Proteomika sergant hipertenzija | žmogaus hipertenzijos žurnalas

Proteomika sergant hipertenzija | žmogaus hipertenzijos žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Hipertenzija
  • Proteomika

Anotacija

Proteomika, baltymų, sudarančių baltymą, tyrimas pastaraisiais metais tapo svarbia priemone keliose skirtingose ​​medicinos tyrimų srityse ankstyvam ligos nustatymui, reagavimo į gydymą įvertinimui ir pagrindinių patofiziologinių mechanizmų išsiaiškinimui. Nors dauguma pacientų, sergančių hipertenzija, gydomi panašiai, priežastys, kuriomis grindžiama liga, yra įvairios ir dažnai blogai suprantamos. Genetiniai tyrimai apėmė kelis skirtingus genus kandidatus, tačiau gali būti, kad „pasroviui“ genų produktų - baltymų - tyrimas padės geriau suprasti ryšį tarp aplinkos ir genetinio poveikio, kuris prisideda prie hipertenzijos vystymosi. Proteominius tyrimus galima greitai ir patikimai atlikti su keliais skirtingais mėginių tipais, įskaitant plazmą ir šlapimą, kuriems reikalingas minimalus paruošimas prieš bandymą. Šioje apžvalgoje mes palyginsime skirtingas analitines platformas ir techninius klausimus, susijusius su proteomine analize. Aptarsime esamus proteomikos hipertenzijos, taip pat susijusių ligų, tokių kaip inkstų liga, preeklampsija ir vainikinių arterijų ligos, tyrimus. Mes taip pat ištirsime galimus proteomikos tyrimų taikymo atvejus ateityje, kurie galų gale gali padėti pagerinti gyventojų patikrinimą, terapijos stebėjimą ir ankstyvą tikslinių organų pažeidimų nustatymą.

Įvadas

Hipertenzija, užuot atskira liga, yra svarbus kelių skirtingų širdies ir kraujagyslių ligų, įskaitant koronarinių arterijų ligą (inkstų nepakankamumą), inkstų nepakankamumą ir insultą, rizikos veiksnys. Nepaisant pasaulinio paplitimo, vis dar yra mažai suprantamų veiksnių. Aišku, kad genetiniai veiksniai turi didelę reikšmę hipertenzijos išsivystymui, kai apskaičiuotas kraujospūdžio paveldimumas yra maždaug 20–40%. 1 Keletas kitų veiksnių, įskaitant aplinką ir mitybą, sąveikauja su genomu; todėl gali būti, kad genų produktų, ypač baltymų ir metabolitų, pasroviui tyrimas padės geriau suprasti ryšį tarp aplinkos ir genetinio poveikio hipertenzijos vystymuisi.

Proteomika yra proteomo, genomo baltymo komplemento, tyrimas. Tradiciniai ligos apibrėžimai dažniausiai remiasi stebimų simptomų ir požymių aprašymu, dažnai visiškai nesuprantant patofiziologijos, kuria grindžiamas ligos procesas. Sudėtingoms ligoms, tokioms kaip hipertenzija ar kitos širdies ir kraujagyslių ligos, pavienius „žymenis“ diagnozuoti, nustatyti ir vertinti prognozes galbūt naudoti nerealu. Vienas iš proteomika pagrįstų tyrimų pranašumų yra tas, kad daugelį šių mechanizmų galima integruoti plėtojant „daugialypį“ metodą. Be to, kadangi proteomika yra „hipotezes generuojanti“ tyrimų priemonė, tikėtina, kad ši tyrimų linija atvers naujas galimybes potencialiam biomarkerių atradimui ir naujoms diagnostinėms bei prevencinėms priemonėms.

Žmogaus genome yra apie 20 000 genų; kiekvienas genas gali būti diferencijuotas susirišimas, transliacija ir posttransliacinė modifikacija. Dėl to kiekvienas genas gali koduoti ne mažiau kaip 10 kartų daugiau baltymų, kurie visi gali nustatyti skirtingas ląstelių funkcijas. 2 Taigi galima teigti, kad nors genomika paaiškina savo polinkį į ligą, proteomika tiksliau atspindi baltymų, išreikštų, taigi ir tikslius ligos procesus tyrimo metu. Technologijai tobulėjant ir lengvai prieinamai, proteominė analizė gali atlikti svarbų vaidmenį klinikinėje praktikoje, nustatant pagrindines patofiziologines hipertenzijos priežastis, individualizuojant terapiją ir nustatant ankstyvus tikslinių organų pažeidimo požymius.

