Su proliferacija susijęs brn-3b transkripcijos faktorius gali suaktyvinti ciklino d1 ekspresiją neuroblastomos ir krūties vėžio ląstelėse | onkogenas

Su proliferacija susijęs brn-3b transkripcijos faktorius gali suaktyvinti ciklino d1 ekspresiją neuroblastomos ir krūties vėžio ląstelėse | onkogenas

Anonim

Anotacija

Brn-3b transkripcijos faktorius padidina neuroblastomų (NB) ir krūties vėžio ląstelių linijų proliferaciją in vitro ir padidina naviko augimo greitį bei dydį in vivo , tuo tarpu sumažindamas Brn-3b sulėtina augimą tiek in vitro , tiek in vivo . Brn-3b yra padidėjęs> 65% krūties vėžio biopsijų, ir čia parodome, kad Brn-3b taip pat yra padidėjęs NB navikų atvejais. Mes parodėme reikšmingą koreliaciją tarp Brn-3b ir ciklino D1 (CD1) krūties vėžiu ir NB navikų bei ląstelių linijomis. Brn-3b tiesiogiai transaktivuoja CD1 promotorių ko-transfekcijos eksperimentuose, tuo tarpu elektroforetinio judėjimo poslinkio ir chromatino imunoprecipitacijos tyrimai rodo, kad Brn-3b baltymas jungiasi prie oktamero sekos, esančios proksimaliniame CD1 promotoriuje. Vietos nukreipta šios sekos mutagenezė lėmė tai, kad Brn-3b prarado CD1 promotoriaus transaktyvaciją. Taigi, Brn-3b gali pakeisti krūties vėžio ir NB ląstelių augimo savybes, padidindamas CD1 ekspresiją šiose ląstelėse.

Įvadas

Brn-3b transkripcijos faktorius iš pradžių buvo išskirtas iš neuroblastomos (NB) gautos ND7 ląstelių linijos remiantis homologija susijusio Brn-3a baltymo konservuotame Pit-Oct-Unc (POU) domene (Lillycrop et al., 1992). . Brn-3b yra ekspresuojamas besivystančios ir suaugusios nervų sistemos neuronuose (Xiang ir kt., 1993; Turner ir kt., 1994; Xiang, 1998), bet ir neneuroniniuose audiniuose, įskaitant krūties epitelį (Budhram-Mahadeo ir kt.)., 2001; Budhram-Mahadeo ir Latchman, 2006). Brn-3b baltymai turi sudėtingas funkcijas, kurios priklauso nuo to, kokie ląstelių tipai juos išreiškia. Pavyzdžiui, tinklainėje Brn-3b yra ekspresuojamas skilvelio zonoje ir tinklainės ganglinėse ląstelėse (RGC) (Xiang ir kt., 1993, 1996) ir yra būtinas normaliam tinklainės vystymuisi, nes Brn-3b „išmuša“. (KO) pelės yra akli (Erkman ir kt., 1996; Gan ir kt., 1996). Tai atsiranda dėl netinkamo diferenciacijos / aksonų išsivystymo ir mirties RGC sluoksnyje ir skilvelio zonoje vėlyvosios embriogenezės metu ir po gimdymo (Xiang, 1998).

Priešingai nei jo poveikis tinklainėje, padidėjusi Brn-3b ekspresija vėžio ląstelėse yra stipriai susijusi su padidėjusiu proliferacija ir pakitusiu augimu. Brn-3b ekspresija proliferuojančiose NB ląstelių linijose sumažėja, jei ląstelės diferencijuojasi pašalindamos serumą arba stimuliuodamos retinoine rūgštimi (RA) (Budhram-Mahadeo ir kt., 1995; Smith ir Latchman, 1996). Be to, priverstinis per didelis Brn-3b baltymo ekspresija sergant krūties vėžiu ir NB ląstelėmis padidina proliferaciją in vitro ir skatina auglių augimą in vivo ksenografinių modelių modeliuose, tuo tarpu sumažinus Brn-3b (antisense), sumažėja proliferacija in vitro ir atsiranda mažesni, lėčiau augantys navikai in vivo (Dennis ir kt., 2001; Irshad ir kt., 2004). Brn-3b taip pat suteikia atsparumą augimą slopinančiam dirgikliui RA ir padidina NB ląstelių migracijos potencialą (Irshad et al., 2004). Brn-3b yra padidėjęs> 65% krūties vėžio atvejų (Budhram-Mahadeo ir kt., 1999), tačiau jo išraiška pirminėse NB yra iki šiol netirta.

