Atsitiktinai sulaužytas fragmentas pcr su 5 ′ galu nukreiptu adapteriu, skirtu vaikščioti po genomą | mokslinės ataskaitos

Atsitiktinai sulaužytas fragmentas pcr su 5 ′ galu nukreiptu adapteriu, skirtu vaikščioti po genomą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Chromosomos
  • DNR
  • Genomas
  • Nukleorūgštys

Anotacija

Galima naudoti daugybę genomo vaikščiojimo metodų, pagrįstų polimerazės grandinine reakcija (PGR), įskaitant tuos, kurie modifikuojami su restrikcijos fermentais ir be jų. Nepaisant to, šie metodai yra mažai atkuriami, neveiksmingi ir nėra specifiški. Čia pateikiame atsekamą ir veiksmingą PGR strategiją: atsitiktinai sulaužytą PGR fragmentą su 5 ′ galu nukreiptu adapteriu, skirtu vaikščioti po genomą. Pirmiausia genomas suskaidomas atsitiktinai. Po neryškių galų fragmentai sujungiami į 5 ′ nukreiptus adapterius. Tada atliekama pusiau įdėta PGR. Taigi, mes galime gauti nežinomą seką, klonuodami dominančius fragmentus, o po to seką. Šis metodas veiksmingai įveikia aukščiau paminėtas kliūtis ir suteikia privalumų: 1) genomo suskaidymas nenaudojant restrikcijos fermentų; 2) grunto specifiškumo didinimas ir savaiminio jungimosi tarp adapterių prevencija, naudojant 5 ′ nukreiptą galą. Visi šio naujojo metodo žingsniai yra nesudėtingi, o nežinomą seką galima tiksliai gauti, tik pritaikius metodą vieną kartą.

Įvadas

Genomo ėjimas (GW) yra pagrindinė molekulinės biologijos metodika, apimanti nepakopotos DNR sekos, apimančios sritį su žinoma seka 1, laipsnišką nustatymą. Ši metodika gali būti naudojama daugybėje atvejų, pavyzdžiui: 1) transposonų arba T-DNR ir egzogeninių genų įterpimo vietų identifikavimas transgeninėje technologijoje; 2) skatintojų ir reguliavimo elementų atskyrimas; 3) sutampančios dirbtinės chromosomos (PAC, YAC, BAC); 4) žemėlapių klijavimo sutapimų konstravimas; ir 5) naujų genų, susijusių su ligomis, atradimas 2, 3, 4, 5, 6 .

Dabartiniai GW metodai apima dvi kategorijas. Pirmai kategorijai priklauso atvirkštinis PGR (IPCR) ir kasetinis PGR, kuriems genomo suskaidymui reikia naudoti restrikcijos fermentus. IPCR yra ankstyviausias klonavimo būdas, paremtas įprastu PGR 7, kurio sėkmės laipsnis ir atkuriamumas yra žemas, nes jie priklauso nuo naudojamų endonukleazių efektyvumo ir savaiminio jungimosi greičio. Kasetiniai PGR metodai apima vienkartinio PGR, vienkartinio specifinio pradinio PGR, šabloną blokuojančią PGR, RCA – GIP, genomo eigą, vykstančią tiesiomis ligomis, sujungimą su liga, AT linkerio PGR 8, kilpų susiejimo PGR 9 ir kitus 10 . Dauguma aukščiau paminėtų metodų yra skirti PGR specifiškumui sustiprinti, pavyzdžiui, išlaikant adapterių jungimą, deformalizuojant 5 ′ galą arba naudojant ddNTP, kad blokuotų adapterio savaiminį ligavimą, arba naudojant aminogrupę. blokuoti adapterio prailginimą. Tačiau šie metodai yra neveiksmingi, jei genomas yra didelis arba neturi tinkamų restrikcijos endonukleazių vietų. Be to, šie metodai priklauso nuo daug laiko reikalaujančių ir daug darbo reikalaujančių fermentinių tikslinės DNR modifikacijų.

