Postsinapsiniai srovės sprogimai nurodo veikimo potencialą šaudyti laipsniškoje sinapsėje | gamtos komunikacijos

Postsinapsiniai srovės sprogimai nurodo veikimo potencialą šaudyti laipsniškoje sinapsėje | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Veiksmų potencialo generavimas
  • Sinapsinis perdavimas
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2014 m. Gegužės 14 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Nematodo neuronai paprastai sukuria laipsnišką potencialą, o ne veikimo potencialą. Neaišku, kaip klasifikuoti potencialai fiziologinėmis sąlygomis kontroliuoja postsinapsines ląsteles. Čia parodyta, kad postsinapsinės srovės dažnai pasireiškia „ Caenorhabditis elegans“ nervų ir raumenų jungčių plyšimais . Cholinerginiai pliūpsniai kartu su palengvintu veikimo potencialu šaudymu, padidėjusiu citozoliniu [Ca 2+ ] ir raumenų susitraukimu, tuo tarpu GABAerginiai pliūpsniai slopina veikimo potencialą. Smūgiams, besiskiriantiems nuo dirbtinai sukeltų reakcijų, būdinga nuolatinė srovė (pirminis su sprogstamaisiais susijusio krūvio perdavimo komponentas) ir padidėjęs postinapsinių srovės įvykių dažnis ir vidutinė amplitudė. Nuolatinę cholinerginę postsinapsinę srovės pertrauką daugiausia įtakoja levamisole jautrūs acetilcholino receptoriai, o tai gerai koreliuoja su receptorių mutantų lokomotyvo fenotipais. Pašalinus komandinius interneuronus, pašalinami sprogimai, o mutavus SLO-1 K + kanalą, kuris yra stiprus presinapsinis egzocitozės slopiklis, labai padidina vidutinę sprogimo trukmę. Šie stebėjimai rodo, kad motoneuronai kontroliuoja raumenis gamindami postsinapsinius srovės pliūpsnius.

Įvadas

Rūšiuotos sinapsės perduoda informaciją, užkoduotą presinapsinių neuronų ar jutimo receptorių ląstelių, kurios neturi ugnies potencialo (AP). Jų buvo rasta daugelyje rūšių, įskaitant žinduolius, ir jie prisideda prie įvairių sensorinių ir lokomotyvų funkcijų 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Rūšiuotų sinapsių požymis yra tas, kad presinapsinė ląstelė gamina laipsniškus rezultatus, atsižvelgiant į ląstelės gaunamų dirgiklių stiprumą. Tačiau postsinapsinės srovės (PSC), kuria grindžiami fiziologiniai atsakai, savybės yra silpnai apibūdinamos, nes stebimi PSC paprastai iššaukiami dirbtinai stimuliuojant presinapsinę ląstelę (pavyzdžiui, dabartinė injekcija, optogenetinė aktyvacija, ATP perfuzija ir didelė [K + ] o ). 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 . Fiziologinių PSC savybių aprašymas gali turėti didelę reikšmę norint suprasti, kaip presinapsiniai signalai kontroliuoja postsinapsinius atsakus laipsniškose sinapsėse in vivo .

C. elegans dažnai naudojamas kaip pavyzdinė sistema jutimų ir motorinių funkcijų nervų grandinėms tardyti. C. elegans neuronai nešaudo klasikinio natrio ar kalcio AP. Vietoj to, jie sukuria klasifikuotą ar bistabilų potencialą 7, 9, 10, kas rodo, kad sinapsinis perdavimas greičiausiai yra laipsniškas arba turi kitų neįprastų savybių. Naujausi tyrimai rodo, kad presinapsinių neuronų optogenetinė stimuliacija sukelia PSC, kurių didžiausia amplitudė yra stimulo stiprumo funkcija 5, 6, 7, o tai atitinka laipsnišką sinapsių perdavimą. Tačiau optogenetiniu būdu sukeliami PSC gali skirtis nuo fiziologinėmis sąlygomis atsirandančių, nes optogenetiniai dirgikliai dažnai naudojami esant 5, 6, 7 soties stiprumui, ir juos komplikuoja greita kanadrodopsin-2 (ChR2) 11, 12 inaktyvavimo savybė.

C. elegans kūno sienelės raumenų ląstelės sudegina visus APB 13, 14 arba jų visai nėra, tuo tarpu jų vidiniai motoneuronai greičiausiai sukelia laipsniškus signalus 5, kurie primena pirmąją žinduolių klausos sistemos sinapsę (tarp plaukų ląstelių ir kochlearinių nervų) ir antrąją sinapsę. žinduolių regos sistemoje (tarp bipolinių ir ganglinių ląstelių). Šis tyrimas atskleidžia, kad sliekų pernešimas nervų ir raumenų sankryžoje (NMJ) yra užkoduotas PSC pliūpsniais. Funkciniai panašumai tarp C. elegans NMJ ir kai kurių kitų aukščiau aprašytų klasifikuotų sinapsių rodo, kad PSC pliūpsnių naudojimas postsinapsinėms ląstelėms kontroliuoti gali vykti ir kai kuriose kitose rūšiuotose sinapsėse.

Rezultatai

PSC pertrūkiai tuo pat metu vyksta gretimose raumenų ląstelėse

Įrašinėdami endogeninius PSC prie C. elegans NMJ, kirminas dažnai sukiojasi galvą ir uodegą ir rodo raumenų susitraukimus. Tai rodo, kad kai kurie endogeniniai PSC gali reikšti signalus, kontroliuojančius raumenų įtampą. Mes manėme, kad bet kokie raumenų veiklai svarbūs PSC turėtų atsirasti tuo pačiu metu šalia esančiose raumenų ląstelėse, nes šios ląstelės susitraukia ir kartu atsipalaiduoja, kad susidarytų sinusoidinis lokalizacija. Norėdami identifikuoti tokius PSC įvykius, mes užfiksavome endogeninius PSC iš gretimų raumenų ląstelių poros ir ištyrėme tuo pačiu metu vykstančių įvykių, kurie gali būti svarbūs raumenų veiklai, registravimo pėdsakus. Analizei buvo pasirinkta L2R2 pora veninių raumenų ląstelių, esančių toje pačioje padėtyje išilginėje kūno ašyje (1a pav.), Nes jas valdo tie patys motoneuronai 15, 16, bet jie turi mažai elektrinės jungties 17, 18 . Pastebėjome, kad PSC atsirado tiek retkarčiais, tiek ir sprogus. Įdomu tai, kad santykinai ilgos trukmės (> 3 s) PSC sprogimai abiejose ląstelėse visada buvo vienodi (1b pav.), O tai kėlė galimybę, kad jie atspindi fiziologinius signalus, kontroliuojančius raumenų įtampą.

Image

a ) Diagramos, vaizduojančios ventralinių kūno sienos raumenų anatomiją. Kairysis skydelis yra dešinėje pavaizduotas raumenų skerspjūvis. Dvi raumenų juostos, vadinamos kvadrantais, eina šalia ventralinio nervo laido. Raumenų ląstelės dešiniajame kvadrante yra pažymėtos kaip R1 ir R2, o kairiajame kvadrante esančios - L1 ir L2. Buvo paryškinta viena L2R2 ląstelių pora. b ) Įtampos spaustuko registravimas, rodantis, kad PSC sprogimai tuo pat metu įvyko L2R2 ląstelių poroje. Laikymo potencialas buvo –60 mV. Buvo naudojamas tarpląstelinis I tirpalas ir pipetės tirpalas I. Tik tie PSC pliūpsniai, kurie atitinka mūsų kriterijų (akivaizdus PSC dažnio padidėjimas, kai pradinis poslinkis trunka> 3 s), yra paženklinti kaip pliūpsniai.