Kaip transkripcijos faktorius, Brn-3b baltymas reguliuoja kritinių genų, kontroliuojančių skirtingus procesus, raišką; Pvz., neuronų ląstelėse Brn-3b slopina genus, susijusius su diferenciacija, būtent, α-interneksinu , SNAP 25 ir sinaptofizinu (Latchman, 1998a), tuo tarpu krūties vėžio ląstelėse jis slopina BRCA1, susijusį su ląstelių ciklo sustabdymu (Budhram-Mahadeo). et al., 1999). Priešingai, Brn-3b aktyvuoja šilumos šoko baltymą 27 ( Hsp27 ), susijusį su invaziškumu ir atsparumu vaistams krūties vėžyje (Lee ir kt., 2005) ir nuo ciklino priklausoma kinazė CDK4 , reikalinga ląstelių ciklo progresavimui (Samady et al. ., 2004).

CDK4 baltymas kontroliuoja G1 perėjimą ląstelėse, vykstant ląstelių ciklui (Arnold ir kt., 1991), susiejant su reguliavimo partneriais, tokiais kaip ciklinas D1 (CD1) (dar vadinamas PRAD1, CCND1) (Motokura et al., 1991) fosforilinti specifinius substratus, tokius kaip retinoblastomos baltymas (Israels and Israels, 2000). Tačiau, nors CDK4 slopina jo ryšys su slopinančiais baltymais, tokiais kaip p21 cip1 / waf1, cikliniai subvienetai yra reguliuojami ekspresijos lygiu ir baltymų stabilumu, nes ląstelės progresuoja per ląstelių ciklą (Guo ir kt., 2005). Todėl veiksniai, kontroliuojantys CD1 raišką, vaidins svarbų vaidmenį progresuojant ląstelių ciklui, ypač per G1 fazę.

Kaip ir Brn-3b , CD1 yra labai svarbus normaliam tinklainės vystymuisi (Fantl ir kt., 1995; Sicinski ir kt., 1995), nes CD1 KO pelės praranda tinklainės ląsteles ir sukelia aklumą (Sicinski et al., 1995). Dar svarbiau, kad Brn-3b KO mutantų tinklainėje, lyginant su laukinio tipo (WT) pakratų draugais, mikrotraumos analizėje stebimas CD1 sumažėjimas 2, 5 karto (Mu ir kt., 2001). Panašiai kaip Brn-3b , CD1 taip pat padidina krūties vėžio ląstelių dauginimąsi (Zwijsen ir kt., 1996) ir yra padidėjęs sergant daugeliu krūties vėžio atvejų (Barnes ir Gillett, 1998; Budhram-Mahadeo ir kt., 1999). Be to, transgeninėms pelėms, kurios yra padidintos, kad per daug ekspresuotų CD1 baltymą krūtyje, vystosi pieno liaukos navikai (Wang ir kt., 1994).

Šiame tyrime parodyta koreliacija tarp Brn-3b su CD1 krūties navikuose ir NBs bei parodyta, kad Brn-3b baltymai gali tiesiogiai transformuoti CD1 promotorių.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Brn-3b mRNR yra ekspresuojama dideliu kiekiu biopsijų, paimtų iš pacientų, sergančių NB navikais

Kadangi Brn-3b galėjo žymiai padidinti augimą ir migracijos potencialą, tuo pačiu metu suteikdami atsparumą augimą slopinančiam dirgikliui NB ląstelių linijose (Irshad et al., 2004), mes išbandėme, ar Brn-3b nėra padidėjęs NB naviko biopsijose. Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR (qRT – PGR) buvo naudojama norint išmatuoti bendrą Brn-3b mRNR iš cDNR (paruošto iš RNR, gauto iš NB biopsijos). Taip pat buvo išmatuotas susijęs Brn-3a POU transkripcijos faktorius (susijęs su NB ląstelių linijų diferenciacija). Vertės buvo pakoreguotos naudojant namų tvarkymo geną, glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazę ( GAPDH ), o skirtumai buvo išreikšti Brn-3b ar Brn-3a pokyčiais, lyginant su kontroliniame lygyje (žmogaus SHSY5Y ląstelės - nustatyta 1) pokyčiais. 1a paveiksle parodytas aukštas Brn-3b mRNR kiekis daugelyje navikų mėginių, kai ∼ 75% rodo padidėjusį Brn-3b (daugiau nei 100 kartų didesnis), palyginti su kontroliniame lygyje. Priešingai, daugumoje šių naviko mėginių buvo labai žemas mRNR, koduojančio susijusį, bet antagonistinį Brn-3a, lygis . Ši priešinga Brn-3b ir Brn-3a išraiška NBs atspindi jų unikalų poveikį NB ląstelių linijoms. Taigi, skirtingai nuo Brn-3b augimą skatinančio poveikio, didelis Brn-3a kiekis lemia NB ląstelių diferenciaciją kaip skirtingo poveikio specifiniams taikiniams genus pasekmę (Smith ir Latchman, 1996; Latchman, 1998b). Šiuo atžvilgiu padidėjęs Brn-3b ir žemas Brn-3a kiekis NB biopsijose taip pat atsispindi jų priešinguose ir antagonistiniuose poveikiuose NB ląstelių linijose. Kartu su ankstesniais rezultatais NB ląstelių linijose, tikėtina, kad padidėjęs NB Brn-3b padidės reikšmingai reguliuojant šių navikų augimą ir elgesį.

