Ras1ca per didelis ekspresija užpakalinėje šilko liaukoje pagerina šilko derlių | ląstelių tyrimai

Ras1ca per didelis ekspresija užpakalinėje šilko liaukoje pagerina šilko derlių | ląstelių tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Entomologija
  • Genetinė inžinerija
  • Genetinė hibridizacija
  • Vertimas
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2011 m. Birželio 2 d

Anotacija

Serologinis auginimas buvo labai pažengęs pritaikius hibridinio veisimo būdus prijaukintiems šilkaverpiams Bombyx mori , tačiau per pastaruosius dešimtmečius jis pasiekė plokščiakalnį. Pirmą kartą pranešame apie pagerėjusį šilko derlių GAL4 / UAS transgeniniame šilkaverpyje. Dėl per didelio Ras1 CA onkogeno ekspresijos, ypač užpakalinėje šilko liaukoje, fibroino gamyba ir šilko išeiga pagerėjo 60%, o maisto suvartojimas padidėjo tik 20%. Ras aktyvinimas dėl Ras1 CA perdėto ekspresijos užpakalinėje šilkmedžio liaukoje padidino efektinių baltymų Ras paspartėjusį fosforilinimo lygį, aukščiau reguliuojamą fibroino mRNR lygį, padidino bendrą DNR kiekį ir stimuliavo endoreplikaciją. Be to, dėl Ras1 aktyvacijos padidėjo ląstelių ir branduolių dydžiai, praturtėjo tarpląsteliniai organeliai, susiję su baltymų sinteze, ir stimuliuota ribosomų biogenezė mRNR transliacijai. Darome išvadą, kad Ras1 aktyvinimas padidina ląstelių dydį ir baltymų sintezę užpakalinėje šilko liaukoje, todėl pagerėja šilko derlius.

Įvadas

Hibridinis veisimas sąmoningai kerta artimai ar tolimai susijusias rūšis, kad atsirastų naujų linijų, turinčių norimų savybių. Ši įprasta technika buvo plačiai naudojama įvairių kultūrinių augalų ir gyvūnų derliui pagerinti. Nors hibridinis šilkaverpių veisimas praeityje davė didelę naudą serologinei kultūrai, per pastaruosius keturis dešimtmečius serologiškumas pasiekė plynaukštę, daugiausia dėl būdingos šios technikos ribos. Norint įveikti šilko gamybos kliūtis, naminiams šilkaverpiams „ Bombyx mori“ reikia sukurti naujus metodus, tokius kaip molekulinis veisimas. Molekulinis veisimas susideda iš dviejų šiuolaikinių veisimo strategijų, tai yra žymeklio pagalba atranka (MAS) ir žymeklio pagalba atliekamas kryžminimas (MABC). Transgeninis veisimas yra svarbiausia MABC technika 1 ir, manoma, turi didelę potencialą pagerinti šilko gamybą.

„ Bombyx“ šilko liauka susideda iš trijų regionų: priekinės, vidurinės ir užpakalinės šilko liaukos. Priekinė šilko liauka yra atsakinga už šilko verpimą, vidurinė šilko liauka išskiria sericiną, o užpakalinė šilko liauka gamina fibroiną. Šilko pluoštas pagamintas iš fibroino, o užpakalinės šilko liaukos pagamintas fibroinas yra tiesiogiai proporcingas šilko išeigai. Fibroino gamybą lemia du veiksniai: liaukos dydis ir fibroino baltymų sintezė užpakalinėje šilko liaukoje 2, 3, 4, 5, 6 . Labai patraukli yra idėja, kad padidinus užpakalinę šilko liaukos dydį ir (arba) stimuliuojant fibroino baltymų sintezę transgeniniu būdu, būtų galima pagerinti fibroino gamybą ir taip pagerinti šilko derlių, nors iki šiol apie tokius bandymus nebuvo pranešta.

