Apsauginis pi3-kinazės / akt / enos signalo vaidmuo mechaniniame strese slopinant p38 mitogeno suaktyvintą baltymo kinazę pelės plaučiuose | acta pharmaologica sinica

Apsauginis pi3-kinazės / akt / enos signalo vaidmuo mechaniniame strese slopinant p38 mitogeno suaktyvintą baltymo kinazę pelės plaučiuose | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti hipotezę, kad PI3K / Akt / eNOS signalizacija turi apsauginį vaidmenį su pelių vėdinimu susijusio plaučių sužalojimo (VALI) modelyje, sumažinant p38 MAPK signalizacijos signalus.

Metodai:

Patinėliai C57BL / J6 (laukinio tipo, WT) arba eNOS išmuštos pelės (eNOS - / - ) buvo veikiami mechanine ventiliacija (MV), turėdami mažai (LV T, 7 ml / kg) ir didelį potvynio tūrį (HV T, 20 ml). / kg) 0–4 val. WT pelių pogrupiui buvo skiriami specifiniai PI3K (100 nmol / L Wortmannin [Wort], ip) arba p38 MAPK (SB203580, 2 mg / kg, ip) inhibitoriai 1 val. Prieš MV. Išaugintos II tipo alveolių epitelio ląstelės C10 buvo paveiktos 18% cikliniu tempimu 2 val., Naudojant arba be 20 nmol / L misos. Eksperimento pabaigoje kapiliarų nutekėjimas in vivo buvo įvertintas ekstravazuojant Evanso mėlynąjį dažiklį (EBD), šlapio / sauso svorio santykį ir plaučių plovimo baltymų koncentraciją. Plaučių audinys ir ląstelių lizatas taip pat buvo renkami baltymų ir histologiniam tyrimui.

Rezultatai:

MV sumažino PI3K / Akt fosforilinimą ir eNOS ekspresiją, tačiau padidino fosfo-p38 MAPK ekspresiją kartu su EBD nutekėjimu plaučiuose. Wort slopindami fosfo-Akt, pablogina plaučių edemą, tuo tarpu p38 MAPK kinazės slopinimas atstatė Akt aktyvaciją kartu su palengvintu kapiliarų nutekėjimu. eNOS - / - pelėms buvo paūmėjusi plaučių edema ir sužalojimai. Ištemptos C10 ląstelės parodė, kad misa silpnina Akt aktyvaciją, tačiau sustiprino MAPK p38 fosforilinimą.

Išvada:

Mūsų rezultatai rodo, kad PI-3K / Akt / eNOS kelias turi reikšmingą apsauginį poveikį VALI, nes apsaugo nuo kapiliarų nutekėjimo, ir kad tarp VALI atsiranda kraujagyslių barjero disfunkcijos PI3K / Akt ir p38 MAPK keliai.

Įvadas

Ūmus plaučių pažeidimas (ALI) yra sudėtingas sindromas, pasižymintis padidėjusiu kraujagyslių pralaidumu, sukeliančiu audinių edemą ir gilią hipoksiją 1, 2 . Mechaninė ventiliacija (MV) dažnai yra būtinas kvėpavimo nepakankamumo gydymas ir palaikomoji priemonė kritiškai sergantiems pacientams. Tačiau gerai žinoma, kad vėdinimas esant dideliam potvynio tūriui (HV T MV) ar slėgiui gali būti žalingas, pakenkiant anksčiau sveikiems plaučiams ar pabloginant jau sužeistus. Tai ypač pasakytina apie pralaidumą, kai dėl didelių kvėpavimo sistemos komponentų mechaninio krūvio gali atsirasti ventiliacija susijusi plaučių trauma (VALI). Mes atlikome čia aprašytą tyrimą siekdami išsiaiškinti pagrindinius VALI mechanizmus ir ištirti galimą VALI terapiją.

Akt (baltymo kinazė B), daugiafunkcinė serino-treonino baltymo kinazė, yra pagrindinė pasroviui signalizuojanti fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) molekulė. Tai taip pat yra eNOS fermentas. Jo aktyvacija buvo susijusi su įvairiomis endotelio funkcijomis, įskaitant ląstelių išgyvenimą, migraciją ir azoto oksido 3, 4, 5 sintazės aktyvaciją. In vitro tyrimai parodė, kad Akt gali tiesiogiai fosforilinti endotelio azoto oksido (NO) sintazę (eNOS) ir suaktyvinti fermentą, sukeldamas NO gamybą 6 . Taigi PI3K / Akt / eNOS signalizacijos kelias yra labai svarbus palaikant endotelio kraujagyslių tonusą ir vientisumą 7, 8 . Anksčiau mes parodėme, kad NOS signalizacija ir p38 MAPK yra reikšmingi ūminio plaučių pažeidimo vystymuisi 9, 10 . Nors PI3K / Akt ir MAPK, į kuriuos įeina ERK1 / 2, JNK ir p38 MAPK pogrupiai, yra bene geriausiai apibūdinami išgyvenimo arba mirties atvejais susiję signalizacijos keliai atitinkamai 11, 12, 13, 14, 15, jų funkcinis vaidmenys VALI, ypač šių dviejų būdų sąveika, dar nebuvo išaiškinti. Atsiradę įrodymai sukėlė susidomėjimą skerspjūvio jungtimi tarp PI3K / Akt ir MAPK signalų, signalizuojančių apie 16, 17, 18, 19 .

