Baltymų kristalų atranka ir serijinės femtosekundės nanokristalografijos apibūdinimas | mokslinės ataskaitos

Baltymų kristalų atranka ir serijinės femtosekundės nanokristalografijos apibūdinimas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biofizika
  • Rentgeno kristalografija

Anotacija

Neseniai sukurti rentgeno spindulių laisvieji elektronų lazeriai (XFEL) paskatino serijinės femtosekundės nanokristalografijos (SFX) plėtrą, kuri pirmą kartą įgalina struktūros atstatymą iš sub mikronų baltymų kristalų. Nors jau yra vis daugiau struktūrų, skelbiamų naudojant SFX, vis dar yra labai nauja ir pateikia daug unikalių iššūkių bei galimybių struktūriniams biologams. Vienas didžiausių SFX eksperimentų sėkmės barjerų yra tinkamų baltymų kristalų mėginių paruošimas ir parinkimas. Čia pateikiame tinkamų XFEL taikinių paruošimo ir atrankos protokolą.

Įvadas

Rentgeno spindulių laisvieji elektronų lazeriai (XFEL) yra naujausias struktūrinių biologų įrankis. Dėl labai intensyvios femtosekundės impulsų struktūros jie idealiai tinka nanokristalų tyrimams ir baltymų dinamikai tirti. Šiuo metu veikia du kietieji be rentgeno spindulių elektronų lazeriai, kurie gali būti naudojami serijinei femtosekundinei kristalografijai (SFX); Tai yra „Linac“ nuoseklusis šviesos šaltinis (LCLS) JAV ir „SPring-8 Angstrom“ kompaktiškas laisvųjų elektronų lazerių (SACLA) šaltinis Japonijoje. Dėl unikalių šių šaltinių galimybių ir jų trūkumo reikia nuolatos reikalauti prieigos prie šių įrenginių. Naujausi XFEL eksperimentai leido gauti daugybę didelio poveikio biologinių struktūrų, tarp kurių yra, bet neapsiribojant, I fotosistema ir serotonino receptoriais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 . Tačiau ši technologija vis dar yra pradinėje stadijoje ir mažai skelbiama apie tinkamų XFEL kristalų mėginių paruošimą ir atranką, kurie daugeliu atvejų labai skiriasi nuo kristalų rūšių, kurie įprastai matuojami sinchrotrono šaltiniuose.

Dėl reikšmingų mikro fokusavimo kristalografijos spinduliuotės pokyčių trečiosios kartos sinchrotronuose kristalų dydis, kurį galima išmatuoti esant tokiems šaltiniams, tapo vis mažesnis. Sumažinus foninį signalą ir įdiegus nuosekliąją sinchrotrono kristalografiją (SSX), praplečiama riba, nuo kurios galima rinkti pavienių kristalų duomenis sinchrotronuose iki mikronų skalės 9, 10 . Baltymų kristalams, esantiems žemiau nei 1 mikrono skalė (ty tiems, kurių augimą sunku optimizuoti už nanometrų skalės ribų), SFX yra vienintelis perspektyvus būdas gauti aukštos skiriamosios gebos vieno kristalo difrakcijos duomenis dėl greito išmatuoto difrakcijos skilimo. intensyvumas, atsirandantis dėl radiacinės žalos 11 .

Net ir esant ypač intensyviems XFEL spinduliams, sėkmingo eksperimento metu būtina išmatuoti tinkamų dydžio, kokybės ir kristalinės struktūros charakteristikų pavyzdžius. Prastai išdėstyti nanokristalai greičiausiai neduos aukštos skyros XFEL, tuo tarpu tie, kurie yra labai tvarkingi, vis tiek bus per maži monokristalų sinchrotrono matavimui, tačiau gali būti puikūs kandidatai XFEL analizei. Todėl pagrindiniai klausimai, į kuriuos reikia atsakyti atrenkant tinkamus XFEL tikslus:

  1. Ar kristalas yra per mažas, kad būtų galima matuoti pavienius kristalus sinchrotrone?

  2. Ar krištolo baltymas, ar druska?

  3. Ar kristalų kokybė yra pakankama, kad XFEL būtų renkama aukštos skyros struktūrinė informacija?

Kaip mes paprastai tikimės dirbti su nanokristalais, kurie yra mažesni nei daugelio standartinių baltymų kristalų apibūdinimo metodų diapazonas, - atsakyti į šiuos klausimus nėra nereikšmingas uždavinys ir reikia sukurti naujus nanokristalų specifinius protokolus. Šiuo metu yra kuriami nanokristalų difrakcijos kokybės įvertinimo ir nanokristalų vizualizacijos metodai 12, 13 . Tačiau čia aprašome metodą, kurį sukūrėme, naudodamiesi standartinių laboratorinių ir sinchrotroninių metodų deriniu, pasirinkdami tinkamus nanokristalografijos tikslus, kurie leidžia nustatyti kristalų dydį ir patikrinti kristalų kokybę, kad būtų galima įsitikinti, ar jie tinkami XFEL eksperimentams, ar reikia tolesnio kristalizacijos. optimizavimas.

Norėdami parodyti protokolų, kuriuos sukūrėme SFX patikrai, efektyvumą, pateikiame pavyzdį, atliktą atliekant paprastą bandymo sistemą: lizocimą. Atlikdami „aklą testą“, mes pritaikome šį protokolą naujam baltymo taikinio, MAL TIR domeno, sukeltos MyD88 TIR domeno (toliau - MyD88 TIR ) kristalams. Mes parodome, kad mūsų pateiktas protokolas gali sugeneruoti pakankamai duomenų, kad būtų galima nustatyti, ar šis mėginys yra tinkamas XFEL eksperimentams. Mūsų požiūris sujungė duomenis iš įvairių biofizikinių apibūdinimo metodų, įskaitant šviesos mikroskopiją, perdavimo elektronų mikroskopiją (TEM), dinaminį šviesos sklaidą (DLS) ir sinchrotrono spinduliuotę.

Rezultatai

Krištolo atvaizdavimas ir dydžio nustatymas

Mikroskopija

Optinis mikroskopas yra naudinga priemonė, paprastai naudojama baltymų kristalams apžiūrėti ir jų dydžiui įvertinti. Tačiau naudoti kristalus, kurie yra mažesni už įprastų baltymų kristalų dydžio diapazoną (<5 μm), naudoti optinį mikroskopą gali būti sudėtinga. 1a paveiksle parodytas lizocimo kristalų, kurių dydis yra apie 2 μm, vaizdas. Naudojant didžiausią „Nikon“ optinio mikroskopo padidinimą (x100) buvo sunku gauti aštrų vaizdą, nes pats mikroskopas buvo apribotas. MyD88 TIR pavyzdžių kristalų nebuvo galima aiškiai pamatyti po šviesos mikroskopu, tačiau buvo galima nustatyti lazdelės formų morfologiją (1b pav.).

Image

a ) Lizocimas ir b ) MyD88 TIR kristalai. Numatomas lizocimo kristalų dydis buvo ~ 2 μm. „MyD88 TIR“ kristalai buvo lazdelės formos, o ilgiausias matmuo buvo apytiksliai nuo ~ 10 μm iki 20 μm. Šie vaizdai buvo padaryti naudojant Nikon 'Eclipse Ti-s' optinį mikroskopą.

Visas dydis

Norint gauti geresnius kristalų vaizdus, ​​buvo naudojama perdavimo elektronų mikroskopija (TEM). TEM atskleidė, kad kristalizacijos suspensijos abiejų tirtų mėginių kristalų populiacija buvo mišri. Lizocimo kristalų morfologija buvo tetraedrinė ir svyravo nuo 2 μm iki 50 nm (2a pav.). „MyD88 TIR“ pavyzdyje buvo rodomi lazdelės formos kristalai, kurių ilgumas buvo 12–0, 5 μm, o ilgiausias matmuo x ~ 0, 1 µm (2b pav.).