Ras onkogenas koduoja mažą GTPazę, susijusią tiek su normaliu vystymu, tiek su abejotinais biologiniais procesais, tokiais kaip navikogenezė ir vystymosi sutrikimai. Ras aktyvinimas įgalina aukštą afinitetinę sąveiką su jo pasroviuose esančiais efektoriniais baltymais, įskaitant Raf ir PI3K110. Raf-MAPK ir PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP keliai dalyvauja įvairiuose ląsteliniuose ir molekuliniuose įvykiuose, ypač susijusiuose su ląstelių augimu ir baltymų sinteze 7 . Pvz., „ Ras CA “ per didelis ekspozicija vaisiaus, Drosophila melanogaster , priekinėje liaukoje, žymiai sumažina kūno dydį, padidindamas ląstelės dydį liaukoje ir skatindamas ekdizono gamybą 8 .

Bombyx genome 9, 10 yra trys Ras genai, tačiau jų biologinė reikšmė iš esmės nežinoma. Kadangi užpakalinė šilko liauka dramatiškai išauga per lervos gyvenimą, o jos baltymų sintezės pajėgumas yra ypatingai didelis paskutiniame 2, 3 etape, mes hipotezavome, kad Ras aktyvumas gali būti susijęs su fibroino gamybos ir šilko išeigos reguliavimu. Pateikiame pranešimą, kad naudojant dvejetainę GAL4 / UAS transgeninę sistemą 11, 12, padidėjęs onkologinio „Ras1 CA“ ekspresija konkrečiai „ Bombyx“ užpakalinėje šilko liaukoje padidina ląstelių dydį ir baltymų sintezę užpakalinėje šilko liaukoje ir pagerina šilko derlių. Derinant hibridinių ir molekulinių veisimo metodų savybes Bombyx, gali būti pasiektas naujas proveržis serologinėje kultūroje.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Endogeninis Ras aktyvumas koreliuoja su užpakalinių šilko liaukų augimu

Pirmiausia mes ištyrėme, ar Ras aktyvumas susijęs su fibroino gamyba ir šilko išeiga. MAPK, bendrojo Ras aktyvumo 7 rodmens, fosforilinimo lygiai užpakalinėje šilko liaukoje buvo matuojami kiekvieną dieną nuo 4 -ojo instinkto 2 dienos iki prepupalinės stadijos. MAPK fosforilinimas nebuvo aptinkamas ankstyvame 4 -ajame instarde, palaipsniui padidėjęs nuo 4 -ojo lervos molt iki 5 -ojo instarto 4 dienos, išliko aukštame lygyje iki klajojimo stadijos ir greitai sumažėjo per pupuliaciją (papildoma informacija, S1A pav.) . MAPK fosforilinimo modelis vystymosi metu koreliavo su užpakalinės šilko liaukos augimu ir šiek tiek prieš jį augo (papildoma informacija, S1B paveikslas). Taip pat buvo išmatuotas Akt fosforilinimo pobūdis užpakalinėje šilko liaukoje. Skirtingai nuo MAPK, Akt fosforilinimas neturėjo reikšmingos koreliacijos su užpakalinės šilko liaukos augimo greičiu (papildoma informacija, S2A pav.). Priežastis gali būti ta, kad Akt fosforilinimas atsiranda dėl kelių signalo perdavimo būdų, be „Ras-PI3K110“ kelio 7, 13 . Tada penktojo instinkto 1 dieną mes suleidome PI3K110 inhibitorių wortmanniną į lervas. Gydymas Wortmannin sumažino šilko liaukų dydį, sumažino viso kūno svorį ir sulėtino lervų vystymąsi (papildoma informacija, S2B-S2E pav.). Iš aukščiau pateiktų eksperimentinių duomenų darome išvadą, kad Ras aktyvumas teigiamai reguliuoja fibroino gamybą užpakalinėje šilko liaukoje.

„Ras1 CA“ per didelis ekspresija pagerina šilko derlių

Maždaug prieš 10 metų šilkaverpiams buvo nustatytas stabilus gemalo linijų transformacijos metodas, naudojant kaip transgeninį vektorių 14 perduodamą elementą piggyBac . Remiantis šiuo metodu, buvo sukurta dvejetainė GAL4 / UAS sistema tikslinei genų ekspresijai 11 ir buvo toliau taikoma nepilnamečio hormono esterazės 12 genų funkcijai analizuoti. Pagrindinis GAL4 / UAS sistemos pranašumas yra jos sugebėjimas nukreipti genų ekspresiją į specifinį audinį ar stadiją15.