Šio tyrimo tikslas yra nustatyti apsauginį PI3K / Akt / eNOS signalizacijos vaidmenį atsižvelgiant į plaučių kraujagyslių pralaidumą reaguojant į mechaninį krūvį ir išsiaiškinti, ar šis apsauginis poveikis pasireiškia per p38 MAPK signalus pelių HV T MV ir cikliniuose cikluose. tempimo modeliai. Mūsų rezultatai rodo, kad PI3K / Akt / eNOS kelias yra susijęs su HV T MV procesu keičiant fosforilintas formas nepažeistuose plaučiuose. Be to, genetinis eNOS trynimas pasunkina kraujagyslių disfunkciją, kaip įvertino Evans Blue Dye (EBD). Galiausiai išvados, kad PI3K ir Wort farmakologinis antagonizmas stiprina p38 MAPK fosforilinimą, reaguojant į ciklinį tempimą C10 epitelio ląstelėse, ir kad p38 MAPK slopinimas palengvina Akt, išgyvenimo signalizuojančio baltymo, aktyvavimą, rodo Akt ir p38 MAPK sąveiką. kraujagyslių barjero disfunkcijos keliai 20 .

medžiagos ir metodai

Medžiagos

CMRL 1066 terpė buvo nupirkta iš Invitrogen (Carlsbad, CA), o vaisiaus vaisiaus serumas buvo gautas iš Hyclone (Logan, UT) ir Invitrogen (Carlsbad, CA). Wortmanninas buvo gautas iš Calbiochem (San Diegas, CA). Fosfo-specifiniai PI3K, Akt ir eNOS antikūnai, taip pat p38 MAP kinazė buvo gauti iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA). SB203580 ir kiti šiame tyrime naudojami reagentai buvo gauti iš bendrovės „Sigma“ (Sent Luisas, MO).

VILI gyvūnų modelis ir vaistų skyrimas

10 savaičių amžiaus C57BL / 6J pelių patinai (23–25 g, Džeksono laboratorija, Bar Harbor, ME) buvo tiriami patogenų neturinčioje įstaigoje pagal protokolą, patvirtintą Johns Hopkins universiteto laboratorinės gyvūnų medicinos katedros. Anestezija buvo sukelta natrio pentobarbitaliu (50 mg / kg, ip). Tuomet gyvūnams buvo atlikta tracheotomija ir intubacija, prieš tai veikiant MV (Harvardo aparatūra, Bostonas, MA) kambario oru 0 (kontrolinis, tęstinis), 2 arba 4 valandas su 7 ml / kg arba 20 ml / kg potvynio tūriu (LV). T arba HV T ). Visų potvynių tūrių kvėpavimo dažnis buvo 160 įkvėpimų per minutę, taip pat sureguliuota negyvoji erdvė, kad palaikytų arterijų pH tarp 7, 35 ir 7, 45. Kvėpavimo takų slėgis buvo nuolat matuojamas ir išliko maždaug 0–2 cm H 2 O. 500 mg boliuso Ringerio laktato tirpalo į veną buvo sušvirkšta pradėjus MV, kad palaikytų pakankamą vidutinį arterinį kraujospūdį (apie 80 torų) per 4 val. . MV parametrų tinkamumas keičiantis dujomis buvo įvertintas pagal vidutinį kraujo spaudimą (MBP) ir arterinio kraujo dujas, gautas kateterizuojant šlaunikaulio arteriją. Naudojant šildymo lempą ir padėkliuką, tiesiosios žarnos temperatūra buvo palaikoma artima 37 ° C. Pasibaigus MV, gyvūnams buvo suleista intraperitoninė mirtina anestetiko dozė prieš imant plaučius.

Norint įvertinti MV poveikį PI3K / Akt / eNOS ir p38 MAPK signalizavimui, pelės buvo gydomos specifiniu p38 MAPK inhibitoriumi, SB203580 (2 mg / kg, ip) arba specifiniu PI3K inhibitoriumi, misos ( 100 nmol / L, ip) 21, 1 val. Prieš veikiant MV. SB203580 ir misa pirmiausia buvo ištirpinti DMSO, o po to dar skiedžiami druskos tirpalu. Visos dozės, vartojimo būdas ir farmakologinių preparatų, taip pat tirpiklio, pateikimo laikas buvo pagrįsti žinomu agentų pusinės eliminacijos periodu ir išankstiniais eksperimentais, kurie parodė veiksmingumą 22, 23 .

Plaučių kapiliarų pralaidumo įvertinimas

Ūminiai kraujagyslių pralaidumo pokyčiai buvo įvertinti naudojant bronchoalveolinio plovimo (BAL) skysčio albuminų koncentracijas ir EBD tyrimą nepažeistoms pelėms. Plaučių edemos susidarymas taip pat buvo įvertintas naudojant plaučių šlapio ir sauso svorio (W / D) santykį. EBD (20 mg / kg) buvo įšvirkštas į išorinę smegenų veną 60 minučių prieš eksperimento pabaigą, kad būtų nustatytas kraujagyslių nutekėjimas, kaip aprašyta anksčiau, 24, 25 . Norint nustatyti šlapio ir sauso plaučių svorio santykį, kaip atskirą plaučių edemos dydį, trumpam buvo išpjautas kairysis plaučiai ir iš karto pasvertas ant paruoštų indų, kad būtų galima nustatyti drėgną plaučių masę. Tada mėginiai 7 dienas buvo džiovinami 60 ° C temperatūros krosnyje (Fisher Isotemp) ir keletą kartų sveriami, kol masė tapo pastovi 26 .