Image

NB naviko biopsijose padidėja Brn-3b, bet ne Brn-3a mRNR. a ) qRT – PGR buvo naudojamas Brn-3b ir Brn-3a mRNR išmatuoti NB biopsijose. Bendras Brn-3b arba Brn-3a nuorašas buvo išmatuotas naudojant pasirinktinį zondą ir pradmenis (ABI tyrimas pagal projektą) ir QuantiTect zondo rinkinį (Qiagen, West Sussex, UK). Žmogaus GAPDH buvo kiekybiškai įvertintas naudojant „TaqMan Gene Expression Assay 99999905“ (Applied Biosystems, Warrington, JK). NBN RNR buvo gautos iš Italijos neuroblastomų draugijos (Genuja, Italija), o NB biopsijos buvo gautos iš Patologijos skyriaus, Great Ormond Street ligoninėje (Londonas, JK) arba UKCCSG, JK. Atlikus qRT – PGR, reikšmės buvo normalizuotos iki endogeninio GAPDH namų tvarkymo geno ir išreikštos raukšlės indukcija, palyginti su lygiais, nustatytais žmogaus NB ląstelių linijoje, SHSY5Y, žinomu kaip Brn-3a ir Brn-3b (mRNR ekspresija kiekvienam ląstelės transkripcijos faktoriui). linija savavališkai nustatyta ties 1) (Vandesompele et al., 2002). ( b ) Brn-3b lygio analizė pagal NB stadiją (INSS) rodo aukštesnį Brn-3b lygį 3 ir 4 stadijų navikuose, palyginti su žemesnėmis 1 ir 2 arba 4 stadijomis. c ) Brn-3b mRNR lygio koreliacija 4 stadijos NB navikų, turinčių MYCN statusą, atveju, rodo didesnį Brn-3b lygį navikuose su normaliais (ne amplifikuotais) MYCN kopijų skaičiais (4 stadija NA), palyginti su 4 stadijos navikais, turinčiais „MycN“ stiprinimas (4 „ MycN“ stadija ). INSS, tarptautinė neuroblastomų sustojimo sistema; NA, nepadauginta; NB, neuroblastoma; qRT – PGR, kiekybinė atvirkštinė transkripcija – PGR.

Visas dydis

Tolesnė šių NB analizė pagal naviko stadijas (naudojant Tarptautinę neuroblastomos stadijos sistemą (INSS)) (Brodeur, 2003) parodė aukščiausią Brn-3b lygį 3 stadijos navikuose (1b paveikslas), kurio mediana 1500, palyginti su mažiau agresyvia 1/2 stadijos (mediana ∼ 222) arba 4 (mediana ∼ 344, 5). Įdomu tai, kad aukštesnio laipsnio 4 navikai išreiškė mažesnį Brn-3b (mediana ∼ 362) nei 3 stadijos navikai.

Agresyvi 4 stadijos NB dažnai turi MYCN amplifikaciją, todėl Brn-3b lygis buvo toliau analizuojamas naudojant navikų MYCN būklę. 1c paveiksle parodyti žemesni Brn-3b lygiai 4 stadijos navikuose su MYCN amplifikacija, palyginti su tais, kuriuose MYCN amplifikacija nėra (NA) (1c paveikslas) (12 NB mėginių vidutinės vertės su MYCN amplifikacija padidėjo 362 kartus, palyginti su vidurkiu ∼ 548 esant panašiam skaičiui NB navikų su normaliomis MYCN kopijomis ). Tačiau dėl didelių šių auglių Brn-3b lygio skirtumų ir mažo mėginio dydžio, tai nėra statistiškai reikšminga ( P = 0, 2), o norint patvirtinti šiuos duomenis reikės daugiau mėginių.

Šie rezultatai rodo, kad Brn-3b yra žymiai padidėjęs daugelyje NB navikų, ypač 3 ir 4 stadijų navikuose, kurie neturi MYCN amplifikacijos.

