Rapamicinas padidina plaučių fibroblastų ccn2 ekspresiją per fosfoinositido 3-kinazę | laboratorinis tyrimas

Rapamicinas padidina plaučių fibroblastų ccn2 ekspresiją per fosfoinositido 3-kinazę | laboratorinis tyrimas

Anonim

Dalykai

  • Tarpląstelinės signalinės molekulės

Anotacija

Per didelis jungiamojo audinio augimo faktoriaus (CTGF, CCN2) gaminimas ir padidėjęs aktyvuoto fibroblastų fenotipo motorinis pajėgumas prisideda prie idiopatinės plaučių fibrozės (IPF) patogenezės. Tačiau molekulės ir signalo keliai, reguliuojantys CCN2 ekspresiją ir plaučių fibroblastų migraciją, vis dar yra sunkiai pasiekiami. Mes hipotezuojame, kad rapamicinas, prisijungdamas ir blokuodamas rapamicino (mTOR) komplekso (mTORC) taikymą žinduoliams, daro įtaką CCN2 ekspresijai ir plaučių fibroblastų migracijai in vitro . Pirminiai normalūs ir fibroziniai žmogaus plaučių fibroblastai buvo išskirti iš trijų pacientų, kuriems buvo pirminis spontaninis pneumotoraksas, ir trijų, kuriems buvo IPF, plaučių audinių. Ląstelės buvo inkubuotos su įprasta terpe arba terpe, kurioje yra rapamicino, žmogaus rekombinantinio transformuojančio augimo faktoriaus (TGF) β1, arba abiem. Aptikta CCN2 ir audinių metaloproteinazės (TIMP) -1 ekspresijos ląstelėse arba supernatanto. Migracijos potencialui įvertinti buvo naudojamas žaizdų gijimas ir migracijos tyrimas. Rapamicino veikimo mechanizmui nustatyti buvo naudojami TGF-β I tipo receptoriai (TβRI) / Smad inhibitoriai, SB431542 ir fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) inhibitoriai, LY294002. Mes įrodėme, kad rapamicinas amplifikavo bazinę arba TGF-β1 sukeltą CCN2 mRNR ir baltymo ekspresiją normaliuose ar fibrotiniuose fibroblastuose, atlikus Smad nepriklausomą, bet nuo PI3K priklausomą kelią. Be to, rapamicinas taip pat sustiprino TIMP-1 raišką, kaip nurodyta ELISA. Tačiau žaizdų gijimas ir migracinis tyrimas parodė, kad rapamicinas neturėjo įtakos fibroblastų mobilumui. Bendrai kalbant, šis tyrimas reiškia reikšmingą fibrogeninį rapamicino indukcijos aktyvumą, suaktyvinant AKT ir indukuojant CCN2 ekspresiją in vitro, ir pateikiami galimi in vivo radinių mechanizmai, kurie anksčiau neparodė rafamicino antifibrotinio poveikio plaučių fibrozei.

Pagrindinis

Idiopatinė plaučių fibrozė (IPF) yra labiausiai paplitusi ir sunki idiopatinės intersticinės pneumonijos (IIP) forma, paprastai mirtina, vidutinis išgyvenimo laikas 2, 5–3, 5 metų. 1 Nors IPF etiologija ir patogenezė vis dar neaiški, dabar siūloma, kad epitelio ląstelių sužalojimo sukeltas nenormalus žaizdų gijimo procesas turi lemiamą reikšmę IPF pradėjimui ir progresui. 2 Plaučių fibroblastai yra pagrindinės efektorinės ląstelės, dalyvaujančios sutrikusiame žaizdų gijimo procese, nes jų per daug aktyvacija ir migracija bei perėjimas į miofibroblastus daugiausia prisideda prie pluoštinės tarpląstelinės matricos susidarymo. 3 Viena iš abejotinų fibroblastų savybių yra ta, kad jie gamina perteklinius autokrininius profibrotinius mediatorius, įskaitant jungiamojo audinio augimo faktorių (CTGF, CCN2). 4 CCN2 yra daugiafunkcinis tarpininkas, kurio disreguliuota išraiška pastebima sergant daugeliu fibroproliferacinių ligų. 5 Fibroblastai, esantys fibroziniame plaučiuose, taip pat pasižymi padidintu judrumu, primenančiu, kad IPF gali būti neoproliferacinis, į vėžį panašus plaučių sutrikimas. 6

Tačiau veiksniai ir pagrindiniai signalizacijos keliai, reguliuojantys CCN2 ekspresiją ir fibroblastų migraciją, nebuvo iki galo išaiškinti. Rapamicinas (sirolimuzas) daro stiprų imuninę sistemą slopinantį poveikį ir šiuo metu yra naudojamas transplantato atmetimo profilaktikai organų persodinimo recipientams. 7 Rapamicinas atlieka savo funkciją inaktyvuodamas rapamicino (mTOR) 1 komplekso (mTORC1) taikinį žinduoliams. 8 Ilgalaikis rapamicino poveikis arba daug didesnė jo koncentracija taip pat blokuoja naujo mTOR 2 komplekso (mTORC2) susidarymą ir slopina jo aktyvumą. 9, 10 Pagrindiniai paskesni „mTORC1“ taikiniai yra p70S6 kinazė 1 (p70S6K1) ir eukariotų inicijavimo faktoriaus 4E surišimo baltymas 1 (4E-BP1). 8 Be imunosupresinio poveikio, rapamicinas taip pat pasirodė esąs veiksmingas užkertant kelią fibrogenezei gyvūnų modeliuose. 11, 12, 13, tačiau tikslūs molekuliniai mechanizmai, pagrindžiantys rapamicino poveikį organų fibrozės prevencijai, išlieka menkai suprantami. Be to, antifibrotinis rapamicino poveikis buvo rimtai nuginčytas kituose tyrimuose, kurie parodė, kad rapamicinas neturėjo reikšmingo fibrozinio proceso pagerėjimo. 14, 15, 16 Taigi, mes siekiame ištirti galimus mechanizmus, galinčius paaiškinti prieštaringai vertinamas išvadas, parodydami, ar rapamicinas moduliuoja CCN2 ekspresiją ir plaučių fibroblastų migraciją in vitro .

