Galimi nauji antibiotikai, gauti iš viržių, reguliuojančių virulentiškumą reguliuojančio transkripcijos faktoriaus virf, iš shigella flexneri | žurnalas apie antibiotikus

Galimi nauji antibiotikai, gauti iš viržių, reguliuojančių virulentiškumą reguliuojančio transkripcijos faktoriaus virf, iš shigella flexneri | žurnalas apie antibiotikus

Anonim

Dalykai

  • Antibiotikai
  • Bakterinė infekcija
  • Tikslo patvirtinimas

Anotacija

VirF yra AraC tipo transkripcijos reguliatorius, atsakingas už virulentiškumo genų, reikalingų ląstelių invazijai į ląstelę ir Shigella flexneri plitimą iš ląstelių, transkripcijos suaktyvinimą . Genų sutrikimo tyrimai įteisino VirF kaip galimą antivirusinio gydymo šigeliozei gydyti tikslą, nustatant, kad VirF yra būtinas virulencijai, bet nereikalingas bakterijų gyvybingumui. Naudodamiesi bakterijomis paremtu β-galaktozidazės reporterio tyrimu baigėme didelio pralaidumo atrankos (HTS) kampaniją, stebinčią VirF aktyvumą, esant daugiau kaip 140 000 mažų molekulių. Vykdydami atrankos kampaniją, mes nustatėme penkis pagrindinius junginius, kurie turėtų būti naudojami audinių kultūrų invazijos ir ląstelių iš ląstelių plitimo bei toksiškumo tyrimuose. Mūsų stebėjimai apie aktyvumą šiuose infekcijos modeliuose patvirtino mūsų požiūrį į virulentiškumo reguliavimą ir leido mums atpažinti perspektyvius cheminius pastolius iš mūsų HTS, kad būtų galima plėtoti „į lyderį“. Įdomu tai, kad skirtingas invazijos poveikis, palyginti su plitimu tarp ląstelių, rodo, kad junginių efektyvumas iš dalies gali priklausyti nuo specifinio promotoriaus, kurį atpažįsta VirF.

Įvadas

Visuotinis atsparumas įvairiems vaistams sukėlėjas yra rimtas iššūkis žmonių sveikatai. Atsparumo vaistams, kurie yra laikomi paskutine galimybe, atsiradimas ir plitimas, pvz., Plazmidės užkoduotame Naujojo Delio metalo-β-laktamazėje, kuri suteikia atsparumą visiems β-laktamams, net ir karbapenemams 1, yra didžiausias susirūpinimas sveikatos priežiūros pareigūnams visame pasaulyje. Paūmėja ši problema yra lėtas naujų antibiotikų atradimo greitis. Nuo septintojo dešimtmečio nebuvo atrasta jokia nauja plataus veikimo spektro antibiotikų klasė ir tik keturios siauro spektro antibiotikų klasės (streptograminai: streptograminas B, oksazolidinonai: linezolidas, lipopeptidai: daptomicinas ir diarilchinolinai: bedaquiline) turėjo junginių, patvirtintų naudoti klinikoje. 2 Deja, jau buvo pastebėtas atsparumas visiems keturiems naujai patvirtintiems junginiams. 3, 4, 5, 6

Visi dabartiniai antibiotikai neigiamai veikia bakterijų gyvybingumą, todėl visi organizmai, kurie mutavo ir tampa atsparūs antibiotikams, turės selektyvų augimo pranašumą. Dėl to (arba dažnai) gali greitai atsirasti atsparių padermių. Galimas kovos su bakterine infekcija būdas, kuo labiau sumažinant atsparumo atsiradimą, yra nukreipimas į virulentiškumą, o ne į bakterijų gyvybingumą. Hipotezuojama, kad nukreipimas į virulentiškumą sukels mažiau selektyvų spaudimą atsirasti naujiems vaistams atspariems štamams, nes tikimasi, kad jie turės mažą pranašumą arba jo visai neturės. 7, 8, 9. Virulencijos terapija taip pat neturėtų pakenkti normaliai šeimininko mikrobiotai, nes terapija nukreipta į virulencijos kelius, kurių nėra nepatogeniškoje mikrobiotoje. Nors viruso terapija atrodo daug žadanti, ji vis dar yra pradiniame vystymosi etape; tačiau naujausi tyrimai pateikė vilčių teikiančių įrodymų, kad ši strategija galėtų būti veiksminga. Buvo parodyta, kad „Virstatin“, mažų molekulių „ToxT“ (kritinių virulencijos faktorių Vibrio cholerae aktyvatoriuje) inhibitorius, apsaugo peles kūdikius nuo V. cholerae žarnyno kolonizacijos. Taip pat nustatyta, kad serija benzimidazolo junginių riboja infekciją Yersinia pseudotuberculosis pneumonijos pelių modelyje, nes slopina Yersinia III tipo sekrecijos sistemos LcrF transkripcinį reguliatorių. 9, 11, 12