CD1 ląstelių linijose ir naviko mėginiuose koreliuoja su Brn-3b

Kadangi Brn-3b TF skatina ląstelių dauginimąsi, o Brn-3b netekimas sulėtino ląstelių augimą (Dennis ir kt., 2001; Irshad ir kt., 2004), mes išmatuojome CD1 baltymą (susijusį su proliferacija) stabiliai transfekuotose NB ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja Brn. -3b (Brn-3b +) arba sumažino Brn-3b baltymą (3b antisense) (Irshad et al., 2004), palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. 2A (i) ir (ii) paveikslai rodo žymiai aukštesnius endogeninio CD1 baltymo lygius Brn-3b (+) ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ( P reikšmė <0, 05), tuo tarpu Brn-3b antisense ląstelėse buvo sumažėjęs CD1 lygis. Šis CD1 sumažėjimas praradus Brn-3b taip pat pastebėtas MCF7 krūties vėžio ląstelėse, kurios stabiliai ekspresuoja Brn-3b antisenzę (2A pav. (Iii)). Taigi, norint pakeisti šių ląstelių augimą, pakako pakeisti Brn-3b baltymo lygį NB ląstelėse arba krūties vėžio ląstelėse, ir tai buvo lygiagreti CD1 ekspresijos pokyčiams.

Image

Brn-3b koreliuoja su ciklinu D1 ląstelių linijose ir naviko biopsijose. ( A ) (i) (a) Reprezentatyvi „Western blot“ analizė, rodanti padidėjusį ciklino D1 baltymo kiekį IMR32 ląstelėse, per daug ekspresuojančiose Brn-3b (Brn-3b +), ir mažesnį lygį ląstelėse su sumažinta Brn-3b (3b α -sense), palyginti su LTR1 ( vektorius) valdymas. (b) Brn-3b baltymo ekspresija stabiliai transfekuotose ląstelių linijose, per daug ekspresuojančios Brn-3b arba su antisensu, kad būtų sumažintas jo lygis. (ii) Ciklino D1 baltymo kiekybinis įvertinimas IMR32 ląstelėse, išreiškiančiose skirtingus Brn-3b lygius, nuskaitydamas trijų nepriklausomų eksperimentų densitometriją. (iii) Brn-3b sumažinimas MCF7 ląstelėse naudojant Brn-3b antisenzę sąlygoja atitinkamai ciklino D1 baltymo lygio sumažėjimą, palyginti su vektorių kontrolinėmis ląstelėmis. ( B ) (i) Brn-3b mRNR koreliacija su ciklino D1 lygiais navikų mėginiuose. qRT – PGR buvo naudojamas žmogaus ciklino D1 kiekybiniam įvertinimui (TaqMan Gene Expression Assay, hCG2016647 (Applied Biosystems)), o GAPDH lygiai buvo naudojami koreguoti kintamumui. Regresinė analizė atlikta naudojant Sigmos grafiką. i) reikšmingas ryšys tarp ciklino D1 ir Brn-3b ( R = 0, 55) NB biopsijose, kuris buvo unikalus, nes (ii) rodo blogą koreliaciją tarp Brn-3b ir ciklino E mRNR šiuose mėginiuose ( R = 0, 0002). ( C ) reikšmingas ryšys tarp Brn-3b mRNR ir ciklino D1 krūties vėžio biopsijose po qRT – PGR ( R = 0, 85). Krūties vėžio RNR buvo gautos iš „Candis Tissue Bank“ (Liverpulis, JK) ir „CR-UK Hedley Atkins“ krūties patologijos laboratorijos (Guy's ligoninė, Londonas). LTR, ilgas terminalo pakartojimas; NB, neuroblastoma.

Visas dydis

Toliau CD1 kiekybiškai įvertinome navikuose su žinomu Brn-3b lygiu, naudodamiesi RNR, gauta iš 48 NB (1 paveikslas) ir 42 (anksčiau išanalizuota) krūties vėžio biopsijų (Budhram-Mahadeo ir kt., 1999; Samady ir kt., 2004; Lee ir kt.) al., 2005). 2B (i) paveiksle parodyta gera Brn-3b koreliacija su CD1 mRNR> 50% NB mėginių ( R = 0, 55), būdinga CD1, nes tarp šių navikų buvo bloga koreliacija tarp ciklino E ir Brn-3b ( R). = 0, 0002) (2B paveikslas (ii)). Panaši 42 krūties vėžio biopsijų analizė parodė dar stipresnę koreliaciją ( R = 0, 85) tarp Brn-3b ir CD1 (2C paveikslas), patvirtindama glaudų ryšį tarp Brn-3b ir CD1 navikų mėginiuose ir ląstelių linijose, išreiškiančiose skirtingą Brn- 3b baltymas.

