Pirminė heligmosomoides polygyrus bakeri infekcija sukelia mieloidų sukeliamas slopinančias ląsteles, slopinančias cd4 + th2 reakcijas ir skatinančias lėtinę infekciją | gleivinės imunologija

Pirminė heligmosomoides polygyrus bakeri infekcija sukelia mieloidų sukeliamas slopinančias ląsteles, slopinančias cd4 + th2 reakcijas ir skatinančias lėtinę infekciją | gleivinės imunologija

Anonim

Dalykai

  • Gleivinės imunologija
  • Parazitinė infekcija

Anotacija

Pirminė virškinimo trakto nematodo Heligmosomoides polygyrus bakeri infekcija yra lėtinė C57BL / 6 (B6) pelėms, tuo tarpu infekcinė infekcija greitai pašalinama. Pranešama, kad F4 / 80 - CD11b + Gr + ląstelės, manomos kaip neutrofilai, kaupiasi žarnyno audinyje užkrėstų lervų metu pirminės infekcijos metu, tačiau tiksli jų tapatybė ir vaidmuo neaiškūs. Mes pastebėjome reikšmingą F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių padidėjimą mezenteriniuose limfmazgiuose (MLN) ir blužnyje po pirminės, bet neužkrečiamos infekcijos; didelė šių ląstelių dalis ekspresuoja Ly6G ir Ly6C. Šių ląstelių, kurios fenotipiškai primena mieloidų sukeliamas slopinančias ląsteles (MDSC), padidėjo lamina propria (LP) ankstyvos pirminės infekcijos metu. Padidėjęs MDSC buvo susijęs su mažu alternatyviai aktyvuotų makrofagų (AAMØ) kiekiu LP ir CD4 + GATA3 + T ląstelėse ir AAMØ MLN bei blužnyje. Išgrynintos CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės iš H. polygyrus bakeri infekuotų pelių slopino OVA specifinio CD4 + T ląstelių proliferaciją, naudojant nuo azoto oksido priklausomą mechanizmą ir parazitams būdingą IL-4 sekreciją in vitro . Pasirinkęs CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių perkėlimas iš pelių, turinčių pirminę infekciją, žymiai padidino suaugusiųjų kirminų naštą ir padidino kiaušinių gamybą naiviems B6 recipientams, infekuotiems H. polygyrus bakeri . Visi šie duomenys rodo, kad pirminė H. polygyrus bakeri infekcija sukelia naują MDSC pogrupį, kuris slopina CD4 + Th2 atsakus ir skatina lėtinę infekciją.

Įvadas

Apskaičiuota, kad visame pasaulyje virškinimo trakto (GI) nematodų infekcija paplitusi daugiau kaip 1, 7 milijardo atvejų; maždaug 25% atvejų tai sukelia kabliukai, 47% - Ascaris lumbricoides ir 27% - Trichuris trichiura . 1 Tokios infekcijos nėra pagrindinė mirštamumo priežastis, tačiau jų poveikis sergamumui yra milžiniškas. 1, 2 Pavyzdžiui, hookworm infekcija sukelia anemiją, kuri gali būti sunki vaikams ir nėščioms moterims. 3, 4 maliarijos endeminiuose regionuose Afrikoje į pietus nuo Sacharos, kur taip pat yra didelis paplitimas tarp virškinamojo trakto nematodų, dažnai pasitaiko kartu užsikrėtusių kabliais ir maliarija. Tai gali sukelti sunkesnę maliariją ir padažnėti mirčių nuo maliarijos atvejų. 5, 6 Be to, GI nematodų infekcija gyvuliams, pavyzdžiui, galvijams ir kiaulėms, turi svarbių ekonominių padarinių. 7

Pagrindinė GI nematodų savybė yra jų gebėjimas užsikrėsti lėtinėmis infekcijomis jų šeimininkų organizme. Nepaisant jų sugebėjimo sukelti labai poliarizuotą Th2 imuninį atsaką, kuris laikomas apsauginiu. 8, 9 Heligmosomoides polygyrus bakeri yra natūralus pelių patogenas, pateikiantis naudingą laboratorinį modelį tiriant imuninį atsaką į GI nematodus, kurie užkrečia žmones ir gyvulius. 10 Pirminė H. polygyrus bakeri infekcija yra lėtinė ir gali išsilaikyti daugelį savaičių kai kurių veislių pelių padermėse, įskaitant C57BL / 6 (B6) peles. 10 Atlikus suaugusiųjų kirminų valymą antihelmintikais, infekcinė infekcija greitai kontroliuojama mechanizmu, apimančiu atminties CD4 + T ląsteles, IL-4, alternatyviai aktyvintus makrofagus (AAMØ) ir specifinius parazitams skirtus antikūnus. 11, 12 Panašiai kaip ir kiti helmintai, H. polygyrus bakeri slopina imuninį atsaką į pašalinius antigenus ir nesusijusius patogenus, tokius kaip maliarija, ir slopina imuninį atsaką į koinfekcijas su nesusijusiais helmintais. 13, 14 Lėtinės infekcijos, kurias sukelia helmintai, įskaitant H. polygyrus bakeri, gali būti dėl jų sugebėjimo indukuoti įvairius reguliavimo mechanizmus, įskaitant reguliuojančias T ląsteles (Tregus), tolerogenines dendritines ląsteles (DC), AAMØ ir reguliuojančias B ląsteles. 14, 15 Šios reakcijos gali prisidėti prie šių parazitų imuninio vengimo ir palaikyti kommensalinį ryšį su jų šeimininkais, kad būtų išvengta jų pačių pašalinimo ar sunkios patologijos. Tačiau tikslus šių ląstelių vaidmuo slopinant imunitetą parazitui, besivystančiam jo šeimininkui, nežinomas.