Visas dydis

Cholinerginiai ir GABAergic PSC pliūpsniai turi priešingą poveikį

Jei PSC pertrūkiai iš tikrųjų buvo fiziologiškai svarbūs, jie turėtų būti siejami su raumenų veiklos pokyčiais. 1b pav. Parodyti PSC buvo užregistruoti esant –60 mV laikymo potencialui esant dideliam [Cl ] pipetės tirpale. Dėl to visi PSC pasirodė kaip vidiniai dabartiniai įvykiai, nors juos veikė dviejų skirtingų tipų receptoriai: acetilcholino (ACh) receptoriai ir γ-aminosviesto rūgšties (GABA) receptoriai. Norėdami įvertinti galimus cholinerginių ir GABAerginių motoneuronų fiziologinius vaidmenis, mes panaudojome eksperimentines sąlygas cholinerginiams ir GABAerginiams PSC išskirti ir išanalizavome laikinus ryšius tarp PSC pertvarų ir raumenų AP arba Ca 2+ pereinamųjų. ACh receptorių tarpininkaujami PSC buvo registruojami naudojant pipetes ir tarpląstelinius tirpalus, kurių chlorido pusiausvyros potencialas buvo lygus sulaikymo potencialui (–60 mV). GABA receptorių tarpininkaujami PSC buvo užfiksuoti palaikant membranos potencialą esant –10 mV ir naudojant skirtingus pipetės ir tarpląstelinius tirpalus 14, 19, kurie leido raumenims šaudyti AP daug greičiau, todėl buvo lengviau nustatyti slopinantį GABAerginių sprogimų poveikį. . Laiko ryšiai tarp PSC pertvarų ir raumenų AP buvo įvertinti analizuojant tuo pačiu metu užfiksuotus PSC iš vienos L2R2 poros ląstelės (užfiksuotos įtampos) ir AP iš kitos ląstelės (užfiksuotos srovės), kai AP šaudymas vienoje ląstelėje nebuvo paveiktas. sulaiko kitų ląstelių potencialą (papildomas S1 pav.). PSC pertraukų poveikis raumenų Ca 2+ pereinamiesiems rodikliams buvo įvertintas užrašant PSC iš vienos ląstelės ir Ca 2+ pereinamosios medžiagos iš gretimos ląstelės kamiene, išreiškiančiu GCaMP2 kūno sienos raumenyje 13 . Šis požiūris buvo tinkamas, nes Ca 2+ pereinamieji elementai yra sinchroniniai kaimyninių raumenų ląstelėse 18 .

Dažnai buvo stebimi spontaniniai ACC receptorių sukeliami PSC sprogimai, kurie paprastai sutriko su palengvintu raumenų AP šaudymu, Ca 2+ pereinamuoju periodu ir ląstelių trumpėjimu (2a pav. Ir 1 papildomas filmas). Bendras PSC pliūpsnių krūvio perdavimas teigiamai koreliavo su [Ca 2+ ] i ( r = 0, 86), kuris neigiamai koreliavo su raumenų ląstelių ilgiu ( r = 0, 87) (2b pav.). Šie stebėjimai rodo, kad cholinerginiai motoneuronai sukelia raumenų susitraukimus, sukeldami sužadinamuosius PSC (EPSC) pliūpsnius. Paaiškėjo, kad stebint tuo pat metu vykstantį raumenų Ca 2+ pereinamąjį laiką, PSC pertraukimo trukmė turėjo būti ilgesnė nei ~ 3 s. Įdomu tai, kad PSC pliūpsniai, rodantys laikiną koreliaciją su Ca 2+ pereinamaisiais elementais, visada buvo susiję su nuolatine srove (2 pav. Ir papildoma S2 pav.). Norėdami objektyviai išanalizuoti fiziologiškai svarbius PSC pliūpsnius, nepasikliaudami Ca 2+ vaizdavimu, PSC pliūpsnį apibrėžėme kaip akivaizdų PSC dažnio padidėjimą, kai nuolatinė srovė trunka> 3 s. Šiame tyrime kaip nuolatinės srovės sprogimo trukmė buvo naudojama nuolatinės srovės trukmė.

Image

( a, b ). Spontaniniai cholinerginiai PSC pliūpsniai buvo susiję su palengvintu raumenų AP šaudymu ( a ), padidėjusiu citozoliniu [Ca 2+ ] ir raumenų ląstelių sutrumpėjimu ( b ). Citozolinis [Ca 2+ ] buvo teigiamai koreliuojamas su bendru endogeninių PSC pertvarų krūvio perdavimu, tačiau neigiamai koreliavo su raumenų ląstelių ilgiu. Šio reprezentacinio eksperimento filmas parodytas priede (1 papildomas filmas). c ) Spontaniniai GABAergic PSC sprogimai slopino raumenų AP šaudymą. Cholinerginiai PSC pasirodė kaip vidinės srovės (deformacijos žemyn), o GABAergic PSC - kaip išorinės srovės (įlinkiai į viršų). Pėdsakai buvo iš žaibiško periodo transgeniniame kirmine, išreiškiančiame ChR2 GABAerginiuose neuronuose. Laikymo potencialas buvo –60 mV a ir b, bet –10 mV, c . Tyrimai a, b buvo atlikti su tarpląsteliniu I tirpalu ir pipetės tirpalu I (AP) arba III pipete tirpalu (PSC). C bandymas buvo atliktas su tarpląsteliniu II tirpalu ir pipetės tirpalu II.

Visas dydis

Spontaniniai PSC pliūpsniai, tarpininkaujantys GABA receptoriams, laukinio tipo kirmėlėse nebuvo lengvai stebimi. Įdomu tai, kad transgeniniame kamiene, kuris naudojamas fotostimuliacijos poveikiui GABAergic PSC sprogimams tirti (aprašyta vėliau), spontaniniai GABAergic PSC sprogimai dažnai buvo stebimi mėlynosios šviesos metu (dažnis: 1, 17 ± 0, 13 min –1 ; trukmė: 8, 72 ± 0, 66). s, n = 9) ir visada susijęs su AP šaudymo slopinimu (2c pav.). Įrašymo metu taip pat nebuvo jokio kito mikroskopo apšvietimo. Nors savaiminis GABAerginių sprogimų atsiradimo transgeniniame kamiene mechanizmas nėra aiškus, šie pastebėjimai rodo, kad GABAerginiai pliūpsniai gali atsirasti nepažeistuose kirminuose.

C. elegans judėjimą gali modifikuoti aktyvinant tempimui jautrius kanalus motoneuronuose ar kai kuriuose kituose neuronuose 20, 21, 22, 23 . Šiame tyrime viruso galva ir uodega eksperimento metu buvo leista pasislinkti, o tai galėtų paveikti PSC pliūpsnius. Norėdami nustatyti, ar taip buvo, palygėme cholinerginių PSC pliūpsnių dažnį ir trukmę tarp laukinio tipo kirminų, kurių galva ir uodega laisvai juda (Kontrolė), ir tų, kurių galva ir uodega imobilizuoti klijuojant. Mes nustatėme, kad tiek PSC pliūpsnių dažnis, tiek trukmė buvo panašūs tarp šių dviejų grupių (kontrolė 3, 05 ± 0, 40 min −1, 7, 40 ± 0, 58 s, n = 8; galva ir uodega imobilizuoti 3, 12 ± 0, 41 min −1, 7, 73 ± 0, 53 s., n = 7).