Antroji GW metodų kategorija neapima restrikcijos fermentų, kurie pirmiausia suvirškina genomą, ir apima pradmenų ir pratęsimo metodus 11, tokius kaip vietos nustatymo PGR, TAIL-PGR, pusiau atsitiktinio pradmens PGR ir dviejų pakopų. genų vaikščiojanti PGR. Tačiau nespecifinių DNR produktų generavimas yra pagrindinė šios kategorijos problema, ypač TAIL-PGR, o specifinis produktas retai gaunamas atlikus gelinę elektroforezę. Prastas atkuriamumas yra dar viena problema dėl naudojamų pradmenų atsitiktinumo.

Norėdami išvengti aukščiau paminėtų trūkumų, sukūrėme naują metodą, vadinamą atsitiktinai sulaužytu fragmento PGR su 5 ′ galu nukreiptu adapteriu, skirtu vaikščioti po genomą (RBF-PCR). RBF-PGR turi šiuos privalumus: 1) genomas yra atsitiktinai suskaidytas, nepriklausant nuo restrikcijos fermentų; 2) iš dalies atvirkščiai papildytų adapterių pora gali sukelti T / A specifinį sujungimą į fragmentų galus, o savaiminio sujungimo tarp adapterių efektyviai išvengia T išsikišimas 3 ′ gale; 3) PGR gali būti atliekama derinant skirtingus adapterio pradmenis su specifiniais pradmenimis; 4) nežinoma seka efektyviai gaunama klonuojant dominančius PGR produktus į vektorius, po to seka. Genetiškai modifikuotų kukurūzų LY038 (GM LY038) eksperimentiniai rezultatai parodė, kad RBF-PGR yra tinkamas vaikščioti po genomą ir gali būti naudojamas dideliu mastu.

Rezultatai

RBF-PGR principas

RBF-PGR principas parodytas 1 paveiksle. Pirmiausia, genomas atsitiktinai suskaidomas naudojant ultragarso procesorių. Norint gauti fragmentus su neryškiais galais, reikėjo papildomų žingsnių. AT yra perlenktas adapterio 3 ′ gale, kad būtų išvengta adapterio savaiminio sustingimo. Todėl, kai galai nublanksta, į suskaidytų fragmentų 3 ′ galus pridedami adeninai, kad būtų galima sujungti su adapteriais. Tuomet atliekama pusiau įdėta PGR, norint gauti žinomos sekos briaunų seką. Pusiau įterpti pradmenys yra sukurti taip, kad patektų į žinomos sekos sritį, ir mes juos pavadinome specifiniais pradmenimis (SP); kitas fiksuotas gruntas yra adapterio gruntas (AP).

Image

Dėžutėje esantys fragmentai yra lankytini objektai, kuriuose yra ir žinomų, ir nežinomų sekų.

Visas dydis

Pirmieji keli žingsniai yra panašūs į bibliotekos paruošimą kai kuriais naujos kartos sekų sudarymo metodais. Tačiau siekiant įsitikinti, kad šie žingsniai buvo tinkami atpažinti besiribojančias sekas, buvo atlikta daugybė modeliavimo eksperimentų ir realaus laiko PGR analizės, kad būtų patikrintas įgyvendinamumas ir optimizuotos sąlygos.

Genominės DNR suskaidymas

Genominei DNR suskaidyti panaudojome trijų skirtingų diametrų ultragarsinius zondus. Kaip parodyta 2 paveiksle, kai zondo skersmuo buvo 6 mm, ultragarso galią buvo lengva valdyti, o genomo DNR buvo tolygiai suskaidyta į 250–2000 bp diapazoną, naudojant šiuos ultragarso parametrus: laikas, 1 s; intervalas, 10 s; pakartokite, 30 kartų. Tuo tarpu PGR amplifikacija buvo atlikta labai tiksliai, kai šablono ilgis buvo 250–2000 bp. Priešingai, DNR nebuvo efektyviai suskaidyta naudojant 2 mm skersmens zondą. Tačiau padidėjęs ultragarso laikas padėjo išsilieti DNR skysčiui. Genomas buvo labai suskaidytas naudojant 3 mm skersmens zondą, todėl vėlesnes modifikacijas buvo sudėtinga ir susidarė trumpa genomo ėjimo seka. Todėl pasirinkome 6 mm skersmens zondą. Tuo tarpu mes pastebėjome, kad keičiant ultragarso trukmę galima kontroliuoti genomo DNR suskaidymo laipsnį. Be to, mes nustatėme, kad zondo skersmens pasirinkimas nebuvo svarbus mūsų tyrime naudojamo skysčio tūriui; mes tik siekėme gauti geriausią susiskaidymą.