Image

( a ) Lizocimo tetraedriniai kristalai ir ( b ) MyD88 TIR lazdelės formos kristalai. Kristalai buvo paimti iš to paties mėginio, kaip parodyta 1 pav. Kristalai buvo nudažyti 1% uranilacetatu ir vizualizuojami JEOL JEM-2010 TEM.

Visas dydis

Dinaminis šviesos sklaidymas (DLS)

Tirpalo kristalų dydis taip pat buvo patikrintas naudojant DLS. 1 lentelėje parodyta keletas lizocimo ir MyD88 TIR kristalų kristalizacijos suspensijos DLS rezultatų atskirų bandymų. Apskaičiuotas lizocimo tirpale esančių dalelių dydis atitiko 2, 3 ± 0, 6 μm, o polidispersiškumo indeksas (PDI) buvo 0, 4 ± 0, 25 (iš 4 bandymų vidurkio). Apskaičiuotas „MyD88“ TIR kristalų dydis iš trijų bandymų vidurkio atitiko 3, 9 ± 0, 3 μm, o vidutinis PDI buvo 0, 408 ± 0, 1 (žr. Papildomos informacijos, S1–3 paveikslas, apie atskirus matavimus). DLS rezultatai patvirtino mėginių nevienalytiškumą, stebėtą TEM vaizduose (2 pav.), Kaip rodo daugkartinės smailės, matomos koreliacijos duomenų diagramoje (3 pav.). Šių duomenų apie kristalinius mėginius patikimumą reikia vertinti atsargiai, nes DLS yra metodas, netinkamas kristaliniams mėginiams. Todėl šie duomenys pateikia tik mėginyje dominuojančių rūšių kristalų dydžio įvertinimą ir nėra tikroji kristalo dydžio vertė.

Pilno dydžio lentelė

Image

Kiekviena spalvota linija žymi skirtingą mėginio eigą, o smailės, paryškintos rodykle, rodo, kad mėginys yra nevienalytis.

Visas dydis

Sinchrotrono kristalų kokybės apibūdinimas

Norėdami patikrinti, ar kristalų kokybė buvo pakankama didelės skiriamosios gebos struktūrinei informacijai rinkti XFEL, mes gavome preliminarius rentgeno spinduliuotės difrakcijos duomenis, naudodami sinchrotrono šaltinį. Į rentgeno spindulį buvo įdėtas nedidelis kiekis polikristalinio mėginio ir padarytas difrakcijos vaizdas. Mes ir toliau didinome kristalų kiekį rentgeno spinduliuose, norėdami pamatyti, kaip tai paveikė difrakcijos modelį. 4 paveiksle parodyta „MiTeGen“ kilpos, į kurią įdėtas mažas kristalų skaičius (4a pav.), Po kurio yra didesnis skaičius kristalų (4b pav.), Nuotrauka. Dėl daugybės kristalų, esančių kilpoje, buvo pastebėtas polikristalinio miltelių difrakcijos vaizdas (4 pav.). Padidėjus kristalų tūriui rentgeno spinduliuotėje, buvo pastebėtas mėginio difrakcijos skyros padidėjimas. Tai parodyta „MyD88 TIR“ kristalų 4 pav. Panašūs rezultatai buvo gauti ir lizocimo kristalų atžvilgiu.

Image

Rentgeno spindulio vietą nurodo raudona žvaigždė. ( a ) Rentgeno spindulys yra ant mažo tankio kristalų kilpoje ir rodo silpną difrakciją, ~ 8, 5 Å skiriamąją gebą. b ) Mėginys perkeliamas į kilpos vidurį taip, kad rentgeno spindulys būtų nukreiptas į didesnį kristalų tankį ir parodytų difrakciją iki ~ 5, 8 Å. Mėginio atstumas buvo 400 mm, o ekspozicijos laikas buvo 5 sekundės. Mėlyni žiedai nurodo skiriamąjį gebą.