PSC sprogimai labai padidina postsinapsinį krūvio perdavimą

Norėdami suprasti, kodėl PSC pertraukos buvo pakankamos raumenų veiklai kontroliuoti, palyginome PSC savybes tarp vidinio sprogimo ir papildomo plyšimo laikotarpių. PSC dažnai pasirodė kaip daugiafaziai įvykiai (du ar daugiau PSC susiliejo kartu, negrįždami į pradinę padėtį, 3a pav., Vidurinės plokštės), ypač PSC pertraukimų metu. Įtraukti daugiafaziai įvykiai, norint įvertinti PSC dažnį, tačiau neįtraukti į PSC amplitudės, krūvio perdavimo, pusės pločio, 10–90% pakilimo laiko ir skilimo laiko kiekybinę vertę.

Image

Cholinerginių ( a ) ir GABAergic ( b ) PSC sprogimų savybės. Viršuje: PSC dažnio, vidutinės amplitudės, vidutinio krūvio perkėlimo, pusės pločio, 10–90% pakilimo laiko ir nuosmukio laiko palyginimai tarp intra ir extra purslų periodų. Dažnumas buvo išreikštas kiekybiškai iš visų PSC, o kiti parametrai buvo įvertinti tik iš vienfazių PSC. Vidurys: Vienfazių ir daugiafazių PSC mėginiai ir jų dažnio palyginimas tarp intra ir extra periodų. Apatinė dalis: pavyzdžių PSC pliūpsniai ir vidutinio krūvio perdavimo greičio ir nuolatinės srovės amplitudės palyginimai tarp ir pertrūkių, ir be pertrūkių. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant tuos pačius duomenis, pavaizduotus 2 pav. Žvaigždutė rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su papildomo sprogimo laikotarpiu ( P <0, 05, suporuotas t- testas). n = 9 tiek a, tiek b . Duomenys rodomi kaip vidurkis ± se

Visas dydis

Statistinė analizė pirmiausia buvo atlikta naudojant tų pačių eksperimentinių grupių duomenis, kaip pavaizduota 2 pav. Palyginti su ypatingais sprogimo įvykiais, vidinio sprogimo PSC reikšmingai padidino vidutinį dažnį, amplitudę ir krūvio perdavimą, bet nepakito pusės plotis. 10–90% pakilimo ir puvimo laikas (3a pav., Viršuje). Nebuvo akivaizdaus priežastinio ryšio tarp didesnės vidinės sprogstamųjų PSC vidutinės amplitudės ir nuolatinės srovės, nes vidinio sprogimo PSC amplitudė buvo nustatyta pagal pasislinkusią bazinę liniją (papildomas S2 pav.). PSC sprogimą lydėjo daugiau nei penkis kartus padidėjęs daugiafazių įvykių skaičius (3a pav., Viduryje). Vidutinis PSC įkrovos perdavimo greitis (pCs −1 ) per sprogimo periodą buvo daug didesnis nei per papildomo sprogimo periodą (3a pav., Apačia). Pagrindinis padidėjusio krūvio perdavimo greičio PSC pertraukimų metu veiksnys buvo nuolatinė srovė, kuri sudarė atitinkamai 76, 5 ir 53, 7% cholinerginių ir GABAergic vidinių sprogimų krūvio perkėlimų. GCaMP2 išraiška raumenyse neturėjo jokio poveikio ekstra- ir vidinio sprogimo PSC (papildomas S3 pav.).

Optogenetiškai sukelti PSC skiriasi nuo endogeninių sprogimų

Ankstesni C. elegans laipsniško sinapsinio perdavimo tyrimai rėmėsi opinagenetine presinapsinių neuronų stimuliacija 5, 6, 7 . Norėdami įvertinti, kokiu laipsniu optogenetiškai iškeltos postsinapsinės reakcijos imituoja endogeninius PSC pliūpsnius, kartu su dviejų padermių L2R2 ląstelių, išreiškiančių mCherry pažymėtą ChR2, cholinerginiuose ir GABAerginiuose neuronuose L2R2 ląstelių poroje, kartu pažymėjome fotoaktyvius PSC ir AP.

Kirmėlės buvo iškeltos, kai buvo arba nėra šviesą atspindinčio kofaktoriaus per-transtininės tinklainės 11, ir buvo veikiamos 2 s šviesos impulsų 30 sekundžių intervalais. Kirmėlėse, kurios buvo išaugintos tinklainėje, fotostimuliuojant cholinerginius motoneuronus, atsirado vidinis PSC ir palengvėjo AP šaudymas (4a pav.), Tačiau GABAergic motoneuronai sukėlė išorinius PSC ir slopino AP šaudymą (4b pav.). AP šaudymo greitis per išjungimo periodą 4b pav. Buvo daug didesnis nei 4a pav., Nes buvo naudojami skirtingi pipetės ir tarpląsteliniai tirpalai, o ne skirtingi įtampoje užfiksuotų elementų laikymo potencialai (papildomas S1 pav.) ). Priešingai, tinklainėje neaugantys kirminai neparodė jokio fotoaktyvaus atsako (4a pav.). Panašiai kaip foto sukeltus atsakus esant C. elegans nociceptive sensorinei sinapsei 6, NMJ išprovokuotas PSC turėjo tris svarbius komponentus, įskaitant didžiulį pradinį pereinamąjį momentą, nuolatinę srovę ir padidintą vienetinių PSC įvykių dažnį (4a pav.). Optogenetiškai sukeltos reakcijos skyrėsi nuo endogeninių PSC sprogimų tuo, kad turėjo papildomą didžiulį pradinį trumpalaikį ryšį, didesnę nuolatinę srovę ir didesnį PSC dažnį.

Image

Tyrimai buvo atlikti su transgeniniais kirminais, ekspresuojančiais ChR2, cholinerginiuose ( a ) arba GABAergic ( b ) neuronuose. Kirmėlės buvo užaugintos, esant arba nepradėjus trans- tinklainės, kaip nurodyta. PSC ir AP buvo registruojami vienu metu iš L2R2 ląstelių poros. Viršuje: Laikinieji ryšiai tarp iškeltų PSC ir raumenų AP. Horizontalios mėlynos linijos žymi mėlynos šviesos impulsus. Rodyklės žymi spontaniškus GABAergic PSC sprogimus apšvietimo laikotarpiais. Ženklas „ ^ “ rodo, kad smailė buvo nukirsta. Vidurys: įrašymo pėdsakų segmentas viršutinėse plokštėse (pažymėtas taškiniu stačiakampiu), parodytas išplėstu mastu. Pradinė trumpalaikė srovė rodoma atskirai kairėje. Apačia: PSC ir AP dažnių palyginimas tarp apšvietimo ir apšvietimo periodų ( n = 8 a ; n = 9 b ) ir tipiškų pėdsakų iš kirminų, kurie nebuvo išauginti esant tinklainei (trijų eksperimentų atstovas) tiek a, tiek b ). Žvaigždutė rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su apšvietimo periodu ( P <0, 01, suporuotas t- testas). Duomenys, parodyti a, buvo atlikti su tarpląsteliniu I tirpalu ir pipetės tirpalu I, o tie, kurie parodyti b, buvo atlikti su tarpląsteliniu II tirpalu ir pipete II tirpalu. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± se

Visas dydis

Per pirmuosius fotostimuliacijos 12 ms 100 sekundžių ChR2 suaktyvėja iki beveik 80%, todėl kilo klausimas, ar nuolatinė srovė ir didesnis PSC dažnis po didžiulės pradinės piko reakcijos buvo tiesiog likutinis piko atsako poveikis. Norėdami ištirti šią galimybę, mes stimuliavome kirminus 50 ms šviesos impulsu ir palyginome PSC dažnį trimis skirtingais intervalais nuo fotostimulijos pradžios: 500–1 000, 1 000–1 500 ir 1500–2 000 ms. PSC dažnis buvo panašus per tris skirtingus intervalus ir nesiskyrė nuo priešstimuliacijos laikotarpio. Be to, mes nenustatėme jokios nuolatinės srovės (papildomas S4 pav.). Šie pastebėjimai rodo, kad pradinis trumpalaikis poveikis neturėjo ilgalaikio poveikio.