Mieloidinės slopinamosios ląstelės (MDSC) yra nevienalytė nesubrendusių ląstelių populiacija, kuri vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant imuninį atsaką vėžio ir lėtinio uždegimo metu. Pelėse MDSC yra F4 / 80 - CD11b + Gr1 + ląstelės. 19 MDSC galima suskirstyti į dvi grupes pagal fenotipą ir morfologiją: CD11b + Ly6G + Ly6C lo granulocitinis MDSC ir CD11b + Ly6G - Ly6C didelio monocitinio MDSC. Nors ryšys tarp neutrofilų ir granulocitinio MDSC išlieka neaiškus, tiek granulocitinis, tiek monocitinis MDSC slopina imuninį atsaką. 17, 19 MDSC kaupiasi lėtinių infekcijų metu pelėse dėl tarpląstelinių patogenų, tokių kaip pirmuonių parazitai, virusai, bakterijos ir helmintų infekcijos. 20, 21, 22, 23, 24, 25, priešingai nei slopinant antigenui būdingus atsakus į tarpląstelinius parazitus, MDSC padidina suaugusiųjų kirminų klirensą pelėse, užkrėstose Nippostrongylus brasiliensis ar Trichinella spiralis. 24, 25

Čia mes pastebėjome, kad pirminė H. polygyrus bakeri infekcija sukėlė ryškų F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių, fenotipo, atitinkančio MDSC, išsiplėtimą B6 pelių žarnyno ir sisteminiuose limfoidiniuose audiniuose. Didelė dalis H. polygyrus bakeri sukelto MDSC ekspresuoja ir Ly6G, ir Ly6C, todėl jų negalima apibūdinti kaip granulocitinio ar monocitinio MDSC. Iš pelių išgryninta MDSC, sukelta pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos , in vitro slopino parazitams būdingus CD4 + Th2 atsakus , o šių ląstelių pernešimas įnešė didelę suaugusiųjų kirminų naštą ir padidino kiaušinių gamybą naiviems B6 recipientams.

Rezultatai

Didelė suaugusiųjų kirminų našta pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos metu yra susijusi su sumažėjusiais Th2 atsakais

Ankstesni tyrimai parodė, kad po pirminės ir užkrėstos H. polygyrus bakeri infekcijos BALB / c pelėse kaupiasi mažiau CD4 + T ląstelių ir AAMØ šeimininko ir parazito sąsajoje, laikomos santykinai atspariomis pirminėms infekcijoms ir išskiriančios suaugusius kirminus po kelias savaites. 11, 26, siekiant ištirti, ar ląstelių reakcijų skirtumai tarp pirminės ir užkrėstos H. polygyrus bakeri infekcijos prisideda prie pirminės infekcijos, kuri yra lėtinė, palyginome ląstelių, susikaupusių vietiniuose ir sisteminiuose limfoidiniuose audiniuose B6 pelėms, skaičių ir tipą. 10 Remiantis ankstesniais stebėjimais, suaugusiųjų kirminų našta buvo žymiai didesnė po pirminės, palyginti su H. polygyrus bakeri infekcija (1a pav.). Bendras mezenterinis limfmazgis (MLN) ir blužnies ląstelės žymiai padidėjo infekuotose, palyginti su anksčiau negydytomis pelėmis, tačiau abiejų audinių po infekcijos abiejų audinių ląstelių skaičius buvo žymiai didesnis, palyginti su pirminiu užkrėtimu (1b paveikslas). CD4 + GATA3 + T ląstelių žymiai padidėjo MLN tiek po pirminės, tiek ir po infekcijos infekcijos, palyginti su anksčiau negydytomis pelėmis, tuo tarpu blužnis žymiai padidėjo, palyginti su anksčiau negyvomis pelėmis, tik po užkrėtimo infekcija (1c paveikslas). Svarbu tai, kad CD4 + GATA3 + T ląstelių skaičius buvo žymiai didesnis abiejuose audiniuose po užkrėtimo, palyginti su pirminiu užkrėtimu.

Image

Mezenterinio limfmazgio (MLN) ir blužnies ląstelių sudėties skirtumai po pirminės ar užkrėtimo H. polygyrus bakeri infekcija. a ) Suaugusiųjų kirminų našta H. polygyrus bakeri infekuotose B6 pelėse 14 dieną po pirminės ar užkrėstos infekcijos. Parodomi atskirų pelių, surinktų iš trijų nepriklausomų eksperimentų, duomenys. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem **** P <0, 0001. b ) Bendras MLN ir blužnies ląstelių skaičius 7 dieną po pirminės ar užkrėstos infekcijos. * P <0, 05; *** P <0, 001. c ) Bendros CD4 + GATA3 + T ląstelės MLN ir blužnyje 7 dieną po pirminės arba užkrėtimo. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 ( d ir e ) CD11b + CD206 + ląstelės buvo nustatomos srauto citometrijos metodu gautose F4 / 80 + MLN ( d ) ir blužnies ląstelėse ( e ) iš naivių ir užkrėstų pelių 7 dieną po pirminės ar užkrėstos infekcijos. . Kairiajame skydelyje pateikiami reprezentatyvūs vienos pelės kontūriniai brėžiniai, nurodantys F4 / 80 + CD11b + CD206 + dažnį, o dešinėje - absoliutus ląstelių skaičius. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 5 pelės kiekvienoje grupėje) ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. ns, nereikšmingas; ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Toliau mes įvertinome AAMØ kaupimąsi užkrėstų B6 pelių MLN ir blužnyje, nustatydami F4 / 80 + CD11b + ląstelių, kurios ekspresuoja CD206, dažnį ir skaičių, makrofagų manozės receptorių padidintą, reaguojant į IL-4. 27 Nors po pirminės infekcijos F4 / 80 + CD11b + CD206 + ląstelių skaičius padidėjo, palyginti su anksčiau negydytomis pelėmis, MLN ar blužnies skirtumai nebuvo reikšmingi (1d paveikslas, e). Po užkrėstos infekcijos F4 / 80 + CD11b + CD206 + ląstelių dažnis ir skaičius dramatiškai padidėjo abiejuose audiniuose, ypač blužnyje, palyginti su pelėmis po pirminės infekcijos ar negydytomis pelėmis. Šie stebėjimai kartu rodo, kad ląstelių, dalyvaujančių adaptaciniame imunitete nuo GI nematodo, kaupimasis ir galbūt jų funkcija gali būti slopinamas, o tai lemia sustiprintą ir nuolatinį suaugusiųjų kirminų išgyvenimą po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos B6 pelėse.

Pirminė H. polygyrus bakeri infekcija skatina MDSC kaupimąsi vietiniuose ir sisteminiuose limfoidiniuose audiniuose

Ankstesni tyrimai parodė, kad F4 / 80 populiacija - ląstelės, kurios ekspresuoja CD11b ir Gr1, fenotipą, suderinamą su neutrofilų kaupimu, kaupiasi užfiksavus H. polygyrus bakeri lervas plonosios žarnos raumenyse išoriniame raumenyje anksti po pirminės infekcijos. 11, 26, 28 Tačiau nei tikslus šių ląstelių tapatumas, nei jų vaidmuo nėra aiškūs. Po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos pastebėjome dramatišką F4 / 80 - CD11b hi ląstelių dažnio ir skaičiaus padidėjimą MLN ir dar didesniame blužnyje (2a, b pav.). Įdomu tai, kad F4 / 80 - CD11b hi ląstelės išreiškė aukštą Gr1, MDSC būdingo fenotipo, kiekį. 19, 29, priešingai, reikšmingo šios ląstelių populiacijos padidėjimo po užkrėtimo infekcija nebuvo.

