Chromosomų konformacijos gavimo tyrimų kiekybinė analizė (3c-qpcr) | gamtos protokolai

Chromosomų konformacijos gavimo tyrimų kiekybinė analizė (3c-qpcr) | gamtos protokolai

Anonim

Anotacija

Chromosomų konformacijos fiksavimo (3C) technologija yra novatoriška metodika, leidžianti ištirti in vivo genomo organizaciją masteliu, apimančiu nuo kelių dešimčių iki kelių šimtų kilobazių porų. Suprasti tokio masto genomo sulankstymą yra ypač svarbu žinduoliams, kurių genų reguliavime yra išsklaidyti reguliavimo elementai, pavyzdžiui, stiprikliai ar izoliatoriai. 3C technologija apima formaldehido fiksavimą ląstelėse, o po to - polimerazės grandinine reakcija (PGR) pagrįstą analizę, kai dažnis pasirinktų DNR fragmentų yra susietas ląstelių populiacijoje. Norint tiksliai išmatuoti sukryžiavimo dažnius, reikia geriausių kiekybinių įvertinimo metodų. Neseniai pritaikėme realaus laiko „TaqMan“ PGR technologiją 3C tyrimų analizei, gaudami metodą, kuris tiksliau nustato kryžminimo dažnius nei dabartinės pusiau kokybinės 3C strategijos, kurios remiasi etido bromidu dažytų PGR produktų, atskirtų geliniu elektroforeze, intensyvumu. Pateikiame išsamų šio metodo protokolą, kurį mes pavadinome 3C-qPCR. Atlikus išankstinę kontrolę ir optimizavimą, visa procedūra (3C tyrimai ir kiekybinė analizė) gali būti atlikta per 7–9 dienas.

Įvadas

Įžvalga apie genominę organizaciją yra labai svarbi norint suprasti žinduolių genų reguliavimą. Tačiau dėl techninių apribojimų mes vis dar turime menką supratimą apie tai, kaip žinduolių genomas yra struktūrizuotas in vivo tokiu mastu, kokiu dažniausiai vyksta ilgalaikė fizinė genų ir dispersinių reguliavimo elementų sąveika (1–10 3 kbp). Naujausi „Asocijuotų baltymų žymėjimo ir atstatymo“ 1 ir 3C (žr. 2 nuorodą) tyrimai sukūrė pirmąjį žvilgsnį į šį lemiamą genomo organizmo lygmenį 3, 4, 5 . Tačiau RNR-TRAP metodas, pagrįstas peroksidazės aktyvumo nukreipimu į besiformuojančius nuorašus, apsiriboja fizine sąveika, vykstančia su aktyviai transkribuotais genais, o 3C tyrimai potencialiai leidžia nustatyti fizinę sąveiką tarp bet kurių chromatino segmentų. „3C“ technologija ypač tinka identifikuoti chromatino kilpas, susidariusias genominiuose regionuose, kurių dydis yra iki kelių šimtų kilobazių. „5C“ technologija 6, 7 siūlo patikimą didelio pralaidumo alternatyvą šiai analizei, pagrįstą didelio masto sekų sudarymu ar mikrotraumos analize. Vis dėlto 5C įrengti yra sunkiau. Norėdami nustatyti DNR segmentus, kurie sąveikauja didesniais atstumais nei keli šimtai kilobazių, mes rekomenduojame naudoti 4C technologiją 8, 9, 10, 11, leidžiančią DNR elementų, kurie sąveikauja su pasirinkta genomo vieta, ekrano objektyvą visame objekte.

3C technologijos 2 principas (1 pav.) Grindžiamas sąveikaujančių chromatino segmentų kryžminimu formaldehidu, po kurio vyksta restrikcinis skaidymas ir sujungtų fragmentų sujungimas į vidinę molekulę. Vėliau ligacijos produktai analizuojami PGR, naudojant pradmenis, būdingus dominantiems restrikcijos fragmentams. Tai, kad aptiktas jungimo produktas tarp dviejų segmentų, nėra daug ką parodyta. Norint nustatyti chromatino kilpą tarp dviejų segmentų, reikia įrodyti, kad jie sąveikauja dažniau tarpusavyje, nei su kaimyniniais DNR fragmentais. Taigi prasminga 3C analizė kritiškai priklauso nuo tikslaus įvairių ligavimo produktų kiekybinio įvertinimo, o tam, savo ruožtu, reikia atlikti matavimus, kai DNR amplifikacijos reakcija yra tiesiniame diapazone.

Image

a ) 3C tyrimų principas (pritaikytas, gavus Dekker ir kt . leidimą, 2 ). 3C tyrimai apima tris pagrindinius etapus: 1 pakopa: sąveikaujantys chromatino segmentai yra kryžminami, apdorojant formaldehidu; 2 pakopa: DNR yra suardoma atitinkamu restrikcijos fermentu; ir 3 pakopa: sujungti fragmentai sujungiami intramolekuliniu būdu ir gaunami jungimo produktai, kuriuos kiekybiškai įvertina qPCR. ( b ) „TaqMan“ zondo ir qPCR pradmenų projektavimas. Pastovaus fragmento (juodas segmentas) ir kandidatų sąveikaujančių fragmentų (raudonos, mėlynos, žalios ir rausvos spalvos segmentai) vietos yra pavaizduotos viršutinėje paveikslo dalyje. Apribojimų vietos, kurios bus naudojamos atliekant 3C tyrimą, pavaizduotos kaip mažos vertikalios juostos mėlynos spalvos. Taip pat pavaizduotos zondo „TaqMan“ (Q - F) ir bandymo pradmenų (juodosios rodyklės T1 – T4), kurie bus naudojami qPCR kiekybiškai įvertinti, santykinės padėtys. „TaqMan“ zondas turėtų būti suprojektuotas ant antisezinės grandinės, nukreiptos į „Constant“ gruntą (juoda rodyklė C), tačiau tame pačiame restrikcijos fragmente, kaip pavaizduota paveiksle. PGR pailginimo etapo metu Taq DNR polimerazės 5′ – 3 ′ egzonukleazinis aktyvumas skaido zondą ir atpalaiduoja fluoroforą iš gesintojo, tokiu būdu sukurdamas fluorescencinį signalą, kuris yra griežtai būdingas atitinkamų ligavimo produktų amplifikacijai. T, bandymo gruntas; F, fluoroforas; Q, gesintojas.

Visas dydis

Tradiciniuose 3C eksperimentuose visų skirtingų ligacijos produktų analizei naudojamas standartinis PGR protokolas, kuriame naudojamas standartinis PGR ciklų skaičius ir standartinis DNR šablono kiekis. Tada kiekiai apskaičiuojami išmatuojant etidio bromidu dažytų PGR produktų, atskirtų gelio elektroforeze, intensyvumą. Šis pusiau kokybinis metodas yra linkęs pateikti netikslius duomenis, nes ne visada matavimai bus atliekami, kai DNR amplifikacijos reakcija yra tiesinėje srityje.