Nuolatinės srovės priklauso nuo specifinių postsinapsinių receptorių

Kadangi nuolatinė PSC pertrūkių srovė buvo pagrindinė su sprogimu susijusio krūvio perkėlimo priežastis, svarbu nustatyti membraninius kanalus, kurie jį neštų. Pirmiausia mes išbandėme (+) - tubokurarino (TBC) ir gabazino (SR-95531), kurie atitinkamai blokuoja ACh ir GABA receptorius, poveikį C. elegans kūno ir sienos raumenims 18, 24 . Eksperimentai buvo atlikti su dviem kirminų padermėmis, ekspresuojančiomis ChR2 cholinerginiuose ir GABAerginiuose neuronuose, nes didesnė optogenetiškai iššauktų atsakų nuolatinė srovė testą padarė jautresnį. Mes nustatėme, kad nuolatinės cholinerginių ir GABAerginių PSC pertraukimų srovės buvo pašalintos atitinkamai TBC (0, 5 mM) ir gabazino (0, 5 mM) (5a pav.), Leidžiančiomis manyti, kad jas tarpininkauja raumenų ACh receptoriai ir GABA A receptoriai.

Image

( a, b ) kairėje: mėginių pėdsakai iš kirminų, išaugintų esant trans- tinklainei, parodantys (+) - TBC (0, 5 mM) ir gabazino (0, 5 mM) poveikį atitinkamai optogenetiškai iškeltiems cholinerginiams ir GABAergic PSC pliūpsniams. Horizontalios mėlynos linijos žymi mėlynos šviesos impulsus, o ženklas „ ^ “ rodo, kad smailė buvo nukirsta. Dešinė: nuolatinė cholinerginių ( n = 15) ir GABAergic ( n = 12) sprogimų srovė buvo panaikinta atitinkamai TBC ir gabazino. c ) nuolatinė cholinerginių PSC sprogimų srovė labai sumažėjo unc-29 (e1072), bet nepakito acr-16 (ok789), palyginti su laukinio tipo (WT). ( d ) Didelis pradinis chinerinerinių PSC sprogimų pradinis pereinamasis laikotarpis smarkiai sumažėjo acr-16 (ok789), bet nepakitęs unc-29 (e1072), palyginti su WT. Laikant c, d, imties dydis ( n ) buvo aštuoni kiekvienai grupei. WT grupė yra tokia pati, kaip parodyta 4 pav. Žvaigždutė (*) rodo statistiškai reikšmingą skirtumą ( P <0, 01), palyginti su kontroliniu laikotarpiu a arba b (suporuotas t- testas) arba WT grupe c ir d (vienpusė dispersijos analizė, po kurios eina Bonferroni post hoc testas). A ir b punktuose tarpląstelinis I tirpalas ir III pipetės tirpalas buvo naudojami cholinerginiams PSC registruoti, tuo tarpu tarpląstelinis II tirpalas ir II pipetės tirpalas buvo naudojami GABAergic PSC įrašymui. C ir d punktuose buvo naudojamas tarpląstelinis I tirpalas ir pipetės tirpalas I.

Visas dydis

ACh receptoriai, esantys C. elegans kūno ir kūno raumenyse, apima nikotinui jautrius receptorius (N-AChR) ir levamizolui jautrius receptorius (L-AChR). Atrodo, kad pirmasis yra homomerinis kompleksas ACR-16 subvienetui 25, 26, o antrąjį sudaro keli skirtingi subvienetai, įskaitant UNC-29 ( 27 ). Norėdami nustatyti, kuris (-i) ACh receptoriai (-iai) yra svarbūs, palyginome nuolatinės srovės amplitudę ir didelį pradinį pereinamąjį tarp laukinio tipo ir acr-16 (ok789) ir unc-29 (e1072) 24, 25, 26 mutantų . Nuolatinė srovė sumažėjo ~ 70% unc-29 mutante, bet nepakitusi acr-16 mutante (5c pav.), Tuo tarpu pradinė laikinoji srovė sumažėjo ~ 80% acr-16 mutante, bet nepakitusi unc-29 mutante. 29 mutantas (5d pav.). Šie pastebėjimai, panašūs į ankstesnio tyrimo 28 duomenis, leidžia manyti, kad pradinį pereinamąjį poveikį daugiausia veikė N-AChR, o nuolatinę srovę daugiausia L-AChR. Keista, kad PSC didžiausia srovė unc-29 mutante ( τ = 12, 38 ± 1, 25 ms, n = 8) sumažėjo lėčiau nei laukinio tipo ( τ = 4, 71 ± 0, 37 ms, n = 7) (5d pav.), Kuri galėjo atsirado dėl vystymosi pokyčių, turinčių įtakos ACh išsiskyrimui arba postsinapsiniams AChR.

Stimuliuojant komandos interneturonus, atsiranda raumenų plyšiai

Didelis pradinis trumpalaikis, kurį sukelia optogenetinė motoneuronų stimuliacija, primena išprovokuotas reakcijas, kurias sukelia arba optogenetinė, arba elektrinė C. elegans motoneuronų stimuliacija: 5, 29, 30 . Tai, kad nėra endogeninių PSC serijų, leido manyti, kad membranos įtampos pokyčiai, kuriuos sukelia motoneuronų optogenetinė stimuliacija, tikriausiai neatspindi endogeninių įtampos pokyčių. Norėdami tai patvirtinti, mes išreiškėme ChR2 komandų interneto neuronuose, kontroliuojamiems glr-1 (glutamato receptorių subvienetų) promotoriaus 31, ir užrašėme optogenetiškai PSC ir AP iš kūno sienos raumenų ląstelių. Yra žinoma, kad cholinerginius motorinius neuronus kontroliuoja komandiniai interneuronai per tarpų jungtis ir chemines sinapses 32, 33, 34, 35 . Mes manėme, kad tarpų jungtys ir cheminės sinapsės gali būti naudojami kaip žemo dažnio filtras, leidžiantis įvykti PSC pertvaroms, bet ne dideliam pradiniam pereinamajam fotoostimuliuojant komandos interneuronus. Iš tiesų tinklainėse užaugintuose kirminuose fotostimuliacija išprovokavo PSC pliūpsnius, kurie buvo kokybiškai panašūs į endogeninius PSC pliūpsnius ir jų pakako palengvinti raumenų AP šaudymą (6a pav.). Kontroliniai kirminai, kurie buvo užauginti be tinklainės, neparodė jokio PSC pliūpsnio (6c pav.). Šie stebėjimai patvirtina nuostatą, kad motoneuronai kontroliuoja kūno ir sienos raumenų ląsteles gamindami PSC pertvarėles.