Anksčiau atlikome pradinius tyrimus, norėdami aptikti VirF 13 inhibitorių (Emanuele ir kt. , Neskelbta), pagrindinį S. flexneri virulencijos genų transkripcijos aktyvatorių. Mes tikime, kad VirF yra idealus taikinys priešgrybeliniam šigeliozės gydymui, nes genų ardymo tyrimai parodė, kad jis reikalingas šeimininko infekcijai, bet ne bakterijų gyvybingumui. Kaip parodyta 1 paveiksle, VirF kontroliuoja tris pagrindinius procesus, kurie yra būtini šeimininko ląstelių infekcijai. VirF suaktyvina virulentiškumo faktorių, reikalingų makrofagų apoptozės ir pabėgimo, žarnyno epitelio ląstelių invazijos ir plitimo iš ląstelių transkripciją. Mes spėjame, kad VirF aktyvumo sumažinimas atliekant bet kurį iš šių etapų sumažins virulentiškumą.

Image

VirF aktyvuojami procesai, būtini šeimininko ląstelių infekcijai. a ) Makrofagų apoptozė ir pabėgimas: VirF jungiasi prie virB promotoriaus ir aktyvuoja antrinio transkripcijos reguliatoriaus VirB transkripciją. VirB“ suaktyvina IpaB transkripciją. 28 Patekęs į makrofagą, IpaB jungiasi su kaspaze-1, sukeliančiu makrofagų apoptozę, leidžiančią Šigella ištrūkti iš makrofago. 29 b ) Žarnyno epitelio ląstelių invazija: antrinis transkripcijos reguliatorius VirB taip pat aktyvuoja IpaC ir IpaD transkripciją. 27, 28 Kartu su IpaB, IpaC ir IpaD sudaro 3 tipo sekrecijos sistemos (T3SS) adatos galiuką, kuris įkišamas į bazolaterinę žarnos šeimininko epitelio ląstelių pusę. 30, 31 T3SS į šeimininko ląstelę išskiria efektorinius baltymus, kurie skatina bakterijų invaziją. 32 ( c ) išplitimas iš ląstelių: VirF prisijungia prie icsA promotoriaus ir aktyvuoja IcsA transkripciją. 33 IcsA yra komplekso dalis, polimerizuojanti ląstelę-šeimininką, leidžiančią Shigella judėti ir plisti iš ląstelės į ląstelę. 34