„TaqMan“ kiekybinė PGR technologija 12, 13, 14 suteikia tikslesnius matavimus ir neseniai buvo naudojama analizuoti aukštesnės eilės chromatino struktūrą pelės HoxB1 (žr. Nuorodą 10), α-globino 15 ir β-globino lokusus 16 naudojant čia aprašytą protokolą. . „TaqMan“ technologija naudoja lokusui būdingą oligodeoksinukleotido zondą, modifikuotą jo 5 ′ ir 3 ′ galuose atitinkamai fluoroforu ir gesintuvu. PGR pailginimo etapo metu Taq DNR polimerazės 17 5′ – 3 ′ egzonukleazinis aktyvumas skaido zondą ir atpalaiduoja fluoroforą iš gesintojo (1 pav.), Taip sukurdamas fluorescencinį signalą, kuris kiekybiškai įvertinamas kiekviename PGR cikle. 12, 13 . Pastarasis leidžia visada matuoti linijinio stiprinimo diapazono metu. Kiekybiniai įvertinimai atitinka „slenkstinį ciklą“ (Ct), kuris nustatomas kuo arčiau eksponentinės fazės pagrindo, apibrėžiant pradinę liniją, kad būtų pašalintas fonas, esantis ankstyvuosiuose amplifikacijos cikluose. Čia paaiškiname, kaip „TaqMan“ technologija gali būti naudojama kiekybinėje analizėje, naudojant ligavimo produktus, gautus naudojant 3C procedūrą. Mes šią strategiją vadiname 3C-qPCR. Be to, mes pateikiame išsamų 3C DNR šablonų, paruoštų iš pelės audinių, paruošimo 3C DNR šablonus, kurie vėliau gali būti naudojami kiekybinei (arba pusiau kiekybinei) PGR analizei gauti. Norint paruošti 3C šablonus iš kitų šaltinių, gali reikėti toliau pateikto metodo pakeitimų.

Eksperimentinis dizainas

Pasiruošimas prieš 3C tyrimus, kaip aprašyta žemiau, yra sunkiausia ir daug laiko atimanti procedūros dalis. Tai taip pat yra kritinė procedūros dalis, nes technikos skiriamoji geba ir jautrumas labai priklauso nuo jos eksperimentinio projekto.

Restrikcijos fermento pasirinkimas

Restrikcijos fermentas turėtų išpjaustyti lokusą taip, kad būtų galima atskirai analizuoti susijusius reguliavimo elementus (genų kūnus, promotorius, stipriklius, izoliatorius ir kt.). Analizuojant mažų lokusų (<10–20 kb) topologiją, reikia naudoti dažnai pjaustančius restrikcijos fermentus, tokius kaip Dpn II ar Nla III (4 bazių pjaustytuvai). Analizuojant didesnius lokusus, taip pat gali būti naudojami 6 bazių pjaustytuvai, tokie kaip Eco RI, Bgl II ar Hin dIII. Rekomenduojami fermentai, sukuriantys rišlius galus, nes neryškūs galai neleidžia veiksmingai liguoti (PROCEDŪROS 13 žingsnis). Restrikcijos fermentai, jautrūs DNR metilinimui, neturėtų būti naudojami, nes jie gali į analizę nukreipti paklaidas dėl analizuojamų restrikcijos vietų virškinimo efektyvumo skirtumų. Norint patikimai įvertinti kiekį, pasirinktinai gali būti atliekamas papildomas suskaidymo produktų suskaidymas kitu restrikcijos fermentu; tai turėtų padėti sumažinti galimą PGR paklaidą dėl šablono prieinamumo skirtumų 15 (žr. 1 langelį). Akivaizdu, kad atitinkamos restrikcijos vietos (EcoRI 1 langelio pavyzdyje) neturėtų būti PGR amplikonuose, kurie bus naudojami ligavimo produkto kiekybiniam įvertinimui. Todėl šis papildomas restrikcijos fermentas turėtų būti pasirinktas projektuojant PGR pradmenis, naudojamus kiekybiškai įvertinti. Taigi išankstinė sąlyga yra patikimos lokuso, turinčio tiriamus biologinius pavyzdžius, genomo seka.

Šis papildomas suskaidytos DNR skaidymas gali padėti sumažinti galimą PGR paklaidą, kurį gali sukelti ribotas šablono prieinamumas 20 . Žemiau pateiktame pavyzdyje mes panaudojome „ Eco RI“, tačiau galima naudoti bet kurį tinkamą restrikcijos fermentą ir buferį (žr. Skyrių „Eksperimento dizainas“).

  1. Į 34 žingsnio mėginį įpilkite 28 μl dH 2 O ir 20 μl 1 × Eco RI buferio (komercinis 10 × buferis, skirtas Eco RI (ar bet kuriam kitam pasirinktam restrikcijos fermentui) praskiesti vandenyje).

  2. Mėginys įdedamas į 1, 5 ml mėgintuvėlį ir įpilama 2 μl 50 U μl −1 Eco RI fermento (100 U galutinis).

  3. Inkubuokite 2 valandas 37 ° C temperatūroje.

  4. Įpilkite 200 μl fenolio – chloroformo ir stipriai išmaišykite.

  5. Centrifuguokite 5 minutes kambario temperatūroje (18–22 ° C) 16 100 g .

  6. Supernatantas perpilamas į naują mėgintuvėlį ir įpilama 20 μl 2 M natrio acetato, kurio pH 5, 6, tada 0, 5 ml etanolio.

  7. Sumaišykite ir padėkite –80 ° C temperatūroje, kol užšaltų (apie 45 min.).

  8. Centrifuguokite 20 min., Esant 16 100 g, esant 4 ° C.

  9. Nuimkite supernatantą ir įpilkite 200 μl 70% etanolio.

  10. Centrifuguokite 4 min., Esant 10000 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  11. Nuimkite supernatantą ir išdžiovinkite nuosėdas kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  12. Resuspenduokite nuosėdas į 150 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5.