Metodika

Mėginių tipai

Proteominės analizės eiga parodyta 1 paveiksle. Proteominius tyrimus galima atlikti naudojant bet kokio tipo audinius, kūno skysčius ar kultivuojamas ląsteles. Audinių mėginiai yra optimalus būdas nustatyti patologinius pokyčius, tačiau plataus masto žmogaus audinio tyrimus visada riboja invazinės priemonės, kuriomis jie gaunami, ir poreikis parinkti homogenines ląstelių populiacijas. Priešingai, kūno skysčiai, tokie kaip kraujo plazma, smegenų skysčiai ar šlapimas, yra homogeniškesni, lengviau prieinami, todėl jie visi buvo naudojami proteominiams tyrimams.

Image

Proteominės analizės eiga. Darbo eiga parodyta šlapimo mėginyje, skirtoje preeklampsijos proteominei analizei. a ) Šlapimo atveju specialaus mėginio ruošti nereikia. b ) Parodytas atskyrimas naudojant CE-MS. ( c ) Tada atskirus peptidus galima nustatyti ir identifikuoti. d ) Visų peptidų mėginių iš kontrolinių (kairėje) ir atvejų (dešinėje) grafinė iliustracija pagal CE laiką ( x ašis), masę ( z ašis) ir gausą ( y ašis) bei žymiai skirtingus ligai būdingus peptidus. e ) Kaip ir bet kurio kito biomarkerio atveju, norint įvertinti jautrumą ir specifiškumą, radinius reikia pakartoti nepriklausomose grupėse.

Visas dydis

Visų kūno skysčių polipeptidai yra linkę į proteolitinį skaidymąsi, pavyzdžiui, įrodyta, kad žmogaus serume esantys peptidai pasižymi dideliu proteolitiniu aktyvumu iškart po krešėjimo. 3 Šlapimas gali būti stabilesnis baltymų tyrimų šaltinis, nes dėl santykinio proteolitinio aktyvumo trūkumo šlapimo peptidai yra pakankamai stabilūs, kad būtų galima atlikti tikslią analizę. Šlapimas keletą metų gali būti laikomas –20 ° C temperatūroje, 3 dienas 4 ° C temperatūroje arba 6 valandas kambario temperatūroje, be reikšmingų baltymo pokyčių. 4 Kaip kraujo filtratas, šlapime yra daugybė informacijos apie daugelio vidaus organų veiklą, o kai kurie baltymai kraujyje gali pasirodyti jų šlapime kaip nepažeisti baltymai arba kaip peptidų fragmentai. Tačiau šlapimo peptidinė sudėtis priklauso nuo daugelio veiksnių: glomerulų filtracijos, rezorbcijos ir sekrecijos kanalėliuose bei lizosomų proteolitinio aktyvumo teptuko krašte. 5

Mėginio paruošimas

Vienas pagrindinių kūno skysčių proteominių tyrimų aspektų yra mėginio paruošimas. Albuminas šlapime arba lipidai kraujyje gali sukelti šališkumą ir artefaktą dėl baltymų tyrimo rezultatų, todėl šie trukdantys junginiai paprastai pašalinami pagal standartizuotą protokolą. Neseniai buvo pristatyti nauji metodai serumo proteomo analizei iš anksto nepašalinus pagrindinių baltymų, kurie sėkmingai naudojami nėštumo metu atliktų hipertenzijos proteominių tyrimų metu. 6

