Įniršio geno promotoriaus polimorfizmai ir diabetinė retinopatija klinikose gyvenantiems pacientams iš pietų Indijos | akis

Įniršio geno promotoriaus polimorfizmai ir diabetinė retinopatija klinikose gyvenantiems pacientams iš pietų Indijos | akis

Anonim

Anotacija

Tikslas

Pagrindinis šio tyrimo tikslas buvo įvertinti, ar RAGE geno −429T / C, −374T / A ir 63 bp delecijos polimorfizmai yra susiję su 2 tipo diabetu sergančių pacientų diabetine retinopatija (DR) klinikinės populiacijos iš Pietų metu. Indija.

Metodai

PCR-RFLP metodu ištyrėme 149 normalius gliukozės tolerancijos objektus (NGT), 189 2 tipo cukriniu diabetu sergančius asmenis be retinopatijos (DM) ir 190 asmenų, sergančių DR, dėl šių polimorfizmų. DR buvo diagnozuota klasifikuojant spalvotas pamatų nuotraukas. Individualių polimorfizmų ryšiui su DR įvertinti buvo naudojami logistinės regresijos modeliai. Lūkesčių maksimizavimo algoritmai buvo įdiegti asociacijos haplotipų testuose, siekiant ištirti bendrą polimorfizmų –429T / C ir –374T / A poveikį DR.

Rezultatai

Alelių dažnis –429T yra 0, 83 NGT, 0, 84 DM ir 0, 85 DR pacientams, o –374T 0, 93 NGT, 0, 92 DM ir 0, 88 DR pacientams. Buvo nustatyta, kad −374 polimorfizmas buvo susijęs su neproliferacine retinopatija, kai šis pogrupis buvo lyginamas su DM grupe (OR = 1, 814, 95% PI = 1, 005–3, 273). Tačiau šis ryšys nebuvo akivaizdus, ​​kai abu DR subfenotipai (nepoproliferacinė ir proliferacinė DR grupės) buvo tiriami kartu. Nerasta jokių įrodymų apie ryšį tarp −429T / C polimorfizmo ir DR fenotipo. Galiausiai 2-SNP haplotipo išplėtimas nerodė jokio reikšmingo statistinio skirtumo tarp grupių ( P = 0, 668).

Išvada

Šiame tyrime mes nustatėme kuklią sąsają su –374T / A polimorfizmu nepoproliferaciniame DR pogrupyje.

Įvadas

Cukriniu diabetu sergantiems pacientams dėl neenzimatinės baltymų glikikacijos susidaro pažangūs gliukacijos galutiniai produktai (AGE) ir šis procesas vyksta pagreitėjant lėtiniam hiperglikemijai 1, be to, nustatyta, kad šis lygis padidėja sergant diabeto komplikacijomis, tokiomis kaip diabetinė retinopatija (DR). 2 AGE sukelia įvairius patologinius pokyčius, tokius kaip padidėjęs bazinės membranos sustorėjimas, arterijų sustingimas ir glomerulų sklerozė. 3, 4 AGE jungiasi prie specifinio receptoriaus, žinomo kaip pažengusių gliukacijos galutinių produktų (RAGE) receptoriai. RAGE išreiškiamas daugelyje ląstelių tipų, tokių kaip endotelio ląstelės, monocitai ir limfocitai, įskaitant kasos beta ląsteles. Signalizacijos, susijusios su RAGE, sukelia transkripcijos faktorių, tokių kaip NF- κB , AP-1 ir STAT-1, 5, 6, suaktyvinimą, adhezijos molekulių VCAM, ICAM ir audinio faktorių 7, 8, kurie skatina prokoaguliantų būseną. tinklainės mikrokapiliaruose. Tai lemia hipoksinę būseną, dėl kurios gali prasidėti angiogeninis procesas proliferaciniame DR.