Bombyx mieste Ras1 mutantas Ras1 V12 (vadinamas Ras1 CA ) yra iš esmės aktyvus 7, 9 . Norint pagerinti šilko derlių transgeninio veisimo būdu, buvo naudojama GAL4 / UAS sistema, kad būtų padidinta Ras1 CA ekspozicija, ypač užpakalinėje šilko liaukoje (1 paveikslas). Gauti transgeniniai šilkaverpiai, Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA [D (+) E (+)], užpakalinio šilko liaukos dydį padidino> 60%, palyginti su kontroliniais: laukinio tipo [D (-) E (- )], Fil-GAL4 [D (+) E (-)] ir UAS-Ras1 CA [D (-) E (+)], padidėjus moterų 100% dydžiui (2A-A paveikslas) ir ∼ Patinų dydis padidėjo 40% (papildoma informacija, S3A pav.). Atvirkščiai, vidutinės šilko liaukos audinių svoris 4 grupėse buvo beveik vienodas. Kokono svoris [D (+) E (+)] šilkaverpiuose padidėjo ∼ 40%, palyginti su kontroliniais (2B ir 2B paveikslai; papildoma informacija, S3B paveikslas), o tai buvo mažesnis proporcingas pokytis nei užpakalinės šilko liaukos svoris (60 pav. %). Taip yra todėl, kad kokoną sudaro tiek sericinas, kurį gamina vidurinė šilko liauka, tiek fibroinas, kurį gamina užpakalinė šilko liauka. Įdomu tai, kad, nors [D (+) E (+)] šilkaverpių lervų kūno svoris padidėjo ∼ 20% (2C paveikslas; papildoma informacija, S3C paveikslas), vyzdžių kūno svoris nepasikeitė (2D paveikslas; papildoma informacija, S3D paveikslas). ). Galime daryti išvadą, kad padidėjęs lervos kūno svoris atsirado dėl padidėjusio užpakalinės šilko liaukos dydžio.

Image

Dvejetainė GAL4 / UAS transgeninė šilkaverpių sistema ir 4 skirtingi fenotipai. (A) GAL4 (pBac {Fil-GAL4-3XP3-DsRed}) ir UAS (pBac {UAS-Ras1 v12 -3XP3-EGFP}) plazmidžių konstrukcijos. (B) UAS linijos kertamos su GAL4 linijomis, kad būtų sukurtos Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA linijos, kuriose Ras1 CA buvo specialiai ekspresuota užpakalinėje šilko liaukoje. Šio kirtimo palikuonys turi keturis skirtingus akių spalvos fenotipus (1) - nei DsRed2, nei teigiamas EGFP, laukinio tipo, [D (-) E (-)]; (2) tik DsRed2 teigiamos, GAL4 linijos, [D (+) E (-)]; (3) tik teigiamos EGFP, UAS linijos, [D (-) E (+)]; ir (4) tiek DsRed2 teigiamos, tiek EGFP teigiamos, GAL4 / UAS linijos, [D (+) E (+)].

Visas dydis

Image

Padidėjęs užpakalinio šilko liaukos dydis dėl „ Ras1 CA “ perraiškos labai padidina šilko derlių, tačiau turi palyginti nedidelį poveikį maisto vartojimui. Atliekami trys biologiniai pakartojimai ir pateikiami vieno pakartojimo rezultatai. Vidurkis ± SEM, n ≥ 25. Juostos, paženklintos skirtingomis mažosiomis raidėmis, labai skiriasi ( P <0, 05, ANOVA). Parodomi patelių duomenys. (A - A “), palyginti su kontroliniais šilkaverpiais: laukinio tipo [D (-) E (-)], Fil-GAL4 [D (+) E (-)] ir UAS-Ras1 CA [D (-) E (+)], užpakalinio šilko liaukos dydis transgeniniame šilkaverpyje Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA [D (+) E (+)] žymiai padidėja. (A) Priekinės šilko liaukos ir vidurinių šilko liaukų dydžiai nuo [D (+) E (+)] nepakinta, tačiau užpakalinės šilko liaukos dydis padidėja. Mėlyna rodyklė nurodo plotą, atskiriantį priekinę šilko liauką, ir vidurinę šilko liauką, o žalia rodyklė nurodo plotą, atskiriantį vidurinę šilko liauką ir užpakalinę šilko liauką. (A ' ir A') Užpakalinės šilko liaukos palyginimas. (B ir B ') Padidėja patelės [D (+) E (+)] kokono svoris. (C) Padidėja lervos kūno svoris [D (+) E (+)]. (D) Patelių kūno svoris [D (+) E (+)] nekinta. Penktojo instrato šėrimo etapui atlikti reikia dar [D (+) E (+)]> 6 valandų. Maisto suvartojimas padidėja [D (+) E (+)].