Image

Ultragarso zondo skersmenys nurodyti paveikslėlyje. Kiekvienas ultragarso laiko impulsas buvo kartojamas 30 kartų; 1, 3 ir 5 juostų ultragarsinis laikas buvo 1 s, o 2, 4 ir 6 juostų - 2 s. M, žymeklis DL2000.

Visas dydis

Adapterio grunto pasirinkimas

Dėl to, kad adapteriai (papildoma S2 lentelė) iš dalies papildomi atvirkščiai, būtų keturių rūšių amplifikacijos stiliai (papildomas paveikslas S1), ir kiekvienam atskiram gruntui galima gauti du galimus amplifikacijos produktus. Mes panaudojome realaus laiko PGR, norėdami patikrinti, kuri pradmenų pora gali duoti patenkinamus amplifikacijos rezultatus. RTaq fermentas A ampluono 3 ′ gale po PGR buvo perrištas . Būtent dėl ​​„ rTaq“ fermento savybės PGR produktus galime laikyti genomo fragmentais, turinčiais neryškius galus ir pridedančius A 3 ′ galuose. Todėl mes tiesiogiai sujungėme PGR produktus su adapteriais, o ne su suskaidyta genomine DNR, o ligavimo produktai bus patikrinti kaip šablonas realaus laiko PGR. Tiesioginis PGR produktų, o ne suskaidytos genominės DNR panaudojimas buvo laiko taupymas. Šiame tyrime realaus laiko PGR buvo pasirinkta 673 bp amplikona.

673 bp amplikonas buvo amplifikuotas SP 673-F / R - DNR segmentu, esančiu GM LY038 genomo egzogeniniame geno regione; išsami vieta parodyta papildomame S2 B paveiksle. 673 bp amplikonai buvo liguojami prie adapterių, o po to jungimo produktai buvo 10 kartų praskiesti, kad būtų naudojami kaip šablonas realaus laiko PGR. Realiojo laiko PGR pradmenimis buvo imtasi SP vidinio F su AP1 arba AP2 (papildoma S2 C pav.). Kaip parodyta 3 paveiksle, AP1 ir AP2 Ct vertės buvo palyginamos, kai buvo naudojama aukšta šablono koncentracija. Tačiau, mažėjant šablono koncentracijai, pradiniai dimerai linkę į reakciją atsirasti, kai buvo naudojamas AP2, o tai gali būti priskiriama didesnėms AP1, palyginti su AP2, jungimosi ir amplifikacijos galimybėms. Be to, dėl to, kad AP2 seka buvo atvirkščiai papildyta Adapter-2 seka, amplifikacijos metu AP2 taip pat galėjo prisijungti prie kitų nespecifinių ligavimo produktų. Kaip parodyta Ct ir Tm reikšmėmis, SP kartu su AP1 davė geresnį amplifikacijos rezultatą nei AP2, be to, šio metodo specifiškumą galima sustiprinti, kai AP1 naudojame su SP.

Image

3 (a), (b) ir (c) paveiksluose pavaizduota realaus laiko PGR amplifikacijos kreivė, lydymosi kreivė ir standartinė AP1 kreivė. (D), (e) ir (f) paveiksluose pavaizduotos atitinkamos AP2 kreivės.

