56, kuris lengvai denatūruojasi 37 ° C temperatūroje, šiluminį stabilumą, skilimo tyrimai buvo atlikti naudojant skirtingus p53 / 20S proteasomų santykį vienu metu, o ne atliekant laiko tėkmės tyrimą. Tiksliau, 5 μM išgrynintas p53 baltymas buvo inkubuotas su serijiniais 20S proteasomų skiedimais, esant proteasomų inhibitoriui MG132, arba jo nebuvo, ir inkubuotas 37 ° C temperatūroje 45 minutes. Norint ištirti DNR jungimosi įtaką skilimui, 10 kartų didesnis molinis p53r2 duplekso B (5′-ttTGACATGCCCAGGCATGTCTa-3 ′) perteklius buvo inkubuotas su p53 ant ledo 30 minučių prieš pridedant proteasomas. Proteolizė buvo užgesinta pridedant Laemmli buferio ir verdant mėginį. Mėginiai buvo analizuojami SDS-PAGE, po to dažant koomassę. Kaip alternatyva, 50 μg ląstelių ekstraktų buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 120 minučių su skilimo buferiu (10 mM Tris (pH 7, 5), 50 mM NaCl, 2 mM DTT) ir serijiniais 20S baltymų skiedimais, esant arba neturint. proteasomų inhibitorius MG132. Proteolizė buvo užgesinta pridedant mėginio buferio (140 mM Tris (pH 6, 8), 22, 4% glicerolio, 6% SDS, 10% β- merkaptoetanolio ir 0, 02% bromfenolio mėlynojo) ir verdant mėginį. Mėginiai buvo analizuojami SDS-PAGE, po to atlikta Western blot analizė.

Gimtosios masės spektrometrijos analizė

Prieš atliekant MS matavimus, baltymų mėginių alikvotinės dalys buvo keičiamos buferiu 2–3 kartus į 500 mM amonio acetato, naudojant „Bio-Spin 6“ kolonėles („Bio-Rad“) arba namuose paruoštas gėlinimo kolonėles, supakuotas su „Sephadex G-25“ („GE Healthcare“). Kiekvienam MS eksperimentui apie 2 μl buferio, kuriame pasikeista, pavyzdžio (~ 10 μM ) buvo įpilta į vidiniu būdu paruoštas borosilikato adatas. 54 MS analizė buvo atlikta naudojant Synapt HDMS instrumentą (WATERS, Milford, MA, JAV). Natūralių kompleksų perdavimui būdingi prietaiso parametrai buvo šie: atraminis slėgis (mbar) = 4, kapiliarinė įtampa (kV) = 1, 1–1, 3, mėginio ėmimo kūgio įtampa ( V ) = 80–100, ištraukimo kūgio įtampa ( V ) 0– 2, nanoflow dujų slėgis (Bar) = 0–0, 15, gaudyklės susidūrimo energija ( V ) = 12–20, pernešimo susidūrimo energija ( V ) = 2–12, gaudyklės dujų srautas (ml / min.) = 1, 5–3, 5, gaudyklės šališkumas įtampa ( V ) = 0–15.

Elektroforetinio judėjimo poslinkio tyrimai

DNR surišimo tyrimai buvo atlikti atidžiai laikantis anksčiau paskelbtų protokolų. 57, 58 Trumpai tariant, DNR dupleksas, apimantis konsensuso 20 bazės porų ilgio p53 RE ir ekstrahelialinius timidino nukleozidus 5′-gale (5′-tGGGCATGTCCGGACATGCCC-3 ′), radioaktyviai buvo pažymėtas [ γ - 32 P]. ATP ir išgrynintas nuo 10% poliakrilamido gelio denatūravimo, po to per naktį atkaitinamas iki kambario temperatūros. Pažymėta DNR ir išgrynintas WTp53 arba Δ40p53 buvo inkubuojami 2 valandas 20 ° kampu reakcijos mišiniuose, kuriuose yra <1 nM DNR ir nuosekliai praskiestas p53 baltymas, svyruojantis nuo 12 μM iki 2 nM buferyje, pagamintame iš 50 mM Tris HCl (pH 7, 5), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 25 V / ml BSA, 10% glicerolio, 10 mM DTT ir 100 mM KCl. Baltymų ir DNR mišiniai buvo atskirti ant 6% nedenaturuojančio akrilamido gelio ir juostos buvo vizualizuotos „GE Typhoon FLA7000“ fosfovaizdu. Vertinant baltymų ir DNR afinitetus per EMSA, reikia pažymėti, kad tikrosios Kd vertės yra mažesnės (ty, didesnis surišimo afinitetas), nes baltymų frakcija, skirta prisijungti prie sekos specifinei DNR, yra mažesnė nei pradiniuose reakcijos mišiniuose. Šis reiškinys atsiranda dėl baltymų polinkio kauptis, kaip rodo gelio šulinių aukšto intensyvumo juostos.