Visas dydis

Ankstesniuose tyrimuose mes panaudojome bakterijomis pagrįstą, VirF pagrįstą, β-galaktozidazės reporterio testą, norėdami nustatyti ∼ 42 000 mažų molekulių, kad nustatytume VirF inhibitorius. Žurnalistų tyrimas stebėjo virB promotoriaus aktyvaciją VirF pagalba. Šiuo metu neskelbtame darbe mes taip pat patikrinome 20 000 natūralių produktų ekstraktų, naudodamiesi tuo pačiu reporterio tyrimu (Emanuele et al. , Neskelbta). Iš dviejų didelio pralaidumo ekranų mes sugebėjome atpažinti septynias mažas molekules ir 24 natūralių produktų ekstraktus, kurie slopino VirF aktyvumą. Nors natūralių produktų ekstraktų ekranuose sudėtinga tęsti veiklą, jis jau atpažino vieną žinomą antibiotiką, o dar keli ekstraktai turi būti toliau apibūdinami (Emanuele et al. , Neskelbta). Mūsų ankstesnio mažų molekulių ekrano biblioteka buvo kukli (∼ 42 000). Norėdami padidinti cheminės įvairovės diapazoną, kuriam buvo veikiami mūsų ekranai, mes čia pranešame apie mūsų mažų molekulių ekrano išplėtimą, kad apimtų dar ∼ 100 000 junginių, kad bendras mažų molekulių ekranas sudarytų apie 140 000 junginių. Per skaitiklių ir patvirtinimo ekranų seriją mes sugebėjome susiaurinti savo rezultatus iki penkių švino junginių. Tuomet šie švino junginiai buvo išbandyti invazijos į audinius ir apnašų bei apnašų susidarymo tyrimuose, siekiant nustatyti jų sugebėjimą užkirsti kelią pradinei šeimininko ląstelių infekcijai ir plitimui. Mūsų stebėjimai apie šių infekcijų modelių aktyvumą patvirtino mūsų požiūrį į virulentiškumo reguliavimą ir leido mums atpažinti perspektyvius cheminius pastolius iš mūsų HTS, kad būtų galima sukurti priešvirusinį terapiją, skirtą šigeliozės gydymui.

Rezultatai

Rezultato identifikacija

Rezultatų identifikavimo proceso santrauka parodyta 2 paveiksle. 100 000 junginių, ištirtų pirminiame ekrane (dviem egzemplioriais), pagamino 640 junginių, kurie buvo laikomi aktyviais pagal pirminius atrankos kriterijus (0, 64% atitikties rodiklis). Iš 640 aktyvių junginių 592 atitiko A atrankos kriterijų, 39 atitiko atrankos kriterijų C ir 9 atitiko atrankos kriterijų B. Pirminiame ekrane išbandytos plokštelės vidutinis Z ′ koeficientas buvo lygus 0, 66 ( Z ′ = 1 - ((3 σ) c + +3 σ c− )) / (| μ c + - μ c− |)), kur σ c + ir σ c− yra teigiamos ir neigiamos kontrolės sd, o μ c + ir μ c– yra teigiamos vidurkiai ir neigiamos kontrolės).

Image

Srauto diagrama, vaizduojanti didelio našumo patikros (HTS) atitikties identifikavimo procesą.

Visas dydis

Kitas 640 veikliųjų junginių buvo išbandytas atliekant dozės ir atsako tyrimą (dviem egzemplioriais), stebint tiek bakterijų augimo slopinimą (OD), tiek VirF slopinimą (CPRG hidrolizę). Iš 640 aktyvių junginių tik 52 slopino CPRG hidrolizę, o ne slopino bakterijų augimą tiriamų koncentracijų intervale (pavyzdžiui, MIC 50 > 100 μM). Šie 52 junginiai buvo toliau tiriami dėl tiesioginio β-galaktozidazės slopinimo, o 17 iš 52 junginių slopino β-galaktozidazę priklausomai nuo dozės. Todėl atrodė, kad tik 35 iš 640 aktyvių junginių slopina VirF aktyvumą. Iš 35 junginių tik 16 turėjo IC50 100 μM VirF slopinimui. Remdamiesi suvokiamu pastolių naujumu (dažniausiai pasitaikantys pastoliai yra mažiau pageidautini, nes jie gali turėti ne tikslinį poveikį), jų prieinamumu ir galimu toksiškumu, mes pašalinome šešis junginius iš tolesnių tyrimų. Švieži likusių 10 junginių pavyzdžiai buvo užsakyti iš komercinių pardavėjų (septyni iš „ChemDiv“, trys iš „Vitas-M laboratorijos“) pakartotinio patvirtinimo tyrimui (žemiau). Šių 10 junginių struktūros parodytos 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Pakartotinis patvirtinimas

Kiekvienas iš 10 junginių buvo patikrintas modifikuotu 96 šulinėlių plokštelės atrankos tyrimu. 2 lentelėje pateikti modifikuoto atsako į dozę tyrimo rezultatai. Iš 10 tirtų junginių tik 5 buvo dar kartą patvirtinti. Šių junginių IC50 vertės svyravo nuo 14 iki 66 μM. 3 paveiksle pavaizduotos dviejų stipriausių junginių, 19615 m. Ir 144092, dozės ir atsako kreivės. Likusių junginių dozės ir atsako kreivės pateiktos 1 papildomame paveiksle.