Ciklinis ruožas (CS) ir C10, epitelio ląstelių kultūra

C10, pelių nonmalignant II tipo alveolinių epitelinių ląstelių linija, buvo auginama CMRL 1066 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir antibiotikais. Ląstelės buvo sėjamos standartinio tankio (8 × 105 ląstelės / duobutėje) ant I kolageno dengtomis „BioFlex“ plokštelėmis, o pasiekus santaką, plokštelės buvo sumontuotos „FX-4000T Flexercell Tension Plus“ sistemoje (Flexercell International, McKeesport, PA) įrengta 25 mm „BioFlex“ pakrovimo stotelė. Ši sistema suteikia tolygų radialinį ir apskritimo įtempimą per membranos paviršių visais spinduliais. Ląstelėms buvo pailginta 18% norimą laiką 25 ciklų per minutę greičiu. Ląstelės, išaugintos BioFlex plokštelėse ir tuo pat metu dedamos į ląstelių kultūros inkubatorių, buvo laikomos statinėmis kontrolėmis. Eksperimento pabaigoje ląstelės buvo surinktos baltymų analizei.

SDS-PAGE ir imunoblotantų analizė

Aliuminiai iš ląstelių lizatų ir audinių homogenatų buvo imituojami naudojant biologinius ir fosfospecifinius antikūnus, kaip aprašyta anksčiau 9 . Tada blotai buvo vizualizuoti naudojant ECL Western Blot Detection Kit (Amersham, Piscataway, NJ, JAV).

Statistika

Duomenys parodomi kaip vidutiniai ± standartinis nuokrypis (SD) už kiekvieną bandymo sąlygą. Lyginimai tarp grupių buvo atlikti naudojant t- testus arba vienpusį ANOVA su Bonferroni korekcija. Atliekant skirtingų grupių palyginimo dispersijos analizę, reikšmingumas nustatytas ties P <0, 05.

Rezultatai

PI3K / Akt / eNOS signalizacijos kelias reaguojant į MV

Imunoblot analizė, skirta fosfo-specifinių (aktyviųjų) ir bendrųjų PI3K, Akt ir eNOS izoformų tyrimams, atlikta plaučių audinio homogenatams, gautiems iš laukinio tipo pelių, paveiktų MV su HV T 0 (kontrolė), 15, 30, 60 arba 120 min. . Kaip parodyta 1A paveiksle, HV T sukeliantis MV sukėlė PI3K, Akt ir eNOS fosforilėjimo sumažėjimą jau po 30 minučių nuo MV pradžios. 1B, 1C ir 1D paveiksluose parodyta fosfo-PI3K, phopo-Akt ir fosfo-eNOS densitometrija, normalizuota iki bendro Akt. Kai pratęsėme eksperimentą iki 4 h HV T MV, buvo pastebėtas nuoseklus fosforo-Akt pokytis (2 pav.).

Image

PI3K / Akt / eNOS signalizacijos kelias reaguojant į MV. C57BL / 6J pelės 2 valandas atsitiktinai buvo veikiamos savaiminio kvėpavimo (kontrolė, tęsinys) arba HV T (20 ml / kg). (A) WT pelių plaučių homogenatų imunoblotacija rodo PI3K, Akt ir eNOS fosforilėjimo sumažėjimą pradėjus HV T MV, nustatytą jų aktyviųjų antikūnų formose. (B), (C) ir (D) rodo fosfo-PI3K, phopo-AKT ir fosfo-eNOS tankį, normalizuotą iki bendro Akt. n = 3–4 pelės kiekvienoje sąlygoje, b P <0, 05, palyginti su kontroline. Pastaba: 1A pav. P-Akt juostos atspindi rezultatų derinį iš kelių eksperimentų.

Visas dydis

Image

Sumažėjęs fosfo-Akt reguliavimas atsižvelgiant į mechaninį įtempį priklausomai nuo laiko. (A) Atskirame 4 h HV T MV eksperimente mes pastebėjome, kad fosfo-Akt jo 473 serino liekanoje labiausiai sumažėjo per 30 min., O po to palaipsniui grįžo į kontrolinį lygį po 2 val. (B) rodo phoho-Akt densitometriją, normalizuotą iki bendro Akt. n = 3–4 pelės kiekvienoje sąlygoje, b P <0, 05.

Visas dydis

„eNOS“ signalizacija reikalinga norint išsaugoti plaučių kraujagyslių vientisumą

Norėdami apibrėžti eNOS vaidmenį plaučių pralaidumoje, susijusiame su VALI, gavome eNOS - / - pelių iš to paties kamieno fono, kaip ir laukinis tipas, ir abi MV veikėme iki 4 h LV T (7 ml / kg) arba HVT. (20 ml / kg) esant 160 BPM. Didžiausias oro kvėpavimo takų slėgis buvo nuolat stebimas, kaip aprašyta Metodose. Plaučių kraujagyslių nutekėjimas buvo vertinamas ekstravazuojant EBD į plaučių parenchimą. MV su LV T nepadidino EBD ekstravazacijos WT pelėms, tačiau pastebimai padidino EBD nutekėjimą eNOS - / - pelių plaučiuose. HV T MV padidino 50% EBD WT pelių plaučiuose ir dar apie 100% padidėjo eNOS - / - pelėse (3 paveikslas).