Visas dydis

RBF-PGR specifiškumas ir aptikimo riba

RBF-PGR specifiškumui patikrinti buvo naudojamas GM LY038 ir jo laukinis tipas. Įdėtieji pradmenys buvo pasirinkti SP 673-F ir SP internal-F, kiekvienam šablonui buvo ištirti du techniniai pakartojimai. Kadangi laukinio tipo genome nebuvo egzogeninio geno, po pusiau įdėto PGR amplifikacijos amplikonų gauti nereikėtų, nes nėra SP surišimo vietų. Kaip parodyta 4 paveiksle, po 2% agarozės gelio elektroforezės buvo stebimos išsklaidytos juostos (1 ir 2 juostos), kai kaip šablonas buvo naudojamas atsitiktinai suskaidytas GM LY038 genomas; ir tik pradmenų dimerai (3 ir 4 juostos) buvo stebimi, kai šablonu buvo naudojamas laukinio tipo genomas.

Image

Šablonas buvo GM LY038 genomas 1 ir 2 juostose; šablonas buvo laukinio tipo genomas 3 ir 4 juostose. M, žymeklis DL2000.

Visas dydis

Tyrimui atlikti buvo naudojami du PGR produktai - fragmentai 673 bp ir 218 bp be identiškos sekos (papildomas paveikslas S2 B), sukurti SP 673-F / R ir SP 218-F / R, naudojant šabloną GM LY038 genomą. RBF-PGR aptikimo riba realiojo laiko PGR. Po bendro PGR gavome 673 bp ir 218 bp amplikonus; šios amplikonai buvo sujungti atskirai su adapteriais ir išmatuotas ligavimo produkto kopijos numeris. Šiuos ligacijos produktus sumaišėme skirtingais santykiais, kad būtų galima imituoti DNR fragmentų būklę po ultragarso. 673 bp ligacijos produktai buvo laikomi tiksliniais šablonais, o 218 bp - kaip netiksliniais šablonais. Mes tik sumažinome 673 bp fragmento koncentraciją, kol nebuvo gauti amplikonai. Realaus laiko PGR naudojami pradmenys buvo AP1 ir SP vidinis F, galimai sustiprinantys 189 bp segmentą iš 673 ​​bp fragmento, kuris buvo beveik tokio paties ilgio kaip 218 bp amplikonas.

Kaip parodyta 1 lentelėje, kai 673 bp ir 218 bp produktų santykis buvo sumažintas iki 0, 0001: 1 (kopijos skaičiaus ekvivalentas 6: 6000), tiksliniai šablonai vis tiek buvo aptinkami. Remiantis lydymosi kreive (papildomas S3 paveikslas), amplifikacijos produkto nebuvo, kai šablonas buvo naudojamas netiksliniam 218 bp fragmentui. Taigi, besivystančias sekas tikrai galima gauti naudojant mūsų sukurtą metodą.

Pilno dydžio lentelė

AP / SP ir SP / SP amplifikacijos tapatumas

Amplikonai, sukurti naudojant SP 673-R ir SP internal-F, buvo išdėstyti regionuose, atitinkančiuose SP 673-R ir AP1. Mes išbandėme, ar AP / SP pradmenų pora turi tas pačias amplifikacijos galimybes kaip SP / SP pora tomis pačiomis šiluminio ciklo sąlygomis. Kaip parodyta 5 paveiksle, esant tokiai pačiai šablonų koncentracijai, SP / SP Ct vertė buvo šiek tiek mažesnė nei AP / SP, todėl gali būti, kad abu SP pradmenys galėjo veikti kartu sustiprindami taikinį. Tačiau per pirmuosius kelis AP / SP reakcijos PGR ciklus AP jungties vietos nebuvo, nes AP1 seka yra tokia pati kaip Adapter-1. SP gruntas pirmiausia surišo į tikslinį segmentą ir po kelių amplifikacijos ciklų AP1 pradmuo turi savo surišimo vietas ir atlieka savo vaidmenį. Grunto dimeriai pasirodė toje pačioje koncentracijoje; taigi AP / SP aptikimo riba buvo laikoma tokia pati kaip SP / SP.