Visas dydis

[D (+) E (+)] šilkaverpiams prireikė ∼ daugiau 6 valandų 5 -ojo instaro maitinimo etapui atlikti nei kontroliniams šilkaverpiams (2E paveikslas). Taigi, [D (+) E (+)] šilkaverpiai 5 -ojo instaro metu suvalgė ∼ 20% daugiau šilkmedžio lapų (2F paveikslas). Atsižvelgiant į tai, kad šilko išeiga padidėjo 60%, o maisto suvartojimas padidėjo tik 20%, mes apskaičiuojame, kad [D (+) E (+)] šilkaverpiuose maistas paverčiamas šilku maždaug 30%, o tai rodo, kad papildomos maistas dažniausiai buvo paverstas padidintu užpakaliniu šilko liaukos dydžiu ir tokiu būdu gaunant šilką. Šie radiniai įrodo principą, kad transgeninis šilkaverpis Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA, kuris gamina daugiau šilko, bet vartoja tik šiek tiek daugiau maisto, turi potencialo serologinėje kultūroje.

Ras aktyvinimas stimuliuoja Ras pasroviuose esančius efektorius

Mes pagrindėme, kad padidėjęs užpakalinių šilko liaukų dydis [D (+) E (+)] šilkaverpiuose atsirado dėl Ras1 CA per daug ekspresijos ir dėl to Ras aktyvacijos. Kiekybinis realaus laiko PGR (qPCR) parodė, kad [D (+) E (+)] šilkaverpio užpakalinėje šilko liaukoje Ras1 mRNR lygis buvo ∼ 10 kartų didesnis nei kontroliniuose (3A pav.). Todėl Ras aktyvumas buvo žymiai padidintas (3B pav.), Kaip aptinkamas Ras aktyvinimo tyrimo rinkiniu, kurį sudaro GST sulietas baltymas, atitinkantis Raf-1 žmogaus Ras surišimo domeną. Be to, Ras1 aktyvinimas padidino MAPK, Akt, S6K ir 4EBP fosforilinimo lygius. Skirtingai nei „Ras“ pasroviui veikiantys efektoriai, „Ras1“ aktyvacija neskatino InR 16, kuris nėra „Ras“ pasroviui priklausantis efektorius, bet veikia priešais „Ras-Raf-MAPK“ ir „Ras-PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP kelius 13“, fosforilinimo. (3C pav.). Šie rezultatai rodo, kad „Ras“ pasroviuose esantys efektoriniai baltymai Raf ir PI3K110 buvo tiesiogiai suaktyvinti dėl „ Ras1 CA “ perdėtos ekspresijos užpakalinėje šilko liaukoje. Priešingai nei užpakalinė šilko liauka, vidurinėje šilko liaukoje nei Ras1 mRNR, nei fosforilinimo lygis Ras pasroviuose esančiuose efektoriniuose baltymuose neparodė jokių reikšmingų skirtumų tarp keturių grupių (duomenys nepateikti), patvirtindami, kad Fil-GAL4 konkrečiai genų ekspresija užpakalinėje šilko liaukoje 11 . Apibendrinant, darome išvadą, kad Ras1 CA per didelis ekspresija užpakalinėje šilko liaukoje padidina Ras aktyvumą ir stimuliuoja Ras pasroviuose esančius efektorius transgeniniame šilkaverpyje Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA.