  13. Tęskite nuo pagrindinės procedūros 35 veiksmo.

„TaqMan“ zondo dizainas

Remdamiesi genomo DNR kiekiu, reikalingu ligacijos produktams aptikti, mes apskaičiavome, kad kai kurie lokusui būdingi ligavimo atvejai gali pasireikšti tik 1/2 000–1 / 20 000 žinduolių ląstelėse. Todėl patikimas ligavimo produktų kiekybinis įvertinimas yra įmanomas tik tuo atveju, jei į kiekvieną PGR pridedama daug DNR (ty daug genomo ekvivalentų); mes paprastai naudojame 50–200 ng 3C šablono (nuo ∼ 8 × 10 4 iki 3 × 10 5 genomo ekvivalentai) vienam PGR. Kadangi tokie dideli DNR kiekiai neleidžia naudoti „Syb R Green“ inkorporacijos kaip PGR produktų kiekybinio įvertinimo 4, norint nustatyti kiekius realaus laiko PGR reikia labai specifinės „TaqMan“ chemijos. 3C analizė nustato ligacijos produktus, susidarančius sujungiant „pastovų fragmentą“ su kandidatais sąveikaujančiais lokuso fragmentais. Šiems ligacijos produktams įvertinti reikia „TaqMan“ zondo ir „pastovaus pradmens“ (C), esančių „pastoviame fragmente“, kartu su „bandymo pradmenų“ (T), suprojektuoto kandidatuose sąveikaujančiuose fragmentuose, baterija. Norint efektyviai amplifikuoti ligavimo produktus, amplikonas turi būti mažas, todėl tiriamieji pradmenys turėtų būti suprojektuoti taip, kad hibridizuotųsi kuo arčiau ir, pageidautina, per 50 bp nuo dominančių restrikcijos vietų. „TaqMan“ zondas ir „nuolatinis gruntas“ taip pat turėtų būti suprojektuoti kuo arčiau atitinkamos restrikcijos vietos ir, svarbiausia, jie turėtų hibridizuotis su priešingomis „nuolatinio fragmento“ 16 sruogomis. Dėl šios konfigūracijos gaunamas fluorescencinis signalas, griežtai būdingas analizės būdu parinkto ligavimo produkto amplifikacijai (žr. 1 pav.). Kadangi „TaqMan“ zondas yra sukurtas hibridizuotis nuolatiniame fragmente, šis zondas gali būti naudojamas visų produktų, susietų su „pastoviu fragmentu“, kiekybiniam įvertinimui. Išsamesnę informaciją apie grunto ir zondo dizainą galite rasti skyriuje REAGENTO NUSTATYMAI.

Kontrolės šablono / grunto efektyvumas

Kontrolės šablonas, kuriame vienodi kiekiai yra visi ligavimo produktai, naudojamas siekiant optimizuoti realaus laiko PGR ir nustatyti minimalų ligavimo produkto kiekį, kurį vis dar galima patikimai įvertinti. PGR kontrolės šablonui mes rekomenduojame naudoti vieną bakterinės dirbtinės chromosomos (BAC) kloną, apimantį tiriamą genomo segmentą. Kaip alternatyva, galėtų būti naudojamas minimaliai sutampančių BAC klonų, sumaišytų lygiaverčiais kiekiais, rinkinys 18, 19 . Tada šis BAC supjaustomas pasirinktu restrikcijos fermentu (pvz., Hin dIII) ir pakartotinai sujungiamas T4 DNR ligaze. Antrinis restrikcijos fermentas (pvz., EcoRI) gali būti naudojamas DNR ratams linearizuoti, o tai gali kitaip paveikti pradmenų hibridizacijos efektyvumą 20 . Tuomet būtina atlikti šios reakcijos nuoseklųjį praskiedimą, kad būtų gautos standartinės kreivės, apimančios tą patį ligavimo produkto koncentracijos diapazoną, kaip ir tie, kurie bus gauti 3C mėginiuose. Norint imituoti 3C mėginio sąlygas, galutinė DNR koncentracija šiuose praskiedimuose sureguliuojama pagal DNR kiekį, naudojamą 3C mėginiuose (žr. PROCEDŪROS 38 veiksmą). Taigi, atsižvelgiant į naudojamo 3C mėginio kiekį, šie praskiedimai atliekami 50–200 ng genomo DNR tirpalu.

Eksperimentinė kontrolė

Norint gauti reikšmingus duomenis, reikia atlikti keletą kontrolių kiekvienam 3C mėginiui. Mėginio grynumas (35–37 žingsniai) ir virškinimo efektyvumas (2 langelis) turėtų būti atidžiai įvertinti, nes jie gali pakenkti tiksliam kiekybiniam įvertinimui. Galiausiai reikia atidžiai įvertinti atsitiktinių susidūrimų lygį, kad būtų galima atskirti santykinai dažną, bet nefunkcinę sąveiką nuo fiziologiškai svarbios sąveikos (žr. Skyrių ANTICIPUOTI REZULTATAI). 3C-qPCR duomenys, siekiant koreguoti kryžminimo ir virškinimo efektyvumo skirtumus tarp mėginių, yra normalizuojami, atsižvelgiant į „kontrolinės sąveikos dažnių“ rinkinį. Šiam tikslui mes įprastai naudojame ERCC3 geno lokusą (ekscizijos atkūrimo kryžminį papildymą graužikų atstatymo trūkumas, 3 papildymo grupė) - visur egzistuojančio geno. Kadangi šis genas yra ekspresuojamas labai panašiu lygiu visuose pelių audiniuose, laikoma, kad aukštesnės eilės chromatino architektūra šiame lokuse yra identiška ir gali būti naudojama 3C-qPCR duomenims normalizuoti (apie pradmenų sekas, naudojamas kartu su Hin dIII, žr. Splinter et al . 16 ).

Virškinimo efektyvumas turėtų būti atidžiai įvertinamas kiekvienoje analizėje dalyvaujančioje restrikcijos vietoje. Iš tikrųjų dėl dvigubo tam tikros vietos virškinimo efektyvumo sumažėjimo dvigubai sumažėja turimas tam tikro apribojimo galo kiekis, o tai paveiktų ligavimo produktų, kuriuos jis gali sudaryti, skaičių. Todėl virškinimo efektyvumas turėtų būti vienodas kiekvienoje dominančioje vietoje.

  1. Į kontrolinius alikvotus, išsaugotus 12 žingsnyje (UND) ir 14 (D), įpilkite 500 μl 1 × PK buferio ir 1 μl 20 mg ml – 1 PK (20 μg galutinio).

  2. Inkubuokite 30 minučių 65 ° C temperatūroje (arba per naktį 65 ° C temperatūroje, jei tai atliekama lygiagrečiai 22–34 veiksmams).

  3. Kelias minutes subalansuokite 37 ° C temperatūroje, tada įpilkite 1 μl 1 mg ml – 1 RNazės A (1 μg galutinio) ir inkubuokite 2 valandas 37 ° C temperatūroje.

  4. Įpilkite 500 μl fenolio – chloroformo, stipriai išmaišykite.

  5. Centrifuguokite 5 minutes kambario temperatūroje (18–22 ° C) 16 100 g .

  6. Supernatantas perpilamas į naują mėgintuvėlį ir įpilama 50 μl 2 M natrio acetato, kurio pH 5, 6, tada 1, 5 ml etanolio.