Image

Visas dydis

AP ir SP santykis

Mes optimizavome AP ir SP santykį pusiau įdėtame PGR. 218 bp ir 673 bp fragmentai buvo sumaišyti, kad būtų imituojamas aptikimas. AP1 ir SP internal-F santykis buvo 10: 1, 4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 6 ir 1:10 (1 lygus 100 nM), ir amplifikacijos kreivės buvo palyginamos pagal realaus laiko PGR rezultatus (6 paveikslas ir papildoma S1 lentelė). Kai grunto santykiai buvo 1: 1, 1: 2 ir 1: 4 (paryškinti raudona spalva), lydymosi kreivių smailių aukštis buvo didesnis nei kitų, o Ct vertės buvo atitinkamai mažesnės. Nepaisant šių pastebėjimų, skirtumai tarp pradmenų santykio buvo nedideli, net tada, kai šablono koncentracija buvo maža. Ši išvada rodo, kad AP / SP santykis buvo platus, o optimalus rezultatas buvo gautas, kai SP koncentracija buvo didesnė už AP.

Image

6 pav. (A), amplifikacijos kreivė; b) lydymosi kreivė. Raudonos kreivės rodo AP / SP santykį 1: 1, 1: 2 ir 1: 4.

Visas dydis

GM LY038 genomo supančios srities analizė

Atlikdami RBF-PGR žingsnių seriją, mes gavome pusiau įdėto PGR produktus, kurių apimtis 500–2000 bp, kurių gausu, kaip rodo gelio elektroforezė. T-easy vektoriaus transformacija ir klonavimas buvo atlikti trimis egzemplioriais. Kiekvienai replikacijai paruošėme 10 dengimo terpių, kad pasirinktume mėlynai baltą spalvą. Kultūra buvo atrinkta šimtą baltų kolonijų, o po to sekvenuota (Sangonas, Šanchajus, Kinija). Sėkmingų sekos rezultatų skaičius pateiktas 2 lentelėje; tačiau sekos sekcija nebuvo sėkminga visais atvejais, dėl kokių priežasčių buvo galima paaiškinti šias priežastis. Pirma, kai kurie vektoriai buvo klaidingai teigiami tušti vektoriai. Antra, dėl kelių nespecifinių amplifikacijų sekos sudarymo rezultatas neatitiko nei adapterio sekos, nei LY038 egzogeninio geno. Nepaisant to, daugiau nei 65% sekos nustatymo rezultatų buvo neabejotinos išorinio LY038 geno sekančios sekos.

Pilno dydžio lentelė

Atlikę seką, gautų sekų analizei mes panaudojome BLAST, ir tik nedidelė jų dalis galėjo atitikti B73 kukurūzų genomą, kuris buvo visiškai sukomponuotas ir surinktas kukurūzuose. Laukinis LY038 tipas yra kukurūzų veislės linija H99, kuri nebuvo sekuota, ir skirtumas gali būti tarp dviejų genomų. Tada mes pateikėme gautas papildomas sekas „GenBank“, o „GenBank“ prisijungimo numeris yra KF425531; seka bus išleista į viešą duomenų bazę, kai tik jie bus apdoroti. Gautos sekos parodytos papildomose medžiagose S1 ir S2.

Labiausiai gausūs buvo fragmentai tarp 1000–1500 bp (2 lentelė), o sekų ilgio pasiskirstymas rodė varpelio formos kreivę. Remdamiesi rezultatais, gautais naudojant šį metodą, darome išvadą, kad nežinomą seką galima tiksliai ir užtikrintai gauti naudojant metodą tik vieną kartą, norint tęsti tolesnius tyrimus. Todėl, norint garantuoti nežinomos sekos gavimą ir taip pat išvengti pernelyg ilgo sekos darymo laiko, būsimų tyrimų metu sekos reakcijų skaičius turėtų būti sumažintas iki 30 ar net iki 10.