Image

Eksperimentai buvo atlikti su kirminais, ekspresuojančiais ChR2, komandiniuose interneuronuose. Kirmėlės buvo užaugintos esant arba neturint visos trans- tinklainės, kaip nurodyta. a ) Mėginio pėdsakai, rodantys PSC ir membranos potencialą, vienu metu užfiksuotus iš visu trans- tinklaine užauginto kirmino L2R2 ląstelių poros. Foto stimulai (pažymėti mėlyna horizontalia linija) sukėlė PSC pertraukas, kurios palengvino AP šaudymą. Ženklas „ ^ “ rodo, kad smailė buvo nukirsta. b ) PSC ir AP dažnių palyginimas tarp įjungimo ir įjungimo periodų ( n = 7). Žvaigždutė rodo reikšmingą skirtumą ( P <0, 01, suporuotas t- testas). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± se ( c ) Mėginio pėdsakai iš sliekų, išaugintų be tinklainės, rodo, kad fotostimulius (pažymėtas mėlyna horizontalia linija) neturėjo jokio poveikio PSC (reprezentuojantis tris eksperimentus). Tyrimai buvo atlikti su tarpląsteliniu I tirpalu ir pipetės tirpalu I (AP) arba III pipete tirpalu (PSC).

Visas dydis

Cholinerginiai PSC pliūpsniai priklauso nuo komandos interneuronų

PSC sprogimai gali kilti iš motoneuronų arba juos sukelti aukštesnės eilės neuronai. Norėdami atskirti šias dvi galimybes, mes ištyrėme komandų interneuronų vaidmenį kuriant cholinerginius PSC pliūpsnius. Penkios poros komandinių interneuronų kontroliuoja cholinerginius motoneuronus per chemines sinapses ir tarpų jungtis 33 . Du specifiniai innexinai, UNC-7 ir UNC-9, atrodo, yra svarbūs tarpo sankryžų su bet kurio innexino mutacijomis komponentai, sukeliantys didelius lokalizacijos defektus. Mes išanalizavome cholinerginius PSC pliūpsnius unc-7 (e5) ir unc-9 (fc16) mutantuose , kurie yra tariami nuliniai 36, 37 . Mes nustatėme, kad PSC pliūpsnio dažnis sumažėjo daugiau nei 50% tiek unc-7, tiek irc-9 mutantuose, palyginti su laukinio tipo kirmėlėmis (7 pav.). Tai rodo, kad svarbus vaidmuo tenka elektriniam sujungimui tarp komandų interneturonų ir motoneuronų. PSC laidose. Įdomu tai, kad likę PSC sprogimai bet kuriame mutante buvo ilgesnės trukmės ir didesni vidutiniu krūvio perdavimo greičiu ir nuolatiniu srovės amplitudės laipsniu (7 pav.). Norėdami toliau įvertinti komandinių internetinių neuronų vaidmenį, mes užfiksavome chinerinerinius PSC kirminuose, kurių galva ir uodega buvo nupjauta deimanto pjovimo peiliu, kad būtų pašalinti visi komandų internetai. Šiuose kirminuose nenustatėme jokių cholinerginių PSC pliūpsnių (7 pav.). PSC pliūpsnių šiuose kirminuose nebuvo dėl pažeistų motoneuronų, nes PSC, kuriuos sukėlė fotostimuliuodami motoneuronus, išreiškiančius ChR2, negalėjo atskirti tarp kontrolinių kirminų (2, 15 ± 0, 23 nA, n = 8) ir kirminų su nupjauta galva ir uodega (2, 03 ± 0, 20). nA, n = 5). Šie stebėjimai rodo, kad cholinerginius PSC sprogimus inicijavo komandiniai interneuronai ir (arba) kiti aukštesnės eilės neuronai.

Image

a ) Pavyzdiniai PSC pėdsakai, vaizduojantys laukinį tipą (WT) ( n = 9), unc-7 (e5) ( n = 7), unc-9 (fc16) ( n = 9) ir kirminas, kuriam pašalinti visi komandų interneuronai ( galva ir uodega atmesta) ( n = 6). b ) PSC pliūpsnio dažnio, trukmės, krūvio perdavimo greičio ir nuolatinės srovės amplitudės palyginimai. Galvos ir uodegos pašalinimo grupėje visiškai trūko PSC. Žvaigždutė (*) rodo statistiškai reikšmingą skirtumą, palyginti su WT ( P <0, 05, dispersijos vienpusė analizė). Šiuose eksperimentuose buvo naudojamas tarpląstelinis I tirpalas ir pipetės III tirpalas. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± se

Visas dydis

Mutavus SLO-1 K + kanalą, padidėja PSC pliūpsnio trukmė

Ca 2+ ir įtampos K + kanalas SLO-1 yra stiprus neigiamas neurotransmiterio išsiskyrimo reguliatorius prie C. elegans NMJ 38, 39. Norėdami nustatyti, ar SLO-1 reguliuojantis vaidmuo neurotransmiterio išsiskyrime atsispindi PSC pliūpsniuose, palyginome cholinerginių PSC pliūpsnių dažnį ir trukmę tarp laukinio tipo ir slo-1 (md1745) , tariamo niekinio mutanto 38 . Šiems eksperimentams buvo naudojami kirminai, išreiškiantys GCaMP2 kūno sienelių raumenų ląstelėse 13, kad tuo pačiu metu būtų galima registruoti Ca 2+ pereinamuosius ir PSC. Vidutinė PSC pertraukų trukmė smarkiai pailgėjo slo-1 mutante, palyginti su laukiniu tipu (8 pav.), O tai atitinka slopinantį SLO-1 vaidmenį neurotransmiterio atpalaidavime. Nors PSC pliūpsnių dažnis nepakito, raumenų Ca 2+ pereinamųjų pokyčiai slo-1 mutante padidėjo> 2 kartus, palyginti su laukinio tipo (8 pav., Papildomi filmai, 2, 3). Taigi, skirtingai nei iš esmės santykis tarp cholinerginių PSC pliūpsnių ir raumenų Ca 2+ pereinamųjų tarp laukinio tipo kirminų, santykyje 1: 1, Ca 2+ pereinamųjų dažnis buvo žymiai didesnis nei slo-1 mutanto PSC pjūvių dažnis. raumenų slo-1 trūkumas bent iš dalies lemia didesnį raumenų Ca 2+ pereinamųjų dažnį40 . Šie stebėjimai rodo, kad SLO-1 gali kontroliuoti sinapsių jėgą ir raumenų aktyvumą moduliuodamas PSC pliūpsnius.

Image

a ) PSC ir raumenų Ca 2+ pereinamųjų elementų, atspindinčių laukinį tipą (WT) ( n = 9), slo-1 (md1745) ( n = 9), slo-1 (md1745), pėdsakai, išgelbėti cholinerginiuose neuronuose naudojant unc- 17 promotorius ( Punc-17 ) ( n = 7), o slo-1 (md1745) buvo išgelbėti komandų internetone, naudojant „ glr-1“ promotorių ( Pglr-1 ) ( n = 7). Šių tipinių eksperimentų Ca 2+ pereinamieji elementai yra parodyti papildomuose filmuose 2–5. b ) PSC pliūpsnių dažnio ir trukmės bei Ca 2+ pereinamųjų dažnių palyginimas tarp skirtingų grupių. Žvaigždutė (*) rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su WT, tuo tarpu svaro ženklas (#) rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su slo-1 ( P <0, 05, dispersijos analizė vienpusėje analizėje naudojant Bonferroni post hoc testus). Kiekybiniai palyginimai su vidinio ir nepageidaujamo PSC parametrais yra parodyti papildomame S5 pav. Šiuose eksperimentuose buvo naudojamas tarpląstelinis I tirpalas ir pipetės III tirpalas. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± se

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar SLO-1 veikia komandiniuose interneuronuose ar cholinerginiuose motoneuronuose, kad sureguliuotų PSC pliūpsnius, mes išanalizavome tikslinio slo-1 gelbėjimo poveikį komandų interneturonuose ir cholinerginiuose neuronuose, išreikšdami laukinio tipo SLO-1, kontroliuojamą glr-1 promotoriaus. ir unc-17 promotorius. Mes nustatėme, kad laukinio tipo SLO-1 ekspresija cholinerginiuose neuronuose arba komandiniuose interneto neuronuose iš esmės išgelbėjo slo-1 mutacijos poveikį PSC sprogimo trukmei ir visiškai išgelbėjo slo-1 mutacijos poveikį raumenų Ca 2+ pereinamiesiems (pav. 8, papildomi filmai 4, 5). Šie stebėjimai rodo, kad SLO-1 gali veikti tiek komandiniuose interneto, tiek motoneuronuose, kad sureguliuotų PSC pertraukimų trukmę.