MEDŽIAGOS IR METODAI

Tiriamųjų ir plaučių audinių įsigijimas

Plaučių audinys buvo gautas iš trijų IPF sergančių pacientų, kuriems buvo atlikta histologinė įprastos intersticinės pneumonijos įrodymai chirurginės plaučių biopsijos metu. IPF diagnozė buvo nustatyta remiantis standartinėmis Amerikos šlaunikaulio draugijos / Europos kvėpavimo organų draugijos rekomendacijomis. 1 histologinis normalus plaučių audinys, kaip kontrolinis, buvo gautas iš trijų pacientų, kuriems torakoskopijos metu buvo atliktas pirminis spontaninis pneumotoraksas, o oro nutekėjimas buvo susegtas. Visi eksperimentai buvo atlikti naudojant tris fibrozines ir normalias žmogaus plaučių fibroblastų (HLF) pirmines ląstelių linijas. Šį tyrimą patvirtino Sostinės Medicinos universiteto Pekino Chao-Yang ligoninės etikos komitetas ir, remiantis visų tiriamų asmenų institucinėmis gairėmis, buvo gautas informuotas rašytinis sutikimas.

HLF išskyrimas, pirminės kultūros ir identifikavimas

Kaip aprašyta anksčiau, pirminiam fibroblastų auginimui buvo naudojamas audinių gabalų tvirtinimo kultūros metodas. 17 Išsamios auginimo sąlygos buvo aprašytos papildomoje informacijoje. Kultūrinių pirminių plaučių fibroblastų identifikavimas ir grynumas buvo parodyti ankstesniuose mūsų darbuose. 18, 19

Ląstelių stimuliacija ir farmakologinis gydymas

Norint ištirti moduliacinį rapamicino (Sigma, San Franciskas, CA, JAV) poveikį ląstelių elgsenai, normalūs arba fibroziniai HLF (N- / F-HLF) buvo inkubuojami skirtingais laikotarpiais (1, 6, 12, 24 ir 48). h) su rapamicinu (5 ng / ml), nesant ar nėra transformuojančio augimo faktoriaus (TGF) -β1 (10 ng / ml, BD, San Diegas, CA, JAV). Rapamicino moduliaciniams mechanizmams HLF tirti buvo naudojami TGF-β I tipo receptoriai (TβRI) ir fosfoinositido 3-kinazės (PI3K) specifinis antagonistas (SB431542 ir LY294002; 5 ir 15 μM; Biotrend, Kelnas, Vokietija). Po apdorojimo kultūros supernatantai buvo surinkti ir fibroblastai perdirbti baltymų ir RNR ekstrakcijai.

RNR gryninimas ir realaus laiko RT-PGR

Visa RNR buvo išskirti iš HLF naudojant RNAeasy Miniprep rinkinį (Tiangenas, Pekinas, Kinija), o realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant ABI PRISM 7500 instrumentą (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) su SYBRGreen PGR reagentais (Tiangen), kaip aprašyta. papildomoje informacijoje. Tikslinių genų kartų pokytis buvo apskaičiuotas kaip 2 -ΔΔCT metodas. 20

Baltymų ekstrahavimas, SDS-PAGE ir netiesioginė imunobloto analizė

MTOR, S6K1, 4EBP1, AKT, Smad ir CCN2 ekspresija arba aktyvacija ląstelių lizatuose buvo nustatyta Western blot metodu. Kiekybiniai duomenys buvo gauti naudojant densitometriją, išmatuotą naudojant ImageJ programinę įrangą. Išsami informacija apie šiuos metodus pateikiama papildomoje informacijoje.

CCN2 / TIMP-1 ELISA tyrimas ląstelių kultūros supernatante

CCN2 ir metaloproteinazės (TIMP) -1 inhibitorių lygiai ląstelėse kondicionuojamose terpėse buvo išmatuoti naudojant komercinius žmogaus ELISA rinkinius (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Išsamią informaciją apie metodą galima rasti papildomoje informacijoje.

Netiesioginis imunofluorescencinis dažymas ir konfokalinė mikroskopija

Norėdami nustatyti p-Smad2 / 3 ir Smad2 / 3 raišką ir pasiskirstymą, dažymas buvo atliekamas su FITC konjuguotais ožkų anti-triušio antriniais antikūnais. Ląstelių vaizdai buvo užfiksuoti konfokaliniu lazeriniu skenavimo mikroskopu („Olympus“, Tokijas, Japonija). Tyrimai buvo atlikti taip, kaip aprašyta papildomoje informacijoje.