Genetinių veiksnių dalyvavimas DR patogenezėje buvo patvirtintas tyrimais, kurie įrodė DR susiformavusią šeimoje. 9, 10 Ankstesni tyrimai, kuriuos Rema ir kt. 11 atliko Pietų Indijos populiacijoje, parodė, kad DR sergančių asmenų broliams ir seserims 3, 5 karto didesnė tikimybė išsivystyti DR, palyginti su tiriamųjų, neturinčių DR, broliams ir seserims, kurie rodo stiprų genetinį komponentą, susijusį su DR šioje populiacijoje. Ištirti įvairūs genai kandidatai, siekiant nustatyti jų ryšį su DR, įskaitant aldozės reduktazę, 12, 13 azoto oksido sintazę, 14, 15 ir MethylTetra Hydro Folate Reductase 16, apie kurias įvairiose populiacijose buvo prieštaringų pranešimų. Tarp daugelio genų kandidatų, kuriems buvo nustatyta, kad jie yra susiję su retinopatija, RAGE koduojantis genas turi ypatingą reikšmę, nes RAGE tarpininkaujama signalizacija sukelia pagrindinius patologinius mikrovaskuliarų pokyčius, sukeliančius DR. 3 funkcinis polimorfizmas Gly82Ser 3-ame egzemplioriuje anksčiau buvo susijęs su DR, iš kurių įrodyta, kad šio Gly82Ser polimorfizmo Ser aleliai apsaugo DR vystymąsi Azijos ir Indijos populiacijose. 17 Hudsono ir kt . Atlikti tyrimai parodė, kad trys polimorfizmai, esantys RAGE geno promotoriaus regione (−429TC ir −374TA ir 63 bp del), dalyvauja geno reguliavime ir todėl gali atlikti lemiamą vaidmenį patogenezė, sukelianti DR. 63 bp delecijos polimorfizmas yra regione, apimančiame –374 sritį, ir šie promotoriaus polimorfizmai daro savo poveikį veikdami RAGE geno transkripcinį reguliavimą. Šių promotorių polimorfizmų ryšys buvo tiriamas įvairiose populiacijose, atsižvelgiant į DR ir kitas ligas, tačiau rezultatai yra prieštaringi. 19, 20, 21 Nors indėnai turi daugiausiai diabetu sergančių pacientų pasaulyje, 22, 23, literatūroje trūksta duomenų apie genetinius veiksnius, sukeliančius indėnų DR. Šiame tyrime mes ištyrėme –429 TC ir –374 TA promotorių polimorfizmus, susijusius su DR Pietų Indijos 2 tipo cukriniu diabetu.

Dalykai ir metodai

Buvo įtrauktos trys tiriamųjų klasės, kaip aprašyta toliau. Pirmąją grupę, vadinamą DR, sudarė 190 diabetu sergančių asmenų, sergančių bet kokia retinopatijos forma, įskaitant (1) 133 nepoliferacinės diabetinės retinopatijos (NPDR) asmenis, kuriems nustatytas tik NPDR be diabetinės makulos edemos, diabeto trukmė> 10 metų, ir makroproteinurija <300 mg per parą ir (2) 57 proliferacinės diabetinės retinopatijos (PDR) subjektai, kuriems makroproteinurija buvo mažesnė kaip 300 mg per parą. Antrąją grupę, vadinamą „ DM “ grupe, sudarė 189 2 tipo diabetu sergantys asmenys, kurių ligos trukmė> 15 metų, be retinopatijos ir nefropatijos. „ NGT “ grupę sudarė 149 normalūs gliukozės toleranciją turintys asmenys (NGT), vyresni nei 50 metų (tokiu būdu suteikiant pakankamai laiko DM išsivystyti). Antro tipo diabetu sergantys asmenys, sergantys DR ir be jų, šioms dviem pirmosioms kategorijoms buvo įdarbinti iš pacientų, kurie lankėsi poliklinikoje Dr Mohano diabeto specialybių centre. Norėdami apeiti populiacijos stratifikacijos problemą, atlikome atvejo ir kontrolinį tyrimą su penkiais neatsietais žymeklio lokusais, kurie, kaip manoma, nesusiję su tiriama liga, tačiau, kaip žinoma, turi alelinę įvairovę skirtingose ​​populiacijose. 24, 25 alelių dažnio skirtumas tarp DM, DR ir NGT asmenų nebuvo statistiškai reikšmingas nė viename iš penkių lokusų.