Image

eNOS su trūkumais pelės yra mažiau tolerantiškos nei WT pelės, reaguodamos į didelio amplitudės mechaninį stresą, pasireiškiantį sunkia plaučių edema. Plaučių kraujagyslių nutekėjimas buvo įvertintas per 4 val., Ekstravazuojant evanso mėlynojo dažo (EBD) albuminą plaučių parenchimoje. MV su LV T nepakeitė EBD antplūdžio C57BL / 6J pelių plaučiuose, tačiau žymiai padidino EBD ekstravazaciją eNOS - / - pelių plaučiuose. Be to, HV T MV padidino 100% EBN eNOS - / - pelių plaučiuose, palyginti su 50% padidėjimu WT pelėms. n = 4 pelės / eksperimentinė sąlyga. b P <0, 05, palyginti su kontroline; e P <0, 05 vs LV T ; h P <0, 05 palyginti su pelėmis, kurių ventiliacija neapsaugota nuo WT.

Visas dydis

Šlapio / sauso plaučių svorio santykis, atskiras plaučių edemos matas, parodė, kad 4 valandos LV T MV padidino šį santykį, bet ne reikšmingai. HV T MV sukėlė ryškesnį plaučių vandens susilaikymą eNOS - / - pelėse nei WT pelėse (4 paveikslas). Kontrolinės būklės skirtumų tarp WT ir eNOS - / - pelių nepastebėta (rezultatai neparodyti).

Image

ENOS trūkumo poveikis plaučių kraujagyslių nutekėjimui mechaninės ventiliacijos metu. Kaip atskiras plaučių edemos matas buvo nustatytas šlapio / sauso plaučių svorio santykis 4 h HV T MV pabaigoje. HV T MV padidino plaučių šlapio ir sauso svorio santykį, ypač pelėms, kurių trūksta eNOS. n = 4 pelės / eksperimentinė sąlyga. b P <0, 05, palyginti su LV T paveiktais gyvūnais; e P <0, 05, palyginti su WT pelėmis, paveiktomis HV T MV.

Visas dydis

PI3K / Akt reguliuoja eNOS apsauginį vaidmenį mažinant plaučių edemą

Norėdami išsiaiškinti, koks yra eNOS reguliavimas prieš srovę, mes ištyrėme fosfo-Akt raišką WT ir eNOS - / - pelėse po MV streso. Mes nustatėme, kad fosfo-Akt sumažėjo labiau, palyginti su WT, eNOS - / - pelėse. Be to, eNOS - / - pelėse buvo mažesnis fosfo-Akt lygis, kai jos veikiamos LV T (5 pav.). Norėdami išsamiau ištirti šio kelio poveikį kraujagyslių nutekėjimui, susijusiam su HV T MV, 1 valandą prieš HV T MV ekspoziciją skyrėme PI3K inhibitorių Wortmannin (misą, 100 nmol / L, ip). Eksperimento pabaigoje, kaip minėta, buvo atliktas EBD tyrimas. Kaip parodyta 6 paveiksle, prieš pradedant gydymą misa, palyginti su negydyta grupe, žymiai pablogėjo EBD plaučių kaupimasis WT pelėse, kurį sukėlė 4 h HV T MV. Plaučių morfologija parodė nuoseklų EBD tyrimo išvadą, kad gydymas misa padidino neutrofilų infiltraciją ir plaučių edemą (7A, 7B paveikslai). C57BL / 6J pelių, paveiktų LV T, plaučiuose nebuvo ryškių histologinių pokyčių, palyginti su kontroliniais gyvūnais (rezultatai neparodyti).

Image

Žemesnis fosfat-Akt ekspresijos lygis eNOS - / - pelėse, palyginti su WT pelėmis, veikiant mechaniniam poveikiui. Mes specialiai įvertinome fosforo-Akt, išgyvenamojo signalo, reaguojant į įvairius stresus, lygį mūsų 4 valandų VALI modelyje, atlikdami imunoblotus. (A) Remiantis mūsų aukščiau pateiktais duomenimis, sumažėjęs phopo-Akt kiekis buvo užtemdytas WT pelėms 4 h HV T MV pabaigoje, tuo tarpu eNOS - / - pelėms nustatytas reikšmingas tolesnis fosforilinto Akt sumažėjimas reaguojant į 4 h HV T. susilpninta fosfo-Akt ekspresija, veikiant KT. (B) Phopo-Akt densitometrija normalizuota iki bendro Akt. n = 3–4 pelės kiekvienoje būklėje. b P <0, 05 vs LV T ; e P <0, 05, palyginti su eNOS - / - pelėmis.

Visas dydis

Image

Išankstinis gydymas Wortmannin (Wort) padidina WT pelių plaučių kraujagyslių nutekėjimą, kurį sukelia 4 h HV T MV. C57BL / 6J pelės (WT) iš anksto buvo gydomos selektyviu PI3Kazės inhibitoriumi Wort (100 nmol / l, skiriamos intraperitoniniu būdu) 1 val. Prieš ekspoziciją MV. Pati misos dozė neturėjo įtakos EBD tyrimui (duomenys nepateikti). Kita vertus, gyvūnams veikiant LV T, šios vertės, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis, nepakito (duomenys nepateikti). Tačiau išankstinis gydymas misa žymiai padidino EBD plaučių kaupimąsi C57BL / 6J pelėse, kurias sukėlė 4 h HV T MV. n = 4–6 pelės / eksperimentinė sąlyga. b P <0, 05 vs LV T ; e P <0, 05 palyginti su HV T MV.