Pilno dydžio lentelė

Image

Pakartotinio patvirtinimo tyrimo reprezentatyvios dozės ir atsako kreivės. Visos koncentracijos buvo tiriamos trimis egzemplioriais. Vidutinis kiekvienos koncentracijos slopinimas% pateikiamas grafikuose kaip kieti juodi kvadratai. Duomenys buvo normalizuoti pagal bakterijų augimą ir prieš braižymą iš duomenų buvo pašalintas fono signalas (teigiamos kontrolės vidurkis: imituoja visišką VirF slopinimą). Kreivės atitiko lygtį, išvardytą Medžiagos ir metodai, ir brėžiniai buvo pavaizduoti kaip vientisos juodos linijos. Priepuoliams M1 = log (IC 50 ) ir M2 = kalno nuolydis. a ) 19615 m. junginio dozės ir reakcijos kreivė. Buvo tiriamos 100–0, 78 μM koncentracijos. b ) Junginio 144092 dozės ir reakcijos kreivė. Buvo patikrintos koncentracijos nuo 100 iki 0, 78 μM.

Visas dydis

Didžiausia junginio koncentracija, nedaranti įtakos ląstelių-šeimininkų ar bakterijų išgyvenimui

Kaip parodyta 4 paveiksle ir 2 papildomame paveiksle, virulencijos tyrimams buvo naudojamos didžiausios junginių koncentracijos, kurios, kaip nustatyta, neturi jokio pastebimo poveikio ląstelės-šeimininkės ar bakterijų išgyvenimui, yra šios: 144092 (6, 25 μM), 144143 (6, 25 μM). ), 19615 (6, 25 μM), 153578 (12, 5 μM) ir 24904 (50 μM).

Image

Dimetilsulfoksido (DMSO) kontrolės ir 144092 bakterinis toksiškumas. Junginių praskiedimai buvo įpilti į bakterijų kultūras, o OD 600 buvo stebimas 24 valandas ir braižomas per tam tikrą laiką. Parodytos 1% DMSO kontrolės ir junginio 144092 augimo kreivės esant 6, 25 μM, didžiausiai tirtai koncentracijai, kuri neparodė augimo slopinimo. (Kitus junginius žiūrėkite 2 papildomame paveiksle.)

Visas dydis

Invazijos testai

Invazijos testai buvo atlikti siekiant nustatyti junginių poveikį bakterijų invazijai į HeLa ląsteles, turint junginių vien tik bakterijų subkultūros ir invazijos ar invazijos perioduose. Kaip parodyta 5 paveiksle, 144092 buvo bakterijų subkultūros ir invazijos laikotarpiu vienintelis junginys, kuris sumažino invazijos efektyvumą, palyginti su laukinio tipo S. flexneri 2457T (atitinkamai 0, 14% ir 0, 30%); tačiau jis neturėjo jokio poveikio invazijai, kai jis buvo tik invazijos laikotarpiu (0, 30%).

Image

Invazijos tyrimas su S. flexneri 2457T. Grafike pavaizduota% S.lexneri 2457T invazijos į HeLa ląstelių monosluoksnius, esant junginiams, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. Kiekvienas junginys buvo dozuojamas didžiausia koncentracija, kuri neturėjo jokio poveikio ląstelių ar bakterijų išgyvenimui, kaip nurodyta 3 paveiksle. Junginiai buvo duodami tik invazijos laikotarpiu (pažymėtos brūkšninės diagramos) ir eksponentinėje bakterijų augimo fazėje ir išliko invazijos metu. laikotarpis (kietos brūkšninės diagramos).

Visas dydis

Likusiuose junginiuose buvo hiperinvazija, palyginti su laukinio tipo invazinėmis bakterijomis (junginiai 144143 ir 19615, padidėjimas 2, 1 karto; junginys 153578, padidėjimas 9, 6 karto; junginys 24904, padidėjimas 9, 8 karto). Kaip kontrolę mes išbandėme virulentiškumu plazmidžiu kietintą S. flexneri 2457T darinį, BS103, invazijos tyrime, esant junginiams. Rezultatai neparodė, kad BS103 būtų išgyvenęs gydymas gentamicinu (duomenys nepateikti).