Siekiant ištirti RAGE geno polimorfizmų ryšį su DR, pagrindinis dėmesys buvo skirtas palyginti DR grupę, susidedančią iš NPDR ir PDR pogrupių atskirai ir kartu su DM grupe, ir toliau išsiaiškinti šių variantų vaidmenį sergant 2 tipo diabetu., DM grupė taip pat buvo palyginta su NGT grupe. Taip pat buvo atliktas DR palyginimas (atskirai ir kartu) su NGT grupe. Atsižvelgiant į ryšį, apie kurį pranešė Hudson et al 18, kartu su mūsų imties dydžiu, mūsų tyrimas būtų turėjęs 91% galios aptikti panašų ryšį.

Remiantis Madros diabeto tyrimų fondo institucinės etikos apžvalgos tarybos patvirtintu protokolu, buvo gautas visų tiriamųjų sutikimas.

Biocheminiai įvertinimai

Buvo paimtas nevalgiusio kraujo mėginys, serumas atskirtas ir laikomas –70 ° C temperatūroje, kol bus atlikti tyrimai. Biocheminiai tyrimai buvo atlikti naudojant „Hitachi-912 Autoanalyser“ (Hitachi, Vokietija), naudojant rinkinius, tiekiamus „Roche Diagnostics“ (Manheimas, Vokietija). Buvo matuojamas nevalgius gliukozės kiekis plazmoje (GOD-POD metodas), cholesterolio kiekis serume (CHOD-PAP metodas), trigliceridų kiekis serume (GPO-PAP metodas) ir DTL cholesterolis (tiesioginis metodas - polietilenglikolio iš anksto apdoroti fermentai). Mažo tankio lipoproteinų (MTL) cholesterolis buvo apskaičiuotas pagal Friedewald formulę. Glikuotas hemoglobinas (HbA1C) buvo apskaičiuotas atliekant efektyvią skysčių chromatografiją, naudojant variantinį aparatą (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV).

Šlapimo mėginiai buvo imami ankstyvą rytą po nakties pasninko. Šlapimo baltymai buvo matuojami vietoje šlapimo, naudojant sulfosalicilo rūgšties metodą. Numatomas baltymų išsiskyrimas buvo apskaičiuotas baltymų / kreatinino santykio metodu, o akivaizdi proteinurija buvo apibrėžta kaip ≥300 mg / dieną. 27

DR diagnozė

DR buvo diagnozuota tiriant tinklainę ir užfiksuota 35 mm spalvota fotografija. Tinklainės tyrimui mokiniai buvo išsiplėtę, įlašindami po vieną lašą po 10% fenilefrino ir 1% tropikamido į abi akis, ir lašai buvo kartojami tol, kol buvo gauta geriausia įmanoma midriazė. Keturių laukų spalvotą tinklainės fotografavimą apmokytas fotografas atliko naudodamas „Zeiss FF 450 plus“ fotoaparatą, naudodamas 35 mm spalvų skaidres. Keturi paimti laukai buvo stereoskopiniai geltonosios dėmės, disko, aukštesnių laikinių ir žemesnių laikinių kvadrantų vaizdai. Jei tam tikros akies ar kokio nors lauko fotografuoti nebuvo įmanoma dėl netinkamo išsiplėtimo, nesugebėjimo bendradarbiauti ar laikmenos nepermatomumo, tai buvo nurodoma kaip trūkstama akis ar laukai.