Visas dydis

Image

Po plaučių morfologinės apžvalgos atlikus išankstinį gydymą misa ir mechaninę ventiliaciją. (A) Neutrofilų imuninis padengimas: parenchiminių neutrofilų buvimas buvo įvertintas naudojant specifinį anti-neutrofilų antikūną. Po 4 val. HV T MV ekspozicijos padidėjo neutrofilų dažymas WT pelių intersticiume ir alveolėse (c, rodyklė), palyginti su tik LV T ir misa (a ir b). Tačiau misa - specifinis PI3K inhibitorius - prieš gydymą sustiprino šį poveikį (d, rodyklė). (B) Hematoksilino ir eozino dėmės iš plaučių audinio (× 40): Neutrofilų infiltracija WT pelių plaučiuose, veikiant HV T 4 valandas, yra panaši, kaip ir stebint neutrofilų imuninį dažymą, tačiau retkarčiais pasireiškiant kraujavimui iš alveolių (g, rodyklė), palyginti tik su LV T ir misa (e ir f); Žievė, palyginti su gyvūnais, kurie vėdinami (h, rodyklė), pablogino plaučių sužalojimus. C57BL / 6J pelių, paveiktų LV T, plaučiuose nebuvo ryškių histologinių pokyčių, palyginti su kontroliniais gyvūnais (rezultatai neparodyti).

Visas dydis

Kryžminis pokalbis tarp p38 MAPK ir PI3K / Akt / eNOS

Gavę įrodymų apie p38 MAPK reguliavimą, prisidedantį prie VALI mūsų pelių modelyje 10, 22, mes siekėme nustatyti galimą p38 MAPK dalyvavimą PI3K / Akt / eNOS kelyje. Mes nustatėme, kad išankstinis WT pelių gydymas SB203580 (2 mg / kg, ip) 1 valandą prieš HV T MV sumažino plaučių kapiliarų nutekėjimą, išmatuotą pagal BAL baltymo indeksą 2 h HV T MV pabaigoje (8 paveikslas). Neseniai, naudodami šlapio / sauso plaučių svorio santykį ir EBD, mes parodėme, kad p38 MAP kinazės kelio slopinimas su SB203580 sumažina kapiliarų pralaidumą plaučiuose, reaguojant į didelę potvynio tūrio mechaninę ventiliaciją 22 . Dar ryškiau, kad per 4 val. Mes nustatėme, kad gydymas SB203580 p38 MAPK slopinimu padidino Akt aktyvaciją reaguojant į HV T MV, galbūt parodant šių dviejų signalizacijos kelių sąveiką (9 paveikslas). Norėdami dar labiau patvirtinti šių dviejų signalų sutapimą, mes stebėjome PI3K inhibitoriaus, 20 nmol / L Wort 27, poveikį fosfo-Akt ir fosfo-p38 MAPK ekspresijai C10 alveolinėse epitelio ląstelėse, veikiant 18% pailgėjimo. CS 1–2 val. Šie duomenys parodė, kad PI3K farmakologinis antagonizmas su misa sumažino Akt aktyvaciją, tačiau suintensyvino MAPK p38 fosforilinimą, reaguojant į kultivuojamų epitelio ląstelių mechaninį stresą (10 paveikslas).

Image

P38 MAP kinazės slopinimas užkerta kelią baltymų nutekėjimui reaguojant į HV T MV. Pelės buvo gydomos p38 MAP kinazės inhibitoriumi SB203580 (2 mg / kg, ip) 1 val. Prieš ekspoziciją 1–2 h HV T MV. Duomenys parodė, kad plaučių kapiliarų nutekėjimas buvo sumažintas naudojant BAL baltymo indeksą 2 h HV T MV pabaigoje. n = 4. b P <0, 05 vs LV T ; e P <0, 05 palyginti su 2 h HV T MV.

Visas dydis

Image

SB203580 (SB) poveikis Akt aktyvavimui WT pelėms, veikiamoms 4 val. Mechanine ventiliacija. Western blot tyrimas pelėms, plaučiams, paveiktiems HV T MV 4 valandas, parodė, kad p38 MAPK slopinimas su SB203580 padidino Akt aktyvaciją (serino 473 fosforilinimas), parodydamas šių dviejų signalo kelių sąveiką. n = 3–4 pelės kiekvienoje būklėje. b P <0, 05.

Visas dydis

Image

PI3K inhibitoriaus, 20 nmol / l misos, poveikis fosfo-Akt ir fosfo-p38 MAPK ekspresijai. Farmakologinis PI3K ir Wort antagonizmas sumažino Akt aktyvaciją, tačiau suintensyvino MAPK p38 fosforilinimą C10, II tipo alveolių epitelio ląstelėse, kai nuo 1 iki 2 val. Buvo veikiami 18% ciklinio tempimo (CS). A) reprezentacinis blotinimas; B ir C) fosfo-p38 / aktino ir fosfo-Akt / aktino densitometrinis santykis. n = 3–4. b P <0, 05 palyginti su transporto priemone; e P <0, 05 palyginti su statiniu. Pastaba: P-Akt juostos atspindėjo rezultatų derinį iš kelių eksperimentų.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad norint palaikyti plaučių kraujagyslių vientisumą reaguojant į mechaninį krūvį, reikalingas eNOS signalizavimas ir kad šį poveikį moduliuoja jo aukščiau esantis PI3K / Akt kelias. Dar svarbiau, kad pirmą kartą pateikiame įrodymų apie PI3K / Akt / eNOS ir p38 MAP kinazės kelių kryžminį kalbėjimą mechaniniame tempimo modelyje. Mes parodėme, kad PI3-kinazės / Akt slopinimas sustiprina p38 MAPK aktyvaciją, o p38 MAPK slopinimas sukelia padidintą Akt fosforilinimą, kuris reguliuoja eNOS apsauginį poveikį nuo plaučių kraujagyslių edemos, susijusios su mechaniniu stresu. Apibendrinant, šis darbas kartu su ankstesnių tyrimų rezultatais rodo, kad apsauginis PI3K / Akt / eNOS signalizacijos vaidmuo mechaniniame strese iš dalies yra susijęs su p38 mitogenais aktyvuotos baltymų kinazės signalizacijos slopinimu.