CD1 promotoriaus transakcija Brn-3b pagalba

Toliau mes išbandėme, ar Brn-3b gali tiesiogiai reguliuoti CD1 ekspresiją atlikdami pereinamojo laikotarpio transfekcijos tyrimus, kuriuose CD1 promotoriaus reporterio plazmidė (CD1-848) buvo kartu transfekuota su Brn-3b ekspresijos vektoriu (kuriame ilgas galinis pakartojimas (LTR) skatina Brn-3b cDNR) į ND7 ląsteles. CD1-567 arba CD1-69 delecijos konstrukcijos (Sabbah ir kt., 1999; Redeuilh ir kt., 2002) (3a pav.) Buvo naudojamos norint pažymėti CD1 promotoriaus regioną, reikalingą Brn-3b transakcijai. TK-renilla reporteris (įtrauktas į visus perpylimus) pateikė vidinę transfekcijos efektyvumo kintamumo kontrolę.

Image

Brn-3b aktyvina ciklino D1 (CD1) promotorių NB ir krūties vėžio ląstelių linijose. a ) Tyrime naudojamų ciklino D1 promotoriaus konstruktų schema. Ilgiausią konstrukciją (CD1-848) sudaro sekos nuo –848 iki +49, klonuotų į pGL2 luciferazės vektorių, ir delecijos konstruktai buvo gauti pašalinant specifines sritis iš promotoriaus 5 ′ galo; tai yra atitinkamai –567 (CD1-567) ir −69 (CD1-69) pozicijos (dr. Gerardo Redeuilho dovanos, Saint-Antoine ligoninė, Paryžius). ( b ) (i) Reporterio tyrimai, parodantys Brn-3b ekspresijos vektorių kartu su ciklino D1 promotoriaus konstruktais transfekcijos į ND7 neuroblastomos ląsteles poveikį. Promotoriaus aktyvumo pokyčiai, kai yra Brn-3b, buvo išreikšti tuščiojo vektoriaus kontrolės procentine dalimi (nustatyta 100%), pritaikius transfekcijos efektyvumo pokyčius (naudojant Renilla Luciferase reporterio geną, pRL-TK). Pateiktos vertės parodo trijų eksperimentų rezultatą (± sd). (ii) Žurnalisto tyrimas, rodantis bazinio deleto konstrukto CD1-69 promotoriaus aktyvumą, palyginti su viso ilgio CD1-848 promotoriumi. Kiekvieno promotoriaus luciferazės aktyvumas, išmatuotas atlikus transfekciją į neuroblastomos ląsteles, buvo normalizuotas iki TK-Renilla. (iii) Western blot analizė, siekiant parodyti padidėjusią Brn-3b baltymų ekspresiją po Brn-3b ekspresijos vektoriaus transfekcijos, palyginti su vektorių, kontroliuojamų transfekuotomis ląstelėmis. c ) Žurnalistikos testai, rodantys ciklino D1 promotoriaus (CD1-848) transaktyvaciją Brn-3b MCF7 krūties vėžio ląstelėse, palyginti su tuščiojo vektoriaus kontrole (nustatyta 100%). Reikšmės koreguojamos naudojant vidinės kontrolės renilla reporterio geną ir parodo trijų eksperimentų vidurkį (± sd).

Visas dydis

Pav. 3b (i) parodo, kad Brn-3b ilgiausiai CD1 promotorių (CD1-848) aktyvuoja nuo 8 iki 10 kartų, palyginti su vektoriaus kontrole, LTR ( P <0, 005). Panašus transaktyvacija buvo pastebėtas, kai delecijos konstruktas CD1-573 buvo transfekuotas kartu su Brn-3b, tačiau trumpiausias promotoriaus konstruktas, CD1-69, Brn-3b nebuvo aktyvuotas, nors jo bazinis aktyvumas buvo panašus į ilgiausio promotoriaus CD1- 848 (santykinis luciferazės tyrimo vienetas (RLU) po kiekvieno promotoriaus transfekcijos atskirai) (3b paveikslas (ii)). 3b (iii) paveiksle parodyti padidėję Brn-3b baltymai ląstelėse po transfekcijos Brn-3b ekspresijos vektoriu. Šie rezultatai rodo, kad CD1-69 promotoriaus konstrukte yra elementai, reikalingi nepažeistos bazinės transkripcijos mašinos surinkimui, tačiau norminiai elementai, reikalingi Brn-3b šiam promotoriui aktyvinti, yra promotoriaus sekose −567 ir −69 ir yra prarasti CD1 -69 konstrukcija.

Panašiais eksperimentais mes taip pat išbandėme, ar Brn-3b gali MCA7 krūties vėžio ląstelių linijose atlikti viso ilgio CD1 promotoriaus CD1-848 aktyvumą. 3c paveikslas parodo, kad Brn-3b taip pat stipriai aktyvuoja CD1 promotorių krūties vėžio ląstelėse.

Brn-3b gebėjimas aktyvinti CD1 promotorių NB ir krūties vėžio ląstelėse rodo, kad koreliacija tarp šių dviejų veiksnių naviko mėginiuose gali kilti dėl tiesioginio Brn-3b reguliuojamo CD1 .