Image

Pirminė H. polygyrus bakeri infekcija skatina F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi mieloidinių slopintuvų ląstelių (MDSC), kurios ekspresuoja ir Ly6G, ir Ly6C, kaupimąsi. ( a ir b ) CD11b hi Gr1 hi ląstelės buvo nustatomos srauto citometrijos metodu vartojant F4 / 80 - ląstelėse mezenteriniame limfmazgyje (MLN) ( a ) ir blužnies ląstelėse ( b ) iš naivių ir užkrėstų pelių 7 dieną po pirminės ar užkrėstos ląstelės. infekcija. Kairiajame skydelyje pateikiami reprezentatyvūs kontūriniai brėžiniai iš vienos pelės, nurodantys F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių dažnį, o dešinėje - absoliutus ląstelių skaičius. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 5 pelės kiekvienoje grupėje) ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. ns, nereikšmingas; ** P <0, 01; *** P <0, 001. c ) Ląstelės buvo surinktos ant CD206 - CD11b + populiacijos ir išanalizuotos srauto citometrijos metodu, siekiant išreikšti Ly6G ir Ly6C. Parodyti tipiniai vienos pelės MLN ir blužnies ląstelių kontūriniai brėžiniai 7 dieną po pirminės infekcijos ( n = 5 pelės). ( d ) F4 / 80 + CD11b + CD206 + ir F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių kaupimasis MLN ir blužnyje po pirminės infekcijos. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 4 pelės per laiko tašką). Kairės plokštės, F4 / 80 + CD11b + CD206 + elementai. Dešinės plokštės, F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelės. ns, nereikšmingas; *** P <0, 001.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

MDSC yra heterogeniška mieloidinių ląstelių grupė, iš pradžių identifikuota navikus turinčioms pelėms ir vėžiu sergantiems pacientams, kurie reguliuoja įgimtą ir adaptyvų imuninį atsaką. 17, 29, 30 MDSC gali būti apibūdinta toliau kaip atitinkamai granulocitinė arba monocitinė, remiantis jų išreikšta Ly6G arba Ly6C. Pažymėtina, kad pastebėjome reikšmingą CD206 - CD11b + ląstelių populiacijos padidėjimą, kurios po pirminės infekcijos išreiškė Ly6G ir Ly6C tiek MLN, tiek blužnyje, tuo tarpu nė viename audinyje reikšmingo Ly6G - Ly6C + populiacijos padidėjimo nepastebėta. užkrėstų, palyginti su anksčiau negyvomis pelėmis (2c paveikslas ir 1 papildomas paveikslas internete). Nors buvo palyginti nedaug F4 / 80 - CD11b Hi Gr1 hi ląstelių, kurios išreiškė Ly6G MLN ar naivių ar užkrėstų pelių blužnyje, ši populiacija reikšmingai padidėjo abiejuose audiniuose po pirminės infekcijos.

Norėdami nustatyti, ar AAMØ ir MDSC kaupimosi laiko skirtumai prisideda prie neefektyvaus suaugusiųjų kirmėlių pašalinimo po pirminės, palyginti su H. polygyrus bakeri infekcija, atlikome F4 / 80 + CD11b + CD206 + ir F4 / 80 padidėjimo kinetinę analizę. - CD11b hi Gr1 hi MDSC MLN ir blužnyje per pirmąsias 2 savaites po užsikrėtimo (pi). Šiame eksperimente stebėjome reikšmingą F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ padidėjimą 7 dieną pi MLN ir 14 dieną pi blužnyje po pirminės infekcijos (2d paveikslas, kairiosios plokštės). Reikšmingas F4 / 80 - CD11b ir Gr1 hi MDSC padidėjimas buvo pastebimas jau 2-ą dieną pi abiejuose audiniuose, skaičiai pasiekė aukščiausią lygį 7 pi dieną ir sumažėjo 14 pi parą tiek MLN, tiek blužnyje (2d paveikslas, dešinės plokštės). ).

Norėdami nustatyti, ar MDSC nėra infekcijos vietoje, pirminės infekcijos metu iš naivių ir užkrėstų B6 pelių mes paėmėme plonąsias žarnas, išskyrėme iš lamina propria (LP) leukocitus ir išanalizavome F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi MDSC ir F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ, naudojant srauto citometriją. Palyginti su naivių pelių LP ląstelėmis, F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi MDSC dažnis padidėjo antrą dieną pi, tuo tarpu F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ dažnis buvo panašus į naivių pelių (duomenys nepateikti). 7 dieną pi buvo pastebimai padidėjęs F4 / 80 - CD11b ir Gr1 hi MDSC dažnis, o F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ padidėjimas buvo nedidelis (3a pav.). F4 / 80 - CD11b ir Gr1 hi MDSC skaičius žymiai padidėjo užsikrėtusiųjų LP, palyginti su naiviomis pelėmis, tuo tarpu F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ padidėjimas nebuvo reikšmingas (3b paveikslas). 7 dieną pi užkrėstose pelėse stebėjome aukštą ląstelių morfologiją, panašią į aprašytą MDSC 19, tiek LP (3c, d pav.), Tiek blužnyje (papildomi 2C ir D paveikslai). Šie duomenys rodo, kad MDSC kaupiasi žarnyne ir sisteminėje sistemoje. limfoidinis audinys pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos metu ir gali neigiamai reguliuoti makrofagų poliarizaciją į AAMØ.

Image

F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelės padidėja lamina propria (LP) po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos. Leukocitai buvo išskirti iš LP, gauto iš naivių ar užkrėstų pelių plonųjų žarnų 7 dieną po užkrėtimo (pi) ( n = 4 kiekvienoje grupėje). ( a ) CD11b hi Gr1 hi ląstelių dažnis vartotose F4 / 80 ląstelėse (dvi viršutinės plokštės) ir CD11b + CD206 + ląstelės vartuose F4 / 80 + ląstelėse (dvi apatinės plokštės) buvo nustatytas srauto citometrija. ( b ) F4 / 80 - CD11b ir Gr1 hi mieloidų gautų slopinančių ląstelių (MDSC) ir F4 / 80 + CD11b + CD206 + alternatyviai aktyvuotų makrofagų (AAMØ) / 10 6 LP leukocitų skaičius naiviomis ir 7 dieną užkrėstomis pelėmis. ns, nereikšmingas; *** P <0, 001 ( c ir d ) Diff-Quik dažyti LP leukocitų citospinatų preparatai, gauti iš naivių ( c ) ir užkrėstų pelių 7 dieną pi ( d ). Rodyklės rodo ląsteles, turinčias būdingą MDSC būdingą spurgos formos branduolį. Pradinėse dėžutėse pateikiama išsami branduolinės morfologijos informacija. Didinimas = × 630.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