Proteominės platformos

Dviejų matmenų gelinė elektroforezė

Dviejų matmenų gelinė elektroforezė (2-DE) atskiria baltymus dviem matmenimis: jų izoelektriniu tašku ir molekuline mase. Tada baltymai yra apdorojami proteolitiniu vidiniu geliu virškinimu; suskaidyti baltymų fragmentai ekstrahuojami ir gauto peptido „pirštų atspaudų“ analizei naudojama masių spektrometrija (MS). 7 2-DE suteikia didelę skiriamąją gebą didelės molekulinės masės baltymų atskyrimui ir identifikavimui. Kadangi 2-DE nėra automatizuotas procesas, galimas trūkumas yra tas, kad vienu metu dideliam baltymų skaičiui analizuoti yra per daug laiko, o palyginimą tarp tyrimų sunku nustatyti. Pastarąjį tašką galima pagerinti atliekant 2D diferencialo gelio elektroforezę. Metodas naudojamas dviem mėginiais, skirtingai paženklintais dviem fluorescenciniais dažais. Biologiniai mėginiai tuo pačiu metu išskiriami tame pačiame gelyje, naudojant vidinį standartą, kurį sudaro vienodi visų biologinių mėginių, paženklintų trečiuoju dažikliu (pagrindinis gelis), kiekiai. Kiekvienos baltymo dėmės ant gelio gausumas nustatomas pagal jų santykį su atitinkamomis to paties gelio vidinio etalono dėmėmis. 8

Skysčių chromatografija-MS

Skysčių chromatografija (LC) yra galingas frakcionavimo metodas, galintis atskirti didelį kiekį analitės LC kolonėlėje. Tolesnė nuodugni analizė suteikia didžiulį duomenų kiekį ir apima daugybinį atskyrimą, naudojant skirtingas matricas, atliekant nepriklausomus etapus (daugiamatė baltymų identifikavimo technologija). 9 Daugiamačio atskyrimo sąlyga yra atskirų atskyrimo metodų ortogonalumas, tai yra, kiekvienas atskyrimo žingsnis turi būti pagrįstas skirtingomis (ortogonalinėmis) molekulinėmis savybėmis. Pagrindinis LC-MS apribojimas yra laikas (dienomis), paimtas pavienio mėginio analizei. Be to, dideli baltymai (> 10 kDa) prieš analizę turi būti proteolitiškai suskaidomi tripsinu. Taigi 2-DE ir LC-MS, nepriklausomai arba kartu, gali analizuoti didelio jautrumo baltymus, tačiau nė vienas iš jų netinka palyginti didelio mėginių skaičiaus 4 lyginamai analizei ir daugiausia apsiriboja biomarkerių atradimo tyrimais, o vėliau patvirtina kandidatą. žymekliai pagal didelio pralaidumo platformas, tokias kaip imunofermento tyrimas, susijęs su fermentais.

Paviršiuje patobulinta lazerio desorbcija / jonizacijos-MS

Paviršiuje sustiprinta lazerio desorbcija / jonizacija (SELDI) naudoja skirtingus hidrofilinius paviršius, kad adsorbuotų baltymus, o nesurišti baltymai būtų nuplaunami. Ryšys su matricos paviršiumi atskiria baltymus, todėl vėlesnė MS analizė tampa ne tokia sudėtinga. SELDI naudojimo tikslas yra surišti nedidelę, bet tiksliai apibrėžtą baltymų frakciją į paviršių, atsižvelgiant į pH, koncentraciją ir druskos kiekį. SELDI gali analizuoti kelis mėginius per trumpą laiką, tačiau peptidų surišimo atkuriamumas (todėl vėlesnė MS analizė) atrodo menkas. 10 Imties tvarkymas, SELDI nustatymai ir duomenų analizė turi būti griežtai kontroliuojami. Be to, ruošimo metu pašalinama didelė dalis biologinio mėginio, todėl analizuotų duomenų rinkinių palyginimas su skirtingais paviršiais ar skirtingomis paruošimo sąlygomis yra ribotas.

Kapiliarinė elektroforezė-MS

Kapiliarinė elektroforezė (CE) atskiria baltymus vienu žingsniu pagal jų elektroforezinę migraciją per buferiu užpildytą kapiliarą. Vėliau atskirti baltymai aptinkami masės spektrometru. „CE-MS“ pranašumas, palyginti su kitais metodais, yra tas, kad užtikrina greitą atskyrimą ir didelę skiriamąją gebą, vietoj brangių LC kolonų naudoja nebrangius kapiliarus ir yra suderinamas su dauguma buferių ir analitų. 11 CE-MS suteikia galimybę generuoti palyginamus didelės skiriamosios gebos duomenų rinkinius, leidžiančius greitai išanalizuoti didelį kiekį biologinių mėginių. Santykinis kiekybinis įvertinimas naudojant labai gausius, vidinius, be žymenų esančius peptidus kaip referencijas, suteikia panašų tikslumą, palyginti su stabiliais izotopų žymėtų peptidų etalonais. 12 Kaip ir LC, CE trūkumas yra tas, kad jis nėra idealiai tinkamas didelių baltymų analizei, kurie turi būti pašalinti ultrafiltracija prieš atliekant CE-MS analizę. 13