Brn-3b jungiasi tiesiai prie oktamero vietos proksimaliniame CD1 promotoriuje

Analizuojant tariamų transkripcijos faktoriaus rišamųjų vietų CD1 promotoriaus seką tarp –567 ir –69, naudojant „MatInspector“ (//www.genomatix.de/), paaiškėjo dvi A / T turtingos sekos tarp –248 ir –228 padėčių ( 4a paveikslas (i)), kuris turėjo homologiją su oktamerio vietomis, kurias atpažino šie POU baltymai. Norint patikrinti, ar Brn-3b jungiasi su šia CD1 promotoriaus sritimi, buvo atliktas elektroforetinio judrumo poslinkio tyrimas (EMSA), naudojant 32 P-radioaktyviu būdu pažymėtus oligonukleotidų zondus (atitinkančius šią seką). 4a (ii) paveiksle pavaizduoti sulėtėję baltymų / DNR kompleksai, suformuoti, kai zondas buvo inkubuotas su Brn-3b (+) baltymų ekstraktais (pažymėtais * ), bet jų nebuvo, kai buvo naudojami SAOS2 ląstelių ekstraktai (trūko endogeninio Brn-3b). Šios juostos buvo konkuruotos pridėjus nepaženklintą Brn-3 surišimo vietą (specifinis konkurentas), bet ne nespecifiniu oligonukleotidu (NS). Pridėjus Brn-3b antikūnus (bet ne antiaktino antikūnus), baltymų / DNR kompleksai pasikeitė (pažymėti dvigubu * ). Šie rezultatai patvirtina, kad Brn-3b baltymai specifiškai ir stipriai jungiasi su šia CD1 promotoriaus sritimi, o skirtingos mobilumo kompleksų buvimas rodo, kad Brn-3b gali jungtis prie skirtingos konfigūracijos DNR (pavyzdžiui, monomeras arba hetero / homo -dimeras).

Image

Tariamos Brn-3b jungties vietos identifikavimas ciklino D1 promotoriuje. ( a ) (i) scheminis ciklino D1 promotoriaus vaizdas, rodantis numanomos Brn-3 rišamosios vietos vietą (–248 ir –227). EMSA buvo atlikta, kaip aprašyta (Lee ir kt., 2005), o baltymų ir DNR kompleksai buvo išskaidyti naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę. (ii) Baltymų ir DNR kompleksai, susidarantys, kai ląstelių ekstraktai, paruošti iš Brn-3b perreguliavimo (Brn-3b (+)) NB, buvo inkubuojami su pažymėtu zondu (1 juosta; pažymėta * ), bet ne su SAOS2 ląstelių ekstraktu, neturinčiu Brn-3b (7 juosta). Brn-3b – DNR kompleksai buvo konkuruoti pridedant „šaltą“ konkurentą (nepaženklintą oligonukleotidą) (2 juosta), bet ne pridedant 100 kartų molinį perteklių nespecifinio konkurento (3 juosta). Inkubuojant su Brn-3b antikūnu, brn-3b turinčių kompleksų, sujungtų su DNR (4 + 5 juostos - dvigubos * ), bet ne su aktino antikūnu (kontrolė) (6 juosta), poslinkis pasikeitė. ( b ) (i) Seka, kurioje parodytas WT oligonukleotidas iš ciklino D1 promotoriaus ir mutacijos, įvestos į „TA“ turtingas vietas (pažymėtos pusjuodžiu kursyvu). (ii) Kompleksų, susidariusių, kai Brn-3b (+) ląstelių ekstraktai buvo inkubuojami su WT oligonukleotidu (1 juosta), nematyti, kai pažymėti 1 mutanto oligonukleotidai buvo inkubuojami su tuo pačiu ląstelių ekstraktu (2–4 juostos). 5 juostoje pateikiami pažymėti 2 mutanto oligonukleotidai, inkubuojami su Brn-3b (+) ląstelių ekstraktu, dėl kurių susidaro panašūs kompleksai, matomi 1 juostoje. Jie buvo konkuruoti pridedant specifinį konkurentą (6 juosta), bet ne nespecifinį konkurentą (7 juosta). c ) Oktamerio vietos mutacija, nukreipiant į vietą nukreiptą mutagenezę. (i) Pradmenų seka, naudojama mutacijoms į „TA“ vietą 240–237 padėtyje CD1-848 promotoriaus konstrukte (bazės pokyčiai pažymėti pilkomis mažosiomis raidėmis), sukėlę Pvu II restrikcijos fermento vietą promotoriuje (naudojant „QuikChange II“ į vietą nukreipto mutagenezės rinkinį). (ii) Reporterio tyrimų, naudojant WT CD1 promotorių arba mutavusį CD1 promotorių po ko-transfekcijos, rezultatai į ND7 ląsteles, su Brn-3b arba be jo, į neuroblastomos ląsteles. Kiekvieno promotoriaus aktyvumas esant tuščiai vektoriaus kontrolei buvo nustatytas 100%, o Brn-3b poveikis išreiškiamas šios kontrolės procentine dalimi. Reikšmės buvo pakoreguotos kontroliuojant renilę ir atspindi trijų eksperimentų rezultatą (± sd). ( d ) ChIP tyrimas, rodantis Brn-3b ryšį su ciklino D1 promotoriumi in vivo . ChIP buvo atliktas kaip aprašyta (Lee ir kt., 2005) MCF7 ląstelėse, naudojant Brn-3b antikūną arba kontrolinį aktino antikūną. Pradmenys buvo suprojektuoti taip, kad būtų galima amplifikuoti proksimalinį promotorių arba distalinę sritį ∼ 2, 7 kb prieš Brn-3 vietą standartiniame PGR ir išskaidyti 2% agarozės geliu. i) PGR produktai, gauti po amplifikacijos proksimaliniam ciklino D1 promotoriui, turinčiam numanomą Brn-3 vietą. 1 juostoje parodytas fragmentas, amplifikuotas iš pradinio mėginio (ląstelių ekstraktas prieš IP), kuris nebuvo stebimas, kai IP buvo atliekamas su kontroliniu anti-aktino antikūnu (2 juosta). 3 ir 4 juostose pavaizduotos juostos, amplifikuotos naudojant lustinę DNR, gautą po IP su Brn-3b antikūnu iš ląstelių, ekspresuojančių endogeninį Brn-3b ( e ), arba iš stabilių ląstelių linijų, per daug ekspresuojančių Brn-3b baltymą. (ii) PGR produktai, gaunami amplifikuojant ChIP DNR, naudojant pradmenis, skirtus amplifikuoti arba proksimalinį ciklino D1 promotorių, arba distalinėje vietoje 2, 7 kb prieš galimą Brn-3 vietą. ChIP, chromatino imuninis nusodinimas; EMSA, elektroforetinio judėjimo poslinkio tyrimas; IP, imuninis nusėdimas; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