Apnašų formavimo efektyvumas

Plokščių tyrimai buvo atlikti siekiant nustatyti galimą junginių poveikį ląstelių plitimui naudojant l2 ląsteles, o junginio buvo tik agarozės sluoksnyje. Apskritai, trys junginiai žymiai sumažino apnašų formavimo efektyvumą laukinio tipo S. flexneri 2457T, palyginti su nekontroliuojamais junginiais (144092: 23%, 19615: 19% ir 153578: 24%), tuo tarpu 144143 neturėjo jokio poveikio. dėl apnašų formavimo efektyvumo; žr. 6 paveikslą (Viengubai sluoksniai, kurių 50 μM M 24904 neišliko tyrimo metu). Vidutinis 144092 apnašų dydis buvo sumažintas iki 81% laukinių plokštelių dydžių (0, 87 palyginti su 1, 08 mm), tuo tarpu kitiems junginiams įtakos neturėjo plokštelių dydis; žr. 7 paveikslą.

Image

Apnašų formavimo efektyvumas naudojant S. flexneri 2457T. Grafike pavaizduotas S. flexneri 2457T apnašų susidarymo efektyvumas% esant junginiams po pirminio užkrėtimo L2 ląstelių monosluoksniais, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Kiekvienas junginys buvo dozuojamas didžiausia koncentracija, kuri neturėjo jokio poveikio ląstelių ar bakterijų išgyvenimui, kaip nurodyta 3 paveiksle. 24904 junginys nėra pavaizduotas grafike dėl jo toksiškumo L2 monosluoksniams per visą tyrimo laiką.

Visas dydis

Image

Apnašų dydis, gautas atlikus plokštelių susidarymo bandymą su S. flexneri 2457T. Diagramoje pavaizduotas vidutinis S. flexneri 2457T apnašų dydis, kai L2 ląstelėse yra junginių ir vaizduojamas neutralia raudona spalva, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Kiekvieno tyrime naudojamo junginio koncentracija buvo didžiausia, kuri neparodė jokio poveikio šeimininko ar bakterijos išgyvenimui, kaip nurodyta 3 paveiksle. Joks junginys nebuvo naudojamas kaip laukinio tipo S. flexneri 2457T plokštelių dydžių kontrolė.

Visas dydis

Diskusija

S. flexneri yra gramneigiamas enteropatogenas, užkrečiantis jo šeimininko storosios žarnos epitelį. Dabartinis šigeliozės gydymas apima fluorokvinolonus, tokius kaip ciprofloksacinas, ir cefalosporinus. 19 Augant atsparumui antibiotikams, 20, 21, 22, dar viena dabartinių gydymo galimybių problema yra ta, kad jie taip pat kenkia normaliai storosios žarnos šeimininko mikrobiotai. Storosios žarnos mikrobiotos sutrikimas gali sukelti virškinimo problemas ir antrines infekcijas, pvz., Clostridium difficile 23, kurios gali būti sunkesnės nei pirminė infekcija. Teoriškai virulentiškumo terapija apeitų šias problemas, nes jos tikslo nepatektų nepatogeniškose bakterijose; todėl tai nepakenktų normaliai storosios žarnos mikrobiotai. Įprasta terapijos, nukreiptos į virulentiškumą, kritika yra ta, kad jie nėra baktericidiniai ir tiesiogiai neišvalo infekcijos. Tačiau, slopinant VirF, bus slopinamas pagrindinis S. flexneri virulentiškumo genų transkripcijos aktyvatorius, invazija į šeimininko ląsteles ir plitimas iš ląstelių (kurios abi reikalingos infekcijai palaikyti). Kaip parodyta 1 paveiksle, VirF ne tik suaktyvina virulentiškumo genus, kontroliuojančius invaziją ir plitimą, bet ir suaktyvina virulentiškumo genus, reikalingus makrofagų pabėgimui. Jei galima išvengti makrofagų pabėgimo, infekcija turėtų būti greičiau pašalinta iš šeimininko imuninės sistemos. Jei ši teorija pagrįsta, tada VirF turėtų būti veiksmingas tikslas nukreipti į virulentiškumą nukreiptą terapiją nuo šigeliozės.