Ląstelių linijos, transfekcijos ir gydymas

Nesmulkialąstelinė plaučių karcinomos ląstelių linija NCI-H1299 buvo palaikoma RPMI-1640 terpėje, papildyta 10% veršienos vaisiaus serumu (FCS) ir Pen / Strep tirpalu (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Izraelis). Ląstelės buvo auginamos drėkintame inkubatoriuje, esant 37 ° C ir 5% CO 2 . Perkėlimai į NCI-H1299 ląsteles buvo atlikti naudojant jetPEI reagentą (Polyplus transfekcija, Niujorkas, NY, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Transformuotos žmogaus embrioninių inkstų ląstelės, HEK293T ląstelių linija buvo palaikomos DMEM terpėse, papildytose 10% FCS, 2 mM l-gliutamino, 1 mM natrio piruvato ir Pen / Strep tirpalu (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Izraelis). A31N-ts20 BALB / C pelių ląstelėse, augintose 32 ° C, buvo sukeltas oksidacinis stresas. Kad sukeltų oksidacinį stresą, ląstelės 24 valandas buvo perkeltos į 39 ° C ir po to apdorotos 100 μM DEM. Vėliau ląstelės buvo surinktos skirtingais laiko momentais ir analizuojamos imunobotologiniu būdu, kaip nurodyta. Atsižvelgiant į tai, kad pelėje yra alternatyvus sujungtas p53 su pakeistu C galu, 59 Pab421, pelės antikūnas prieš p53 C galinę sritį, buvo naudojamas siekiant užkirsti kelią galimam juostų sutapimui. Baltymų lygio padidėjimas buvo išmatuotas padalijus juostos intensyvumą Δ40p53 iš FLp53 ir Δ40p53 juostų intensyvumų sumos. Atsižvelgiant į tai, kad šiame eksperimente A31N-ts20 ląstelės jau buvo veikiamos dviejų skirtingų tipų stresorių (26S proteasomų skilimo slopinimas ir oksidacinis stresas), kontrolinio eksperimento, kuriame dalyvavo proteasomų inhibitorius MG132, negalėjo atlikti, nes ląstelės mirė. . Vertių vidurkis apskaičiuojamas per septynis nepriklausomus eksperimentus; klaidos reprezentuoja S.Es.

Tyrimų nutildymui buvo naudojamos šios siRNR: „Dharmacon ON-TARGET“ ir žmogaus PSMD1 (5707) siRNR (L-011363-01-0005), „Dharmacon siGenome“ netaikomas „siRNA Pool Nr. 2“ (D-001206-14-05) ir IDT „Trifecta Kit Mouse DsiRNA“ (mm.Ri.Psmd1.13.1, 2, 3). Pagal gamintojo instrukcijas HEK293T ląstelių transfekcijai buvo naudojamas JetPrime transfekcijos reagentas (Polyplus transfection, Niujorkas, NY, JAV). Prieš transfekciją augimo terpė buvo pakeista terpe, kurioje yra redukuoto FCS (2%). Elektriniam A31N-ts20 BALB / c transfekcijai, 1 × 106 ląstelės buvo sumaišytos su 150 pmol siRNR ir perkeltos pagal gamintojo nurodymus, naudojant 125 V impulsinį impulsą 5 ms. Po elektroporacijos ląstelės buvo kultivuojamos 32 ° C temperatūroje 24 valandas, po 24 valandų inkubacijos 32 ° C temperatūroje, ir ląstelės buvo perkeltos į 39 ° C dar 24 valandas. Praėjus maždaug 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės 3 valandas buvo gydomos proteasomų inhibitoriumi MG132 (40 μM ), surinktos ir išanalizuotos imunobotologiniu būdu, kaip nurodyta.

Junginiai ir plazmidės

WT p53 ekspresijos plazmidę pC53-SN3, turinčią p53 5′-UTR koduojančią sritį, taip pat proksimalinę 3′-UTR sekos nereguliacinę dalį, maloniai pateikė B Vogelstein (Johns Hopkins universiteto medicinos mokykla, Baltimorė, MD, JAV). Šis vektorius buvo naudojamas kaip šablonas nukreipiant į vietą nukreiptą mutagenezę, kad būtų gauta plazmidė, turinti p53 su M40I mutacija (p53 M40I ).

P53 M40I nešanti plazmidė buvo sukonstruota atliekant į vietą nukreiptą mutagenezę, naudojant „QuickChange“ rinkinį (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas, naudojant specifinius pradmenis, kad būtų sukurta specifinė mutacija, pakeičianti ATG kodoną (metioniną) 40 padėtyje. ATA kodonas (izoleucinas). Buvo naudojami šie gruntai:

Pirmyn: 5′-CCCTTGCCGTCCCAAGCAATAGATGATTTGATGCTGTCCC-3 ′

Reversas: 5′-GGGACAGCATCAAATCATCTATTGCTTGGGACGGCAAGGG-3 ′

Δ40p53 ekspresuojantis vektorius SV-p53Δ40 maloniai pateikė prof. Jean-Christophe Bourdon (Dandžio universiteto Ninewells ligoninė, Onkologijos ir molekulinės medicinos centras, CR-UK ląstelių transformacijos tyrimų grupė, Dundee, JK). PSVL-p53 vektorius, išreiškiantis vektorių. WTp53 pilnasis ilgis (FLp53) buvo sukonstruotas klonuojant žmogaus WTp53 cDNR seką į PSVL ekspresijos vektorių, kaip aprašyta anksčiau. 60