Visas dydis

5 paveiksle parodytas polikristalinės difrakcijos modelis, susidaręs dėl daugybės kristalų, įdėtų į lizocimo (5a pav.) Ir MyD88 TIR (5b pav.) Kristalų rentgeno spindulį. Lizocimo ir MyD88 TIR kristalai difrakcionuojasi atitinkamai iki 2, 6 Å ir 5, 6 Å. Neapdoroti duomenys rodo, kad „MyD88“ TIR kristalai gali difrakcijos metu išsiskirti daugiau nei 5, 6 Å, kaip rodo labai silpni miltelių žiedai, kurių šiuose vaizduose nematyti.

Image

( a ) Lizocimo kristalų difrakcija iki 2, 6 Å ir ( b ) MyD88 TIR kristalų difrakcija iki 5, 6 Å skyros. Duomenys buvo surinkti Australijos sinchrotronu (MX2 spindulio linija), o mėlyni žiedai rodo skyros žiedus.

Visas dydis

Diskusija

Kristalų savybės, tokios kaip dydis, kokybė ir kristalų tvarka, lems XFEL eksperimentų sėkmę. Prastai išdėstyti nanokristalai greičiausiai neduos aukštos skiriamosios gebos duomenų XFEL, tuo tarpu tie, kurie yra labai tvarkingi, bet per maži monokristalų sinchrotrono matavimams, gali būti puikūs kandidatai XFEL analizei. Norint, kad sėkmingi serijiniai femtosekundės nanokristalografijos (SFX) eksperimentai būtų svarbūs, norint atvaizduoti kristalus, kad būtų galima sužinoti jų dydį ir kokybę. Žinant kristalų dydį, galima nustatyti purkštuko tiekimo sistemos ir duomenų rinkimo parametrus. Duomenims rinkti bus naudojamas purkštuko dydis ir pradinis pluošto skersmuo. Ar kristalai nesulipę; Kokios formos yra kristalai; ir kokio dydžio yra kristalai; pateikite keletą svarbių klausimų, į kuriuos reikia atsakyti prieš atliekant XFEL eksperimentus? Nanokristalus sunku atvaizduoti naudojant optinį mikroskopą, tai matyti iš mūsų rezultatų. Optinė mikroskopija gali suteikti kristalų dydį, kuris būtų didesnis nei maždaug 2 μm, tačiau sunku nustatyti, ar mėginys yra vienalytis. TEM pateikia tikslų kristalo dydžio matavimą. Tai taip pat nurodo kristalų morfologiją ir dydžio pasiskirstymą mėginyje. Parodėme, kad DLS galėjo gerai įvertinti kristalų dydį ir nurodyti mėginio nevienalytiškumą. Todėl mes nustatėme, kad trijų papildomų metodų, optinės mikroskopijos, TEM ir DLS, derinys gali pateikti kristalų dydžio ir morfologijos mūsų mėginyje apžvalgą. „MyD88 TIR“ kristalų morfologija ir forma leidžia nustatyti pradinius eksperimentinius XFEL spinduliavimo laiko parametrus, į kuriuos įeina spindulio skersmuo ir idealus purkštuko dydis. Identifikuojant lazdelės formos kristalų morfologiją, galima atlikti eksperimentinį planavimą ir taip padėti suprojektuoti eksperimentinę duomenų rinkimo sąranką. Dėl jų morfologijos manytume, kad kristalai turės lengvatinę orientaciją (ilgiausio matmens kryptimi), kai išeis iš GVDN srovės srauto. Todėl turime atsižvelgti į lazdelės formos kristalų srauto suderinimo efektą ir atitinkamai optimizuoti šio mėginio purkštuko tiekimo greitį.