Pasirinktas reakcijos stebėjimas

Pasirinktas reakcijos stebėjimas yra analizė, kurią atliekant analizei nustatomas MS. 14 Pasirinkta reakcijos stebėsena naudoja jonų suskaidymą trigubo kvadrupolio masės spektrometru, kad padidėtų selektyvumas ir leidžia kiekybiškai įvertinti baltymus keliuose mėginiuose net labai sudėtiniuose mišiniuose. Atrankiniam kiekybiniam įvertinimui tikslinis pirmtako jonas ir vienas jo fragmentų (perėjimų) yra parenkami pirmojo ir trečiojo keturkojų ir laikui bėgant stebimi. Antrasis kvadrupolis suteikia susidūrimo suskaidymą, o kartu išsiskiriantys fono jonai filtruojami. Priešingai nei kiti MS pagrįsti proteomikos metodai, užrašomi tik siauri masės langai, o ne visos masės spektrai. Santykinis kiekybinis įvertinimas be etikečių gali būti atliekamas remiantis absoliučiu atskirų mėginių signalo intensyvumu. Kaip alternatyva, kiekybinis įvertinimas taip pat gali būti pagrįstas tiriamųjų mėginių santykiniu intensyvumu, palyginti su vidiniu etalonu, paženklintu stabiliais izotopais.

Pasirinktoje reakcijos stebėsenoje derinamas didelis analitės selektyvumas, žemos aptikimo ribos ir didelis pralaidumas. Tačiau sinchroninė kelių analitų analizė išlieka sudėtinga. 15

Baltymų mikrotraumos

Baltymų mikrorajonai aptinka specifinius baltymus, remdamiesi ne MS pagrįsta metodika. „Tikslinis“ metodas atspausdina specifinius antikūnus ar antigenus ant atraminės membranos medžiagos, kad imunohistochemijos būdu būtų galima įvertinti daugybę baltymų.

Hibridizavus matricą, analitės aptinkamos imobilizuotų antigenų ar antikūnų pagalba. Dėl poreikio aptikti sudėtinius mišinius, kuriuose yra labai mažai baltymų, buvo sukurtos jautrios, realaus laiko ir daugybinės aptikimo platformos, naudojant fluorescencinius, chemiliuminescencinius ar radioaktyvius izotopus, taip pat naujausi pasiekimai, įskaitant kvantinius taškus, aukso nanodaleles ar dažus -apdorotos nanodalelės. 16 Nors neseniai buvo rasta vis daugiau paraiškų, tačiau reikalavimas dėl labai specifinio kiekvieno analitės zondo riboja galimybę greitai ir efektyviai ištirti tūkstančius baltymų vienu metu.

Proteominiai tyrimai su gyvūnų modeliais

Eksperimentinis darbas iš Thongboonkersd ir kt. 17 ištyrė inkstų proteomą žiurkėms, kurioms pasireiškė epizodinė arba ilgalaikė hipoksija. Epizodinė hipoksija yra obstrukcinės miego apnėjos, būklės, susijusios su sistemine hipertenzija, požymis. Gyvūnams, kuriems pasireiškė protarpinė hipoksija, buvo 2-DE inkstų baltymų raiškos pokyčiai, rodantys sutrikusią kraujagyslių išsiplėtimą ir kraujagyslių hipertrofiją. Gyvūnų, kuriems pasireiškė nuolatinė hipoksija, baltymai, priešingai, parodė savybes, atitinkančias kompensuojamąjį kraujagyslių išsiplėtimą ir kraujagyslių rekonstravimą, padedantį užkirsti kelią hipertenzijos išsivystymui. Šis tyrimas iliustruoja proteomikos naudojimą siekiant išsiaiškinti specifinių hipertenzijos formų patofiziologiją gerai kontroliuojamomis sąlygomis.