H. polygyrus bakeri sukeltas MDSC slopina efektorinius CD4 + T-ląstelių atsakus

Pastebėta, kad MDSC kaupiasi lėtinių intraląstelinių patogenų, tokių kaip pirmuonių parazitai, infekcijų metu, kai jie vaidina įvairius vaidmenis, įskaitant slopinančias efektorines CD4 + T ląsteles. 20, 21, 22, 23, 31 Norėdami nustatyti, ar pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos sukeltas MDSC slopino efektorinius CD4 + T-ląstelių atsakus, kartu auginome išgrynintas CD11c - CD11b + Gr1 + ląsteles ir karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esterį (CFSE). įvairiu santykiu pažymėtos OT-II blužnies ląstelės ir stimuliavo bendras kultūras su OVA 323–339 peptidu. CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės iš užkrėstų pelių MLN stipriai slopino CD4 + T-ląstelių proliferaciją, palyginti su ta pačia naivių pelių ląstelių populiacija (4a paveikslas). Naivių ir užkrėstų pelių blužnies CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių slopinamasis pajėgumas buvo panašus esant didesniems santykiams, tačiau užkrėstų pelių CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės buvo slopinančios santykiu 1: 4.

Image

H. polygyrus bakeri sukeltos CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės slopina CD4 + Th2 ląstelių funkciją in vitro . a ) CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės buvo išgrynintos iš mezenterinio limfmazgio (MLN) (dvi viršutinės plokštės) ir blužnies ląstelės (apatinės dvi plokštės), gautos iš naivių ir užkrėstų pelių 7 dieną po pirminės infekcijos, kartu kultivuojamos su karboksifluoresceinu. diacetato sukcinimidilo esteriu (CFSE) pažymėtos OT-II blužnies ląstelės nurodytais santykiais ir stimuliuotos 1 n M OVA 323–339 peptidu. Po septyniasdešimt dviejų valandų ląstelės iš trijų egzempliorių šulinėlių buvo surinktos ir sujungtos, nudažytos APC konjuguotu anti-CD4 mAb, o CFSE skiedimas buvo analizuojamas srauto citometrijos metodu pažymėtose CD4 + ląstelėse. Duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. b ) 7 ir 14 dienomis po pirminės infekcijos suaugusiųjų kirminų homogenatu (AWH) išskiriami IL-4 lygiai stimuliuoja MLN ir blužnies ląsteles. * P <0, 05 MLN ląstelėms 14 dieną, palyginti su 7 diena pi; **** P <0, 0001 blužnies ląstelėms 14 dieną, palyginti su 7 diena pi; ND, neaptikta. ( c ) CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės buvo išvalytos iš MLN ir užkrėstų pelių blužnies ląstelių 7 dieną po pirminės infekcijos, sujungtos ir kartu auginamos su nefrakcionuotomis blužnies ląstelėmis, gautomis iš užkrėstų pelių 14 dieną pi, esant nurodytam santykiui. Bendrosios kultūros buvo stimuliuotos 50 μg ml −1 suaugusiųjų kirminų homogenatu (AWH), o IL-4 lygis buvo nustatytas supernatantuose, surinktuose 48 val. ELISA metodu. *** P <0, 001, palyginti su blužnies ląstelėmis be CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Urban et al. 32 anksčiau parodė, kad gydymas ilgalaikio veikimo IL-4 kompozicija, susidedančia iš IL-4 ir anti-IL-4 monokloninių antikūnų (mAb) komplekso, išleistas trimis dozėmis, pradedant 10-ą dieną pi, pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos metu. sumažėjus kiaušinių gamybai ir beveik visiškai pašalinus suaugusius kirminus. Šie duomenys rodo, kad pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos metu CD4 + GATA3 + T ląstelių IL-4 sekrecija gali būti neoptimali. Anksčiau mes pastebėjome, kad IL-4 blužnies ląstelių sekrecija, reaguojant į suaugusiųjų kirminų homogenato (AWH) pikas, yra 14 dieną po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos B6 pelėse. 13 Čia mes pastebėjome, kad MLN ir blužnies ląstelės, stimuliuotos AWH in vitro, 7 dieną po pirminės infekcijos išskirdavo atitinkamai žemą arba neaptinkamą IL-4 lygį, tuo tarpu IL-4 sekrecija abiejų tipų ląstelėse buvo didesnė 14 dieną pi (pav. 4b). Svarbu tai, kad iš pelių išgrynintos CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės 7 dieną po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos, net esant mažam santykiui, žymiai slopino IL-4 sekreciją užkrėstų pelių blužnies ląstelių, auginamų AWH, stimuliacijose. ).

Padidėjęs L-arginino metabolizmas MDSC per Arg1 ir Nos2 kelius buvo susijęs su šių ląstelių gebėjimu slopinti T-ląstelių atsakus. 33, 34, 35 Norėdami nustatyti, ar kuris iš būdų prisidėjo prie CD4 + T atsako MDSC slopinimo H. polygyrus bakeri infekcijos metu, kartu kultivavome išgrynintas CD11c - CD11b + Gr1 + ląsteles iš užkrėstų pelių su išgrynintomis CFSE pažymėtomis CD4 + T ląstelėmis. iš OT-II pelių ir mitomicinu C apdoroto CD11c + DC iš naivių B6 pelių. Bendrosios kultūros buvo stimuliuotos kartu su OVA 323–339 peptidu, esant N (omega) -hidroksi-nor-L-argininui (nor-NOHA) arba 1400W, kad būtų slopinamas atitinkamai arginazės ar azoto oksido (NO) susidarymas, arba abu inhibitoriai buvo dedami į kultūras. Kontrolinėse kultūrose, turinčiose CD4 + T ląsteles ir DC vien tik terpėje, proliferacija buvo tvirta, tuo tarpu reakcija beveik visiškai buvo slopinama kultūrų, turinčių CD4 + T ląstelių, DC ir CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių, reakcija (5a pav.). Nor-NOHA neturėjo įtakos CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių gebėjimui slopinti CD4 + T-ląstelių proliferaciją, tuo tarpu 1400W atskirai arba kartu su nor-NOHA visiškai atkūrė antigenui specifišką CD4 + T-ląstelių proliferaciją -kultūros. Kartu su kultūromis, turinčiose 1400 W, NO lygis buvo žymiai sumažintas iki žemo lygio (5b paveikslas). Visi šie duomenys rodo, kad NO, bet ne arginazė prisideda prie antigeno specifinio CD4 + T-ląstelių proliferacijos slopinimo MDSC iš H. polygyrus bakeri užkrėstų pelių.