VirF inhibitoriaus identifikavimui atlikome 100 000 mažų molekulių didelio pralaidumo ekraną (HTS), naudodamiesi anksčiau aprašytu 13 bakterijų pagrindu, VirF pagrįstu, β-galaktozidazės reporterio tyrimu. Pirminis HTS nustatė 640 mažų molekulių, kurios atitiko pradinius atrankos VirF slopinimo kriterijus; žr. 2 paveikslą. 640 mažų molekulių buvo išbandytos serijose priešingų ekranų, siekiant pašalinti bet kokius klaidingus teigiamus rezultatus, kurie tiesiogiai slopino bakterijų augimą ar β-galaktozidazę, ir patikrinti, ar junginiai turi nuo dozės priklausomą aktyvumą. Iš viso 16 junginių atitiko visus atrankos kriterijus ir kovos ekranus. Remdamiesi pastolių naujumu, prieinamumu ir galimu toksiškumu, mes pašalinome šešis junginius iš tolesnių tyrimų. Likę 10 junginių buvo užsakyti iš komercinių šaltinių ir buvo išbandyti atliekant dozės ir atsako tyrimą. 10 junginių struktūros ir pradinės IC50 vertės parodytos 1 lentelėje. Kaip parodyta 2 lentelėje, tik 5 iš 10 junginių buvo patvirtinti, kai buvo tiriami švieži, gryni mėginiai. Masinės spektroskopijos metodu buvo patikrinta, ar nauji penkių junginių mėginiai, kurie nepatvirtino pakartotinai, buvo tinkamos masės (duomenys nepateikti), kas rodo, kad švieži mėginiai buvo teisingi junginiai. Žemas pakartotinio patvirtinimo dažnis nėra neįprastas atliekant HTS vėlesnius tyrimus. 24 Įvairūs veiksniai, įskaitant bibliotekinio junginio skilimą, bibliotekos junginio priemaišas ir junginio pernešimo klaidas, gali padidinti klaidingai teigiamų HTS rezultatų skaičių. Labiausiai tikėtinas mūsų mažo pakartotinio patvirtinimo greičio paaiškinimas yra tas, kad HTS bibliotekos aktyvūs junginiai yra pirminių junginių skilimo produktai. HTS biblioteka yra laikoma dimetilsulfokside ir jai buvo atlikti keli užšalimo-atšildymo ciklai, o tai padidina junginio skaidymo tikimybę. Dėl sunkių ir nenuspėjamų HTS bibliotekos aktyvių skilimo produktų nustatymo pobūdžio nusprendėme judėti pirmyn tik su penkiais junginiais, kurie buvo patvirtinti iš naujų, švarių mėginių.

Dar kartą patvirtinti junginiai buvo laikomi perspektyviais dėl įvairių priežasčių. Visų junginių IC 50 reikšmės VirF slopinimui buvo <100 μM, o 19615 m. Junginys buvo pats stipriausias (IC 50 = 14 μM). Kadangi šios IC50 vertės buvo nustatytos naudojant Shigella pagrįstą reporterių sistemą, mes žinome, kad kiekvienas junginys gali kirsti per bakterijų membraną ir surišti savo tikslą. 144092 ir 144143 junginiai yra panašūs į analogus ir turi pagrindinį pirimidino pastolį, todėl jie yra patrauklūs kandidatai ateityje optimizuoti atliekant struktūros ir aktyvumo santykio tyrimus. 153578 junginys turi benzimidazolo šerdį, panašų į benzimidazolo junginius, kurie, kaip buvo nustatyta, slopina Y. pseudotuberkuliozės , LcrF, virulencijos reguliatorių. 9, 11, 12 Įdomu tai, kad LcrF ir VirF yra tos pačios klasės transkripcijos aktyvatoriai, AraC šeima. 24904 junginys yra žinomas augalų tręšimas, tidiazuronas, kuris, kaip pranešama, turi mažai ūmų toksiškumą žmonėms. 25