Sinchrotrono apibūdinimas parodė, kad kristalų dydis buvo per mažas, kad būtų galima atlikti įprastą vieno kristalo difrakciją sinchrotrono šaltinyje, todėl jis yra idealus kandidatas į XFEL. Naudodamiesi sinchrotrono duomenimis, mes galime padėti nustatyti kristalų sudėtį (ty baltymus ar druską, kaip rodo difrakcijos žiedų tarpai, matomi difrakcijos vaizduose (dideli tarpai tarp miltelių žiedų rodo mažą molekulę, o maži tarpai) rodo didelę molekulę) .Sinchrotrono duomenys taip pat leidžia mums pasiekti kristalo kokybę.

Kristalo kokybė yra svarbi nustatant, ar mėginys yra tinkamas gauti aukštos skyros struktūrinę informaciją XFEL. Pirmoji prielaida, kurią daro dauguma žmonių, kurie yra nauja XFEL mokslo sritis, yra ta, kad prasta difrakcija nuo kristalų, naudojant sinchrotrono šaltinį, leis geriau difrakciją naudojant labai sufokusuotą XFEL spindulį. Tai gali būti ne tas atvejis, nes tai labai priklauso nuo kristalų kokybės mėginyje. Dėl kristalui būdingo sutrikimo, kristalas, kurio sandarumas kristalų atžvilgiu yra blogas ir kuris gerai neišsiskiria į sinchrotroną, geriau neišskaidys XFEL. Gali būti sunku nustatyti skirtingą prastos kokybės nanokristalų ir nepakankamo fotono mėginio poveikį. Mes pademonstravome sinchrotrono spinduliuotės šaltinio metodą, kuriuo galima nustatyti, ar kristalo rentgeno spinduliuotės difrakcija yra ribota dėl vidinio kristalo sutrikimo, ar dėl šaltinio sukuriamų fotonų trūkumo. Padidėjus kristalų skaičiui rentgeno spinduliu, padidėjo vaizdo difrakcijos modelio skiriamoji geba. Tai yra tiesioginis kristalų, didinančių Braggo atspindžius, rezultatas ir rodo, kad mėginio kristalų kokybė yra gerai nustatyta; todėl didelės skiriamosios gebos duomenis gali riboti sinchrotrono fotono srautas, o ne kristalo kokybė. Tai aiškiai parodė dvi patikrintos kristalų sistemos, ypač „MyD88 TIR“ kristalai, kurie buvo mažiausi ištirti. Jei kristalai turėjo vidinį sutrikimą, mes nesitikėtume, kad padidės mėginio skiriamoji geba difrakcijos vaizde, nes padidinome kristalų skaičių rentgeno spinduliuotėje. Taip yra todėl, kad kristalų sutrikimas išliks tas pats, nesvarbu, kiek kristalų buvo.

Kristalų dydžio pasiskirstymas pavyzdyje taip pat paveiks duomenų kokybę. Geresni difrakcijos duomenys gali būti renkami, jei vidutinis kristalo dydis yra palyginamas su židinio taško 14 pločiu. Dideli kristalų dydžio skirtumai imtyje turės įtakos duomenų kokybei. Šiuo metu dėl blogo difrakcinių kristalų ir oro sklaidos (duomenų, kuriuose nėra kristalų) duomenų rinkimo derinio, SFX sėkmingų įvykių procentas gali būti tik 4, 8% visų 15 paspaudimų. Mūsų rezultatai rodo, kad abiejų tirtų mėginių kristalų populiacijos dydis yra nevienalytis. Tolesnis pavyzdžio kristalų populiacijų apibūdinimas ir atskyrimas būtų naudingas renkant duomenis, siekiant pagerinti mėginio kokybę ir padidinti sėkmingą SFX atitikties procentą. Tai bus atskiro leidinio dėmesys.