Image

CD4 + T ląstelių slopinimas H. polygyrus bakeri sukeltomis CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelėmis priklauso nuo azoto oksido (NO). ( a ) CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelės, išvalytos iš mezenterinio limfmazgio (MLN), ir užkrėstų pelių blužniai 7 dieną po pirminės infekcijos buvo kultivuojamos kartu su karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esteriu (CFSE) pažymėtomis blužnies CD4 + T ląstelėmis, išgrynintomis iš OT-II pelės, esant mitomicinu C apdorotai blužninei CD11c + dendritinei ląstelei (DC), išvalytai iš naivių pelių. Bendrosios kultūros buvo stimuliuotos 1 n M OVA 323–339 peptidu, o ląstelės iš trijų dublių šulinėlių buvo surinktos po 72 valandų ir sujungtos. Ląstelės buvo nudažytos APC konjuguotu anti-CD4 monokloniniu antikūnu (mAb), o CFSE skiedimas buvo analizuojamas srauto citometrijos metodu įstrigusiose CD4 + ląstelėse. ( b ) Supernatantai buvo surinkti iš trijų egzempliorių šulinėlių kiekvienai auginimo sąlygai a, o NO lygis buvo nustatytas naudojant Grieso reagentą. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem *** P <0, 001. Kultūros sąlygos, nurodytos skaičiais, yra šios: (1) CD4 + T ląstelės + DC su terpe; (2) CD4 + T ląstelės + mieloidinės slopinančios ląstelės (MDSC) su terpe; (3) CD4 + T ląstelės + DC + MDSC su terpe; (4) CD4 + T ląstelės + DC su N (omega) -hidroksi-nor-L-argininu (nor-NOHA) (300 μM); (5) CD4 + T ląstelės + DC + MDSC su nor-NOHA (300 μM); (6) CD4 + T ląstelės + DC su 1400 W (100 μM); (7) CD4 + T ląstelės + DC + MDSC su 1400 W (100 μM); (8) CD4 + T ląstelės + DC su abiem inhibitoriais; ir (9) CD4 + T ląstelės + DC + MDSC su abiem inhibitoriais. Pateikti vieno iš dviejų nepriklausomų eksperimentų duomenys.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Priimtas MDSC perkėlimas slopina kirmėlių išstūmimą pelėms-recipientams

Norėdami ištirti, ar MDSC slopina adaptyvųjį imunitetą pirminiam H. polygyrus bakeri , pirminės infekcijos metu mes apdorojome užkrėstas peles anti-Gr-1 mAb (klonas RB6-8C5), kad MDSC būtų sunaikintos in vivo . Taikydami šį metodą, mes pastebėjome, kad F4 / 80 - CD11b + Gr1 + MDSC buvo išeikvoti 7 dieną pi, bet išeikvojimas buvo trumpalaikis. Srauto citometrijos analizė parodė, kad F4 / 80 - CD11b + Gr1 + MDSC skaičius buvo žymiai didesnis antikūnais apdorotos grupės audiniuose, palyginti su kontrolinėmis pelėmis vėliau 14 pi dieną (nepaskelbtas stebėjimas). Šis atradimas atitinka paskelbtus pastebėjimus, kad periferijoje pastebimai padidėjo F4 / 80 - CD11b + Gr1 + MDSC, po anti-Gr-1 mAb pelėms. 36 Mūsų pastebėjimai rodo, kad MDSC išsiskyrimas naudojant anti-Gr-1 monokloninius antikūnus gali paskatinti kaulų čiulpų mieloidinių pirmtakų dauginimąsi, dėl kurio vėliau šios ląstelės gali išsiplėsti ir atsinaujinti periferiniuose audiniuose H. polygyrus bakeri infekcijos metu.

Kaip alternatyvų metodą, 7-ą dieną po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos iš anksto užkrėstų pelių CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių, išvalytų iš užkrėstų pelių, perkėlėme naiviems gavėjams (6a pav.) Atskira pelių grupė gavo CD4 + CD25 - CD103 - T ląsteles, surinktas iš MLN, ir blužnies ląsteles, gautas 28 pi dieną. Ankstesni tyrimai, atlikti Rausch ir kt. 37 įrodė, kad įvaikinus šios ląstelės populiaciją, pelėms recipientams žymiai sumažėja kirminų našta. Kaip kontrolė, pelių grupė buvo gydoma fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS).

Image

Pasirinkus CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių perkėlimą iš H. polygyrus bakeri infekuotų pelių, padidėja kiaušinių gamyba ir padidėja suaugusiųjų kirminų našta pelėms-recipientams. a ) Įtėvio perkėlimo eksperimento schema. Pelės gavėjos, perkeltos į veną, injekuodamos 2 × 10 CD4 + CD25 - CD103 arba CD11c - CD11b + Gr1 + ląsteles, ir kontrolinės pelės, įšvirkštos 200 μl fosfatu buferiu užpildyto druskos tirpalo (PBS), buvo užkrėstos per os (po) 200 trečdalių. -pakopės lervos (L3) po 24 val. Pelės buvo nužudytos 7 dieną po užkrėtimo (pi) dėl imunofenotipų nustatymo. Pi ( b – d ) dienomis atskiroms pelėms buvo nustatyta suaugusiųjų kirminų našta ir kiaušinių gamyba. Diagramos diagramoje rodo absoliučius CD4 + GATA3 + T ląstelių ( b ), F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių ( c ) ir F4 / 80 + CD206 + ląstelės ( d ) PBS kontrolinių pelių blužniuose ir efektorinių CD4 + T ląstelių arba CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių recipientuose. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem ( n = 5 pelės kiekvienoje grupėje). ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01 ( e ir f ) Suaugusiųjų kirminų našta ir kiaušinių skaičius buvo nustatyti 14 ( e ) ir 28 ( f ) pi dienomis. Pateikti atskirų pelių duomenys ir nurodyti kiekvienos grupės vidurkiai ± sem ( n = 5). pelių vienoje grupėje). ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; **** P <0, 0001. Duomenys, pateikti b - d, atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. E punkte pateikti duomenys yra gauti iš atskirų pelių, surinktų iš dviejų nepriklausomų eksperimentų. Duomenys, pateikti f punkte, yra gauti iš atskirų pelių iš vieno eksperimento.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Mes pastebėjome, kad efektorinių CD4 + T ląstelių perkėlimas sąlygojo žymiai didesnį CD4 + GATA3 + ląstelių skaičių ir žymiai mažą F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi MDSC skaičių, palyginti su kontrolinėmis pelėmis ir MDSC gavėjais (6b, c pav.). F4 / 80 + CD11b + CD206 + AAMØ skaičiai reikšmingai nesiskyrė CD4 + T-ląstelių recipientuose, palyginti su MDSC gavėjais ar kontrolinėmis pelėmis (6d paveikslas). Tarp CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių gavėjų ir PBS kontrolių reikšmingų skirtumų tarp CD4 + GATA3 + T ląstelių ar MDSC nebuvo ir AAMØ skaičiaus skirtumų, palyginti su PBS kontrole ar CD4 + T ląstelių gavėjais. .