Jin ir kt. 18 pacientų naudojo 2D CE-MS, norėdami ištirti baltymų ekspresiją kairiojo skilvelio miokardo sergant spontaniškai hipertenzinėmis ligomis, ir kontroliavo Wistar Kyoto žiurkes, norėdami ištirti kairiojo skilvelio hipertrofiją. Jie pranešė apie 13 baltymų, kurie diferencijuotai ekspresuojami gyvūnams, sergantiems hipertenzija iki hipertenzijos pradžios. Šie baltymai apėmė α-enolazę ir laktato dehidrogenazę B, du svarbius glikolizės fermentus, taip pat baltymus, kurie, kaip žinoma, yra susiję su mitochondrijų oksidantų fosforilinimu, oksidaciniu stresu ir ląstelių energijos metabolizmu. Lee ir kt. 19 pranešimų apie 2D CE-MS naudojimą tiriant baltymų ekspresijos profilius lygiajame aortos raumenyje. Jie pranešė apie septynis baltymus, kurie buvo diferencijuoti tarp spontaniškai hipertenzinių ir „Wistar Kyoto“ gyvūnų, įskaitant sumažintą dihidropteridino reduktazės (DHPR) ekspresiją, kuri yra susijusi su tetrahidrobiopterino (BH4) regeneracija ir dalyvauja kuriant kraujagyslių oksidacinį stresą. Delbosc ir kt. 20 skyrė mažų dozių nitro-L-arginino, azoto oksido blokatorių, kaip hipertonijos pavyzdį Fišerio ir Rudo Norvegijos žiurkių padermėse. Fišerio žiurkėms, reaguojant į nitro-L-arginino skyrimą, buvo didesnė hipertenzijos išsivystymo rizika nei rudosioms Norvegijos žiurkėms. Ištyrus paveiktų gyvūnų proteomą nuo aortos, nustatyta skirtinga keturių peptidų ekspresija: ubikvitinas, SMS22α, timosinas β-4 ir filamino A C galinis fragmentas.

Yra didžiulis potencialas naudoti proteomikos strategijas tiriant konkrečių manipuliacijų ar konkrečių modelių poveikį. Šie tyrimai yra pavyzdžiai, tačiau papildomas potencialas slypi genetiškai manipuliuotų modelių 21 arba įgimtų modelių 22 tyrimuose, kuriuose ribotas skaičius genų yra atsakingi už fenotipo pokyčius, o baltymo skaidymas gali būti ne toks sudėtingas.

Su hipertenzija susijusių ligų tyrimai su žmonėmis

Senėjimas

Hipertenzija tampa įprasta ilgėjant amžiui, o įžvalgą apie senėjimo poveikį kraujagyslėms galima sužinoti ištyrus proteomą. Norėdami tai išsamiau ištirti, Zürbig ir kt. 23 ištirti 324 sveikų asmenų, sergančių CE-MS, šlapimas, kurio amžius svyravo nuo 2 iki 72 metų. Reikšmingi su amžiumi susiję peptidų pokyčiai įvyko 325 iš 5000 tirtų šlapimo peptidų. Buvo didelis persistengimo, susijusio su senėjimu, ir tų, kurie siejami su įvairiomis lėtinės inkstų ligos formomis, sutapimai. Šie atradimai leido manyti, kad proteolitinio aktyvumo pasikeitimas ir sumažėjusi tarpląstelinės matricos apykaita gali būti siejama su kraujagysliniu senėjimo poveikiu. Tolesnis darbas parodė, kad telomerų disfunkcija, kuri riboja ląstelių dauginimosi galimybes ir yra susijusi su normaliu žmogaus senėjimu bei lėtine liga, gali būti nustatyta naudojant proteominius tyrimus su telomerazės išmuštos pelės kaulų čiulpų ląstelių kultūros supernatantu. 24

Vainikinių arterijų liga

Naudodamiesi CE-MS technologija, Zimmerli ir kt. 25 pranešė apie 15 šlapimo peptidų rinkinį, kuris apibūdino būdingą CAD parašo skydą, kurio jautrumas buvo 98%, o specifiškumas - 83%. Šiame tyrime dalyvavo pacientai, sergantys sunkia širdies liga, atliekant koronarinę angiografiją, lyginant juos su akivaizdžiai sveikomis kontrolinėmis grupėmis. Tolesniame von zur Mühlen ir kt. Tyrime . , 26, kuris atspindėjo „tikrovės“ situaciją, su kuria susiduria gydytojai, ištirta pacientų, sergančių ūminiu krūtinės skausmu, šlapimo ir plazmos proteomika bei širdies ir kraujagyslių sistemos rizikos veiksniai; visiems pacientams vėliau buvo atlikta koronarinė angiografija, kad būtų patvirtinta arba pašalinta reikšminga CAD. Naudodami 17 peptidų derinį, diagnozavus CAD diagnozę buvo 81% jautrumas ir 92% specifiškumas. Dauguma šiuose tyrimuose nustatytų šlapimo peptidų, susijusių su CAD, atsirado iš kolageno, atspindint jo svarbiausią vaidmenį aterosklerozės patofiziologijoje. Plazmos proteomika tiksliai neišsiskyrė tarp pacientų, sergančių CAD ir nuo tų, kurie galbūt nesusiję su latentinės proteazės aktyvumu plazmoje. 3