PI3K / Akt / eNOS signalizacijos kelias reaguojant į MV

Šiame darbe mes ištyrėme PI3-kinazės / Akt / eNOS vaidmenį su ventiliatoriais susijusiais alveolių-kapiliarų sužalojimais ir disfunkcijomis pelių modelyje, naudodami eNOS - / - peles kartu su WT pelėmis ir panaudodami farmakologinį PI3 inhibitorių. -kinazė. Ankstesniame tyrime mes nustatėme, kad bendras eNOS signalas nepažeistų pelių plaučiuose sumažėjo po to, kai gyvūnai buvo paveikti HV T MV 9 . Šiame VALI tyrime išmatuotos aktyvios PI3K / Akt / eNOS formos. Iš pradžių nustatėme, kad ne tik fosfo-eNOS signalas sumažės jau po 15 minučių, bet ir kad PI3 kinazės ir Akt fosforilinimas sumažėjo tuo pačiu metu priklausomai nuo HV T MV inicijavimo iki 2 h WT pelėse. plaučiai. Tai parodė, kad PI3K / Akt kelias yra susijęs su šiuo įvykiu (1 paveikslas). Tada prailginome vėdinimo įtempį iki 4 val. Imunoblotai parodė tą pačią fosfo-Akt mažėjimo tendenciją, kaip ir per pirmąsias 2 HV T MV. Pasibaigus 4 h HV T MV, šis pokytis pamažu grįžo prie pradinio lygio (2 paveikslas). Atsižvelgiant į tai, kad bendras Akt nesikeitė ir visi signalai buvo aptikti tuo pačiu blotinimu, mes kiekybiškai įvertinome fosforilinto PI3K / Akt / eNOS išraišką, remiantis bendru Akt.

„eNOS“ signalizacija reikalinga norint išsaugoti plaučių kraujagyslių vientisumą

Mes toliau tyrėme eNOS vaidmenį plaučių mikro kraujagyslių nutekėjime. Mes nustatėme, kad genetinis eNOS ištrynimas sumažino plaučių endotelio toleranciją mechaniniam poveikiui. MV su LV T nepakeitė laukinio tipo pelių EBD ekstravazacijos, tačiau pastebimai padidino EBD nutekėjimą eNOS - / - pelių plaučiuose. HV T MV padidino EBD antplūdį WT pelių plaučiuose 50%, o EBD plaučių kaupimąsi eNOS - / - pelėse dar apie 100% (3 paveikslas). Šis rezultatas atitiko mūsų anksčiau paskelbtą darbą, kuriame teigiama, kad sumažėjusi eNOS baltymo išraiška buvo susijusi su VALI C57BL / 6J pelėse, ir kad padidėjęs eNOS aktyvumas buvo susijęs su pelių, kurioms trūksta iNOS, tolerancija ventiliatoriaus sukeltam plaučių kapiliarų nutekėjimui 9 . Ši išvada taip pat buvo suderinta su Takenaka ir kt. Atliktais darbais, kuriuose per didelis ekspozicijos eNOS kiekis plaučiuose galėjo sumažinti VALI 28, 29 .

Taip pat stebėjome šlapio / sauso plaučių svorio santykį kaip atskirą plaučių edemos rodiklį, kad patvirtintume, kad eNOS daro įtaką kraujagyslių barjero funkcijai. Kaip parodyta 4 paveiksle, HV T MV per 4 valandas sukėlė gilesnę plaučių edemą eNOS - / - pelėms nei WT pelėms. Mūsų duomenimis, padidėjęs plaučių pralaidumas reaguojant į mechaninį krūvį iš dalies gali būti paaiškintas eNOS signalizacijos defektais - radiniu, panašiu į ankstesniame pranešime pateiktą, kuriame pelėms, sergantiems eNOS ar Akt1, buvo sutrikusi kraujo tėkmė ir neovaskuliarizacija po arterijų 30 okliuzija ir slopinta VEGF sukelta angiogenezė ir kraujagyslių pralaidumas 13 . Chen ir kt. Taip pat parodė, kad sutrikus pelių Akt1 (Akt1 - / - ) geno praradimui, dėl sumažėjusio endotelio azoto oksido sintazės (eNOS) 7 aktyvavimo gali sumažėti kraujagyslių brendimas.

ENOS trūkumų turintiems gyvūnams, palyginti su laukinio tipo (WT) kontrolėmis, šlapimo / sauso svorio santykio indeksas pasikeitė mažiau, nei būtų galima tikėtis remiantis Evanso mėlynojo dažo tyrimu (EBD). Farmakokinetinė analizė parodė, kad 87% intravaskulinės Evans mėlynos spalvos sumažėjimas per pirmąsias 3 valandas po vartojimo įvyko dėl transvaskulinio srauto į audinių skyrius. Taigi pradinė „Evans blue“ sankaupa plaučiuose ir širdyje gali būti naudojama kaip transkapiliarinio makromolekulinio srauto žymeklis šiuose audiniuose 26 .

EBD daugiausia matuoja kapiliarų pralaidumą, kurį nustato albuminas, nutekėjęs iš kraujagyslių į intersticinį skyrių. Pradinis EBD intravaskulinio turinio sumažėjimas atitinka tarpląstelinį klirensą ir transkapiliarinį makromolekulinį srautą. Šlapio / sauso plaučių svorio santykis matuoja viso plaučių vandens kaupimąsi, tačiau tai apima tris skysčių skyrius (kraujagyslinį, intersticinį ir alveolinį). Matavimas atspindi ne tik kraujagyslių ir plaučių pralaidumą, bet ir kapiliarų hidraulinį slėgį bei kvėpavimo takų skysčių klirensą.