14 dieną pi buvo žymiai mažiau suaugusiųjų kirminų CD4 + T ląstelių gavėjose, kaip buvo parodyta anksčiau, tuo tarpu kirminų našta buvo panaši CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių ir PBS kontrolinių pelių gavėjams (6e pav.). Tačiau kiaušinių gamyba žymiai padidėjo CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių gavėjų organizme, palyginti su CD4 + T ląstelių recipientais ar PBS kontrolinėmis pelėmis, ir tai rodo padidėjusį kirminų vaisingumą buvusiose pelėse. 28 dieną pi, suaugusiųjų kirminų našta buvo ženkliai ir žymiai didesnė, kartu su žymiai didesne kiaušinių gamyba CD11c - CD11b + Gr1 + ląstelių recipientuose, palyginti su efektoriniais T ląstelių recipientais ar PBS kontrolinėmis pelėmis (6f pav.). Visi šie duomenys rodo, kad H. polygyrus bakeri sukeltas MDSC slopina adaptyvųjį imuninį atsaką, kuriame dalyvauja CD4 + GATA3 + T ląstelės pirminės infekcijos metu.

Diskusija

Laikas, reikalingas suaugusiems kirminams išsiųsti po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos, skiriasi priklausomai nuo genetinio šeimininko fono. 10, 38, 39 veislės pelių padermės, tokios kaip SWR ir SJL pelės, pašalina pirminę infekciją per 4–6 savaites ir yra laikomos greito reagavimo funkcijomis, o kitos, pavyzdžiui, CBA ir C3H pelės, reaguoja lėtai. Išgydžius vaistus ir užkrėstos H. polygyrus bakeri infekcija, suaugusieji kirminai greitai išstumiami daugumoje inbreduotų pelių padermių, įskaitant B6 peles, ir yra kritiškai priklausomi nuo atminties CD4 + GATA3 + ląstelių, IL-4, AAMØ ir specifinių parazitų antikūnų. 10, 11, 12, 15 Anksčiau buvo pastebėta, kad mažiau žarnyno audinių užkrėstų lervų kaupiasi mažiau CD4 + T ląstelių ir AAMØ po pirminės ir užkrėstos H. polygyrus bakeri infekcijos BALB / c pelėse, kurios greitai reaguoja ir reikalauja. suaugusių kirminų išsiuntimas po pirminės infekcijos - iki 8 savaičių. 11, 26 Šiame tyrime mes klausėme, ar panašūs vietinių ir sisteminių limfoidinių audinių ląstelių sudėties skirtumai yra akivaizdūs B6 pelėms. Pirminė H. polygyrus bakeri infekcija B6 pelėms yra lėtinė, o suaugę kirminai išlieka keletą mėnesių, tai rodo vidutinį reagavimo lygį.

Remdamiesi BALB / c pelių duomenimis, abiejuose audiniuose pastebėjome reikšmingą bendrų ląstelių ir CD4 + GATA3 + T ląstelių padidėjimą po pirminės ar užkrečiamosios infekcijos, tačiau kiekvienu atveju po užkrėtimo infekcija ląstelių skaičius buvo žymiai didesnis. Nors F4 / 80 + CD11b + ląstelių padaugėjo po pirminės ir užkrečiamųjų infekcijų (duomenys nepateikti), CD206 + AAMØ žymiai padidėjo tik užsikrėtimo infekcija metu, kad CD11b + CD206 + ląstelės sudarė> 50% visų F4 / 80 + makrofagų. Po pirminės infekcijos padidėjo MLN ir blužnies AAMØ padidėjimas 2–2, 5 karto, tuo tarpu audiniuose po užkrėtimo infekcija AAMØ padidėjo> 10 kartų. Svarbu pabrėžti, kad blužnyje buvo 8–10 kartų daugiau AAMØ nei MLN po užkrėtimo infekcija. Šis atradimas atitinka splenomegalijos stebėjimus H. polygyrus bakeri užkrėstose pelėse kartu su padidėjusia 2 tipo citokinų geno ekspresija. Nepaprastas H. polygyrus bakeri sugebėjimas sukelti stiprų sisteminį atsaką, įskaitant imuninį reguliavimą užtikrinančius tinklus, yra įtikinamų įrodymų, patvirtinančių šio virškinimo trakto nematodo, taip pat kitų helmintų naudingumą gydant moduliuoti ligą, skatinančią imuninį atsaką distalinėse vietose, tokiose kaip 1 tipo diabetas. ir alerginės reakcijos.

Svarbu tai, kad pastebėjome reikšmingą F4 / 80 - ląstelių, kurios ekspresuoja aukštą CD11b ir Gr1 kiekį MLN ir blužnyje, padidėjimą po pirminės, bet neužkrėstos H. polygyrus bakeri infekcija. F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių populiacija taip pat padidėjo užkrėstų pelių LP per anksti po pirminės infekcijos. Pranešama, kad panašaus fenotipo ląstelės kaupiasi aplink lervas, turbūt L4 stadijos lervas, per kelias dienas po pirminės infekcijos įsitvirtindamos plonosios žarnos raumenyse. 11, 26, 28. Nors iš pradžių buvo manoma, kad šios ląstelės yra neutrofilai, nei jų tapatumas, nei vaidmuo nebuvo išsamiai ištirtas. Norėdami toliau apibūdinti šių ląstelių fenotipą, mes išanalizavome Ly6G ir Ly6C raišką, ląstelių paviršiaus žymenis, naudojamus MDSC atskirti, mieloidinėmis ląstelėmis, fenotipiškai panašias į ląsteles, kurias sukėlė H. polygyrus bakeri infekcija, kaip granulocitines ar monocitines, atitinkamai. 17, 29, 30. Po pirminės H. polygyrus bakeri infekcijos užkrėstų pelių MLN ir blužnyje F4 / 80 - CD11b ir Gr1 hi Ly6G + Ly6C - MDSC reikšmingai padidėjo. Tačiau ši populiacija, panaši į granulocitinę MDSC, sudarė palyginti nedaug visų CD11b hi Gr1 hi ląstelių. Priešingai, dramatiškas ir reikšmingas F4 / 80 - CD11b hi Gr1 hi ląstelių padidėjimas, išreiškiantis ir Ly6G, ir Ly6C, buvo pastebimas MLN ir blužnyje po pirminės infekcijos. Tai rodo, kad pirminė H. polygyrus bakeri infekcija sukelia unikalią MDSC populiaciją.