Žaizdų gijimo ir migracijos tyrimai

Žaizdų gijimo ir migracijos tyrimai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau. 21, 22 Norėdami gauti išsamesnės informacijos, apsilankykite papildomoje informacijoje.

Statistika

Analizėms buvo naudojama SPSS 13.0 (SPSS, Čikaga, IL, JAV) programinė įranga. Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± pus. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant dispersijos analizės (ANOVA) reikšmingumo testą. P reikšmės <0, 05 buvo laikomos reikšmingomis.

REZULTATAI

Rapamicinas sumažina mTOR / p70S6K / 4EBP1 signalizacijos kelio aktyvumą HLF

Iš pradžių mes siekėme išsiaiškinti, ar mTOR / p70S6K / 4EBP1 kelio fosforilinimo / aktyvacijos F-HLF reguliuoja rapamicinas. Mes nustatėme, kad rapamicino (0, 01–10 ng / ml) reikšmingai sumažėjo bazinio ar TGF-β1 sukeltos fosfo-mTOR / p70S6K / 4EBP1 ekspresija HLF (1 pav.). Anksčiau mes taip pat parodėme, kad rapamicinas mažina mTOR signalo aktyvumą N-HLF. 18

Image

Rapamicino poveikis mTOR / p70S6K / 4EBP1 signalo kaskados aktyvumui žmogaus fibroziniame plaučių fibroblastas. a ) Kairysis skydelis: HLF buvo inkubuojami su skirtingomis rapamicino dozėmis nuo 0, 01 iki 10 ng / ml 24 valandas. Atliktas Western blot tyrimas siekiant nustatyti bendrą ar fosforilintą (aktyvuotą) mTOR / p70S6K / 4EBP-1 formą. Gelis yra trijų nepriklausomų eksperimentų (kurių kiekvienoje yra dublikatų) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus, pavyzdys. Dešinysis skydelis: Fosfo-mTOR / S6K / 4EBP densitometrinė analizė, palyginti su visais mTOR / S6K / 4EBP lygiais. Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± sem ( n = 3) ** P < 0, 01, palyginti su kontroline grupe, išreiškiant p-mTOR / mTOR; # P < 0, 05, ## P < 0, 01, ### P < 0, 001 prieš kontrolinę grupę p-S6K / S6K atžvilgiu; $ $ P < 0, 01, palyginti su kontroline grupe p-4EBP / 4EBP atžvilgiu. ( b ) Kairysis skydelis: HLF buvo inkubuojami su skirtingomis rapamicino dozėmis (0, 01–10 ng / ml) 24 valandas, esant 10 ng / ml TGF-β1. Atlikta Western blot analizė, norint nustatyti bendrą ar fosforilintą (aktyvuotą) mTOR / p70 S6K / 4E-BP1 formą. Gelis yra trijų nepriklausomų eksperimentų (kurių kiekvienoje yra dublikatų) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus, pavyzdys. Dešinysis skydelis: Fosfo-mTOR / S6K / 4EBP densitometrinė analizė, palyginti su visais mTOR / S6K / 4EBP lygiais. Pateikti duomenys reiškia vidurkius ± sem ( n = 3). * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 palyginti su TGF-β grupe. Molekuliniai svoriai: p-mTOR / mTOR, 289 KDa; p-S6K / S6K, 70 KDa; „p-4EBP / 4EBP“, 15 kDa.

Visas dydis

Rapamicinas skatina bazinės ir TGF-β1 indukuotos CCN2 mRNR ir baltymų ekspresiją

Toliau norime ištirti, ar rapamicinas moduliuoja CCN2 ekspresiją tiek N-HLF, tiek F-HLF. Kaip parodyta 2a ir b paveiksluose, rapamicinas, priklausomai nuo dozės, reikšmingai sukėlė mNNR pastovų CCN2 lygį tiek N-HLF, tiek F-HLF. Tada mes panaudojome 5 ng / ml (efektyvesnę dozę) rapamiciną (su 10 ng / ml TGF-β1 arba be jo), kad papildomai parodytų jo moduliacinį poveikį CCN2 mRNR ekspresijai priklausomai nuo laiko. Kaip parodyta 2c ir d paveiksluose, 5 ng / ml rapamicinas nepaprastai padidino CCN2 mRNR ekspresiją nuo 1 iki 48 h, ypač kai kartu stimuliuojama 10 ng / ml TGF-β1. „Western blot“ ir ELISA tyrimai taip pat parodė, kad vien 5 ng / ml rapamicino arba kartu su 10 ng / ml TGF-β1 derinio reguliuota CCN2 baltymo ekspresija ląstelių lizate (3 paveikslas) ir auginimo terpėje (4 paveikslas) tiek N-HLF, tiek F -HLF.

Image

Rapamicinas padidina CCN2 mRNR ekspresiją normaliame ir fibroziniame fibroblastuose. ( a, b ) Serumo neturintys subkonfluentiniai N- / F-HLF 24 valandas buvo gydomi įvairiomis rapamicino dozėmis (0, 01–10 ng / ml). Po inkubacijos buvo išgauta bendra ląstelinė RNR, o CCN2 mRNR pusiausvyrinės būklės buvo nustatytos realaus laiko RT-PGR ir normalizuotos β-aktino mRNR. Parodytos vertės yra vidurkis ± sem ( n = 3 skirtingos ląstelių linijos, kiekviena su eksperimento kopijomis, * P < 0, 05, palyginti su kontroline transporto priemonės grupe). ( c, d ) Serumo neturintys subkonfluentiniai N- / F-HLF buvo suskirstyti į keturias grupes: kontrolinę grupę, rapamicino (5 ng / ml) grupę, TGF-β1 (10 ng / ml) grupę ir rapamicino + TGF-β1. bendro inkubacijos grupė. 1, 6, 12, 24 ir 48 val., Bendra ląstelinė RNR buvo išgauta, o CCN2 mRNR pusiausvyrinės būklės buvo nustatytos realaus laiko RT-PGR. Vertės reiškia vidurkį ± sem ( n = 3 skirtingos ląstelių linijos, kiekvienoje iš jų yra eksperimentiniai dublikatai, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001, palyginti su kontroline grupe).