Tarp šlapio ir sauso santykio ir EBD pastebėti skirtumai rodo, kad šlapio ir sauso svorio santykis nėra toks jautrus kaip EBD tyrimas, norint įvertinti kraujagyslių nuotėkį. Tai gali lemti daugybė veiksnių. Pirma, tikėtina, kad mechaninis tempimas gali turėti nevienodą poveikį baltymų pralaidumui, hidrauliniam laidumui ir skysčio klirensui 31 . Be to, daugelis tyrimų parodė, kad hidraulinis laidumas padidėjo nekeičiant baltymų pralaidumo 32 . Be to, įmanoma, kad vandens srautas per kraujagyslių barjerą padidėja, kai trūksta eNOS, tačiau edemos šalinimo mechanizmai yra nepakitę arba yra kompensacinėje būsenoje, todėl sumažėja bet kokie šlapimo / sauso plaučių svorio skirtumai tarp išmuštų ir WT gyvūnų. Šie trys veiksniai gali užkirsti kelią kraujagyslių pralaidumo pokyčiams, kuriuos sukelia mechaninis krūvis, ypač esant LV T MV būklei. Neparodėme duomenų apie spontanišką gyvūnų kvėpavimą, nes mes savo ankstesniuose eksperimentuose ir paskelbtuose darbuose ne kartą parodėme, kad nėra skirtumo tarp kontrolinės ir LV T MV.

Dabar yra įtikinamų įrodymų, patvirtinančių, kad endotelio NO yra barjerą sutvirtinantis faktorius moduliuojant trombino, citokino ir H 2 O 2 sukeltą endotelio pralaidumą 33, 34 . Elektroninės mikroskopinės analizės metu buvo nustatyta tarpląstelinė jungties anga plaučių mikrovaskuliaruose eNOS - / - pelėms 35 . „ENOS“ transgeninėse pelėse yra didelis atsparumas ventiliatorių sukeltam plaučių sužalojimui ir bakterijų sukeltam lipopolisaharido sukeltam septiniam šokui (su silpna hipotenzija, plaučių leukocitų infiltracija ir plaučių vandens kiekiu), taip pat padidėjusiam kontrolinių pelių išgyvenamumui 28, 29 . Todėl manoma, kad eNOS gautas azoto oksidas yra endotelio jungiamojo vientisumo veiksnys, o eNOS bus naudingas signalinis baltymas, apsaugantis indą nuo nutekėjimo.

PI3K / Akt reguliuoja eNOS apsauginį vaidmenį mažinant plaučių edemą

Naujausi tyrimai parodė, kad Akt1 trūkumas, vyraujanti Akt izoforma, gali sukelti nesubrendusį kraujagyslių išsivystymą, linkusį nutekėti 7, 13 . Kraujagyslių sienelėje Akt1 praradimas padidina uždegiminius mediatorius ir sumažina eNOS fosforilinimąsi. Tai rodo, kad Akt1 iš dalies veikia kraujagysles nuo aterogenezės, naudodamas eNOS 12 .

Atsižvelgiant į ryšį tarp PI3K / Akt ir „eNOS“, eNOS signalizavimas yra būtinas norint išlaikyti plaučių kraujagyslių vientisumą po mechaninės ventiliacijos. Atsižvelgiant į tai, kad PI3K / Akt vaidmenys in vivo ir sąveika su kitais signaliais dar nėra tiksliai apibrėžti, mes ištyrėme fosfo-Akt raišką abiejų eNOS - / - ir WT pelių plaučiuose po 4 h HV T MV. Kaip parodyta 5 paveiksle, serino 473 liekanoje buvo nustatytas mažesnis fosforilinto-Akt lygis, reaguojantis tiek į LV T, tiek į HV T MV eNOS - / - pelėse, palyginti su WT pelėmis. Tai gali pasiūlyti mechanizmą, susijusį su eNOS - / - pelių pažeidžiamumu reaguojant į mechaninį krūvį. Be to, šie duomenys gali reikšti galimą „eNOS“ trūkumo grįžtamąjį ryšį suaktyvinant „Akt“.

Chenas ir jo kolegos pranešė apie nedidelį aktyvaus eNOS lygio sumažėjimą endotelio ląstelėse, išskirtose iš Akt1 - / - pelių, palyginti su laukinio tipo pelėmis 7 . Įdomu tai, kad mūsų eksperimentiniai duomenys parodė, kad eNOS geno ištrynimas gali sumažinti Akt aktyvaciją tiek fiziologinės būklės, tiek tada, kai gyvūnas reaguoja į didelį potvynio tūrio mechaninį tempimą.

Tiesioginį Akt vaidmenį palaikant kraujagyslių pralaidumą dar labiau patvirtino mūsų pastebėjimas, kad išankstinis gydymas Wort - farmakologiniu PI3K inhibitoriumi - smarkiai pablogino EBD plaučių kaupimąsi WT pelėse, kurias sukėlė 4 h HV T MV (6 pav.). Be to, H&E dažymas ir neutrofilų imuninis dažymas plaučiuose parodė sustiprintą intersticinį ir alveolinį neutrofilų infiltratą WT pelėse, iš anksto apdorotose misa ir paveiktose 4 h HV T MV, palyginti su nešikliu (7A, 7B paveikslai). Šie radiniai rodo, kad fosfo-Akt vaidina svarbų vaidmenį moduliuojant eNOS reguliuojamą kraujagyslių pralaidumą, ir rodo, kad mūsų modelyje aukščiau esančio PI3K / Akt reguliavimo vaidmuo eNOS.