MDSC are known to regulate innate and adaptive immune responses, including effector CD4 + T-cell responses during cancer and chronic inflammation as well as during parasite infections. 20, 21, 22, 23, 31 To determine whether the F4/80 CD11b hi Gr1 hi MDSC induced during primary H. polygyrus bakeri infection suppressed Th2 responses, we performed in vitro and in vivo experiments. First, we purified CD11c CD11b + Gr1 + cells from naïve and infected mice and co-cultured these cells with CFSE-labeled OT-II spleen cells in the presence of OVA 323-339 peptide. At high ratios, CD11c CD11b + Gr1 + cells from infected mice suppressed OVA-specific CD4 + T-cell proliferation compared with cells from naïve mice. To investigate whether H. polygyrus bakeri -induced F4/80 CD11b hi Gr1 hi MDSC contribute to low levels of IL-4 secretion by CD4 + Th2 cells during primary infection, CD11c CD11b + Gr1 + cells from infected mice were co-cultured with spleen cells harvested on day 14 after primary infection when IL-4 secretion is maximal in B6 mice, and the cultures were stimulated with AWH. Even at a ratio of 1:16, CD11c CD11b + Gr1 + cells purified from infected mice on day 7 after primary infection significantly suppressed IL-4 secretion.

Studies in tumor-bearing mice and cancer patients have identified various mechanisms whereby MDSC mediate their suppressive effects on effector T-cell responses. 41 Increased L -arginine metabolism via either the Arg1 or Nos2 pathway has emerged as a major pathway. Although both granulocytic (Ly6G + ) and monocytic (Ly6C + ) MDSC utilize the Arg1 pathway to mediate their suppressive activity, only Ly6C + MDSC produce high levels of NO. 41 Co-culture of CD11c CD11b + Gr1 + cells from H. polygyrus bakeri -infected mice with OT-II CD4 + T cells and DC revealed that inhibiting NO secretion reversed suppression of OVA-specific proliferation whereas the arginase inhibitor nor-NOHA had no effect. It is well established that AAMØ secrete arginase that is responsible together with specific antibody for elimination of adult worms after challenge infection with H. polygyrus bakeri. 11, 12 Indeed, in vivo treatment with the arginase inhibitor S-(2-boronoethyl)-l-cysteine during challenge infection results in higher worm burdens, reduced egg production, and increased larval recovery. 11, 12 Together, these studies support a critical role for arginase in eliminating challenge infection with H. polygyrus bakeri . NO secretion by macrophages or other myeloid-derived cells in response to the Th1 cytokine IFN-γ has not been described during either primary or challenge infection with this parasite. Nevertheless, in our hands, treatment with the NO inhibitor 1400W almost completely restored OVA-specific proliferation and significantly reduced NO levels in the co-cultures. Finally, we demonstrated that adoptive transfer of CD11c CD11b + Gr1 + cells from mice with primary H. polygyrus bakeri infection to naïve mice resulted in significantly higher adult worm burdens and increased egg counts on days 14 and 28 pi

Our findings that MDSC suppressed Th2 immune responses to H. polygyrus bakeri are divergent from reports on the role of these cells in N. brasiliensis and T. spiralis infected mice. In these models, MDSC were observed to enhance adult worm clearance by increasing IgE-mediated cytokine production by mast cells. 24, 25 While mucosal mastocytosis correlates with adult worm expulsion during H. polygyrus bakeri infection, the exact role of mast cells in immunity against H. polygyrus bakeri is unclear. 10 Although N. brasiliensis and H. polygyrus bakeri are closely related rodent GI nematodes, primary N. brasiliensis infection is rapidly eliminated in mice within 2 weeks. In contrast, primary H. polygyrus bakeri infection is chronic in B6 mice used in our studies. Thus, differences in how these parasites establish infection and how the host immune system responds may explain the different role of MDSC in these infections.

Primary H. polygyrus bakeri infection induces Foxp3 + Tregs in intestinal tissue as well as in the MLN and spleen, but the reported effect of depletion of these cells on worm expulsion and intestinal pathology is variable. 37, 42, 43, 44, 45 However, these studies consistently showed that depletion of Tregs results in increased Th2 responses. Furthermore, it appears that there is no correlation between susceptibility to primary H. polygyrus bakeri infection and the number of tissue Foxp3 + Tregs among inbred mouse strains although the suppressive potential of cells from mice with varying levels of susceptibility was not examined. 46

Taken together, our findings demonstrate that primary H. polygyrus bakeri infection induced the accumulation of F4/80 CD11b hi Gr1 hi MDSC in local and systemic lymphoid tissues. A high proportion of these cells express Ly6G and Ly6C, and thus may represent a novel class of MDSC. H. polygyrus bakeri -induced MDSC suppressed antigen-specific CD4 + T-cell proliferation in vitro via an NO-dependent mechanism. Importantly, infection-induced MDSC suppressed parasite-specific IL-4 secretion in vitro and possibly CD4 + GATA3 + T-cell function in vivo . A role for MDSC in promoting the establishment of chronic primary H. polygyrus bakeri infection in B6 was demonstrated by adoptive transfer studies. Understanding how MDSC are induced during GI nematode infection and their interplay with other regulatory cells such as Foxp3 + Tregs to dampen protective Th2 responses will be important in devising vaccines and new therapeutic approaches to alleviate the burden of infections with these parasites in humans and livestock, especially in regions where co-infections are prevalent.