Visas dydis

Image

Rapamicino, TGF-β1 arba abiejų sukeltas baltymo CCN2 ekspresija normaliame ir fibroziniame fibroblastuose. Serumo badavę subkonfluenciniai N- / F-HLF buvo suskirstyti į keturias grupes: kontrolinė grupė, rapamicino (5 ng / ml) inkubacijos grupė, TGF-β1 (10 ng / ml) grupė ir rapamicino + TGF-β1 koinkubacinė grupė. . Nesmulkintų ląstelių lizatai buvo surinkti RIPA buferiu, o SDS-PAGE paveikti 30 μg ląstelių ekstraktų. N-HLF ( a ) ir F-HLF ( b ) CCN2 ir β-aktino baltymų juosta buvo ištirta „ChemiDoc XRS“ per 1, 6, 12, 24 ir 48 valandas. Kairysis skydelis: Tipiškos Western blot juostos atspindi tris nepriklausomus eksperimentus (kiekviename yra dublikatai) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus. Dešinysis skydas: Densitometriniai rezultatai kaip CCN2 ir β-aktino santykis ir parodyti kaip vidurkis ± sem ( n = 3, * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001, palyginti su kontroline grupe). Molekuliniai svoriai: CCN2, 38 KDa; β-aktinas, 42 KDa.

Visas dydis

Image

Rapamicinas padidina CCN2 baltymo ekspresiją normalios ir fibrozinės fibroblastų terpėse. Ramūs N-HLF ( a ) ir F-HLF ( b ) buvo suskirstyti į keturias grupes: kontrolinė grupė, rapamicino (5 ng / ml) inkubacijos grupė, TGF-β1 (10 ng / ml) grupė ir rapamicinas + TGF-β1. bendro inkubacijos grupė. Ląstelių supernatantai buvo surinkti nurodytais laiko momentais, o sekrecinis CCN2 baltymas buvo nustatytas ELISA metodu. Stulpeliai rodo trijų nepriklausomų eksperimentų iš skirtingų ląstelių linijų su standartine paklaida vidurkį, kiekviename iš jų yra dubliuoti mėginiai. * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

PI3K, ne Smad, yra susijęs su Rapamicino poveikiu CCN2 ekspresijai HLF

Mes hipotezuojame, ar TβR1 / Smad taip pat dalyvauja teigiamame rapamicino poveikyje CCN2 raiškai HLF. Kaip parodyta 5a ir b bei 6a ir b paveiksluose, rapamicinas (5 ng / ml) nesugebėjo sukelti greito ar nuolatinio Smad2 / 3 fosforilinimo nuo 1 iki 48 valandų tiek F-HLF, tiek N-HLF. Priešingai, TGF-β1 (10 ng / ml) sukėlė nepaprastą ir pastovų Smad2 / 3 aktyvavimą, kaip tikėtasi. Tačiau pridėjus rapamicino, teigiamas TGF-β1 poveikis dar negali sustiprėti.

Image
Image

Smad2 / 3 aktyvacija ir vieta normaliame fibroblastas. ( a ) Ramūs N-HLF buvo stimuliuojami tirpikliu (-) arba rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml) arba abiem nurodytais laiko momentais. Tada ląstelės lizuojamos Western blot analizei ir tiriamos anti- (fosfo) -Smad 2/3 specifiniais antikūnais. Tipiškos Western blot juostos yra tipiškos trims nepriklausomiems eksperimentams (kiekviename yra dublikatai) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus. Molekulinė masė: (p) -Smad2 / 3, 58 KDa. ( b ) Densitometriniai rezultatai kaip p-Smad2 / 3 ir Smad2 / 3 santykis, išanalizuoti naudojant ImageJ programinę įrangą. Duomenys rodo vidurkius ± sem ( n = 3, * P < 0, 05, *** P < 0, 001 vs. kontrolinė grupė). ( c ) Ramūs N-HLF pirmiausia buvo imituojami nešikliu arba rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml) arba abiem 1 val. Tada ląstelės buvo fiksuotos ir dažytos anti-p-Smad2 / 3 antikūnais. Spalvoms gaminti buvo naudojami FITC konjuguoti ožkų antriniai antikūniai su triušiais. Branduoliams aptikti buvo naudojamas DAPI dažymas. Juosta rodo 20 μM.