Diskusija

GW yra molekulinė technika, leidžianti tiesiogiai identifikuoti nukleotidų sekas iš tikslinių genomų. Vienintelis reikalavimas - ar yra žinoma nukleotidų seka, nuo kurios pradėti. Nors per pastaruosius 20 metų pranešta apie keletą techninių patobulinimų, skirtų patobulintiems GW metodams patobulinti, daugiausiai problemų kelia atkuriamumo, jautrumo ir specifiškumo stoka.

Palyginti su kitomis GW technologijomis, RBF-PGR turi ryškių pranašumų. Įrodyta, kad jis yra labai paprastas, bet griežtas genų vaikščiojimo metodas, pasižymintis dideliu jautrumu, be to, visus pasirinktus veiksmus lengva atlikti, pvz., Galų nykimas, adapterio surišimas ir T-vektoriaus klonavimas. Genomą ultragarsinis procesorius suskaido atsitiktine tvarka, o skaldytų segmentų laipsnį galima kontroliuoti keičiant ultragarso laiką ir dažnį. Šis genomo DNR paruošimo būdas nereikalauja didelio DNR vientisumo ar grynumo. Naudojant ultragarsinį procesorių, gaunami norimo ilgio fragmentai be fermentinio virškinimo.

Kita šio metodo naujovė yra 5 ′ nukreiptas adapteris. Iš dalies atvirkščiai papildytos sekos priverčia adapterius jungtis tiesiai prie tikslinių fragmentų galų. T perėjimas adapterio 3 ′ gale gali užkirsti kelią adapterių savaiminiam sujungimui. Kadangi PGR produktai yra pasklidę agarozės gelyje, perspektyviausius PGR produktus galima gauti ir klonuoti į vektorių sekai nustatyti. Po to sekos palyginimo rezultatai lyginami su pusiau įdėtais PGR pradmenimis ir žinomomis sekomis, o tie, kurie sutampa su dviem pradmenimis ir žinomomis sekomis, žymi norimas sekančias sekas.

Atlikdami daugybę žingsnių, mes galime pasiekti atsekamumą imituodami eksperimentą. Visus veiksmus lengva atlikti ir nereikia brangaus instrumento. Nežinomas sekas gauname per vieną RBF-PGR bandymą; tačiau besiribojančių sekų ilgis pirmiausia priklauso nuo dviejų veiksnių. Pirmasis veiksnys yra DNR genomo suskaidymo laipsnis apdorojant ultragarsu: kuo labiau suskaidytas genomas, tuo trumpesnę besiribojančią seką galime gauti. Antrasis veiksnys yra susijęs su sekos reakcijų skaičiumi. Remiantis mūsų patirtimi, labiau tikėtina, kad papildomos sekos sudarymo reakcijos sukurs ilgesnius besiribojančius regionus.

Visų pirma, šis metodas gali būti taikomas atliekant įvairius eksperimentus ir puikiai veiktų identifikuojant multiplekso įterpimo vietą. Atliekant specifines sekas, ypač turinčias sudėtingą antrinę ar tretinę struktūrą, genomo virškinimas gali nepavykti dėl restrikcijos endonukleazių apribojimų. Priešingai, genomo suskaidymas RBF-PGR metodu nebūtų ribojamas dėl šių priežasčių. Todėl RBF-PGR turi didelę pritaikymo galią ir turi daug galimų pranašumų.

Metodai

DNR ekstrahavimas

Genetiškai modifikuoto kukurūzo LY038 ir laukinio tipo sėklos buvo sumaltos į miltelius maišytuvu (papildomas paveikslas S2 A). Buvo išmatuotas 120 mg mėginio kiekis, norint išgauti genomo DNR, naudojant CTAB metodą 12 . DNR koncentracijos buvo nustatytos spektrofotometriniu būdu, esant 260 nm bangos ilgiui, naudojant UV / VIS spektrometrą (Kontron, Neufahrn, Vokietija). DNR grynumas buvo nustatytas apskaičiuojant A260 / A280 santykį.