  7. Sumaišykite ir padėkite –80 ° C temperatūroje, kol užšaltų (apie 45 min)

  8. Centrifuguokite 20 min., Esant 16 100 g, esant 4 ° C.

  9. Nuimkite supernatantą ir įpilkite 500 μl 70% etanolio.

  10. Centrifuguokite 4 min., Esant 10000 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  11. Nuimkite supernatantą ir išdžiovinkite nuosėdas kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  12. Suspensiją iš naujo suspenduokite 60 μl vandens.

  13. Atlikite realiojo laiko PGR kiekybinius įvertinimus (Syb R Green) iš abiejų mėginių (UND ir D), naudodami qPCR sąlygas, aprašytas pagrindinės procedūros 38A žingsnio ii ir iii punktuose. Norėdami patikrinti virškinimo efektyvumą, naudokite pradmenų rinkinius, kurie sustiprina kiekvieną dominančią restrikcijos vietą (R); jie turėtų būti suprojektuoti taip, kaip aprašyta skyriuje REAGENTŲ NUSTATYMAS. Norėdami ištaisyti į PGR pridėto šablono kiekio skirtumus, taip pat PGR amplifikuokite kontrolinius regionus, kuriuose nėra dominančios restrikcijos vietos (naudokite „vidinius“ pradmenis, naudojamus pakraunant koregavimus, 38 veiksmas).

  14. Norėdami apskaičiuoti ribojimo efektyvumą pagal šią formulę, naudokite ciklo slenksčius (Ct vertės, ty PGR ciklų skaičius, reikalingas norint gauti ribinį PGR produkto kiekį).

    % apribojimas = 100−100 / 2 ^ ((Ct R - Ct C ) D - (Ct R - Ct C ) UND)

    ▴ KRITINIS ŽINGSNIS Restrikcijos fermento skaidymo efektyvumas turėtų būti didesnis nei 60–70%, bet idealiu atveju> 80% turėtų būti virškinamas. Mėginiai, kurių virškinimo efektyvumas mažesnis, turėtų būti išmesti.

Medžiagos

Reagentai

  • Pelės arba atitinkamos kultūrinės ląstelės

    Atsargiai

    Turi būti laikomasi patvirtintų darbo su gyvūnais taisyklių ir gairių.

  • 10% (v / v) FCS / DMEM

  • 10% (v / v) FCS / PBS

  • 0, 25% (m / t) tripsino

  • 37% formaldehido (tūris / tūris; 47629 Fluka)

    Atsargiai

    Formaldehidas yra toksiškas (žr. Medžiagos saugos duomenų lapą, pateiktą //www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/FLUKA/47629).

  • Glicinas, 1 M

  • Lizės buferis (10 mM Tris-HCl, pH 7, 5; 10 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0, 1 mM EGTA; 1 x pilnas proteazės inhibitorius; 11836145001 Roche)

    Kritinis

    • Kai kuriems ląstelių tipams reikalingas griežtesnis lizės buferis. Norėdami gauti papildomos informacijos, žiūrėkite „REAGENT SETUP“.

  • 2, 5% (m / t) 1 tipo kolagenazės (Sigma C0130)

  • 20% (m / t) natrio dodecilsulfato (SDS) (EU0460B Euromedex)

  • „Triton X-100“ (2327140 BDH chemikalai)

  • Aukštos koncentracijos restrikcijos fermentas (40 U μl −1 )

  • T4 DNR ligazė, aukštos koncentracijos (20 U μl −1 ; Promega)

  • 10 × ligavimo buferis (660 mM Tris-HCl, pH 7, 5; 50 mM DTT; 50 mM MgCl2; 10 mM ATP)

  • Ribonukleazė A (RNazė A), 1 mg ml −1

  • Proteinazės K (PK), 10 mg ml −1

  • PK buferis (5 mM EDTA, pH 8, 0; 10 mM Tris-HCl, pH 8, 0; 0, 5% SDS)

  • Kontroliniai PGR pradmenys, skirti įvertinti DNR skaidymo efektyvumą, būdingi vartotojui (žr. REAGENTO NUSTATYMAS)

  • Pirmyn ir atvirkščiai „vidiniai“ gruntai, skirti pritaikymo pakrovimui, atsižvelgiant į vartotoją (žr. REAGENTO NUSTATYMAS)

  • Pastovieji ir bandomieji PGR pradmenys, skirti 3C reakcijos kiekybiniam įvertinimui, atsižvelgiant į vartotoją (žr. REAGENTO NUSTATYMAS)

  • PGR pradmenys virškinimo efektyvumui nustatyti, skirti vartotojui (žr. REAGENTO NUSTATYMĄ)

  • PGR pradmenys, skirti nustatyti konkretaus vartotojo valdymo sąveikos dažnius (žr. REAGENTO NUSTATYMĄ)

  • „TaqMan“ zondas, skirtas konkrečiam vartotojui (žr. REAGENTO NUSTATYMAS ir Eksperimentinis dizainas)

  • „QuantiTect Probe PCR Master Mix“ (204343 Qiagen)

  • „QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix“ („Qiagen“) arba kaip aprašyta 14 nuorodoje

  • TE pH 8, 0 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 0; 1 mM EDTA)

  • Agarozė (A9539 Sigma)

Įranga

  • Mikrocentrifugu, pvz., Eppendorf 5415 D, rotorius F45-24-11 (1, 5 ml mėgintuvėliams)

  • „Eppendorf“ centrifuga 5810R (15 ir 50 ml „Falcon“ mėgintuvėliams).

  • „LightCycler“ aparatas („Roche“) ir „LightCycler Software“, versija 3.5 („TaqMan qPCR“ analizės buvo atliktos „F1 / F2“ režimu)

  • 40 μm ląstelių kamštis (352340 Falcon).

Reagento nustatymas

  • Ląstelių lizė Lizės buferio pasirinkimas priklauso nuo naudojamo audinio ar ląstelės tipo. Daugumai audinių pakaks aukščiau aprašyto lizės buferio. Jei ląstelės nėra tinkamai lizuojamos, gali būti naudojamas kitoks lizės buferis, kuriame yra NP-40 (10 mM Tris-HCl, pH 7, 5; 10 mM NaCl; 0, 2% NP-40; 1 x pilnas proteazės inhibitorius (11836145001 Roche)). Jei to nepakanka, gali būti įtrauktas papildomas šalinimo žingsnis, kaip aprašyta 5 trikčių šalinimo veiksme. Ląstelių dažymas metilgrün-pironinu ir jų peržiūra šviesos mikroskopu gali patvirtinti ląstelių lizę.

  • PGR pradmenų dizainas Visi šiame protokole naudojami PGR pradmenys paprastai turėtų būti 20–22 merai, kai T m yra 55–65 ° C diapazone, o skirtumas tarp visų pradmenų, naudojamų viename eksperimente, yra 2 ° C. Gruntai gali būti kuriami naudojant programinę įrangą, kurią galima rasti internete (pvz., //Frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). PGR pradmenys, naudojami virškinimo efektyvumui analizuoti, arba 3C tyrimai turėtų būti suprojektuoti arti (per 50 bp) restrikcijos vietai, naudojamai 3C tyrimams.