Visas dydis

Image

Smad2 / 3 aktyvacija ir vieta fibroziniame fibroblastas. ( a ) Ramūs F-HLF buvo stimuliuojami tirpikliu (-) arba rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml) arba abiem, ir buvo lizuojami atliekant Western blot analizę. Juostos yra tipiškos trims nepriklausomiems eksperimentams (kiekvienas su dubliais) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus. Molekulinė masė: (p) -Smad2 / 3, 58 KDa. ( b ) Kiekybiniai rezultatai, išmatuoti naudojant „ImageJ“ programinę įrangą, rodo densitometriją kaip p-Smad2 / 3 ir Smad2 / 3 santykį. Duomenys reiškia vidurkį ± sem ( n = 3, * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 vs. kontrolinė grupė). c ) p-Smad2 / 3 tarpląstelinis lokalizavimas F-HLF tiriamas tiriant imuninę spalvą specifiniu p-Smad2 / 3 antikūnu po inkubacijos su rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml), arba abu po 1 h. Branduoliams aptikti buvo naudojamas DAPI dažymas. Juosta rodo 20 μM.

Visas dydis

Toliau mes sukūrėme eksperimentą, norėdami ištirti, ar rapamicinas paveikia p-Smad2 / 3 branduolio translokaciją HLF. Kaip parodyta 5c ir 6c paveiksluose, bazinėje būsenoje p-Smad2 / 3 buvo ekspresuojamas daugiausia N-HLF ir F-HLF citoplazmoje. Kai ląstelės 1 valandą buvo gydomos rapamicinu (5 ng / ml), branduolinis p-Smad2 / 3 translokacija N / F-HLF liko nepakitęs. Tačiau gydymas TGF-β1 arba esant rapamicinui, arba jo nesant 1 val., Žymiai paskatino p-Smad2 / 3 branduolio translokaciją. Be to, bendras Smad2 / 3 gali lokalizuotis tiek baziniame N- / F-HLF branduolyje, tiek citoplazmoje; tačiau branduolys buvo vyraujanti lokalizacijos vieta. Šiam požymiui nepaveikė nei rapamicinas, nei TGF-β1, nei abu (papildomi paveikslai S1 ir S2).

Trečia, mes panaudojome SB431542 (Smad inhibitorių), kad nustatytume, ar jis gali blokuoti teigiamą rapamicino poveikį CTGF ekspresijai N- / F-HLF. Vien SB431542 nesugebėjo sukelti pastebimo CTGF ekspresijos pokyčio N- / F-HLF (papildomas S3A ir C paveikslas). Be to, mes nustatėme, kad SB431542 (5 μM) nepakeitė rapamicino indukuotos CCN2 mRNR ekspresijos (7a ir d paveikslai, kairė skiltis). Didesnė SB431542 dozė (15 μM) netgi galėtų sustiprinti teigiamą rapamicino poveikį CCN2 ekspresijai. Priešingai, SB431542 (5 ir 15 μM) žymiai susilpnino CCN2 mRNR raišką, sukeltą apdorojant TGF-β1 (7b ir e paveikslai, vidurinė skiltis). N-HLF, SB431542 taip pat sumažino CCN2 mRNR raišką, kai ląstelės buvo gydomos tiek rapamcinu, tiek TGF-β1 (7c paveikslas). Tai prieštaravo SB431542 poveikiui F-HLF, kurie parodė, kad tai netgi palengvino CCN2 mRNR gamybą (7f pav.).

Image

SB431542 poveikis normalios ir fibrozinės fibroblastų CCN2 ekspresijai. Po inkubacijos su rapamicinu ( a ir d ), TGF-β1 ( b ir e ) arba abiem ( c ir f ), esant SB431542, 24 h, CCN2 mRNR pusiausvyrinės būklės N-HLF ( a - c ) ir F -HLF ( d - f ) buvo nustatyti kiekybine RT-PGR. Stulpeliai rodo trijų nepriklausomų eksperimentų, gautų iš trijų skirtingų ląstelių linijų, vidurkį ± sem iš trijų, kurių kiekviename yra dublikatai. *, **, *** Reikšmingas skirtumas, atitinkamai P <0, 05, P <0, 01, P <0, 001.

Visas dydis

Tada buvo ištirtas, ar PI3K kelias reguliuoja teigiamą rapamicino poveikį CCN2 ekspresijai N- / F-HLF. Pirmiausia parodėme, kad gydymas rapamicinu (5 ng / ml) reikšmingai skatino p-AKT (S473) raišką, ypač kai jis buvo gydomas TGF-β1 (10 ng / ml) (8a ir 9a paveikslai). LY294002, PI3K-AKT kelio inhibitorius, negali pakeisti bazinės CCN2 ekspresijos N- / F-HLF (papildomas S3B ir D paveikslas). Tačiau mes tada parodėme, kad LY294002 (5 ir 15 μM) visiškai užblokavo rapamcino sukeltą CCN2 mRNR (8b ir 9b paveikslai, kairysis skydelis). LY294002 taip pat reikšmingai sumažino TGF-β1 sukeltą CCN2 mRNR ekspresiją (8b ir 9b paveikslai, vidurinė plokštė). Be to, rapamicino ir TGF-β1 kartu stimuliuojami N-HLF / F-HLF taip pat parodė sumažintą CCN2 ekspresiją, kai jie inkubuojami su LY294002 (8b ir 9b paveikslai, dešinė panelė).