Image

„Ras1 CA“ per didelis ekspresija užpakalinėje šilko liaukoje padidina „Ras1“ aktyvumą ir stimuliuoja „Ras“ pasroviui veikiančių efektorių fosforilinimą bei RpS6 baltymo lygį. Atliekami trys biologiniai pakartojimai ir pateikiami vieno pakartojimo rezultatai. Vidurkis ± SEM. Kiekviename pakartojime naudojami penki vyrai ir penkios moterys. (A) Ras1 mRNR lygis užpakalinėje šilko liaukoje nuo [D (+) E (+)] yra ∼ 10 kartų didesnis nei kontrolinių šilkaverpių [D (-) E (-)], [D (+) E (-)] ir [D (-) E (+)]. Skirtingos mažosiomis raidėmis pažymėtos juostos žymiai skiriasi ( P <0, 05, ANOVA). (B) Padidėja [D (+) E (+)] užpakalinės šilko liaukos ras aktyvumas. (C) padidėja MAPK, Akt, S6K ir 4EBP fosforilinimo lygis, taip pat RpS6 baltymų lygis, bet ne InR fosforilinimo lygis užpakalinėje šilko liaukoje nuo [D (+) E (+)]. Tubulinas naudojamas kaip krovimo kontrolė.

Visas dydis

Ras aktyvinimas padidina fibroino mRNR lygį ir bendrą DNR kiekį

Tada mes nustatėme, ar Ras aktyvinimas užpakalinėje šilkmedžio liaukoje reguliavo fibroino mRNR lygį transgeniniame šilkaverpio fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA. Kaip nustatė qPCR, trijų pagrindinių fibroino genų, fibrino sunkiosios grandinės ( Fih ), Fil ir p25 mRNR lygiai užpakalinėje šilko liaukoje iš [D (+) E (+)] šilkaverpių buvo sureguliuoti nuo 2 iki iki 3 kartus daugiau, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis (4A-4C paveikslas). Transkripcijos faktoriaus geno bHLH , kuris yra ekspresuojamas tik šilko liaukoje ir reguliuojantis fibroino genus 17, 18, mRNR lygis buvo ∼ 3 kartus didesnis [D (+) E (+)] šilkaverpiuose nei kontroliniuose ( 4D pav.). Raso aktyvacijos mechanizmas, reguliuojantis bHLH ir fibroino genus, yra neaiškus ir vertas tolesnio tyrimo.

Image

Ras1 aktyvinimas užpakalinėje šilko liaukoje reguliuoja fibroino baltymų mRNR kiekį, padidina bendrą DNR kiekį ir stimuliuoja endoreplikaciją. Atliekami trys biologiniai pakartojimai ir pateikiami vieno pakartojimo rezultatai. Vidurkis ± SEM. Kiekviename pakartojime naudojami penki vyrai ir penkios moterys. Skirtingos mažosiomis raidėmis pažymėtos juostos žymiai skiriasi ( P <0, 05, ANOVA). (A - D) Trijų pagrindinių fibroino baltymų genų, fibrino sunkiosios grandinės ( Fih ) (A), fibroino lengvosios grandinės ( Fil ) (B) ir p25 (C) mRNR lygis, taip pat transkripcijos faktoriaus genas bHLH (D). užpakalinėje šilko liaukoje nuo [D (+) E (+)] yra 2–3 kartus, palyginti su kontroliniuose šilkaverpiuose [D (-) E (-)], [D (+) E (-) ] ir [D (-) E (+)]. (E ir F) Bendras DNR kiekis (E) ir ciklino E ( CycE ) ir ciklino D ( CycD ) (F) mRNR lygis užpakalinėje šilko liaukoje nuo [D (+) E (+)] yra 2–3. palyginti su valdikliais.