Tinklainės nuotraukos buvo klasifikuojamos naudojant identifikavimo numerį ir įvertintos užmaskuotai, siekiant sumažinti galimą šališkumą. Fotografijos buvo įvertintos atsižvelgiant į retinopatijos sunkumą, palyginti su standartinėmis ankstyvojo diabeto retinopatijos tyrimo (ETDRS) klasifikavimo sistemos nuotraukomis. Akis, kuriam nustatyta aukštesnio laipsnio retinopatija, buvo pasirinktas kaip galutinė to asmens diagnozė.

PCR-RFLP

Žmogaus genomo DNR buvo ekstrahuota fenolio – chloroformo metodu. PCR-RFLP genotipas buvo atliktas, kaip aprašyta. 18 PGR sudarė 100–150 ng DNR, denatūruoto 94 ° C temperatūroje, atkaitinimo 56 ° C temperatūroje, pratęsimo 72 ° C temperatūroje 30 ciklų, o po to paskutinis pratęsimas 72 ° C temperatūroje 5 minutes 50 μl reakcijos metu. Tada PGR produktai buvo suardyti Alu I (Naujosios Anglijos Bio Labs) esant 37 ° C temperatūrai 6 h - 429 T / C polimorfizmui ir Tsp509 I (New England Bio Labs) 65 ° C temperatūrai 16 h - 374 T / Polimorfizmas. 18 Apriboti produktai buvo atskirti 3% agarozės gelyje ir vizualizuoti naudojant dažymą etidžio bromidu.

Statistinė analizė

Šiam atvejo ir kontrolės tyrimo projektui atlikti buvo naudojami nepriklausomi bandinių bandymai, siekiant įvertinti kiekybinių bruožų skirtumus tarp skirtingų tyrimo grupių, naudojant kompiuterinę programą SPSS (10 versija). Bruožai buvo modifikuoti taip, kad prireikus atitiktų Gauso pasiskirstymą, ir prireikus buvo pakoreguoti pagal amžiaus ir lyties kovariacinius parametrus. Alelių ir genotipų dažnis, loginis regresijos koeficientų santykis (OR) ir χ 2 testai buvo įvertinti siekiant nustatyti asociacijas vieno SNP lygyje. Hardy Weinbergo pusiausvyra buvo įvertinta naudojant tests 2 testus („Excel 2003“), o jungčių pusiausvyra įvertinta naudojant „Haploview“. 29 Grupinių haplotipų dažnis buvo sugeneruotas naudojant lūkesčių maksimizavimo (EM) algoritmą, aprašytą Fallin ir kt. Kiekvienam atskiram haplotipui buvo apskaičiuoti 30 hipotipo dažnių ir χ 2 dydžiai, palyginti su visais kitais, o empirinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant 10 000 stebimų duomenų permutacijas. Taip pat buvo atliktas „omnibus testas“, siekiant nustatyti bendrojo haplotipo dažnio profilių skirtumus tarp atvejų ir grupių. 30 Haplotipo analizė buvo atlikta naudojant SNPEM. 30

Rezultatai

529 nesusijusiuose Pietų Indijos kilmės tiriamuosiuose tiriame RAGE geno promotoriaus regioną dviem funkciniais promotoriaus polimorfizmais, būtent –429 T / C ir –374 T / A. Trijų tiriamųjų grupių klinikinės charakteristikos pateiktos 1 lentelėje. Amžius, HbA1C, nevalgius cukraus kiekis kraujyje, sistolinis kraujospūdis ir trigliceridai buvo reikšmingai susiję su cukriniu diabetu (lyginant DR ir DM grupes su NGT grupe). Sistolinis kraujospūdis, HbA1C ir vyrų lytis buvo oficialiai siejami su DR ( P <0, 05, palyginus DR grupę su DM grupe), o DM tiriamieji buvo žymiai vyresni ( P <0, 001).