Genomo DNR suskaidymas ir modifikavimas

Genominei DNR 13, 14 atsitiktinai suskaidyti buvo naudojamas ultragarso procesorius (Scientz JY92-IIN, Ningbo, Kinija). Ultragarso zondo skersmuo buvo 2, 3 ir 6 mm. Kiekviena genomo DNR grupė, suskaidyta skirtingais zondais, buvo apdorota tomis pačiomis ultragarso sąlygomis, įskaitant ultragarso intervalą, ultragarso impulsų pakartojimus ir bendrą DNR kiekį. Vienintelis skirtumas tarp grupių buvo ultragarso laikas nuo 1 s iki 2 s.

Bendras genomo DNR kiekis buvo ne mažesnis kaip 500 ng, o idealus tūris buvo 100 μL, kad būtų pakankamai genomo ultragarsu. Tada mėginys buvo išgrynintas TIANquick Midi gryninimo rinkiniu ir ištirpintas 30 μL ddH2O (Tiangenas, Kinija).

Trys fermentai buvo įpilti, kad fragmentai būtų neryškūs: T4 DNR polimerazė, Klenow DNR polimerazė ir T4 PNK (Takara, Kinija) 15, 16 . T4 DNR ligazės buferis su 10 mM dATP, dNTP mišiniu ir ddH2O buvo pridėtas prie bendro 100 μl tūrio. Reakcija buvo inkubuota terminiame cikleriu 30 minučių 20 ° C temperatūroje. Išblukę galų fragmentai buvo išgryninti TIANquick Midi gryninimo rinkiniu (Tiangenas, Kinija) ir ištirpinti 35 μL ddH2 O. Klenow exo (nuo 3 ′ iki 5 ′ exo minusas) ir dATP buvo pridėta pagal gamintojo instrukcijas, kad būtų gautas A peržengimas 3 'galuose, ir mišinys buvo inkubuotas 30 minučių 37 ° C temperatūroje. Produktai buvo išgryninti naudojant „MinElute PCR Purification Kit“ (Qiagen, Vokietija), kad būtų pašalinti visi likę reagentai, ir ištirpinti 15 μL ddH2O .

RBF-PCR adapterio projektavimas ir paruošimas

RBF-PGR adapterius sudarė 33 bazinės poros, iš dalies atvirkščiai papildytos viena su kita 11 bp; likusių 22 bp nebuvo. AT buvo perkabintas 3-ojo adapterio 1 gale, kad būtų išvengta sujungimo tarp adapterių. Ligacijos reakcijoje 1-asis adapteris gali jungtis prie fragmentų 5 'galų, o 2-asis adapteris gali jungtis prie fragmentų 3' galų. Vėlesniame pusiau įdėtame PGR amplifikacijos stilius buvo skirtingas derinant skirtingus AP su SP. Taikant genomo ėjimo metodą, svarbiausia buvo atsižvelgti į specifiškumą. Nesitikėta, kad adapterio seka sutaps su rūšimis, kurių nukleotidų kolekcijos duomenų bazėje dažniausiai ieško BLAST. SP buvo sukurti naudojant „ABI PRISM Primer Express 2.0“ programinę įrangą („Applied Biosystems“, Kalifornija, JAV).

Šiame tyrime RBF-PGR adapteriui sukurti buvo panaudota 20 μM Adapteris-1 ir Adapteris-2. Adapteriai 2 minutes denatūruoti 96 ° C temperatūroje ir lėtai atšaldomi iki kambario temperatūros, o tada suformuotas RBF-PCR adapteris praskiedžiamas atkaitinimo buferiu, kuriame yra 10 mM Tris-HCl (pH 8, 0), iki 20 μM.

Ligacija su adapteriu

Buvo panaudotas 10: 1 adapterio ir genomo DNR santykis, kad visi fragmentai būtų sujungti su adapteriais. Fragmentų ir adapterių mišinį inkubuodavome terminiame cikleriu 6 valandas 16 ° C temperatūroje, o nesusiję adapteriai buvo pašalinti gryninant. Produktas buvo išanalizuotas naudojant 2% agarozės gelio elektroforezę, po to atgaunant fragmentus, kurių intervalas buvo nuo 750 iki 2000 bp.