Western blot analizė

Ląstelės buvo lizuotos Tris tritono lizės buferiu (TLB) buferiu (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0, 5% natrio deoksicholato ir 0, 1% SDS), papildytu proteazės inhibitoriaus mišiniu (EMD Millipore) 20 val. min ant ledo. Ekstraktai buvo tiriami dėl baltymų koncentracijos BCA baltymų tyrimu („Thermo Fisher Scientific“). Elektroforezei atlikti 50 μg baltymų ekstraktų buvo ištirpinti mėginių buferyje (140 mM Tris (pH 6, 8), 22, 4% glicerolio, 6% SDS, 10% β -merkaptoetanolio ir 0, 02% bromfenolio mėlynojo), virti ir įpilti į 10% poliakrilamido gelius. turinčios SDS. Baltymai buvo perkelti į nitroceliuliozės membranas. Membraniniam dažymui buvo naudojamas „Ponceau S“ dažymas („Sigma-Aldrich Corporation“), norint įvertinti baltymų kiekį. Buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: triušio polikloninis anti-p53, H47 (gaminamas mūsų laboratorijoje); ožkų polikloninis anti-p53 krienų peroksidazės konjuguotas (R&D Systems, Mineapolis, MN, JAV) PAb421 pelių monokloninis anti-p53, nukreiptas į C-galą, buvo išgrynintas iš asketiškų skysčių, pelių monokloninis anti-p53 antikūnas DO-1, nukreiptas prieš p53 N ′ gale esantys 21–25 likučiai, neįtraukti į Δ40p53 izoformą (maloniai parūpina prof. seras Davidas Lane'as (p53 laboratorija, A * STAR, Singapūras). Baltymų ir antikūnų kompleksai buvo aptikti krienų peroksidaze konjuguotu antriniu būdu. antikūnai ir ECL rinkinys („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV), naudojant vaizdo gavimo sistemą „ChemiDoc MP“ („Bio-Rad“).

Bendras imuninis nusodinimas

Ląstelės lizuojamos lizės buferiu (20 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 0, 5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolio, 10% glicerolio), papildytos proteazės inhibitoriaus mišiniu (EMD Millipore, Billerica, MA, JAV) 20 minučių ant ledo. Ekstraktai 2 valandas iš anksto išvalomi su 30 μl A baltymo granulių (Santa Cruz Biotechnology, Dalasas, TX, JAV). Po išankstinio valymo, ekstraktai buvo analizuojami pagal baltymų koncentraciją BCA baltymų tyrimu („Thermo Fisher Scientific“) ir 500 μg baltymų ekstraktų buvo inkubuojami su pelės monokloniniu anti-p53 antikūnu DO-1, nukreiptu į p53 N ’galą, tai yra neįtrauktas į Δ40p53 izoformą (maloniai teikia prof. seras Davidas Lane'as (p53 laboratorija, A * STAR, Singapūras)) arba su nespecifiniu IgG kaip neigiama kontrole (Sigma-Aldrich Corporation, Sent Luisas, MO, JAV). Imuniniai kompleksai buvo nusodinami per naktį 4 ° C temperatūroje, po to inkubuojami su baltymo A granulėmis dar 2 valandas. Imuniniu būdu nusodinta medžiaga tris kartus plaunama PBS. Tada nuosėdos vėl buvo suspenduotos SDS mėginio buferyje ir išanalizuotos atliekant Western blot analizę, naudojant ožkų poliklonalumą. anti-p53 krienų peroksidaze konjuguotas antikūnas, atpažįstantis tiek FLp53, tiek Δ40p53 baltymus.

RNR išskyrimas ir kiekybinis realaus laiko PGR

Visa RNR buvo išskirta naudojant „NucleoSpin“ rinkinį (Macherey – Nagel, Duren, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. 2 μg visos RNR alikvotinė dalis buvo perrašyta atvirkščiai, naudojant Bio-RT (Bio-Lab, Jeruzalė, Izraelis) ir atsitiktinius heksamerinius pradmenis (New England Biolabs, Ipswich, MA, JAV). QRT-PGR buvo atlikta naudojant „ABI StepOne“ instrumentą („Applied Biosystems“, Foster City, CA, JAV), naudojant „Platinum SYBR Green FastMix“ (Quanta Biosciences, Beverly, MA, JAV). Buvo sukurti specifiniai pradmenys šiems genams: žmogaus BTG2, žmogaus p21WAF pelės MDM2, pelės p21WAF. Genų ekspresijos lygis buvo normalizuotas atitinkamai pagal žmogaus GAPDH ir pelės HPRT žmogaus ir pelės ląstelėse (pradmenų sekos išvardytos papildomose lentelėse S1 ir S2). QRT-PGR duomenys aprašomi savavališkai.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento ląstelių mirties ir diferenciacijos svetainėje (//www.nature.com/cdd)