Apskritai, norėdami pasirinkti tinkamus nanokristalų taikinius XFEL eksperimentams, mes sukūrėme metodą, naudojantį standartinius laboratorinius ir sinchrotroninius metodus. „MyD88 TIR“ kristalų apibūdinimas pateikė svarių įrodymų, patvirtinančių, kad kristalai yra tvarkingi ir tinkami SFX XFEL. Eksperimento apibūdinimo rezultatai rodo, kad optinės mikroskopijos, perdavimo elektronų mikroskopijos, dinaminės šviesos sklaidos ir sinchrotrono duomenų deriniu mes sugebėjome nustatyti kristalų, kuriuos sunku optiškai pamatyti, kristalų dydį, morfologiją, mėginio heterogeniškumą ir difrakcijos kokybę. Šie rezultatai kartu su tuo, kad galime užauginti didelius šių kristalų kiekius, daro „MyD88 TIR“ kristalus idealiais serijiniais femtosekundės nanokristalografijos eksperimentais, naudojant rentgeno spindulių nemokamą elektronų lazerį.

Metodai

Lizocimas (L6876-10G) buvo įsigytas iš „Sigma-Aldrich“. Visos naudojamos cheminės medžiagos buvo įsigytos iš „Sigma-Aldrich“, jei nenurodyta kitaip. 24 šulinėlių kristalizacijos plokštelės buvo įsigytos iš „Hampton Research“, o „ZEN0112“ UV vienkartinės kiuvetės, naudojamos DLS eksperimentams, - iš „ATA Scientific“. Kristalografijos tinkleliai buvo įsigyti iš „MiTeGen“.

Pirmiausia mėginiai buvo kristalizuojami ir atvaizduojami naudojant keletą metodų kristalo dydžiui nustatyti. Kristalų difrakcijos kokybė buvo patikrinta Australijos sinchrotronu. Sukurto metodo schema parodyta 6 pav., Kitame skyriuje išsamiau aprašomas metodas.

Image

Geltonos spalvos langeliai atitinka duomenų analizės žingsnius, žali langeliai - apibūdinimo žingsnius, o mėlyni langeliai - „sprendimų priėmimo“ etapus. DLS; dinaminis šviesos sklaidymas, TEM; perdavimo elektronų mikroskopija.

Visas dydis

Kristalizacija

Lizocimo kristalizacija

Lizocimo kristalai buvo auginami remiantis protokolu, pritaikytu iš Falkner ir kt . 16 . Kristalai buvo auginami naudojant partinės kristalizacijos metodą 1, 5 ml centrifugos mėgintuvėliuose. 200 μl kristalizacijos tirpalo (18% natrio chlorido, 6% PEG 6000, pH iki 4, naudojant natrio hidroksidą) buvo įpilta į 20 μl 160 mg / ml lizocimo baltymo, sudaryto iš 0, 5 M acto rūgšties (pH 4, naudojant natrio hidroksidą)., ir iškart sukūrė sūkurį. Kristalizacijos reakcija buvo uždaryta uždaryta ir įdėta į 22 ° C inkubatorių. Kristalai tirpale spontaniškai išaugo ir per naktį išbalansavo.

MAL indukuotų MyD88 TIR srities kristalų gamyba

Žmogaus MAL (liekanos 79–221 liekanos su N-galo His 6 taga) ir MyD88 (155–296 liekanos su C galo His 6 taga) TIR domenai buvo gaminami E. coli BL21 (DE3) ląstelėse, naudojant autoindukcijos metodas 17 ir išgryninamas naudojant imobilizuotų metalų jonų afinitetinės chromatografijos ir gelinio filtravimo derinį. Gelio filtravimo etapui mes panaudojome „Superdex 75 HiLoad 26/60“ dydžio išskyrimo chromatografijos (SEC) kolonėlę („GE Healthcare“), iš anksto subalansuotą buferiu, kuriame yra 10 mM HEPES (pH 7, 5) ir 150 mM NaCl. MAL indukuoti MyD88 TIR domeno kristalai buvo gaminami inkubuojant MAL TIR domeną (0, 5–3 μM) su MyD88 TIR domenu (60 μM) 10 mM HEPES, pH 7, 5, 150 mM NaCl, esant 25–37 ° C, 1–2 valandas.