Mes taip pat išanalizavome kitas papildomo ir vidinio chirurginio PSC savybes slo-1 mutantui ir dviem tikslinėms gelbėjimo padermėms, kaip tai darėme laukinio tipo kirminams. Šios analizės neparodė jokio reikšmingo skirtumo, palyginti su laukiniu tipu (papildomas S5 pav.). Todėl atrodo, kad SLO-1 funkcija apsiriboja PSC pliūpsnių trukmės reguliavimu.

Diskusija

Viena intriguojanti C. elegans NMJ savybė yra tai, kad spontaniniai PSC stebimi labai aukštu dažniu 41 . Spontaninių PSC fiziologinė reikšmė nebuvo aiški. Šio tyrimo rezultatai pateikia įtikinamų įrodymų, kad motoneuronai kontroliuoja raumenis gamindami PSC pliūpsnius.

PSC pliūpsniai išsiskiria iš papildomo pliūpsnio laikotarpio trimis būdingomis savybėmis: didesniu PSC dažniu, didesne vidutine PSC amplitude ir nuolatine srove. Padidėjęs PSC dažnis atspindi padidėjusią presinapsinio išsiskyrimo tikimybę. Didesnę PSC amplitudę gali sukelti įvairūs veiksniai, pavyzdžiui, presinapsinių ryanodino receptorių aktyvavimas 42 . Nuolatinė srovė atsiranda suaktyvinus raumenis ACh arba GABA receptorius. Ankstesnės ACh receptorių mutantų analizės parodė, kad N-AChR mutantai rodo smarkiai sumažėjusią iškeltų PSC amplitudę, bet yra akivaizdžiai normalūs lokomotyvuose, tuo tarpu L-AChR mutantai iš esmės sukelia normalius PSC, tačiau yra labai vangus 26 . Didesnį L-AChR mutacijos poveikį judėjimui gali sukelti daug mažesnė nuolatinė srovė, atsirandanti dėl lėto desensibilizuojančio L-AChR 24, 25, 26 nebuvimo .

PSC sprogimai buvo siejami su daugiau nei dešimteriopai padidėjusia vidutine įkrovos perdavimo sparta, palyginti su papildomo sprogimo laikotarpiu. Nepaisant to, vidutinis srovės debitas sprogimo metu vis dar buvo mažas. Kaip tokios mažos srovės gali pakakti raumenų AP šaudymui palengvinti ar slopinti? Trys C. elegans kūno sienos raumenų ląstelių savybės greičiausiai prisidėjo prie šio didelio jautrumo, įskaitant aukštą membranos įėjimo pasipriešinimą (~ 1, 5 GΩ) 17, ramybės membranos potencialą, kuris yra artimas AP šaudymo slenksčiui 13, 14, ir vidinę savybę . gebėjimas šaudyti AP 13, 43 .

Šiame tyrime laukinio tipo preparatuose nebuvo pastebėtas savaiminis GABAergic PSC pliūpsnis, kuris galėjo būti susijęs su presinapsinių įnašų į GABAergic motoneuronus trūkumu. GABAerginius veninius raumenis inervuojančius motoneuronus kontroliuoja cholinerginiai motoneuronai, kurie vidinius nugaros raumenis inervuoja per sinapses, esančias pakaušio nervo virvelėje 32 . Nors cholinerginių ir GABAerginių motoneuronų somatos yra vidurinėje pusėje, jų nerviniai procesai išsikiša į nugarinę pusę kaip apvažiavimas. Mūsų eksperimentuose šie įvykiai buvo pašalinti arba pažeisti klijais (papildomas S6 pav.). Jei GABAergic PSC pliūpsniai priklausytų nuo presinapsinių įvesties iš cholinerginių motoneuronų, kaip ir cholinerginiai PSC pjūviai priklausytų nuo presinapsinių įėjimų iš komandos Interneturons įvesties, jų dabartinėmis eksperimento sąlygomis būtų sunku pastebėti.

Laukinio tipo kirmėlėse cholinerginių PSC pertraukimų trukmė ir dažnis yra ~ 7 s ir 3 min – 1 . Manoma, kad nepažeistų kirminų cholinerginių ir GABAerginių PSC pertraukimų dažnis ir trukmė yra panašūs. Vidutinė cholinerginių PSC pertraukimų trukmė buvo panaši į kūno raumenų ląstelių Ca 2+ pereinamųjų elementų (2 pav.), Pusiau suvaržytų kirminų motorinių neuronų 44 ir nevaržomų kirminų interneto neuronų 35 trukmę. Kaip PSC pertraukimų trukmė gali būti susijusi su judėjimu? Laukiniai kirminai daugiau nei 90% laiko praleidžia judėdami į priekį. Vidutinė kiekvieno judesio į priekį trukmė yra ~ 16 s ( 35 ), o tai suteikia ~ 3 judesius pirmyn per minutę. Judėjimas į priekį yra panašus į cholinerginius PSC sprogimus laukinio tipo kirmėlėse. Ko gero, vienas PSC sprogimas NMJ atitinka vieną judėjimą pirmyn.

Gana mažas C. elegans dydis yra didelis iššūkis išsaugoti raumenų ląstelių ir neuronų fiziologines sąlygas klijavimo ir išpjaustymo metu. Bėgant metams mes pastebėjome, kad PSC dažniausiai rodė įtrūkimus preparatuose su mažiau klijų užtepimu ir trumpesniais pjūviais. Tokie preparatai dažniausiai rodė dažnai veikiamas raumenų ląsteles. Mes vengėme tokio tipo preparatų arba laukėme, kol raumenų susitraukimai sumažės, kad nepavyktų išlaikyti visos ląstelės konfigūracijos. Tačiau vėliau sužinojome, kad tokio tipo preparatuose gana lengvai gali būti palaikoma visos ląstelės konfigūracija. Šiame tyrime mes atkreipėme ypatingą dėmesį į tai, kad klijų kiekis ir pjūvio ilgis būtų kuo mažesnis, ir kiekvieno preparato (tik iš vieno langelio) įrašymą baigėme per 6–7 min. Visi netinkamai priklijuoti ir neišpjaustyti kirminai buvo atmesti prieš eksperimentą. Mūsų eksperimentuose buvo sunaudota žymiai mažiau klijų nei aprašyta kituose45 . Dėl to mūsų kirminų preparatai nuolat rodė PSC pliūpsnius. Nuolatiniai PSC plyšiai galvos ir uodegos imobilizuotuose kirminuose rodo, kad PSC sprogimai nepriklauso nuo galvos ar uodegos judesių. Vis dėlto PSC pliūpsniai buvo pašalinti kirminuose, kai buvo nukirsta galva ir uodega, ir tai leidžia manyti, kad PSC pliūpsniams greičiausiai reikia komandų interneuronų, o tai patvirtina pastebėjimai, kad komandos interneturonų fotostimuliacija gali sukelti PSC pliūpsnius, o ritminiam judėjimui reikalingi komandos interneturonai. 46 .