Toliau mes išbandėme, kurios iš dviejų A / T vietų, rastų šiame regione, buvo reikalingos Brn-3b prisijungimui prie CD1 promotoriaus, įvedant mutacijas į kiekvieną vietą (1 ir 2 mutantai) (4b paveikslas (i)). EMSA buvo naudojami 32 P-pažymėti mutantiniai oligonukleotidiniai zondai ir jie palyginti su WT zondu. 4b paveiksle (ii) pavaizduoti laukiami kompleksai po ląstelių ekstraktų inkubavimo su WT zondu, tačiau po ląstelių ekstrakto inkubavimo su pažymėtu 1 mutantu zondu (TTT>> GGG 240–237 padėtyse) jokių specifinių juostų nebuvo matyti, o pridedant jokių pokyčių neįvyko. konkretaus ar nespecifinio konkurento. Priešingai, ląstelių ekstrakto inkubacija su 2-ojo mutanto zondu (TTT>> TGG 246–243 padėtyse) lėmė panašų kompleksų, matomų su WT zondu, modelį, tai yra, kompleksų, kuriuos konkuruoja konkretus konkurentas, bet nespecifinis konkurentas, susidarymą . Taigi, TTT, esantis 240–237 padėtyse, yra kritinis, norint sujungti Brn-3b prie CD1 promotoriaus, ir rodo, kad CD1 promotoriuje 5′-ATTTCTAT-3 ′ seka randama tarp –248 ir –228 (nuo transkripcijos pradžios vietos). greičiausiai yra Brn-3b surišta oktamerio vieta.

Vietos nukreipta oktamero mutagenezė CD1 promotoriuje nuo –248 iki –228 užkerta kelią Brn-3b

Norint patikrinti, ar ši seka yra būtina CD1 promotoriaus aktyvavimui, naudojant tarp Brn-3b, buvo panaudota vietai nukreipta mutagenezė, įvedanti mutacijas į tris pagrindus šioje vietoje ilgiausiame CD1-848 promotoriaus reporteryje (4c paveikslas (i)). Gautas mutavęs promotorius kartu su Brn-3b buvo transfekuotas į ND7 ląsteles ir promotoriaus aktyvumas, palyginti su WT CD1 promotoriaus aktyvumu tame pačiame eksperimente. 4c pav. (Ii) parodyta, kad Brn-3b aktyvintas WT CD1 promotorius (nuo 15 iki 20 kartų), tačiau šis poveikis žymiai sumažėjo mutavusiam promotoriui (nuo trijų iki penkių kartų). Taigi, mes nustatėme seką, reikalingą efektyviam Brn-3b tarpininkaujant CD1 promotoriaus aktyvavimui .