Inkstų liga

Pacientų, sergančių lėtine inkstų liga ankstyvoje ligos stadijoje, nustatymas ir ankstyvas specifinių inkstų ligų diagnozavimas, nereikalaujant inkstų biopsijos, yra dar viena klinikinių tyrimų sritis, nagrinėjama proteomų analizės būdu. Šlapimo proteomika yra ypač tinkama inkstų ligai nustatyti. Iš sveikų asmenų išskiriamų 150 mg baltymų per dieną 70% baltymų yra gaunama iš inkstų, 30% - iš plazmos. Iki šiol šlapimo proteomikos tyrimais buvo nustatyti specifiniai su liga susijusių šlapimo peptidų modeliai, susiję su IgA susijusia nefropatija, ureteropelvinės sankryžos obstrukcija, vilkligės nefritu ir anti-neutrofilų citoplazminiais antikūnais, susijusiais su vaskulitu. Taip pat aprašyti peptidų modeliai, būdingi diabetinei nefropatijai, kurie gali numatyti diabetinės nefropatijos išsivystymą prieš nustatant mikroalbuminuriją. 28

Insultas

Nors pacientų, kuriems įtariamas insultas, vaizdavimas atliekant KT skenavimą ir susiję būdai yra pagrindinis dalykas, tikslių insulto biomarkerių identifikavimas galėtų būti naudingas centruose, kuriuose yra ribota galimybė naudotis neurovaizdžiais, identifikuojant mažus infarktus, kurie nerodomi vaizduojant. ir skiriasi nuo kitų patologijų, įskaitant migreną.

Tačiau atlikus hipertenzijos tyrimus, proteominiai galvos smegenų kraujagyslių ligos tyrimai iš esmės apsiribojo gyvūnų modeliais, įskaitant spontaniškai hipertenzinę žiurkę, kuriai būdingas insultas. 29 Apie vieną žmonių tyrimą pranešė Cuadrado ir kt. , 30, kurioje buvo lyginami šešių pacientų, patyrusių bendrą priekinės kraujotakos insultą ir užfiksuotą vidurinę smegenų arterijos okliuziją, smegenų pavyzdžiai iš trijų kontrolinių asmenų, mirusių dėl neneurologinių priežasčių. Diferencialinė gelio elektroforezė buvo naudojama tiriant diferencinę baltymo raišką. Infarkto branduolių mėginiuose sumažėjo baltymų, dalyvaujančių metabolizme ir biosintezėje, kiekis, tuo tarpu infarktuose buvo didesnis fibrinogeno, albumino ir baltymų, dalyvaujančių imuniniame atsake, pavyzdžiui, komplemento aktyvavimo žymenų, kiekis. Nors akivaizdžiai post-mortem pokyčiai galėjo pakeisti baltymų ekspresiją, šie ir kiti tyrimai gali padėti nustatyti naujus biologinių žymenų ir terapinių taikinių vystymosi kelius.

Montaner ir kt. 31 ištyrė 12 plazmos biomarkerių grupę, iš kurių S100 kalcį rišantis baltymas (S100B) ir tirpūs pažengusių gliukacijos galutinių produktų receptoriai tiksliai atskyrė išeminį ir hemoraginį insultą. Dayonas ir kt. 32 ištirtas smegenų tarpląstelinis skystis pacientams, sergantiems piktybiniais vidurinių smegenų arterijų infarktais. Autoriai, norėdami nustatyti skysčių ir 1D gelio elektroforezės / matricos pagalba lazerio desorbcijos / jonizacijos laiko skrydžio MS, naudojo smegenų mikrodializės kateterius, kad nustatytų baltymų, išreikštų infarkto šerdyje, penumbroje ir smegenų pusėse, skirtumus. Infarkto šerdyje ir penumbroje, lyginant su priešingomis smegenimis, buvo pastebėti 53 skirtingų baltymų raiškos skirtumai, įskaitant glialinės fibrozinės rūgšties baltymą, mielino bazinį baltymą ir S100B - visus biomarkerius, apie kuriuos anksčiau pranešta ūminio insulto metu.