  • „TaqMan“ zondo dizainas Zondo atkaitinimo temperatūra turi būti 8–10 ° C aukštesnė nei PGR amplifikacijos pradmenų. Zondas turėtų būti 20–30 nukleotidų ilgio ir jame turėtų būti daugiau C nei G liekanų. Venkite G labiausiai 5 ′ padėtyje (kuri galėtų numalšinti fluorescencinį reporterį) ir tęskite keturis iš eilės vienodus nukleotidus (ypač G). Mes panaudojome 5′FAM – 3′BHQ R ir 5′FAM – 3′TAMRA zondus 12, 13 . „TaqMan“ zondai ištirpinami TE pH 8, 0 ir laikomi –20 ° C temperatūroje kaip 1, 5 μM alikvotinės dalys.

Procedūra

Vieno langelio paruošimas

Laikas: 30 min – 1 h

  1. Gaukite vienaląsčių preparatų iš pelės audinio (A variantas), priklijuotų kultivuotų ląstelių (B variantas) arba iš auginamų ląstelių suspensijoje (C variantas).

    1. Vienos ląstelės preparatai iš pelių audinių

      1. Pagal patvirtintus metodus išpjaustykite pelės audinius ir perpilkite į 1, 5 ml Eppendorfo mėgintuvėlį.

        Atsargiai

        Turi būti laikomasi patvirtintų darbo su gyvūnais taisyklių ir gairių.

      2. Kietesniems audiniams (pvz., Vaisiaus smegenims ir daugumai suaugusiųjų audiniams) inkubuokite 10% (v / v) PBS / FCS, papildytą 0, 125% (m / v) kolagenazės, esant 37 ° C, švelniai pakratant 300 aps / min; tiksli kiekvieno kolagenazės gydymo trukmė turės būti optimizuota. Kituose audiniuose (pvz., Vaisiaus kepenyse), atlikite kolagenazės apdorojimą ir įpilkite 250 μl 10% (tūrio / tūrio) FCS / DMEM 1 × 10 7 ląstelių; iš naujo suspenduokite audinį mėlynu galu.

        Kritinis žingsnis

        • Sutraukę tvirtesnius audinius per jėgą (pvz., Pakartotinai pipetėdami), dažnai sukels ląstelių mirtį, o tai gali užtemdyti 3C rezultatus.

      3. Ląstelių suspensija 1 min. Centrifuguojama 400 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

      4. Supernatantas išpilamas ir nuosėdos vėl suspenduojamos 500 μl 10% (v / v) FCS / PBS.

      5. Filtruokite per 40 μm ląstelių kamštį, kad susidarytų vienos ląstelės suspensija. Ląstelės yra paruoštos kryžminimui (2 žingsnis).

    2. Vienaląsčių preparatų iš priklijuotų auginamų ląstelių

      1. Pašalinkite terpę ir du kartus plaukite ląsteles PBS.

      2. Įpilkite 1 ml 0, 25% (m / v) tripsino ir inkubuokite 5 minutes 37 ° C temperatūroje.

      3. Resuspenduokite ląsteles 9 ml 10% (v / v) FCS / DMEM.

      4. Ląstelių suspensija 1 min. Centrifuguojama 400 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

      5. Supernatantas išpilamas ir nuosėdos vėl suspenduojamos 500 μl 10% (v / v) FCS / PBS 1 × 107 ląstelių.

      6. Filtruokite per 40 μm ląstelių kamštį, kad susidarytų vienos ląstelės suspensija. Ląstelės yra paruoštos kryžminimui (2 žingsnis).

    3. Vienaląsčių preparatai iš suspenduotų kultūrinių ląstelių

      1. Ląstelių suspensija 1 min. Centrifuguojama 400 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

      2. Supernatantas išpilamas ir nuosėdos vėl suspenduojamos 500 μl 10% (v / v) FCS / PBS 1 × 107 ląstelių.

      3. Filtruokite per 40 μm ląstelių kamštį, kad susidarytų vienos ląstelės suspensija. Ląstelės yra paruoštos kryžminimui (2 žingsnis).

Formaldehido susiejimas

Laikas: 20–25 min

  1. Į 1 × 10 7 ląsteles įpilkite 9, 5 ml 2% formaldehido / 10% FCS / PBS ir, inkubuodami, inkubuokite 10 minučių kambario temperatūroje (18–22 ° C). Tai yra susiejimo žingsnis.

    Kritinis žingsnis

    • Taip pat įprastai naudojamas 1% formaldehidas. Formaldehido koncentracija gali turėti įtakos virškinimo efektyvumui; jei greičiausiai virškinimo efektyvumas kils problemų, vietoj 2% formaldehido naudokite 1%.

    Atsargiai

    Formaldehidas yra toksiškas (žr. Medžiagos saugos duomenų lapą, pateiktą //www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/FLUKA/47629).

  2. Reakcijos mėgintuvėliai perpilami į ledą ir įpilama 1, 425 ml 1 M glicino (šalto ledo), kad būtų užgesinta kryžminimo reakcija.

    Kritinis žingsnis

    • Glicinas inaktyvins perteklinį formaldehido kiekį, kuris nereagavo su biologiniu pavyzdžiu. Čia aprašytos glicino koncentracijos pakanka daugumai biologinių mėginių. Tačiau jei mėginyje yra mažai laisvųjų aminogrupių, numalšinimas gali būti neužbaigtas; tokiu atveju glicino koncentracija turėtų būti padidinta prieš iš karto pereinant prie 4 žingsnio.

  3. 8 minutes verpkite 225 g, esant 4 ° C temperatūrai, ir atsargiai pašalinkite visą supernatantą.

Ląstelių lizė

Laikas: 20–25 min

  1. Granulės paimamos į 5 ml šalto lizės buferio ir inkubuojamos 10 minučių ant ledo.

    Kritinis žingsnis

    • Svarbu gauti vienalytį branduolių preparatą, kurį palengvinti švelniai pilant mišinį aukštyn ir žemyn. Priklausomai nuo ląstelių tipo, branduoliams paruošti gali prireikti griežtesnių lizės buferių (žr. REAGENTO NUSTATYMAS).

    Problemų sprendimas

  2. Centrifuguokite 5 minutes 400 g 4 ° C temperatūroje ir pašalinkite supernatantą.

    Problemų sprendimas

    Pauzės taškas

    • Granuliuoti branduoliai gali būti užšaldyti skystame azote ir keletą mėnesių laikyti –80 ° C temperatūroje.