Trijuose naujausiuose tyrimuose 5, 6, 7 buvo atkreiptas dėmesys į C. elegans laipsniško sinapsinio perdavimo ypatybes. Tačiau nė vienas iš šių tyrimų nebuvo skirtas fiziologiškai svarbiems endogeniniams PSC apibrėžti. Atsižvelgiant į tai, kad dauguma nematodų neuronų vietoj AP 4, 9, 47 naudoja pasyvųjį sklidimą, PSC pliūpsniai gali būti naudojami postsinapsinių reakcijų kontrolei daugelyje kitų sinapsių.

Taip pat užfiksuoti išryškėjusios sinapsės tarp vidinių plaukų ląstelių ir aferentinių skaidulų kochleoje bei tarp bipolinių ir ganglioninių ląstelių sinapsėse. Iššaukti atsakymai paprastai yra vadinami EPSC. Katės ir žiurkės tinklainės gangliono ląstelėse šviesos sukeliami EPSC turi pradinę trumpalaikę srovę, po kurios eina nuolatinė srovė, nuo kurios nepavyko pašalinti atskirų PSC įvykių 48, 49 . Žiurkių klausos aferentiniuose pluoštuose EPSC, kuriuos sukelia plaukų ląstelių depoliarizacija esant dideliam tarpląsteliniam [K + ] arba teigiamos įtampos žingsniui, atrodo kaip vientisų PSC įvykių sprogimas 1, 2, 3, kai kurie iš jų greičiausiai reiškia sinchroninį daugelio sinapsių išsiskyrimą. pūslelės 50 . Kai kurios žinomų žinduolių sinapsių EPSC apibūdintos savybės primena PSC pliūpsnius C. elegans NMJ. C. elegans yra potencialiai puiki pavyzdinė sistema konservuotų sinapsių konservuotų mechanizmų tyrimui, nes ją galima pritaikyti galingais genetiniais ir elektrofiziologiniais metodais.

Metodai

C. elegans atmainos ir kultūra

C. elegans padermės, naudojamos šiame tyrime, buvo: Bristol N2 kaip laukinis tipas, unc-7 (e5), unc-9 (fc16), EG 5182 [oxIs407 (Punc-17 :: ChR2 :: mCherry lin-15) (+ ))] 5, EG5025 [oxIs351 (Punc-47 :: ChR2 :: mCherry lin-15 (+))] 5, ZW495 [zwIs132 (Pmyo-3 :: GCaMP2 lin-15 (+))] 13, ZW527 [ zwIs132 (Pmyo-3 :: GCaMP2 lin-15 (+)); slo-1 (md1745)] 40 ir ZW582 [zwIs134 (Pglr-1 :: ChR2 :: GFP Pmyo-2 :: DsRED)], ZW650 [ oxIs407 (Punc-17 :: ChR2 :: mCherry lin-15 (+)); unc-29 (e1072)], ZW651 [oxIs407 (Punc-17 :: ChR2 :: mCherry lin-15 (+)); acr- 16 (ok789)], ZW652 [zwIs132 (Pmyo-3 :: GCaMP2 lin-15 (+)); zwEx173 (Pglr-1 :: slo-1 Pmyo-2 :: YFP); slo-1 (md1745)], ZW654 [zwIs132 (Pmyo-3 :: GCaMP2 lin-15 (+)); „zwEx174“ („Punc-17 :: slo-1„ Pmyo-2 “:: YFP);„ slo-1 “(„ md1745 “)]. Visi kirminai buvo užauginti agaro lėkštelėse, pažymėtose OP50 Escherichia coli sluoksniu, esant 21 ° C aplinkos kameroje.

Elektrofiziologija

Visi elektrofiziologiniai eksperimentai buvo atlikti su suaugusiųjų hermafroditais. Kirmėlės imobilizavimo ir išpjaustymo procedūros buvo panašios į tas, kurios buvo aprašytos anksčiau 24, 38, tačiau ypatingas dėmesys buvo skiriamas kuo mažesniam klijų užpylimui ir pjūvio ilgiui sumažinti. Trumpai tariant, gyvūnas buvo imobilizuotas ant stiklinio dangtelio užklijavus „Vetbond Tissue Adhesive“ („3M Company“, St. Paul, MN). Klijai tepami tik gyvūno užpakaline priekine dalimi (išskyrus galvą), eksperimento metu galva ir uodega galėjo laisvai svyruoti. Išilgai įklijuotos srities buvo padarytas trumpas (~ 300 μm) išilginis pjūvis. Išvalius vidaus organą, odelės dangtelis buvo sulankstytas atgal ir priklijuotas prie dangtelio, atidengiant keletą venų kūno ir sienos raumenų ląsteles priešais vulvą. Du tipiniai kirminų preparatai yra parodyti atitinkamai mažu ir dideliu padidinimu papildomuose filmuose 6, 7. Preparatui peržiūrėti buvo naudojamas vertikalus mikroskopas (FN-1, Nikon, Tokijas, Japonija), turintis × 40 vandens panardinimo objektyvą (skaitmeninė diafragma 0, 8). Borosilikatinės stiklinės pipetės, kurių galiukas 3–5 MΩ, buvo naudojamos kaip elektrodai srovės ir įtampos gnybtų įrašams klasikinėje viso ląstelių pataisų spaustuko konfigūracijoje su Multiclamp 700B stiprintuvu (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), skaitmeniniu būdu ( „Digidata 1440A“, „Molecular Devices“) ir „Clampex“ programinė įranga (10 versija, „Molecular Devices“). Duomenys buvo imami 10 kHz dažniu po filtravimo 2 kHz dažniu.

AP buvo registruojami naudojant srovės spaustuko metodą be srovės įpurškimo, tuo tarpu PSC buvo registruojami naudojant įtampos gnybto metodą. Laikymo potencialas buvo –60 mV visuose įtampos gnybtų eksperimentuose, išskyrus tuos, kurie orientuoti į GABAergic PSC, kurie buvo atlikti esant –10 mV.

Ca 2+ vaizdavimas

Jauni suaugę kirminai, išreiškiantys GCaMP2, buvo suklijuoti ir užfiksuoti, norint vaizduoti kūno sienos raumenų ląstelių spontaninius fluorescencinius pokyčius, naudojant elektronus dauginantį CCD fotoaparatą („iXonEM + 885“, „Andor Technology“, Belfastas, Šiaurės Airija), FITC filtrų rinkinį (59222, „Chroma Technology“). Corp.), šviesos šaltinį („Lambda XL“, „Sutter Instrument“) ir programinę įrangą „NIS-Elements“ („Nikon“). Vaizdai buvo gaunami esant 16 kadrų per sekundę dažniui 10–40 ms ekspozicijos trukmės (be susukimo) 5 minutes. TTL signalai iš fotoaparato buvo naudojami sinchronizuoti Ca 2+ pereinamųjų elementų ir PSC įrašus.