Preeklampsijos proteominiai tyrimai

Preeklampsijos ir nėštumo sukelta hipertenzija yra specifinės hipertenzijos formos, turinčios keletą esminės hipertenzijos bruožų. Manoma, kad ligą sukelia sudėtinga uždegimo, oksidacinio streso ir kitų dar nežinomų besivystančios placentos veiksnių sąveika ir netinkama motinos reakcija, kuriai būdinga endotelio disfunkcija. 34 Nors paveiktų moterų kraujospūdis normalizuojasi po gimdymo, šiai būklei būdingi keli rizikos veiksniai ir patofiziologiniai hipertenzijos mechanizmai. Be to, moterims, kenčiančioms nuo preeklampsijos, yra didesnė rizika vėliau išsivystyti hipertenzijai, širdies ligoms ir insultui. 33

Inkstų patologija yra vienas iš preeklampsijos požymių, gali būti, kad proteominė šlapimo analizė padės nustatyti naujus patofiziologinius mechanizmus. Vienas iš tokių tyrimų pranešė apie šlapimo proteomikos naudojimą preeklampsijoje. Buhimschi ir kt. 35 tyrė 284 moterų šlapimą, iš kurių 88 buvo išsivystę preeklampsija. Šlapimo mėginiai buvo paimti ligos pradžioje; preeklampsijos proteominiai profiliai buvo sukurti naudojant SELDI, o peptidai buvo identifikuoti naudojant tandemą MS. Tuomet preeklampsijos proteominis profilis buvo patvirtintas atskiroje 225 nėščių moterų grupėje ir palygintas su kitais ligos sunkumo žymenimis, įskaitant albumino ir kreatinino santykį. Preeklampsijos proteominis parašo profilis daugiausia buvo apibūdinamas serpin peptidazės inhibitoriaus (SERPINA) 1 ir albumino fragmentais. SERPINA1 yra gausus baltymas plazmoje, kuris slopina neutrofilų elastazės, tripsino ir kasos elastazės veiklą. Taigi šis darbas parodė, kad šlapimo proteominis „pirštų atspaudas“, sudarytas iš SERPINA1 ir albumino fragmentų, gali diagnozuoti preeklampsiją ir gali atskirti sunkias ligos formas nuo švelnesnių variantų.

Neseniai pranešėme apie tyrimą, kuris buvo skirtas nustatyti peptidų biomarkerių modelius, kad būtų galima numatyti preeklampsiją prieš pradedant kliniškai aptinkamą ligą. 36 Palyginę sveikas nėščias moteris su sveikomis nėščiosiomis, mes sugebėjome nustatyti 284 baltymų, kurie pakito įprasto nėštumo metu, CE-MS šlapimo peptidų modelį. Vėlesniame etape mes panaudojome šiuos peptidus, kad palygintume preeklampsiją išsivysčiusias moteris su normotenzinio nėštumo moterimis ir galėjome nustatyti biomarkerio modelį, sudarytą iš 50 peptidų, kuris tiksliai prognozuoja preeklampsiją 28 nėštumo savaitę, gerai iki hipertonijos ir proteinurijos, būdingos būklei, pradžios. Pirmojo nėštumo trimestro metu mes negalėjome aptikti tokių peptidų modelių. Susidomėjimas buvo tas, kad peptidai, aptinkami ikiklampinių moterų šlapime, pasižymėjo fibrinogenu, kolageno fragmentais ir uromodulinu, rodančiais pagrindinį endotelio vaidmenį ligos vystymesi.