Image

PI3K-AKT dalyvavo normalios fibroblastų ekspresijoje CCN2. ( a ) Serumo neturintys N-HLF buvo stimuliuojami nešikliu (-) arba rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml) arba abiem, ir buvo lizuojami atliekant Western blot analizę. Kairysis skydelis: Parodyta, kad tipiškas gelis reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus (kiekvienas su dubliais) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus. Molekulinė masė: (p) AKT, 56 KDa. Dešinysis skydas: parodytas pensitometrinis p-AKT ir bendro AKT santykis su vidurkiu ± sem ( n = 3, * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 vs. kontrolinė grupė). ( b ) Po inkubacijos su rapamicinu, TGF-β1 arba abiem, esant LY-294002, 24 h, CCN2 mRNR pusiausvyrinės būklės buvo nustatomos kiekybine RT-PGR. Stulpeliai rodo trijų atliktų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± sem, kiekviename jų yra dublikatai. **, *** Reikšmingas skirtumas, atitinkamai P <0, 01, P <0, 001.

Visas dydis

Image

PI3K-AKT dalyvavo rapamicino ir TGF-β1 sukeltos fibrozinės fibroblastų CCN2 ekspresijoje. ( a ) Serumo neturintys F-HLF buvo stimuliuojami tirpikliu (-) arba rapamicinu (5 ng / ml), TGF-β1 (10 ng / ml) arba abiem ir buvo lizuojami Western blot analizei. Kairysis skydelis: Parodyta, kad tipiškas gelis reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus (kiekvienas su dubliais) iš trijų skirtingų ląstelių linijų, duodančių panašius rezultatus. Molekulinė masė: (p) AKT, 56 KDa. Dešinysis skydelis: parodytas pensitometrinis p-AKT ir bendro AKT santykis su vidurkiu ± sem ( n = 3, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 vs. kontrolinė grupė). ( b ) CCN2 mRNR pastovios būklės F-HLF buvo nustatyti kiekybine RT-PGR. Stulpeliai rodo trijų atliktų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± sem, kiekviename iš jų yra dublikatai. **, *** Reikšmingas skirtumas, atitinkamai P <0, 01, P <0, 001.

Visas dydis

Rapamicinas nedaro įtakos F-HLF migracijai

Anksčiau buvo parodyta, kad CCN2 ir audinių inhibitorių matricos metaloproteinazė-1 (TIMP-1) buvo sukurti moduliuojant skirtingų tipų ląstelių migraciją. 23, 24 ELISA tyrimais nustatyta, kad pats rapamicinas pastebimai padidino TIMP-1 baltymo lygį mitybinėse terpėse (10e pav.). Tačiau žaizdų gijimo tyrimas parodė, kad rapamicinas nepakeitė F-HLF migracijos gebėjimų (10a ir b paveikslai). Be to, tai dar buvo įrodyta kameros migracijos tyrimu (10c ir d pav.), Kuris parodė, kad rapamicinas neturėjo jokio reguliavimo poveikio ląstelių judėjimui iš viršutinės į apatinę kameras.

Image

Rapamicino poveikis migraciniam fibrozinio fibroblastų gebėjimui. ( a, b ) Serumo nematantys fibroziniai HLF buvo toliau inkubuojami 12, 24 ir 48 valandas, nesant rapamicino (5 ng / ml) DMEM, turinčiame 1% FBS. a ) Tipiškas žaizdų gijimo tyrimo pavyzdys. b ) Žaizdų tyrimo rezultatų santrauka. Reikšmės yra užgydytas žaizdos plotas, palyginti su įbrėžimo laiku; juostos rodo sem; ( c, d ): fibroziniai HLF buvo inkubuojami su terpe, kurioje be serumo, 24 valandas, po to dar 24 valandas pridedama įvairių rapamicino dozių (0, 1–10 ng / ml). Ląstelės buvo surinktos ir pasėtos viršutinėje miliporinių kamerų pusėje migruojančiai analizei. c ) Reprezentacinis transvero migracijos tyrimo pavyzdys. d ) Žaizdų tyrimo rezultatų santrauka. Reikšmės yra perkeltų HLF skaičius, palyginti su nešiklių grupe; juostos rodo sem ( e ) TIMISA-1 baltymo lygio ELISA testą ląstelių kultūros terpėje. Stulpeliai rodo trijų nepriklausomų eksperimentų su standartine paklaida vidurkį, kiekviename iš jų yra dubliuoti mėginiai. * P < 0, 05, ** P < 0, 01.

Visas dydis

DISKUSIJA

Šiuo metu rapamicinas buvo daugiausia naudojamas imunitetą slopinančiam gydymui dėl jo priešuždegiminių ir imunitetą mažinančių veiksmų. 7, 25 Tačiau mTOR yra visuotinai ekspresuojamas nepriklausomai nuo ląstelių tipų, todėl rapamicinas buvo palaipsniui naudojamas priešvėžiniame ir antivibraliniame terapijoje. 11, 26, 27 Mes panaudojome N- ir F-HLF, norėdami įrodyti, kad rapamicinas stipriai veikia tiesioginį profibrotinį aktyvumą, skatindamas CCN2 ekspresiją nuo Smad nepriklausomu ir nuo PI3K priklausomu būdu. Savo seseriniame darbe, 28, taip pat parodėme, kad rapamicinas sustiprina CCN2 raišką alveolių epitelio ląstelėse PI3K keliu. Be to, mes ir kiti taip pat parodėme, kad nors rapamicinas sumažino kolageno mRNR arba baltymo ekspresiją normaliame žmogaus fibroblastiniame 18, 29, tai netgi galėjo palengvinti kolageno I α1 mRNR ekspresiją esant TGF-β1 (nepublikuoti pirminiai duomenys), parodydami, kad pasroviui skirtus efektorius skirtingai moduliuoja mTORC, kai juos slopina rapamicinas, ir jie gali būti labai specifiški ląstelėms. Bendras rapamicino poveikis plaučių fibrozei priklauso nuo prieštaringai vertinamų funkcijų pusiausvyros plaučių struktūrinėse ląstelėse. Apsvarstydami sudėtingą rapamicino poveikį, mes ir kiti siūlome, kad jį klinikiniam naudojimui reikėtų naudoti atsargiai. 14, 15, 16, 30, 31 Be to, čia taip pat parodyta hipotezė, kad monoterapija rapamicinu gali būti nenaudinga, tačiau kombinuotas mTOR ir PI3K slopinimas gali būti veiksmingesnė plaučių fibrozės gydymo strategija.