Virškinimas

Laikas: 18–20 val

  1. Paimkite branduolius į 0, 5 ml 1, 2 × restrikcijos fermento buferio ir perkelkite į saugiai užrakinamą mėgintuvėlį.

  2. Mėgintuvėlis įdedamas į 37 ° C ir įpilama 7, 5 μl 20% (m / v) SDS (galutinis: 0, 3% SDS).

  3. Inkubuokite 1 valandą 37 ° C temperatūroje, purtydami 900 aps./min

    Problemų sprendimas

  4. Įpilkite 50 μl 20% (t / t) Triton X-100 (galutinis: 2% Triton X-100).

  5. Inkubuokite 1 valandą 37 ° C temperatūroje, purtydami 900 aps./min

  6. Paimkite 5 μl mėginio alikvotą ir pažymėkite kaip nesuvirškintą genomo DNR kontrolę (UND). Šis mėginys gali būti laikomas –20 ° C temperatūroje, kol jis reikalingas virškinimo efektyvumui nustatyti (žr. 14 veiksmą ir 2 langelį).

  7. Į likusį mėginį įpilkite 400 V pasirinkto restrikcijos fermento ir inkubuokite per naktį 37 ° C temperatūroje purtydami 900 aps./min.

  8. Paimkite 5 μl mėginio alikvotą ir etiketę pažymėkite kaip suvirškintos genomo DNR kontrolę (D). Norėdami apdoroti likusį mėginį, pereikite prie 15 žingsnio. Norėdami nustatyti virškinimo efektyvumą, išanalizuokite kontrolinius alikvotus iš 12 ir 14 žingsnių, kaip aprašyta 2 langelyje. Ši analizė gali būti atliekama lygiagrečiai su 22–34 žingsniais.

    Problemų sprendimas

Ligacija

Laikas: 8–9 val

  1. Į likusį 14 veiksmo mėginį įpilkite 40 μl 20% (m / v) SDS (galutinis 1, 6%).

  2. Inkubuokite 20–25 min 65 ° C temperatūroje; purtyti esant 900 aps./min

  3. Perpjaustyti branduoliai perpilami į 50 ml dydžio falonus.

  4. Įpilkite 6, 125 ml 1, 15 × ligavimo buferio.

  5. Įpilkite 375 μl 20% (t / t) Triton X-100 (galutinis 1% Triton X-100).

  6. Inkubuokite 1 valandą 37 ° C temperatūroje, švelniai purtant.

  7. Įpilkite 5 μl ligazės (viso 100 U) ir inkubuokite 4 valandas 16 ° C temperatūroje, po to 30 min. Kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  8. Įpilkite 30 μl 10 mg ml – 1 PK (300 μg galutinio).

  9. Inkubuokite 65 ° C temperatūroje per naktį, kad mėginys būtų atsietas.

DNR gryninimas

Laikas: 5–6 val

  1. Įpilkite 30 μl 10 mg ml- 1 RNazės (300 μg galutinio).

  2. Inkubuokite 30–45 minutes 37 ° C temperatūroje.

  3. Įpilkite 7 ml fenolio – chloroformo ir stipriai išmaišykite.

  4. Centrifuguokite 15 min. 2 200 g kambario temperatūroje (18–22 ° C).

    Problemų sprendimas

  5. Supilkite supernatantą į naują 50 ml mėgintuvėlį ir įpilkite 7 ml distiliuoto vandens, 1, 5 ml 2 M natrio acetato, pH 5, 6, po to 35 ml etanolio.

    Kritinis žingsnis

    • Padidinus tūrį prieš kritulį, praskiedžiamas DTT, esantis ligavimo buferyje, ir neleidžiama jam nusėsti (baltasis nuosėdos).

  6. Sumaišykite ir padėkite maždaug –80 ° C temperatūroje maždaug 1 val.

  7. Centrifuguokite 45 min., Esant 2 200 g, esant 4 ° C.

  8. Nuimkite supernatantą ir įpilkite 10 ml 70% (v / v) etanolio.

  9. Centrifuguokite 15 min., Esant 2 200 g, esant 4 ° C.

  10. Nuimkite supernatantą ir trumpai išdžiovinkite nuosėdas kambario temperatūroje (18–22 ° C).

  11. Ištirpinkite DNR granules 150 μl 10 mM Tris, pH 7, 5. 3C šablonas dabar paruoštas qPCR analizei. Jei norint padidinti šablono prieinamumą reikia atlikti papildomą skaidymo etapą, atlikite 1 langelyje pateiktą procedūrą prieš tęsdami 35 veiksmą ir qPCR analizę.

    Problemų sprendimas

    Pauzės taškas

    • 3C šabloną keletą mėnesių galima laikyti –20 ° C temperatūroje.

Mėginio grynumo įvertinimas

Laikas: 2–4 val

  1. 3C mėginio (nuo 34 veiksmo) alikvotą praskieskite du kartus iki dešimties. Į praskiestus reakcijos mėginius įpilkite genominės DNR taip, kad bendras DNR kiekis kiekvienoje reakcijoje būtų pastovus ir nuo 50 iki 200 ng.

  2. Nustatykite 10 μl qPCR, kaip nurodyta toliau pateiktoje lentelėje. Galima naudoti bet kurį 3C bandymo gruntą.

    Ta pačia eiga atlikite standartinę kreivę, naudodamiesi kontrolinio šablono nuosekliais praskiedimais (žr. Eksperimento dizainas) pagal „qPCR“ aparato gamintojo instrukcijas.

    Atsargų komponentasSumaFinalas
    H 2 O2 μl
    Bandymo gruntas (10 μM)0, 5 μl (5 pmol)0, 5 μM
    Pastovus gruntas (10 μM)0, 5 μl (5 pmol)0, 5 μM
    „QuantiTech Probe PCR Master“5 μl
    Maišyti - „Qiagen“
    „TaqMan“ zondas (1, 5 μM)1 μl (1, 5 pmol)0, 15 μM
    3C mėginys (nuo 35 veiksmo)1 μl

  3. Paleiskite qPCR naudodamiesi toliau pateiktomis sąlygomis. Patikrinkite, ar realiojo laiko PGR kiekybiniai įvertinimai yra sumažinti pagal skiedimo koeficientus (žr. Pavyzdį skyriuje ANTICIPUOTI REZULTATAI). Jei taip nėra, mėginio grynumas nėra tinkamas ir mėginys turi būti išmestas.

    Ciklo numerisDenatūraAtkaitinkite ir pratęskite
    115 min 95 ° C temperatūroje
    2–4610 s 95 ° C temperatūroje1 min 60 ° C temperatūroje

Pakrovimo reguliavimo atlikimas

Laikas: 2 val

  1. Įvertinkite mėginių, gavusių grynumo įvertinimą, koncentraciją (35–37 žingsniai). Norint tiksliai nustatyti 3C mėginio DNR koncentraciją, jį reikia palyginti su žinomos koncentracijos genomo DNR etaloniniu mėginiu. Tai gali būti padaryta naudojant „SybGreen“ kiekybinę PGR, naudojant 50 × 3C mėginių ir etaloninio mėginio praskiedimus, naudojant „vidinius“ pradmenų rinkinius, kurie nes amplifikuoja vietose, kurias atpažįsta kuris nors iš naudojamų restrikcijos fermentų (A variantas) (taip pat žr. ANTIKATINIŲ REZULTATŲ skyrius). Kaip alternatyva, 3C mėginių ir etaloninių mėginių praskiedimai gali būti atliekami greta agarozės gelio (B variantas).