Pilno dydžio lentelė

Bendras mažas alelių dažnis tarp visų tiriamųjų buvo 16% polimorfizmui −429 (C) ir 9% −374 (A) polimorfizmui. Abu SNP buvo Hardy Weinbergo pusiausvyroje, o jungčių pusiausvyra (LD) tarp jų buvo vidutinė ( D ′ = 0, 74, R2 = 0, 02, 95% PI D ′: 0, 27–0, 93). Du atskiri SNP aleliniu lygiu nebuvo siejami su DR ar cukriniu diabetu: P reikšmė DM prieš NGT buvo 0, 729, DR prieš DM buvo 0, 011, o DR vs NGT buvo 0, 064, kai –374T / A, ir 0, 719, 0, 688, 0, 444 tų pačių trijų palyginimų atitinkamai –429T / C.

Įvertinant asociacijas genotipo lygyje, reta homozigotinė grupė buvo sugriuvusi su heterozigotine grupe abiejų polimorfizmų atžvilgiu (2 lentelė). Tiriant −374T / A polimorfizmą genotipo analizėje pirmiausia buvo pašalinti subjektai, kurių delecija buvo 63 bp, nes visi šie asmenys turėjo tik vieną šio polimorfizmo kopiją. Palyginus NPDR subjektus su DM grupe, buvo pastebėtas tik nežymus ryšys su −374T / A polimorfizmu (OR = 1, 814, P = 0, 048, 95% PI = 1, 005–3, 273), o lyginant PDR, nebuvo nustatyta jokio ryšio. ir DM grupės (OR = 0, 990, P = 0, 982, 95% PI = 0, 419–2, 336). Nebuvo nustatyta jokių asociacijų −429T / C polimorfizmams (2 lentelė). Asociacijos testai buvo kartojami atsižvelgiant į amžių ir lytį, o skirtumo nepastebėta net ir pritaikius. Vėliau atlikus šių grupių palyginimą su NGT grupe, asociacijos įrodymų nebuvo (žr. 2 lentelę). Duomenų išplėtimas dviejų SNP haplotipu taip pat neparodė jokio ryšio tarp šių promotoriaus polimorfizmų ir DR fenotipo ( P = 0, 668) (3 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

63 bp delecijos polimorfizmas buvo nustatytas tik heterozigotinėje būsenoje visiems tiriamiesiems, kai jie buvo. Taip pat nustatyta, kad šis 63 bp delecijos polimorfizmas yra panašus visose trijose grupėse, kurių buvo 12 NGT , 15 DM ir 16 DR . Mes ištyrėme šio 63 bp trynimo poveikį genotipo ir haplotipo analizėse, koduodami visus tiriamuosius subjektus ištrynimu kaip heterozigotinius esant –374 polimorfizmui. Čia genotipo analizė dar kartą pateikė tik nereikšmingus įrodymus palyginant NPDR ir DM grupes (OR = 1, 666, P = 0, 047, 95% PI = 1, 007–2, 756), tačiau jokių įrodymų apie ryšį su DR minėtoje vietoje nebuvo. haplotipo lygis ( P = 0, 589, duomenys nepateikti).

Diskusija

AGE – RAGE kelias buvo išsamiai ištirtas atsižvelgiant į diabetinę kraujagyslių ligą. Buvo nustatyti RAGE geno variantai ir patikrinta, ar jie nėra susiję su DR ir kitomis ligomis. 31, 32, 33 Iš daugelio patikrintų polimorfizmų, −429 ir −374 yra laikomi svarbiais, nes pranešama, kad šie polimorfizmai padidina RAGE geno nuorašą, o tai padidins padidėjusį AGE prisijungimą prie ląstelių ir dėl to padidės. pakeista signalizacijos kaskada. G82S polimorfizmas taip pat buvo tiriamas įvairiose populiacijose, o tai yra dar vienas svarbus anksčiau šioje populiacijoje ištirtas polimorfizmas. 17 Čia pirmą kartą mes tikrinome −429 ir −374 promotorių polimorfizmus, norėdami sužinoti apie jų ryšį su DR Pietų Indijos tiriamiesiems.