Visas dydis

Šilko liauka yra tipiškas endoreplikacinis audinys 19 . Jos endoreplikacijos ciklai, kuriuos galima įvertinti pagal bendrą DNR kiekį, tiesiogiai atspindi šilko išeigą 4 . Palyginti su kontrolinėmis medžiagomis, bendras DNR kiekis užpakalinėje šilumnešio [D (+) E (+)] šilkaverpėje buvo beveik dvigubai didesnis (4E pav.), Tai reiškia, kad Ras aktyvinimas skatina endoreplikacinius ciklus. Raf-MAPK kelias vaidina lemiamą vaidmenį kontroliuojant ląstelių dauginimąsi. MAPK susideda iš 3 pošeimių, ERK, JNK ir P38. Aktyvuotas MAPK persikelia į branduolį ir fosforilina transkripcijos veiksnius, tokius kaip Myc, ELK ir Jun. Šie transkripcijos veiksniai aukščiau reguliuoja ciklino genus, kurie stimuliuoja nuo G1 iki S fazės progresiją ląstelių cikle 7, 20 . Lygiagrečiai Signalizavimas per TORC1-S6K / 4EBP taip pat suaktyvina „Myc“, kad padidintų ciklino genų 21 reguliavimą . Drosophila , Cyclin E ir Cyclin D skatina lervų audinių endoreplikaciją 22, 23 . Atsižvelgiant į dvigubai padidintą DNR kiekį, ciklino E ir ciklino mRNR lygiai užpakalinėje šilko liaukoje [D (+) E (+)] buvo ∼ 3 kartus didesni nei kontroliniuose (4F pav.). Norėdami patvirtinti, kad [D (+) E (+)] šilkaverpiuose buvo stimuliuojami užpakalinių šilko liaukų endoreplikaciniai ciklai, ankstyvojo klajonių etapo metu ištyrėme endoreplikacinį aktyvumą BrdU ženklinimu. BrdU ženklinimas užpakalinėse šiluminių kirmėlių (D (+) E (+)) šiluminėse liaukose buvo daug stipresnis nei kontroliniuose (papildoma informacija, S4 pav.). Kaip parodyta 2E paveiksle, [D (+) E (+)] šilkaverpiams prireikė dar 6 valandų, kad būtų baigtas 5 -ojo instaro maitinimas, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis, ir tai rodo, kad papildomos 6 valandos gali suteikti pakankamai laiko užpakaliniam užpakaliui. transgeninių šilkaverpių šilko liauka, kad galėtų atlikti papildomą endoreplikacinį ciklą. Šie rezultatai rodo, kad Ras aktyvinimas reguliuoja cikliną E ir cikliną D , skatina endoreplikacinius ciklus ir padidina bendrą DNR kiekį transgeninio šilkaverpio Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA užpakalinėje šilko liaukoje.

Ras aktyvinimas padidina ląstelių dydį ir baltymų sintezę

Galutinis ląstelių skaičius Bombyx šilko liaukoje nustatomas ankstyvoje embriono stadijoje. Tačiau ląstelių dydis didėja vėlyvojo embriono vystymosi metu ir toliau didėja per visas 3, 19 lervų stadijas, tai rodo, kad šilkaverpio užpakalinę šilko liaukos dydį lemia ląstelių dydis, o ne ląstelių skaičius. Kadangi Fil-GAL4 11 yra specifiškai ekspresuojamas užpakalinėje šilko liaukoje vėlyvųjų lervų stadijose, padidėjęs užpakalinės šilko liaukos dydis, kurį sukelia Ras aktyvinimas, turėtų atsirasti dėl padidėjusio ląstelių dydžio. Nors ląstelių dydžio kontrolė dar nėra gerai apibūdinta Bombyx , ji yra gerai suprantama Drosophila . Evoliuciškai konservuotas insulino / insulino tipo augimo faktoriaus signalizacijos kelias (IIS) Drosophila vaidina lemiamą vaidmenį kontroliuojant nuo maistinių medžiagų priklausomą ląstelių augimą 13, 24 . Be kanoninio IIS kelio, TORC1 kelias skatina ląstelių augimą veikdamas transliacinę iniciaciją, ribosomų biogenezę ir maistinių medžiagų kaupimąsi 25, 26 . Nors apie IIS-TORC1 kelius Bombyx 16, 27 yra mažai žinoma, Ras aktyvinimas žymiai padidino Akt, S6K ir 4EBP fosforilinimo lygius (3C pav.) Ir teigiamai paveikė ląstelių dydį užpakalinėje šilko liaukoje (2A paveikslas; papildoma informacija, S3 pav.). Optinė mikroskopija parodė, kad [D (+) E (+)] šilkaverpių užpakalinės šilko liaukos ląstelių dydis žymiai padidėjo padidėjus branduoliams (5A ir 5A 'pav.; Papildoma informacija, S5 pav.). Tada mes ištyrėme [D (+) E (+)] šilkaverpių užpakalinių šilko liaukų ląstelių ultrastruktūrinius pokyčius, naudodami perdavimo elektronų mikroskopiją. Panašiai kaip optinės mikroskopijos rezultatai, branduoliai buvo padidinti, tačiau išlaikė įprastą morfologiją (5B ir 5B 'pav.). Be to, su baltymų sinteze susiję subceluliniai organeliai, įskaitant šiurkštųjį endoplazminį tinklainę, mitochondrijas ir sekrecines pūsleles, buvo žymiai praturtinti (5C-5D paveikslas). Padarėme išvadą, kad ląstelių dydis ir baltymų sintezė padidėja transgeninio šilkaverpio Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA užpakalinėje šilko liaukoje.