Gauti fragmentai buvo naudojami kaip šablonai amplifikacijai pusiau įdėtu PGR. Adapteriai 5 'ir 3' galuose buvo skirtingi: grunto AP1 seka buvo tokia pati kaip Adapter-1 5 'gale, o AP2 seka buvo atvirkštinis Adapter-2 komplektas 3' 3 sek. pabaiga. Taigi, AP1 ir AP2 buvo tiriami atskirai, norint nuspręsti, kuris iš jų būtų idealus pusiau įterptam PGR. Siekiant patvirtinti ir optimizuoti šį naują metodą, buvo atlikta bandomųjų eksperimentų serija, skirta nustatyti AP specifiškumą ir aptikimo ribą bei AP / SP koncentracijos santykį.

PGR būklė

Realaus laiko PGR reakcijos buvo vykdomos naudojant „ABI 7500“ („Applied Biosystems“, Kalifornija, JAV), naudojant šią programą: 2 min 50 ° C, 10 min 95 ° C, 40 15 s ciklų 95 ° C ir 1 min. esant 60 ° C. PGR reakcija buvo atlikta galutiniais 25 μL tūriais, kuriuose buvo 11, 25 μL 2, 5 × SYBR žaliojo pagrindinio mišinio (Tiangenas, Pekinas, Kinija), 3 μL šablono DNR ir 100 nM kiekvieno pradmens.

Pusiau įdėto PGR reakcijos buvo vykdomos 30 μL galutiniais tūriais, turinčiais 1 × Ex Taq buferio, 0, 2 mM dNTP, 0, 3 μM kiekvieno pradmens, 2, 5 vieneto Ex Taq DNR polimerazės (TaKaRa Biotechnology Co. Ltd., Kinija) ir 3 μL DNR šabloną. Visi amplifikacijos buvo atlikti naudojant ABI2720 terminį ciklą (Applied Biosystems, JAV), naudojant šiuos parametrus: vieną 5 minučių žingsnį 95 ° C temperatūroje, 35 ciklus 30 s 95 ° C temperatūroje, 30 s 60 ° C temperatūroje ir 30 s 72 ° C temperatūroje, vienas 5 minučių žingsnis 72 ° C temperatūroje.

Imitacijos eksperimentams naudojamos sekos yra išvardytos papildomoje S2 lentelėje. SP buvo suprojektuoti remiantis GM LY038 genomo egzogeniniais genais ir sudarė pusiau įterptus pradmenis; kitas fiksuotas gruntas buvo AP.

Genomo ėjimas ir sekų analizė

Genomo vaikščiojimui, įterpti pradmenys buvo sukurti remiantis LY038 genomo egzogeniniais genais. R1 – R5 buvo naudojami norint gauti dešinįjį GM LY038 genomo besiribojantį regioną ir buvo suprojektuoti remiantis LY038 genome įvestų egzogeninių genų seka dešinėje pasienio srityje. L1 – L5 buvo naudojami gauti LY038 genomo kairįjį kraštą ir buvo suprojektuoti atsižvelgiant į seką eksogeninių genų kairiajame krašte. Mūsų eksperimentuose naudojamos sekos yra išvardytos papildomoje S3 lentelėje.

PGR produktai buvo analizuojami 2% agarozės geliu; ir produktai, pasižymintys intensyviausiu dažymu, buvo atkurti. Tada fragmentai buvo liguojami į T-easy vektorių; plazmidė buvo transformuota į DH5α kompetentingas ląsteles ir sekos. Sekavimo pradmenys buvo sukurti remiantis vektoriaus 17 seka, o rezultatai buvo analizuojami naudojant DNAMAN programinę įrangą, kuri ieškojo sekų ir GM LY038 genomo panašumų.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.