Kristalų atvaizdavimas ir dydžio nustatymas

Optinė mikroskopija

Kristalų vaizdavimui ir dydžiui nustatyti buvo naudojamas „Nikon“, „Eclipse Ti-s“, optinis mikroskopas. 2–5 μl kristalizacijos suspensijos buvo dedamos ant dangtelio ir apverstos ant mikroskopo stiklelio, kad būtų pavaizduoti kristalai.

Perdavimo elektronų mikroskopija (TEM)

Mėginiai buvo paruošti ant anglies dengtų 400 akių vario tinklelių (ProSciTech, GCU400H). 4 μl alikvotas iš 1:000 kristalų praskiesto tirpalo dedamas ant grotelių ir paliekamas stovėti 2 minutes. Tirpalo perteklius pašalinamas naudojant filtravimo popierių, o tiesiai ant tinklelio įpilama 4 μl 1% uranilacetato ir nedelsiant išpilamas naudojant filtrinį popierių. Prieš vaizdavimą JEOL JEM-2010 perdavimo elektronų mikroskopu, veikiančiu 100 kV įtampoje, mėginys 10 minučių buvo džiovinamas ore. Vaizdai buvo imami naudojant „Valeta 4 MP CCD“ kamerą.

Dinaminis šviesos sklaidymas

Vidutinis kristalų dalelių dydis kristalizacijos suspensijoje buvo nustatytas naudojant Malvern Zetasizer Nano-ZS dinaminio šviesos sklaidos (DLS) analizatorių (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, JK). Ištirtas 40 μl praskiestų kristalų alikvotas dalelių dydžiu keliais bandymais. Pateiktas dalelių dydis parodė hidrodinaminius skersmenis, apskaičiuotus atsižvelgiant į dalelių skaičiaus tankio laiko koreliacijos funkciją 18 . „MyD88“ TIR kristalai prieš filtruodami DLS buvo išfiltruoti per 10 μm frito, kad būtų pašalinti kristalo agregatai iš mėginio.

Sinchrotrono kristalų kokybės apibūdinimas

Sinchrotrono kristalų mėginio paruošimas

50 μl kristalų suspensijos alikvotinė dalis buvo centrifuguota 2000 x g greičiu 5 minutes kambario temperatūroje, kad kristalų nuosėdos būtų granuliuotos. Skystis, supantis granules, buvo išsiurbtas, pakeistas krio tirpalu ir pakartotinai centrifuguojamas 2 000 x g 5 minutes, kad kristalai susiformuotų. Didžioji dalis supernatanto buvo pašalinta iš kristalų. Didelis kristalų tūris buvo pipete įpiltas į „MiTeGen“ tinklelį ir supilamas į skystą azotą ir padėtas ant standartinio kristalografijos laikiklio prie MX2 spindulio linijos Australijos sinchrotrone.

Visi kristalai buvo dedami į kriogeninį tirpalą; „MyD88 TIR“ kristaluose buvo 16% glicerolio, o lizocimo kristaluose - 25% PEG400.

Duomenų rinkimas

Difrakcijos vaizdai buvo gauti naudojant MX2 mikro-fokusavimo spindulio liniją Australijos sinchrotrone. Buvo naudojamas pluoštas, kurio bangos ilgis 0, 957 Ǻ (13, 0 keV) ir kurio matmenys 25 μm × 15 μm, su 5–10 sekundžių ekspozicijos laiku, be slopinimo, ir tipiškas rentgeno srautas - 5 × 10 12 fotonų / s. Duomenys buvo surinkti 500 mm atstumu nuo detektoriaus iki mėginio, naudojant MyD88 TIR kristalus, ir 400 mm, tiriant lizocimo kristalus. 2-D difrakcijos vaizdai buvo įrašyti į ADSC Quantum 315r CCD. Visi vaizdai buvo peržiūrėti naudojant „iMosflm 19“ .

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Darmanin, C. et al . Baltyminių kristalų atranka ir apibūdinimas serijinės femtosekundės nanokristalografijai. Mokslas. Atstovas 6, 25345; „doi“: 10.1038 / srep25345 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.