CCN2 yra daugiafunkcinis matricellular baltymas, plačiai aprašytas dokumentuose, susijęs su įvairių fibroproliferacinių ligų progresavimu ir paciento baigtimi. 32 CCN2 reguliuoja įvairius ląstelių tipus, įskaitant plaučių II tipo alveolines ląsteles, mesangialines ląsteles ir intersticinius fibroblastus. 33 Šiame tyrime mes parodėme, kad rapamicinas (5 ng / ml) reikšmingai sustiprino bazinę CCN2 mRNR ir baltymo ekspresiją N- / F-HLF (2, 3, 4 pav.). TGF-β1 yra stiprus CCN2 induktorius, 34 taip pat nustatėme, kad rapamicinas dar labiau paskatino CCN2 ekspresiją N- / F-HLF, esant TGF-β1 (2, 3, 4 pav.), Rodantį galingą sinergetinį poveikį tarp jų. . Atsižvelgiant į tai, kad TGF-β1 signalas yra per daug aktyvuotas IPF plaučiuose ir fibroziniuose plaučiuose, fibroblastai reaguoja į rapamiciną gamindami CCN2, mūsų išvados rodo, kad IPF gydymas rapamicinu gali reikšmingai sustiprinti rapamcino ir TGF-β1 profibrotinį aktyvumą ir apsunkinti ligos evoliuciją. o ne palengvinti. Kitos išvados mus atitinka. Vienas tyrimas in vitro parodė, kad rapamicinas ir ciklosporinas A sinergiškai padidina žmogaus mezanialinių ląstelių (HMC) CCN2 ekspresiją ir taip pat gali turėti profibrozinį poveikį. 35 Kitas tyrimas in vitro parodė, kad rapamicinas transkripcijos būdu skatino CCN2 mRNR ir baltymų ekspresiją žiurkių mezangiškose ląstelėse (RMC). 36 In vivo tyrime 37 buvo naudojamas lėtinio nefrotoksiškumo žiurkių modelis, siekiant parodyti, kad rapamicinas dar labiau padidino CCN2 ekspresiją inkstų audinyje ir paskatino inkstų fibrozę. Tačiau kiti duomenys 38 taip pat parodė, kad rapamcinas sumažino lėtinę žmogaus transplantato nefropatiją, sumažindamas CCN2 ekspresiją. Tai atrodo gana paradoksalu. Mes siūlome, kad įvairios rapamicino dozės ir gydymo laiko langai bei skirtingi gyvūnų modeliai gali padėti suderinti neatitikimus, susijusius su moduliuotu rapamicino poveikiu CCN2 raiškai.

Bet kaip rapamicinas, slopindamas mTOR signalo kaskadą, skatina fibroblastų CCN2 ekspresiją? Ankstesnis tyrimas parodė, kad rapamicinas skatina CCN2 ir PAI-1 genų RMC ekspresiją priklausomai nuo TGF-β / Smad kaskados. 36 Tačiau mūsų tyrimai parodė, kad priešingai nei TGF-β1 (10 ng / ml), sukeliantis ankstyvą ir nuolatinį p-smad2 / 3 ekspresijos padidėjimą ir branduolinį perėjimą, rapamicinas negali (5 ir 6 paveikslai). Taip pat Smad signalui specifinis inhibitorius SB431542 galėtų iš dalies blokuoti CCN2 mRNR raišką, sukeltą TGF-β1, bet ne rapamicino (7 pav.). SB431542 taip pat iš dalies slopino rapamcino ir TGF-β1 sinergines funkcijas N-HLF, to nebuvo pastebėta F-HLF. Tai galima suprasti, kad F-HLF, SB431542 poveikis rapamicino kompensuoti ir nugalėti poveikį TGF-β1, todėl rapamcino ir TGF-β1 sukelta CCN2 ekspresija buvo net padidinta. Apibendrinant, mes manome, kad, skirtingai nuo TGF-β1, kuris sukelia CCN2 ekspresiją, iš dalies priklauso nuo smegenų signalo, teigiamas rapamcino poveikis CCN2 ekspresijai yra smegenų nepriklausomas.