Toliau junginiai buvo įvertinti atliekant HeLa ląstelių monosluoksnių invaziją ir L2 ląstelių monosluoksnių apnašų tyrimus kaip infekcijos proceso modelius. Kaip parodyta 5 paveiksle, vienas junginys, 144092, sugebėjo sumažinti invazijos procentą, palyginti su nekontroliuojamu junginiu, kai junginys buvo skiriamas eksponentinio bakterijų subkultūros augimo fazėje, be to, kad jo nebuvo invazijos laikotarpiu. Junginys neturėjo įtakos invazijos%, kai jis buvo skiriamas tik invazijos metu. Poveikis pastaruoju atveju greičiausiai yra dėl VirF aktyvinančių virulentiškumo genų eksponentinio augimo metu, kai nėra junginio. Tuos virulentiškumo baltymus jau bus, kai junginys buvo pridėtas invazijos metu; taigi, bakterijos vis tiek sugebės įsibrauti į šeimininko ląsteles. Kitų keturių junginių neveiksmingumas nebuvo netikėtas, nes visų junginių koncentracija buvo mažesnė už jų IC50 vertes dėl toksiškumo didesnių koncentracijų ląstelių monosluoksniams (žr. 2 lentelę ir 2 papildomą lentelę). Tačiau buvo netikėta, kad kiti keturi junginiai turėjo „hiperinvaziją“, palyginti su kitais junginiais. Kontroliniai tyrimai buvo atlikti siekiant patikrinti, ar junginiai dirbtinai nepadidina invazijos, apsaugodami bakterijas nuo gentamicino. Gali būti, kad junginiai gali nepastebimai pakeisti „HeLa“ ląstelių monosluoksnį, todėl jis yra labiau linkęs į bakterinę infekciją. Norint nustatyti „hiperinvazijos“ priežastį, reikės atlikti papildomus tyrimus.

Trys iš junginių 144092, 19615 ir 153578 sumažino apnašų formavimo efektyvumą S. flexneri 2457T, nurodydami, kad junginiai sumažino bakterijų plitimą ląstelėse nuo ląstelių (žr. 6 paveikslą). Šis rezultatas buvo stulbinantis, nes tik 144092 junginys sumažino S. flexneri 2457T invazijos efektyvumą invazijos tyrimų metu. Tačiau apnašų dydį turėjo nors 144092, nors ir gana nedidelį, poveikį. Apnašų dydis priklauso nuo daugelio veiksnių, įskaitant plitimą tarp ląstelių ir bakterijų augimą. Taip pat apnašų dydis įvertinamas po 3 dienų. Junginių stabilumas tuo laikotarpiu nėra žinomas, todėl be papildomų tyrimų sunku suprasti poveikį apnašų dydžiui.

Invazijos ir apnašų susidarymo efektyvumo rezultatai rodo, kad junginiai gali turėti skirtingą poveikį VirF aktyvumui, priklausomai nuo to, koks VirF promotorius jungiasi. Kaip parodyta 1 paveiksle, VirF gali prisijungti prie virB ir icsA (dar vadinamų virG ) promotoriais. Suaktyvinus virB promotorių, atsiranda virulentiškumo genų, susijusių su makrofagų pabėgimu ir virškinimo trakto ląstelių invazija, transkripcija, tuo tarpu icsA promotoriaus aktyvacija sukelia icsA transkripciją, kuri yra susijusi tik su bakterijų plitimu iš ląstelės į ląstelę ( pavyzdžiui, aktino polimerizacija, sukelianti judrumą). Gali būti, kad 19615 ir 153578 junginiai gali turėti stipresnį slopinamąjį poveikį VirF prisijungimui prie icsA promotoriaus (taigi ir aktyvavimui) nei virB promotorius; tai paaiškintų prieštaringus abiejų tyrimų rezultatus. Kadangi HTS naudojamas reporterio testas stebėjo tik VirF, suaktyvinantį virB promotorių, šiuo metu rengiame testus, kurie tiesiogiai matuoja VirF surišimą su kiekvienu jo promotoriu ( virB ir icsA) . Kita galimybė, kurią tiriame, yra tai, kad šie junginiai gali tiesiogiai slopinti aktino polimerazės aktyvumą, susijusį su IcsA.