Brn-3b jungiasi prie CD1 promotoriaus nepažeistose ląstelėse

Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) tyrimai buvo atlikti siekiant ištirti, ar Brn-3b yra prisijungęs prie CD1 promotoriaus in vivo , nepažeistose ląstelėse (Lee ir kt., 2005). Baltymai, surišti su chromatinu MCF7 ląstelėse, buvo imuniteto nusodinti, naudojant Brn-3b antikūną arba kontrolinį aktino antikūną. 4d paveiksle parodyta, kad PGR (su pradmenimis, kad amplifikuotų CD1 promotorių, esančių oktamero vietoje), naudojant ChIP DNR, imuninę nusodintą Brn-3b antikūnu, sukuria produktą, kuris atitiko įvesto mėginio dydį (teigiama kontrolė), tačiau tai nebuvo stebimas naudojant ChIP DNR, gautą su anti-aktino antikūnais. Padidėjęs amplifikuoto produkto intensyvumas, kai naudojama DNR, gauta atlikus ChIP iš Brn-3b per daug ekspresuojančių ląstelių (Brn-3b +) (4d paveikslas (i)), rodo, kad daugiau CD1 promotoriaus buvo imuninis nusėdimas esant didesniam Brn-3b lygiui. Brn-3b yra specifiškai sujungtas su proksimaliniu promotoriumi, nes CD1 promotoriaus distalinės srities (∼ 2, 7 kb nuo rišimo vietos) amplifikacija, naudojant tą pačią chromatino DNR (imunoprecipiduota su Brn-3b Ab), nesukūrė produkto. kuris buvo matomas naudojant įvestį (teigiama kontrolė) (4d paveikslas (ii)). Šie rezultatai patvirtina, kad Brn-3b jungiasi tiesiogiai prie proksimalinio CD1 promotoriaus nepažeistose ląstelėse, taip palengvindamas promotoriaus aktyvaciją.

Todėl mūsų rezultatai rodo, kad koreliacija tarp Brn-3b ir CD1 sergant krūties vėžiu ir NB gali atsirasti dėl Brn-3b sugebėjimo tiesiogiai reguliuoti CD1 raišką. Šis ryšys taip pat egzistuoja ne transformuotose ląstelėse, nes Brn-3b ir CD1 ekspresija yra persidengianti tinklainės vystymosi metu, o Brn-3b netekimas lemia CD1 sumažėjimą Brn-3b KO tinklainėje (Mu et al., 2001). Įdomu ir tai, kad CD1 ir Brn-3b mutantai yra akli (Sicinski ir kt., 1995; Gan ir kt., 1996). Taigi, Brn-3b ir CD1 ekspresija yra glaudžiai susiję skirtinguose audiniuose, kas rodo, kad Brn-3b tarpininkaujant CD1 ekspresijai yra svarbi atskirų tipų ląstelėse.

Platinamasis CD1 poveikis yra susijęs su jo G1 perėjimo kontrole tam tikruose ląstelių tipuose (Arnold ir kt., 1991) ir, nors ji pirmiausia veikia formuodama aktyvius kompleksus su CDK4 (Israels and Israels, 2000), CD1 taip pat gali veikti per nuo CDK4 nepriklausantys mechanizmai (Zwijsen ir kt., 1997; Knudsen ir kt., 1999; Bienvenu ir kt., 2001). Padidėjęs navikas CD1 gali būti pasiektas skirtingais mechanizmais, įskaitant nereguliuojamą geno ekspresiją, mutacijas ar amplifikaciją (Weinberg, 1995). NB ląstelių linijose ir navikuose padidėjęs CD1 nėra susijęs su mutacijomis ar amplifikacija (Molenaar et al., 2003) ir greičiausiai tai atsiras panaikinus kelius, kurie kontroliuoja CD1 raišką šiose ląstelėse. Atsižvelgiant į tai, kad padidėjęs Brn-3b gali žymiai paskatinti krūties vėžio ir NB ląstelių augimą ir dauginimąsi, o endogeninės ekspresijos sumažinimas lėtina jų augimą, tikėtina, kad Brn-3b transkripcijos faktorius tarpininkauja jo poveikiui, iš dalies, atlikdamas ląstelių ciklo efektorius. tokias kaip CD1 ir CDK4 (Samady et al., 2004), tokiu būdu leidžiant progresuoti ląstelių ciklui ir skatinti ląstelių proliferaciją.

Žodynas

CD1

ciklinas D1

ČIP

chromatino imuninis nusėdimas

EMSA

elektroforetinio judėjimo poslinkio tyrimas

LTR

ilgas terminalo pakartojimas

NB

neuroblastoma

POU

„Pit-Oct-Unc“

RA

retinoinė rūgštis