Kaip alternatyva, mes nustatėme, kad rapamicinas palengvino N- / F-HLF AKT fosforilinimąsi S473, ypač ankstyvojo ekspozicijos metu ir inkubuojant su TGF-β1 (8a ir 9a pav.). Atsižvelgiant į tai, kad ūmus slopinamasis rapamicino poveikis visų pirma nukreiptas į mTORC1 (ne mTORC2), ir buvo įrodyta, kad mTORC2 yra Akt kinazė serine 473 padėtyje, 39, įtariame, kad neužblokuoto ar hiperaktyvaus mTORC2 pakanka fosforilinti AKT ir prisideda prie jo. iki ankstyvos AKT aktyvacijos, kurią sukelia rapamicinas. Nuolatinis rapamicino poveikis gali slopinti mTORC2, ypač kai rapamicino koncentracija yra santykinai aukšta, iki μM. 40 Iš viso šiame tyrime buvo naudojamas 5 ng / ml (5, 5 nM) rapamicinas, todėl vėlesnis slopinamasis poveikis mTORC2 gali būti ribotas. Taigi vien rapamicinas nesugebėjo sukelti reikšmingo Akt S473 fosforilinimo lygio sumažėjimo vėlesnėje stadijoje, ypač F-HLF (8a ir 9a pav.). Kita vertus, nuolatinis ir reikšmingas mTORC1 slopinimas lemia neigiamo grįžtamojo ryšio kilpos praradimą S6K 41 ir antrinį žinomos ar nežinomos kompensacinės kinazės aktyvavimą, kuris galiausiai padidina Akt S473 fosforilinimo lygį. Tai ypač pasakytina apie plaučių fibroblastus, nuolat veikiančius rapamicinu, esant TGF-β1 (8a ir 9a pav.). AKT fosforilinimas S473, kartu su T308, reikalingas maksimaliam Akt aktyvumui. Ankstesniame tyrime mes taip pat parodėme, kad rapamicinas suaktyvino PI3K (p110a), p-AKT (Thr308) ir p-AKT (Ser 473) skirtingose ​​plaučių epitelio ląstelių linijose. 28 Taip pat LY294002 beveik visiškai užblokavo rapamicino sukeltą bazinę CCN2 mRNR raišką, tai rodo, kad PI3K-AKT signalas prisidėjo prie teigiamo rapamicino poveikio CCN2 ekspresijai (8b ir 9b paveikslai). Tai atitiko mūsų ankstesnį tyrimą 28 ir neatitiko Osmano B tyrimo. Taigi signalo kelias, slypintis už teigiamą moduliacinį rapamicino poveikį, gali skirtis atsižvelgiant į skirtingo tipo ląsteles. Reikėtų toliau išaiškinti pagrindinius mechanizmus, susijusius su rapamicino veikimu fibroziniuose HLF. Kartu darome išvadą, kad rapamicinas blokuoja vieną PI3K-Akt signalizacijos išvestį (mTORC1) kitų išėjimų aktyvavimo sąskaita.

Anksčiau buvo įrodyta, kad CCN2 padidino monocitų ląstelių migraciją padidindamas monocitų chemoattraktanto baltymo (MCP-1) ekspresiją. Be to, įrodyta, kad kitas profibrotinis tarpininkas TIMP-1 skatina su vėžiu susijusių fibroblastų (CAF) migraciją. Taigi, mes iškėlėme hipotezę, kad ar rapamicinas, moduliuodamas CCN2 ir TIMP-1 ekspresiją, daro įtaką HLF migracijai. Mes nustatėme, kad rapamicinas reguliavo CCN2 ir TIMP-1 ekspresiją, tačiau fibroblastų migracija nepakito (10 paveikslas). Šie rezultatai suteikia bent dvi galimybes. Viena yra tai, kad mTORC1 signalo kelias neturi įtakos motoriniams fibroblastų gebėjimams. Kitas dalykas yra tas, kad mTORC1 gali paveikti ląstelių mobilumą, tačiau rapamicino dozė arba nustatymo laikas apima galimus pokyčius. Reikėtų atlikti papildomus tyrimus, siekiant parodyti rapamcino poveikį HLF migracijai ne tik bazinėje būsenoje, kurią chemiškai veikia tik vaisiaus vaisiaus serumo (FBS) koncentracijos gradientas, bet ir TGF-β1 sukeltoje būsenoje. Be to, reikėtų atlikti eksperimentus, siekiant nustatyti, ar rapamcinas moduliuoja kitus HLF funkcinius požymius, pavyzdžiui, diferenciacijos gebėjimą in vitro.

IŠVADA

Nepaisant naudingo vaidmens, mTOR inhibitoriai kai kuriais atvejais gali sukelti reikšmingą intersticinę pneumoniją ir ankstyvuosius fibrozinius pokyčius, iš esmės nežinomais mechanizmais. 30, 31 Šiame tyrime mes parodėme, kad plaučių fibroblastai reaguos į rapamiciną padidindami CCN2 ekspresiją PI3K-AKT keliu. Tiesą sakant, gydant navikus, buvo teigiama, kad grįžtamojo ryšio reguliuojamiems keliams slopinti taikoma monoterapija yra ribota, ir buvo siūloma, kad kombinuotas gydymas mTOR ir P3IK / MAPK inhibitoriais parodytų daugiau priešvėžinio aktyvumo daugelyje žmogaus piktybinių ligų. 42 Remdamiesi šia idėja, mes iškėlėme hipotezę, kad jei rapamicinas buvo naudojamas fibrozinių ligų gydymui, kombinuotas PI3K ir mTOR kelių slopinimas gali turėti papildomą anti-fibrozinį poveikį. Tolesni in vivo tyrimai turėtų būti skirti nustatyti, ar šie radiniai yra vertingi.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

  4. 4.

    Papildomas 4 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento laboratorinių tyrimų svetainėje (//www.laboratoryinvestigation.org).