Vieną tyrimą, kuriame motinos serumas buvo naudojamas ištirti preeklampsijos paveiktų moterų proteomą, pranešė Watanabe ir kt. 37 2-DE buvo naudojamas motinos serumui tirti iš šešių pacientų, kuriems nustatyta preeklampsija, susijusi su vaisiaus augimo ribojimu, ir šešių panašių moterų, turinčių normalų nėštumą. Tada, naudojant matricinę lazerio desorbciją / jonizacijos laiką MS ir Western blot analizę, buvo identifikuotos per daug išryškėjusios 2-DE dėmės. Taikant šiuos metodus, buvo nustatyta, kad moterys, kurių organizme nebuvo atlikta erekcijos, per daug ekspresuoja klasteriną - baltymą, kuris skatina cholesterolio nutekėjimą iš lipidų apkrautų makrofagų ir yra susijęs su kraujagyslių ligomis, inkstų ligomis ir oksidaciniu stresu. Šie atradimai buvo patvirtinti atskiroje grupėje, kurioje dalyvavo 80 moterų, kuriems nebuvo atlikta eklampsija.

Tolesni proteominiai tyrimai atlikti su plazma. Vieną tyrimą, kuriame buvo naudojami 2-DE metodai baltymų atskyrimui, pateikė Wang ir kt. , 38 tyrė plazmą 11 moterų, sergančių preeklampsija ir 11 normaliosios terapijos kontrolinių grupių. Naudodami MS peptidams identifikuoti, jie sugebėjo parodyti reikšmingą H-ficolino ir L-ficolino ikiklamptinių moterų sumažėjimą - veiksnius, kurie, kaip manoma, vaidina įgimtą imunitetą. Naujausiame tyrime buvo naudojama 2D diferencialinė gelinė elektroforezė, siekiant ištirti plazmos proteomą 20 nėštumo savaitės metu 27 moterų grupėje, kurioms pasireiškė preeklampsija kartu su tinkamai užaugintais kūdikiais, 12 moterų, kurioms pasireiškė preeklampsija kartu su vaisiaus augimu. apribojimas ir 57 kontrolieriai, turėję normalų nėštumą. 39 Po tripsinavimo dominančios baltymų dėmės buvo identifikuotos naudojant LC-MS. Autoriai nustatė, kad 36 vidutinio ar didelio baltymų baltymai buvo diferencijuotai ekskrementuojami moterims prieš 20 savaičių iki klinikinės ligos pradžios.

Apribojimai ir perspektyva

Vienas iš galimų proteominių technologijų apribojimų yra tas, kad dar nėra iki galo išaiškintas visiškas veiksnių, tokių kaip senėjimas, ligos, lytis ir etninė priklausomybė, proteomas. Tačiau tampa akivaizdu, kad proteomika gali būti taikoma specifinėmis sąlygomis, tokiomis kaip lėtinė inkstų liga. Norint gauti daugiau įžvalgos, bet taip pat sukurti ir patobulinti analizės metodus, reikia išsamesnių eksperimentinių modelių tyrimų, lygiagrečių su žmonėmis. Norint sukurti naujus proteomikos metodus, tinkančius įprastoms klinikinėms reikmėms, reikia tinkamų mėginių, atspindinčių visą kliniškai reikšmingų sąlygų spektrą. Tyrimų metu mes kalibravome radinius, naudodamiesi „namų tvarkymo“ peptidų grupe, kuriai, atrodo, nedaro įtakos tokie veiksniai 12, tačiau jie gali būti neperduodami kitiems technologiniams metodams. Be to, siekiant išnaudoti visą šių metodų potencialą, atsižvelgiant į žmogaus proteomo biologinį kintamumą, labai svarbu, kad būtų integruoti duomenys iš proteominių technologijų.

Šiuo metu išlieka iššūkis integruoti informaciją apie biologinius žymenis iš įvairių proteominių strategijų, todėl norint patobulinti skirtingų strategijų palyginimą ar derinimą, reikės patobulinti analizę ir modeliavimą. Tikimasi, kad skirtingi metodai papildys vienas kitą, taip pat ir kitus metodus, tokius kaip genomika ir metabolomika. Kaip ir atliekant genomo tyrimus, proteomikos tyrimuose turės būti laikomasi griežtų taisyklių, kad būtų išvengta klaidingų (teigiamų ar neigiamų) rezultatų. Kitas svarbus proteominių tyrimų iššūkis yra vėlesnis įgyvendinimas klinikinėje praktikoje. Neseniai pasiūlytas klinikinio įgyvendinimo planas 40 žada, kad netrukus galime pamatyti proteomiką klinikinėje medicinoje.