Metodai

Mice, parasite, and infection. C57BL/6 (B6) and BALB/c mice, 8–10 weeks old, were purchased from Charles River Laboratories (Saint-Constant, Quebec, Canada). Breeding pairs of B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J OT-II mice were purchased from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Mice were maintained and handled according to the guidelines of the Canadian Council on Animal Care and the Animal Ethics Committee of McGill University. H. polygyrus bakeri was maintained and propagated in male BALB/c mice as described previously. 13, 47 Female B6 mice were used for all experimental infections. For primary H. polygyrus bakeri infection, mice were infected by oral gavage (per os, po) with 200 infective third-stage larvae (L3), and the adult worm burden was determined on day 14 pi as described previously. 47 For challenge infection, mice were infected with 200 L3 and treated with pyrantel pamoate (100 mg kg −1 ) on day 14 pi to clear adult worms, allowed to rest for 5 weeks, and challenged with 200 L3. In some experiments, fecundity was assessed by collecting feces to determine the number of eggs as described previously. 47 AWH was prepared as described previously, the protein concentration was determined using a protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), and aliquots were stored at −20 °C until use. 47

Cell preparation and adoptive transfer. MLN and spleens were harvested from naïve and infected B6 mice at the indicated times pi, and single-cell suspensions were prepared as described previously. 37 Dead cells were removed using a kit from Miltenyi Biotec, Auburn, CA. Immune cell populations were purified using MACS beads (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions. To isolate MDSC, MLN and spleen cells were enriched by negative selection of CD11c + cells using anti-CD11c magnetic beads followed by positive selection of CD11b + cells using anti-CD11b magnetic beads. The resultant cell populations had a purity of >96% CD11c CD11b + Gr1 + cells. For in vitro suppression assays, purified CD11c CD11b + Gr1 + cells were co-cultured with unfractionated spleen cells or purified CD4 + T cells isolated from the spleens of OT-II mice using a mouse CD4 + T cell isolation kit (StemCell Technologies, Vancouver, BC). Spleen CD11c + DCs were purified from naïve mice by positive selection using anti-CD11c magnetic beads (Miltenyi Biotec). To obtain CD4 + CD25 CD103 cells for adoptive transfer, MLN and spleens were harvested from infected B6 mice on day 28 pi Single-cell suspensions were prepared, pooled, and surface stained with PE-conjugated anti-CD25 (clone 7D4; Miltenyi Biotec) and anti-CD103 (clone 2E7; Miltenyi Biotec) mAbs. CD25 CD103 cells were enriched by negative selection using anti-PE conjugated magnetic beads (Miltenyi Biotec). CD4 + cells were positively selected in the resultant population using anti-CD4 magnetic beads (Miltenyi Biotec). The purity of the CD4 + CD25 CD103 cells obtained was always >96%. Recipient B6 mice were injected iv with 2 × 10 6 CD4 + CD25 CD103 or CD11c CD11b + Gr1 + cells or 200 μl PBS as a control. Twenty-four hours later, recipient mice were infected with 200 L3 and adult worm burden and egg production were assessed on days 14 and 28 pi as described previously. 47

Leukocytes from the LP of the small intestines were isolated according to the method described by Davies and Parrott. 48 The viability of the cells obtained was >90%. For photomicrographs, cytospins of the cells were prepared and stained with Diff-Quik. Images were taken at × 630 magnification using the AxioVision (Zeiss, Jena, Germany) software.

In vitro suppression assay. For antigen-specific proliferation, purified CD11c CD11b + Gr1 + cells from MLN and spleen of naïve or infected mice were co-cultured at various ratios with 1 × 10 6 CFSE-labeled spleen cells from OT-II mice prepared as previously described 49 and stimulated with 1 n M OVA 323–339 peptide (AnaSpec, Fremont, CA). After incubation at 37 °C with 5% CO 2 for 72 h, the cells were harvested and stained with APC-conjugated anti-CD4 mAb (clone GK1.5; eBioscience, San Diego, CA). The CFSE dilution was determined in gated CD4 + T cells by flow cytometry and analyzed using the FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR). To assess H. polygyrus bakeri- specific suppression of cytokine secretion, CD11c CD11b + Gr1 + cells purified from MLN and spleens of infected mice on day 7 pi were pooled and co-cultured at various ratios with spleen cells obtained from infected mice on day 14 pi The co-cultures were stimulated with 50 μg ml −1 AWH, and IL-4 levels were determined in supernatants collected 48 h later by ELISA as described previously. 13 In some experiments, 1 × 10 6 CD11c CD11b + Gr1 + cells from infected mice were co-cultured with CFSE-labeled CD4 + cells purified from the spleens of OT-II mice in the presence of 2 × 10 5 CD11c + DCs purified from the spleens of naïve B6 mice and pre-treated with 0.5 mg ml −1 mitomycin C (Sigma, St. Louis, MO). N (omega)-hydroxy-nor- L -arginine (nor-NOHA; 300 μ M ; Calbiochem, San Diego, CA) or 1400W (100 μ M ; Sigma) was added to the co-cultures to block arginase or NO production, respectively. After incubation at 37 °C with 5% CO 2 for 72 h, the cells were harvested and the CFSE dilution in gated CD4 + cells was determined. Supernatants were harvested and the NO levels were determined using Griess reagent as described previously. 50

Immunophenotyping. Before staining for immunophenotyping, the viability of all MLN, spleen, and LP cell preparations was determined by flow cytometry using eFluor 780 (eBioscience). Fc receptors were blocked using anti-mouse CD16/CD32 mAb (clone 2.4G2; BD Pharmingen, San Jose, CA). To identify MDSC and AAMØ, the cells were surface stained with PE-conjugated anti-F4/80 (clone BM8, eBioscience), APC-conjugated anti-CD11b (clone M1/70, eBioscience), Per-CP-Cy5.5-conjugated anti-Gr-1 (clone RB6-8C5, eBioscience), Horizon V450-conjugated anti-Ly6G (clone1A8, BD Biosciences, San Jose, CA), and Brilliant Violet 510-conjugated anti-Ly6C (clone HK1.4, BioLegend, San Diego, CA) mAbs. Surface stained cells were then fixed using a fixation and permeabilization kit (eBioscience) before intracellular staining with FITC-conjugated anti-CD206 (clone C068C2, BioLegend, San Diego, CA) mAb. To identify Th2 cells, cells were surface stained with FITC-conjugated, anti-CD4 (clone GK1.5; BioLegend) mAb, fixed, and stained intracellularly with PE-conjugated anti-GATA-3 (clone TWAJ; eBioscience) mAb. Compensation controls included UltraComp eBeads (eBioscience) singly stained with each of the fluorochromes used in the experiment. Gating strategies for AAMØ and MDSC are shown in Supplementary Figure 2. Flow cytometry was performed using a FACSCanto or FACSCalibur (BD Biosciences), and the data were analyzed using the FlowJo software.

Statistinė analizė. Data are presented as mean±sem Groups were compared and differences were analyzed for significance using an unpaired t -test with Welsh's correction. For multiple groups, differences were analyzed for significance using one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test using the GraphPad Prism software (La Jolla, CA). A P -value of <0.05 was considered to be significant.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

    PAPILDOMA MEDŽIAGA susieta su internetine šio leidinio versija adresu //www.nature.com/mi