Image

Ras1 aktyvinimas užpakalinėje šilko liaukoje padidina ląstelių ir branduolių dydį ir praturtina tarpląstelinius organelius, susijusius su baltymų sinteze. (A ir A ') Užpakalinės šilko liaukos optinės mikroskopijos stebėjimai. Ląstelių dydis ir branduolių dydis (nukreiptas rodyklėmis) užpakalinėje [D (+) E (+)] (A ') šilko liaukoje buvo padidintas, palyginti su [D (-) E (-)] (A) . Šiuose eksperimentuose naudojamos patelės. (B - C ') Užpakalinės šilko liaukos ląstelės perdavimo elektronų mikroskopijos stebėjimai. Užpakalinės šilko liaukos ląstelių, esančių iš [D (+) E (+)] (B '), branduolių dydis yra padidintas reguliariai morfologiškai, palyginti su [D (-) E (-)] (B) . Su baltymų sinteze susiję tarpląsteliniai organeliai, įskaitant neapdorotus endoplazminius tinklainius (RER, trumpas strėles), mitochondrijas (vidurines strėles) ir sekrecines pūsleles (ilgas strėles), yra praturtinti užpakalinėje šilko liaukos ląstelėje, esančioje [D (+) E (+)]. (C '), palyginti su [D (-) E (-)] (C) . (D) Statistinis RER, mitochondrijų ir sekrecinių pūslelių palyginimas užpakalinėse šiluminės liaukos ląstelėse [D (+) E (+)] ir [D (-) E (-)]. Vidurkis ± SEM. Skirtingos mažosiomis raidėmis pažymėtos juostos žymiai skiriasi ( P <0, 05, ANOVA).

Visas dydis

Ras aktyvinimas padidina ribosomų biogenezę

Ras stimuliuojami baltymai TORC1 ir Myc vaidina lemiamą vaidmenį reguliuojant baltymų sintezę, iš dalies reguliuodami ribosomų biosintezės genus ir taip skatindami ribosomų biogenezę 13, 20, 24, 25, 26 . Šiurkščių endoplazminių tinklainių praturtėjimas [D (+) E (+)] šilkaverpiuose (5C ir 5C 'paveikslai) rodo padidėjusią ribosomų biogenezę. qPCR atskleidė, kad kelių ribosominių baltymų genų, įskaitant mRpL1 , RpL12 , RpS13 ir RpS6 , mRNR lygis buvo padidintas 2–3 kartus [D (+) E (+)] šilkaverpių užpakalinėje šilko liaukoje. ankstyvas klajojimo etapas (6 paveikslas). Be to, Western blot analizė parodė, kad RpS6 baltymų lygis buvo žymiai padidėjęs (3C pav., RpS6). Šie duomenys rodo, kad, atsižvelgiant į tarpląstelinių organelių praturtėjimą, susijusį su baltymų sinteze (5C-5D paveikslas), Ras1 aktyvinimas stimuliuoja ribosomų biogenezę mRNR transliacijai. Šie pokyčiai padidina baltymų sintezės gebėjimą transgeninio šilkaverpio Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA užpakalinėje šilkmedžio liaukoje.

Image

Ras1 aktyvacija užpakalinėje šilko liaukoje reguliuoja ribosomų baltymų genus. 4 ribosomų baltymų genų, įskaitant mRpl1 (A), Rpl12 (B), RpS13 (C) ir RpS6 (D), mRNR lygis užpakalinėje šilko liaukoje iš [D (+) E (+)] yra 2–3. kartus, palyginti su kontroliniuose šilkaverpiuose [D (-) E (-)], [D (+) E (-)] ir [D (-) E (+)]. Atlikti trys biologiniai pakartojimai, gauti iš pateiktas vienas pakartojimas. Vidurkis ± STEDV. Kiekviename pakartojime naudojami penki vyrai ir penkios moterys. Skirtingos mažosiomis raidėmis pažymėtos juostos žymiai skiriasi ( P <0, 05, ANOVA).