Kaip ir tikėtasi, keletas tirtų biocheminių parametrų parodė reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų grupių, įskaitant amžių, HbA1c, nevalgius cukraus kiekį kraujyje, sistolinį kraujospūdį ir trigliceridus. Amžiaus skirtumą lemia mūsų asmenų, kuriems taikoma DM, atrankos kriterijai, dėl kurių cukriniu diabetu reikia gydyti 15 metų be jokios retinopatijos formos. Kiti klinikiniai parametrai, turintys reikšmingų skirtumų, yra gerai nustatyti DR vystymosi rizikos veiksniai.

Tyrimų, atliktų su -374 ir -429 RAGE polimorfizmais, asociacijų rezultatai skirtingose ​​populiacijose nebuvo vienodi. Nors JK kilmės Kaukazo populiacijos tyrimai −429 T / C polimorfizmą siejo su retinopatija 13 ir −374 polimorfizmą su CAD ir proteinurija 1 tipo cukriniu diabetu sergantiems asmenims Suomijoje, 19 neradome įrodymų, kad DR gali būti susijęs su - 429 T / C arba −374 T / A polimorfizmas mūsų duomenyse, nepaisant didesnio imties dydžio, turinčio pakankamai galios aptikti asociacijas praneštuose lygiuose. Stratifikuodami DR tiriamuosius į NPDR ir PDR grupes, stebėjome ryšį su NPDR grupės polimorfizmu –374T / A, tai buvo nežymiai reikšminga ( P = 0, 048), todėl turėtų būti aiškinama atsargiai, ypač atsižvelgiant į kelis testus. atlikta kaip šių analizių dalis. Tačiau glikacija yra procesas, kuris vyksta, kai diabetas prasideda ir modifikuoti baltymai prisijungia prie RAGE ant tinklainės endotelio ląstelių. Tai suaktyvina signalizacijos kaskadą, dėl kurios išsiskiria uždegimą sukeliantys citokinai ir adhezijos baltymai, kurie palaiko trombozę ir galiausiai kapiliarų nutekėjimą bei okliuziją ir sukelia NPDR. Šiame kontekste šis −374 polimorfizmas įgyja reikšmės, atsižvelgiant į RAGE geno indukciją AGE.

Atsižvelgiant į tai, kad tarp šių polimorfizmų yra LD, apie kuriuos buvo pranešta ir kituose tyrimuose, 18, 19, mes taip pat atlikome asociacijos haplotipo testus, kurie taip pat nerodė ryšio. Šiame tyrime mes taip pat palygino alelių dažnį tarp nesergančių diabetu ir DM grupės, taip pat nustatėme, kad jie yra panašūs.

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų rezultatai rodo –374 T / A polimorfizmo ryšį su NPDR, o tai prieštarauja Slovakijos tyrimui ir Kinijos tyrimui, kuris neparodė jokio ryšio tarp šių promotoriaus polimorfizmų ir DR. 20, 21 Kiti RAGE geno polimorfizmai, tokie kaip G82S, G1704T, A2484G ir G2245A, kurie buvo išsamiai ištirti skirtingose ​​populiacijose, šioje populiacijoje reikia ištirti 32, 33, 34, 35, 36, 37, norint suprasti šie DR atsiradimo ir progresavimo pokyčiai. Etninės variacijos, kurios galėjo būti tiriamųjų tarpe, buvo tiriamos naudojant genomo kontrolę, kuri neparodė alelinio dažnio kitimo tarp grupių, ir tai rodo, kad šie rezultatai nėra artefaktas dėl populiacijos substruktūros. RAGE baltymo ekspresijos tinklainės endotelio ląstelėse tyrimai ir AGE lygio nustatymas serume šiems pacientams suteiks papildomos informacijos apie AGE sąveikos su šiuo promotoriaus polimorfizmu, sukeliančiu kraujagyslių diabeto komplikacijas, įtaką.