Pažymėtina, kad šie junginiai (144092, 19615 ir 153578), tiesiogiai iš mūsų HTS, dar nebuvo optimizuoti ir buvo išbandyti gerokai žemiau jų IC 50 verčių slopinimo verčių (dėl citotoksiškumo). Faktas, kad junginiai sukelia nedidelį infekcijos proceso silpnėjimą tiriamose koncentracijose, yra intriguojantis. Junginys 144092 turėjo reikšmingą poveikį invazijai, kai VirF ekrane jo koncentracija buvo apie 25% jo IC50. Mūsų VirF atrankos testai apima vienos nakties inkubacijas, tuo tarpu invazijos testai iš viso inkubuojami 4–6 valandas. Ilgesnis atrankos testų laikotarpis gali leisti mažiems aktyviojo VirF kiekiams generuoti reikšmingus β-galaktozidazės kiekius, todėl padidėja IC50. In vivo yra amplifikacijos faktorius, nes VirF suaktyvina VirB, kuris savo ruožtu suaktyvina invazijos baltymus. VirF slopinimas gali sukelti žymiai didesnį invazijos baltymų sumažėjimą dėl šios amplifikacijos, kurios nėra mūsų atrankos plazmidėje. Shigella baltymas H-NS jungiasi prie virB ir icsA promotoriaus sričių ir slopina jų transkripciją. Gali būti, kad mūsų dirbtinė atrankos plazmidė gali būti mažiau jautri H-NS represijoms nei natūrali, 200 kb virulentiškumo plazmidė, todėl sunkiau blokuoti VirF aktyvaciją genų ekspresijai.

144092 junginys yra perspektyviausias kandidatas plėtoti „į lyderį“, nes jis sugebėjo sumažinti pradinę invazijos efektyvumą (sumažėjimas 53%), apnašų efektyvumą (77% sumažėjimas) ir apnašų dydį (7 paveikslas, 19% sumažinimas) esant koncentracijai. (6, 25 μM), kuris neturėjo jokios įtakos bakterijų ar šeimininkų ląstelių gyvybingumui. Be to, 144092 ir 144143 turi tą pačią pirimidino šerdį. Skirtingas šių analogų aktyvumas suteikia pagrindinę įžvalgą, į kurias junginio 144092 sritis reikėtų atkreipti dėmesį, norint sukurti analogą. Galima pagrįstai tikėtis, kad toliau optimizavus chemines struktūras, padidės invazijos ir apnašų efektyvumo testų veiksmingumas ir sumažės citotoksiškumas.

Šioje ataskaitoje iš 100 000 junginių didelio pralaidumo ekrano mes nustatėme penkis junginius, turinčius VirF slopinančias savybes. Mes patvirtinome požiūrį į savo HTS pateikdami įrodymų, kad įmanoma sumažinti S. flexneri virulentiškumą, slopinant VirF maža molekulė. Mes nustatėme tris mažas molekules, kurios galėjo blokuoti S. flexneri plitimą iš ląstelių į tokias koncentracijas, kurios neturi įtakos bakterijų ar ląstelių augimui. Šie rezultatai taip pat rodo, kad junginiai geba įsiskverbti į bakterijas ir ląsteles šeimininką, ir tai yra labai palankus požymis tolesniam vystymuisi. Kadangi visi trys šie junginiai buvo skirti po pirminės bakterijų invazijos apnašų tyrime, mes taip pat patvirtinome VirF inhibitoriaus galimybes gydyti aktyvią infekciją (dažna viruso terapijos kritika). Be to, vienas iš trijų junginių galėjo sumažinti pradinį S. flexneri invazijos efektyvumą. Šis junginys, 144092, yra perspektyvus cheminis pastaroji priemonė, leidžianti sukurti lyderį į šviną, kaip anti-virulentiškumo terapija, skirta šigeliozės gydymui.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie leidinio „The Journal of Antibiotics“ svetainėje (//www.nature.com/ja).