Optogenetinė stimuliacija

Kirminai, išreiškiantys ChR2, buvo auginami L4 stadijoje įprastose kultūrinėse plokštelėse ir po to 2 dienas prieš eksperimentą perkeliami į naujas plokšteles su arba be visos trans- tinklainės. Tinklainės plokštelės buvo paruoštos apipurškiant kiekvieną plokštelę (60 mm skersmens su 10 ml agaro) su 200 μl OP50 E. coli, kuriame yra 2 mM tinklainės (R2500, Sigma-Aldrich). Fotostimuliacija buvo atlikta per vandens panardinimo tikslą, kurio dydis yra 40, naudojant 2 s impulsus 30 s intervalais, naudojant šviesos šaltinį su užraktu („Lambda XL“ su išmaniuoju užraktu, „Sutter“ instrumentą) ir 470 ± 20 nm sužadinimo filtrą (59222, „Chroma Technology“). Korporacija). Išmatuotas šviesos intensyvumas bandinio vietoje buvo 6, 7 mW mm −2, to pakako, kad būtų galima sukelti maksimalius iššaukiamus didžiausius atsakus (papildomas S7 pav.). Kietojo kūno lazerio generatoriumi (MBL-III-473, 60 mW), Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., sukurta lazerio impulsų (473 nm) koreliacija tarp sužadintų reakcijų smailės amplitudės ir fotostimulių stiprumo. Ltd, Changchun, Kinija) su savo spinduliu, nukreiptu į širdį, per optinį pluoštą (BFL37-200, Thorlabs, Newton, NJ), panardintą į įrašymo tirpalą. Opostimuliu laikui valdyti buvo naudojami TTL signalai iš skaitmenintuvo (Digidata 1440A). Šviesos intensyvumas buvo matuojamas naudojant galios matuoklį (PM100, Thorlabs), aprūpintą standartiniu fotodiodo galios jutikliu (S121C, Thorlabs).

Tirpalai ir chemikalai

Kaip nurodyta paveikslo legendose, buvo naudojami du skirtingi tarpląsteliniai tirpalai ir trys skirtingi pipetės tirpalai. I tarpląsteliniame tirpale buvo (mM) NaCl 140, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 5, dekstrozė 11 ir HEPES 5 (pH 7, 2). II tarpląsteliniame tirpale yra (mM) NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 1, dekstrozės 10, sacharozės 5 ir HEPES 15 (pH 7, 2). I pipetės tirpale yra (mM) KCl 120, KOH 20, Tris 5, CaCl2 0, 25, MgCl 2 4, sacharozė 36, EGTA 5 ir Na2 ATP4 (pH 7, 2). II pipetės tirpale yra (mM) KCl 25, Kgluconate 115, CaCl 2 0, 1, MgCl 2 5, K4-BAPTA 1, HEPES 10, cAMP 0.5, cGMP 0.5, Na2 ATP5 ir Na2 GTP 0.5 (pH 7, 2). . III pipetės tirpale yra (mM) KCl 6, 8, Kgluconate 113, 2, KOH 20, Tris 5, CaCl 2 0, 25, MgCl 2 4, sacharozė 36, EGTA 5 ir Na2 ATP4 (pH 7, 2).

(+) - TBC (T2397, Sigma-Aldrich) ir gabazinas (S106, Sigma-Aldrich) buvo ištirpinti tarpląsteliniame tirpale, kad būtų atitinkamai 50 mM ir 10 mM užšaldytų atsargų, ir pipetė į vonią, kad būtų pasiekta galutinė jų koncentracija.

Duomenų analizė

Ca 2+ vaizdavimo duomenys buvo analizuojami paskiriant atskiras ląsteles kaip atskiras dominančias sritis. Fluorescencijos intensyvumas dominančiuose regionuose per nuoseklius kadrus pirmiausia buvo nubraižytas kaip absoliutus fluorescencijos intensyvumas laikui bėgant naudojant programinę įrangą NIS-Elements (Nikon), o po to konvertuotas į F / F 0 naudojant MATLAB programinę įrangą (The MathWorks, Inc., Natick, MA) paleisti pasirinktinį modulį. Raumenų ląstelių ilgis buvo išmatuotas naudojant NIS-Elements programinę įrangą, o po to normalizuotas iki maksimalaus išmatuoto ląstelės ilgio.

PSC pertrūkiai buvo nustatyti kaip akivaizdus PSC dažnio padidėjimas, lydimas pradinės padėties poslinkio (nuolatinės srovės), trunkančio> 3 s. Sprogimo ribos buvo nustatytos remiantis akivaizdaus pradinio poslinkio pradžios ir pabaigos taškais (papildomas S2 pav.). PSC dažnis, amplitudė, krūvio perdavimas (plotas po smaile), pusės plotis, 10–90% pakilimo laikas ir skilimo laikas buvo nustatyti naudojant MiniAnalysis (Synaptosoft, Inc., Decatur, GA). Pradinėje automatinėje analizėje buvo naudojama 10 pA aptikimo slenkstis, po kurio vizualiai tikrinami siekiant įtraukti praleistus įvykius (≥ 5 pA) ir pašalinti klaidingus įvykius, atsirandančius dėl pradinio svyravimo. The software was set to search for a baseline 3 ms before a PSC event and use the average of a 1-ms period as the baseline level. In a multiphasic event, the number of PSCs was determined from the apparent PSC peaks. The mean charge transfer (pC s −1 ), mean sustained current amplitude and AP frequency were measured with Clampfit software (version 10, Molecular Devices). In quantifying spontaneous PSC bursts, the extra-burst data used for comparisons were from a 10-s period (shorter if there was a preceding PSC burst) immediately before each burst. In quantifying optogenetically evoked PSCs and APs, the first three evoked responses and 10-s data immediately before each evoked response were analysed. The first 500-ms data of each evoked response were excluded from the quantification for PSC properties and sustained current amplitude to avoid complications by the large initial transient.

Data graphing and statistical analyses were performed with OriginPro (version 8.5, OriginLab Corporation, Northampton, MA). Data are shown as mean±se Either analysis of variance (with Bonferroni post hoc tests) or t -test (paired or unpaired) was used for statistical comparisons as specified in figure legends. Laikoma, kad P <0, 05 yra statistiškai reikšmingas. The sample size ( n ) equals the number of cells or cell pairs analysed.

Papildoma informacija

How to cite this article: Liu, P. et al . Postsynaptic current bursts instruct action potential firing at a graded synapse. Nat. Bendruomenė. 4:1911 doi: 10.1038/ncomms2925 (2013).

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

    Papildomi S1-S7 paveikslai

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

    Ca 2+ transients in muscle cells and their temporal relationships with PSC bursts of a neighbouring cells. The recordings were from the same experiment shown in Figure 2b.

  2. 2.

    2 papildomas filmas

    Ca 2+ transients in muscle cells of WT worms and their temporal relationships with PSC bursts of neighbouring cells. The recordings were of a representative experiment shown in Figure 8.

  3. 3.

    3 papildomas filmas

    Ca 2+ transients in muscle cells of a slo-1(md1745 worm and the temporal relationships between muscle Ca 2+ transients and PSC bursts. The recordings were of a representative experiment shown in Figure 8.

  4. 4.

    4 papildomas filmas

    Ca 2+ transients in muscle cells of a slo-1(md1745) worm in which wild-type SLO-1 was expressed in cholinergic neurons under the control of unc-17 promoter, and the temporal relationships between muscle Ca 2+ transients and PSC bursts. The recordings were of a representative experiment shown in Figure 8.

  5. 5.

    5 papildomas filmas

    Ca 2+ transients in muscle cells of a slo-1(md1745) worm in which wild-type SLO-1 was expressed in command interneurons under the control of glr-1 promoter, and the temporal relationships between muscle Ca 2+ transients and PSC bursts. The recordings were of a representative experiment shown in Figure 8.

  6. 6.

    6 papildomas filmas

    A typical worm preparation.

  7. 7

    7 papildomas filmas

    Exposed ventral muscle cells in a typical worm preparation.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.