    Kritinis žingsnis

    • Dėl optinio tankio (OD 260 ) matavimų neįmanoma tiksliai įvertinti DNR koncentracijos 3C mėginiuose, tikriausiai dėl jų riboto grynumo.

    1. SybGreen kiekybinis PGR

      1. Paruoškite 50 × 3C mėginio alikvotės praskiedimą (34 žingsnis) ir pamatinės DNR (10–0, 01 ng μl −1 DNR) serijinius praskiedimus.

      2. Nustatykite 20 μl qPCR taip („LightCycler“ aparatas, „Roche“)

        Atsargų komponentasSumaFinalas
        H 2 O14 μl
        Priekinis vidinis gruntas (10 μM)1 μl (10 pmol)0, 5 μM
        Grįžtamasis vidinis gruntas (10 μM)1 μl (10 pmol)0, 5 μM
        qPCR mišinys 142 μl
        50C 3C mėginio praskiedimas (38A veiksmo i punktas)2 μl

      3. Atlikite qPCR naudodamiesi žemiau pateiktomis sąlygomis:

        Ciklo numerisDenatūraAtvėsinti ir pratęsti
        13 minutes 95 ° C temperatūroje
        2–461 s 95 ° C temperatūroje5 s 70 ° C temperatūroje ir 15 s 72 ° C temperatūroje
        47Padidinkite temperatūrą iki 95 ° C 0, 2 ° C s – 1 greičiu

        Kritinis žingsnis

        • Jei naudojate kitą aparatą nei „LightCycler“ ar kitokį komercinį „qPCR“ mišinį, vadovaukitės gamintojų instrukcijomis.

      4. Nustatykite DNR koncentraciją, palygindami mėginio Ct vertę su standartine kreive.

        Problemų sprendimas

    2. Agarozės gelio analizė

      1. Paruoškite žinomo DNR koncentracijos mėginio ir etaloninio mėginio 1/5, 1/10, 1/20 ir 1/40 praskiedimus.

      2. Atlikite atitinkamus mėginio ir pamatinės DNR skiedinius šonuose agarozės gelyje (0, 8–2%); susieti 3C mėginiai (ir nesuvirškintas genomo etaloninis mėginys) bus paimami kaip viena didelės molekulinės masės juosta.

      3. Kiekybiškai išmatuokite ir palyginkite DNR kiekį tarp sujungtų 3C mėginių ir etaloninio mėginio, išmatuodami etidžio bromido įsiskverbimą, naudodami „Typhoon 9200“ imtuvą (GE Healthcare). Apdoroti vaizdai analizuojami naudojant „ImageQuant“ programinę įrangą („GE Healthcare“), kad būtų nustatyta DNR koncentracija.

  2. Pakoreguokite pradinius 3C tyrimus (nuo 34 veiksmo) su H 2O iki 50 ng μl −1 ± 10% ir pasirinktinai patikrinkite šią koncentraciją pakartodami matavimus, kaip aprašyta 38 veiksme.

Ligacijos produktų kiekybinis įvertinimas realiuoju laiku PGR

Laikas: 2–4 dienos (2–3 val. Per vieną bandymą; bandymų skaičius priklauso nuo pradmenų porų ir analizuojamų 3C mėginių skaičiaus)

  1. Atlikite „TaqMan“ realaus laiko PGR ligacijos produktų kiekybinius nustatymus 1 μl (turinčiame ∼ 50 ng DNR) „sureguliuotų“ 3C mėginių (iš 39 žingsnio). Naudokite reakcijos sąlygas, aprašytas 36 žingsnyje.

  2. Kiekvienam sujungimo produktui atlikite qPCR, naudodamiesi 37 žingsnyje pateiktais PGR parametrais. Kiekviename bandyme atlikite standartines kreives, naudodamiesi kontrolinio šablono nuosekliais praskiedimais (žr. Eksperimento projektas) pagal „qPCR“ aparato gamintojo instrukcijas. Išanalizuokite duomenis, kaip aprašyta skyriuje ANTIKOMIEJI REZULTATAI.

    Kritinis žingsnis

    • 3C-qPCR duomenys turi būti normalizuoti atsižvelgiant į „pakrovimo valdymą“ („vidinius“ pradmenis, esančius spragos gene toliau pateiktame eksperimento pavyzdyje) ir „kontrolės sąveikos dažnių“ rinkinį. Pastaroji kontrolė turėtų būti atliekama kiekviename 3C tyrime, naudojant tiriamojo / pastovaus pradmens porą, lokalizuotą lokuse, kuriame yra visur išreikštas genas. Šiuo tikslu mes reguliariai naudojame pradmenų poras ERCC3 (žr. 16 nuorodą ) arba PDHB genų (žr. Pavyzdį skyriuje ANTIKALUOTI REZULTATAI) lokusuose .

    Problemų sprendimas

Problemų sprendimas

Trikčių šalinimo patarimus galite rasti 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Laikas

1 pakopa, ląstelių paruošimas: 30 min – 1 h

2–4 žingsniai, formaldehido susiejimas: 20–25 min

5 ir 6 žingsniai, ląstelių lizė: 20–25 min

7–14 žingsniai, virškinimas: 18–20 val

15–23 žingsniai, perrišimas: 8–9 val

24–34 žingsniai, DNR gryninimas: 5–6 val

35–37 žingsniai, mėginio grynumas: 2–4 val

38 ir 39 žingsniai, pakrovimo valdymas: 2 val

40 ir 41 žingsniai, realizavimo laiko PCR ligacijos produktų kiekybinis įvertinimas: 2–4 dienos

Laukiami rezultatai

Duomenų analizė

Kaip neseniai pabrėžta kitur 18, kiekvieno 3C mėginio atsitiktinius susidūrimus reikia atidžiai įvertinti, kad būtų galima atskirti gana dažną, bet nefunkcinę sąveiką nuo fiziologiškai svarbios sąveikos. Atsitiktinių susidūrimų foną galima įvertinti nustatant sąveikos dažnį tarp vietų, atskirtų didėjant genominiams atstumams (žr. Eksperimento pavyzdį). Kaip minėta anksčiau, „specifinė sąveika aptinkama, kai stebimas vietinis sąveikos dažnio pikas“ 18 . Naudojant 3C protokolą tiesiog ieškant sąveikos tarp dviejų svetainių (pvz., Skatintojo ir patobulintojo) tik su keliais pradmenų rinkiniais, galima lengvai klaidingai suprasti duomenis.