Kryžminis pokalbis tarp p38 MAPK ir PI3K / Akt / eNOS

Pastaraisiais metais atsiradę įrodymai sukėlė susidomėjimą tarp skerspjūvio tarp PI3K / Akt ir MAPK signalų 18, 19, 36, 37 . Svarbi priežastis išsiaiškinti PI3K / Akt ir p38 MAPK kelių sąveiką yra ta, kad pirmasis būdas yra geriausiai apibūdinamas su išgyvenimu susijusi sistema, o antrasis yra su mirtimi susijęs signalizacijos kelias 13 . Daugelis tyrimų pasiūlė glaudų ryšį tarp NOS / NO raiškos ir p38 fosforilinimo 17, 38, 39 . Mūsų tyrimo duomenys rodo, kad p38 MAPK slopinimas SB203580 padidino Akt aktyvaciją reaguojant į HV T MV ir sumažino plaučių edemą. Neseniai paskelbtas darbas parodė, kad p38 MAP kinazės kelio slopinimas apsaugo nuo EBD ekstravazacijos ir vandens susilaikymo pelių plaučiuose reaguojant į didelio potvynio tūrio mechaninę ventiliaciją 22 . Taigi šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama signalizacijos kelio PI3K / Akt / eNOS naudojimui, naudojant Wort EBD ir šlapio / sauso santykio stebėjimus, užuot slopinant abu kelius. Be to, atsižvelgiant į tai, kad HV T MV sukeltas Akt fosforilinimas išnyko per 4 valandas trunkančią ventiliaciją, ir sunkios plaučių edemos bei sužalojimo įrodymų šiuo metu, stebėdami šių dviejų signalų sąveiką, taikėme PI3K inhibitorių Wort., įvertinti p38 MAPK pokytį. PI3K inhibitorius „Wort“ sustiprino p38 MAPK fosforilinimą, reaguodamas į mechaninį tempimą, nurodydamas galimą moduliacijos mechanizmą tarp lygiagrečių signalizacijos kelių šiuo laiko momentu 40 . Remiantis anksčiau paskelbtais rezultatais, kad fosforilinto P38 MAPK ekspresijos pikas yra maždaug 60 min., Kol jis grįžta atgal per 2 h HV T MV, o plaučių sužalojimai buvo pastebėti 2 arba 4 h HV T MV, manome, kad slopinamas PI3K / Akt / eNOS apsauginis kelias per 4 val. HV T MV buvo tarpininkaujant p38 MAPK reguliacijai. Taigi palaikant normalų PI3K / Akt / eNOS lygį, gali būti paneigtas VALI priskiriamas p38 MAPK vaidmuo.

Mūsų rezultatai sutinka su ataskaita, kad PI3-kinazės / Akt signalizacija skatina endotelio ląstelių išgyvenimą slopindama nuo p38 MAPK priklausomą apoptozę, nes Akt gali sukelti MEKK3 fosforilinimą, prieš tai esantį p38 MAPK reguliatorių. Fosforilinta MEKK3 forma sumažina MEKK3 kinazės aktyvumą, dėl to sumažėja MKK3 / 6 ir p38 MAPK aktyvacija 21 .

Todėl darome išvadą, kad kapiliarų nuotėkio apsauga buvo susijusi su Akt aktyvacija ir p38 MAPK ekspresijos silpnėjimu. Be to, pelėms, kurių trūko eNOS, buvo padaryta žala HV T MV sukeltam poveikiui. Aukščiau parodytas dviejų signalizacijos takų skerspjūvis gali nustatyti skirtingą PI3K / Akt / eNOS ir p38 MAPK poveikį kraujagyslių barjero funkcijai mūsų eksperimentinėje aplinkoje. Išvada, kad PI3K / Akt / eNOS vaidina kritinį vaidmenį palaikant kraujagyslių vientisumą, slopindama p38 MAPK, gilina mūsų įžvalgą ir turi galimą terapinį poveikį.

Autoriaus indėlis

„Xin-qi PENG“ yra atsakingas už bendrą projekto administravimą ir kryptį, kuris prisidėjo kuriant, vykdant, vertinant duomenis ir skelbiant šio tyrimo rezultatus; Jun-tian ZHANG prisidėjo prie kūrinio vedimo ir publikavimo; Mahendra DAMARLA ir Stephanie NONAS padėjo finansuoti projektą ir pateikė pastabų bei aiškinosi tyrimą; Jarrett SKIRBALL, Emile J HASAN, Xuan CAO ir Adel BOUEIZ padėjo atlikti tyrimą; Eugenia J HAN padėjo projekto finansavimui ir atliko tyrimą; Xuan CAO, Xiao-ying WANG, Dana R ANDERSON ir Alfred M SCIUTO padėjo rašyti ant popieriaus; Rubinas M TUDERAS padėjo peržiūrėti morfologijos ir imunohistochemijos rezultatus; Rachel DAMICO pateikė komentarus apie šį tyrimą; David A KASS, Joe GN GARCIA ir Alfred M SCIUTO prisidėjo kaip konsultantai prie šio tyrimo; Paul M HASSOUN finansavo dalį šio tyrimo ir padėjo pirmajam autoriui aiškinti duomenis, taip pat padėjo kaip konsultantas.