Tačiau kai kurie parametrai, pavyzdžiui, restrikcijos fragmentų dydis, gali įtakoti ligavimo produktų 4 kiekybinį nustatymą ir sukurti „artefaktyvias vietines smailes“. Todėl fiziologiškai reikšmingos sąveikos geriausias požymis yra dviejų skirtingų mėginių santykinio susiejimo dažnio palyginimas.

Eksperimento pavyzdys

3C-qPCR pirmiausia patvirtino Splinter ir kt . 16 pelės β-globino lokuse. Norėdami toliau patvirtinti 3C-qPCR protokolą, mes išanalizavome stiprintuvų ir promotorių sąveiką įspaustame H19 lokuse ant pelės 7 chromosomos, kuri yra žinduolių lokusas, neseniai analizuotas 3C tyrimais, naudojant standartinę procedūrą 21, 22 . Mes paruošėme branduolius iš 7 dienų amžiaus pelių kepenų mėginių (kai Igf2 ir H19 yra labai ekspresuojami) 23 ir tęsėme iki 3C protokolo 34 žingsnio, kaip aprašyta aukščiau, naudojant Bam HI (13 žingsnis) ir Eco RI (1 langelis) apribojimą. fermentai. Tada mėginio grynumas buvo įvertintas trijų nepriklausomų 3C tyrimų (A1, A2 ir X) alikvotėmis, kaip aprašyta aukščiau (35–37 žingsniai), naudojant TaqMan PGR su pastoviu pradmeniu, esančiu fragmente, kuriame yra H19 stiprikliai, ir tiriamąjį pradmenį 20 (žr. Pav. 2 ir 2 lentelės pradmenų sekoms). Šios grynumo kontrolės rezultatai yra pateikti 3 lentelėje. Vertės atitinka ligavimo produkto, susidariusio tarp 20 fragmento ir pastovaus fragmento (C), kiekybinius rodiklius. Šios vertės apskaičiuojamos naudojant standartinės kreivės parametrus ( b : kirtis ; a : nuolydis) taip: reikšmė = 10 (Ct – b ) / a .

Image

Kiekvieno ligavimo produkto (fragmentų nuo 1 iki 8 ir nuo 17 iki 20) santykinis lygis buvo nubraižytas pagal atstumą (kb) nuo Igf2 promotoriaus P0 (žr. Žemiau esančius žemėlapius). „Pastovus“ pradmuo ir „TaqMan“ zondas buvo suprojektuoti taip, kaip aprašyta 1 paveiksle (taip pat žr. PGR pradmenų dizainą skyriuje „REAGENTAS SETUP“) „ Bam HI“ fragmente (fragmentas 21), kuriame yra H19 endoderminiai stiprikliai (žr. 2 ir 5 lenteles). Iš tų pačių biologinių mėginių buvo atlikti du nepriklausomi 3C-qPCR eksperimentai (A1, mėlyna kreivė; A2, rožinė kreivė). Duomenys buvo normalizuoti pagal „ Gapdh“ įkrovos valdymą ( a ) arba pagal Pdhb „valdymo sąveikos dažnius“ ( b ). Žemiau diagramų nurodyti Bam HI restrikcijos fragmentai. „Bam HI“ fragmentai sunumeruojami nuo fragmentų nuo –1 iki 21. Rodyklės P0 – P3 nurodo keturis Igf2 promotorius. Įspaudimo-kontrolės srities (ICR, baltas stačiakampis 18 fragmente), Igf2 ir H19 genų (juodas stačiakampis 19 fragmente), endoderminių stiprintuvų (juodi apskritimai 21 fragmente), 3 matricos prijungimo srities (MAR3, balta) vietos stačiakampis 8 fragmente) ir diferencijuotai metilinta 1 sritis (DMR1, baltas stačiakampis 2 fragmente).

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Vienas 3C tyrimas (X) buvo atmestas iš analizės, nes priemaišos sumažino ištikimų kiekybinių rodiklių nustatymą (žr. 3 lentelę). Dviejų kitų 3C mėginių (A1 ir A2) grynumas buvo tinkamas, ir mes atlikome pakrovimo koregavimus (38 žingsnis), kaip parodyta 4 lentelėje. SYBR žaliosios spalvos kiekiai buvo įvertinti šių 3C mėginių 50 × praskiedimo alikvota, kaip aprašyta. atliekant 38A veiksmą. Kai originalūs 3C mėginiai buvo tinkamai praskiesti iki 50 ng μl −1 (ty, A1 mėginio skiedimo koeficientas yra 5 arba A2 pavyzdžio skiedimo koeficientas 5), mes patikrinome jų koncentraciją 50% praskiesto šių sureguliuotų mėginių alikvotinėje dalyje (1 žingsnis). 39). Standartinės kreivės buvo gautos naudojant etaloninio mėginio nuoseklius praskiedimus (žr. 38A veiksmą), suteikiant 1 reikšmę 1 ng μl −1 taškui. Reikšmės buvo gautos naudojant „vidinį“ pradmenų rinkinį (čia mes naudojome pradmenis, esančius Gapdh gene; apie pradmenų seką žr. 2 lentelę). Šios vertės apskaičiuojamos naudojant standartinės kreivės parametrus ( b : kirtis ; a : nuolydis) taip: reikšmė = 10 (Ct – b ) / a .

Pilno dydžio lentelė

Virškinimo efektyvumas buvo kontroliuojamas kaip aprašyta 2 langelyje (duomenys nepateikti; pradmenų sekos pateiktos 5 lentelėje). Ligacijos produktų kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant realaus laiko PGR naudojant „TaqMan“ zondą, suprojektuotą fragmente, kuriame yra H19 sustiprintojai (fragmentas 21; 2 pav.; Pradmenų sekos pateiktos 2 lentelėje). Šie stiprikliai yra specifiški endodermui ir yra būtini tiek Igf2, tiek H19 geno raiškai 24 . Kaip parodyta 2a paveiksle (pakrovimo valdymo normalizavimas) ir 2b paveiksle (normalizavimas, siekiant kontroliuoti sąveikos dažnius, dešinieji grafikai), kiekvienam ištirtam 3C mėginiui (A1 ir A2) nustatyta vietinės sąveikos smailė su restrikcijos fragmentu, kuriame yra H19 promotorius (19 fragmentas). Neapdoroti šio eksperimento duomenys yra pateikti 6 lentelėje kaip duomenų analizės pavyzdys.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Viršutinėje lokuso dalyje mes nustatėme, kad H19 stiprikliai kontaktuoja su sekomis, kuriose yra diferencijuotai metilinta 1 sritis (DMR1, 2 fragmentas) (2a pav., B, kairieji grafikai). Šie rezultatai patvirtina neseniai aprašytus duomenis 21 ir taip dar labiau patvirtina 3C-qPCR metodiką.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.