Visas dydis

Remdamiesi eksperimentiniais duomenimis, mes siūlome hipotetinį mechanizmą, kuris pagerina šilko derlių transgeniniame šilkaverpyje Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA (papildoma informacija, S6 pav.). Pirmiausia, dėl Ras1 CA perdėtos ekspresijos padidėja Ras aktyvumas, dėl to fosforiluojasi Rasos pasroviuose esantys efektoriniai baltymai Raf ir PI3K110, kurie savo ruožtu aktyvuoja Raf-MAPK ir PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP kelius (3 paveikslas). Antra, aktyvuoti Raf-MAPK ir PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP keliai aukštyn reguliuoja cikliną E ir cikliną D (4F pav.), Kurie skatina endoreplikacinius ciklus (papildoma informacija, S4 pav.) Ir padidina bendrą DNR kiekį (4E paveikslas). ). Aktyvuotas PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP kelias taip pat padidina ląstelių dydį (5A ir 5A 'pav.; Papildoma informacija, S5 pav.), Stimuliuodamas transliacijos inicijavimą, ribosomų biogenezę ir maistinių medžiagų kaupimąsi (5C-5D ir 6 paveikslai). Padidėjęs ląstelių dydis ir padidėję endoreplikaciniai ciklai lemia padidėjusį užpakalinį šilko liaukos dydį. Trečia, aktyvuotas PI3K-Akt-TORC1-S6K / 4EBP kelias stimuliuoja ribosomų biogenezę mRNR transliacijai, todėl padidėja baltymų sintezės galimybės (5C-5D ir 6 paveikslai). Per nežinomą mechanizmą, Ras aktyvinimas reguliuoja bHLH ir fibroino baltymų genus (4A-4D paveikslas). Stimuliuojamas baltymų sintezės pajėgumas ir padidėjęs fibroino mRNR lygis padidina fibroino baltymų sintezę. Galiausiai, padidėjus užpakalinės šilko liaukos dydžiui ir fibrino baltymų sintezei užpakalinėje šilko liaukoje, galiausiai padidėja fibroino gamyba ir tokiu būdu šilko išeiga (2 pav.; Papildoma informacija, S3 pav.).

Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita apie naudingą nepageidaujamą audinių vystymąsi, kurį sukėlė Ras per didelis ekspresija. Padarome išvadą, kad transgeninį šilkaverpį Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA galima panaudoti serologinėje kultūroje. Kadangi transgeninių šilkaverpių tyrimams buvo naudojama laboratorinė „Dazao“ padermė, mes negalėjome ištirti jokių šilko kokybės pokyčių. Pramoniniame šilko gamyboje transgeninis veisimas turėtų būti atliekamas hibridinėse šilkaverpių padermėse, kurios paprastai naudojamos tarpkultūrinėje pramonėje. Derinant hibridinių ir molekulinių veisimo metodų savybes Bombyx, gali būti pasiektas naujas proveržis serologinėje kultūroje.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija, S1 pav

    MAPK fosforilinimo lygis koreliuoja ir šiek tiek viršija užpakalinės šilko liaukos augimo greitį.

  2. 2.

    Papildoma informacija, S2 pav

    Dėl PI3K110 aktyvumo slopinimo sumažėja šilko liaukos dydis.

  3. 3.

    Papildoma informacija, S3 pav

    Padidėjęs užpakalinio šilko liaukos dydis dėl „ Ras1 CA“ ekspresijos labai padidina šilko derlių.

  4. 4.

    Papildoma informacija, S4 pav

    „BrdU“ etiketė užpakalinėje šilko liaukoje nuo [D (+) E (+)] (A ’) yra stipresnė nei kontroliniuose elementuose [D (-) E (-)] (A).

  5. 5.

    Papildoma informacija, S5 pav

    Suaktyvinus Ras1, padidėja užpakalinės šilko liaukos dydis, stebimas atliekant optinę mikroskopiją.

  6. 6.

    Papildoma informacija, S6 pav

    Siūlomas modelis parodo, kad padidėja užpakalinės šilko liaukos dydis ir stimuliuojamas fibroino baltymų sintezė, naudojant Ras1 CA, per daug ekspresuojant transgeninį šilkaverpį Fil-GAL4 / UAS-Ras1 CA.

  7. 7

    Papildoma informacija, S1 lentelė

    Visi šiame darbe naudojami gruntai

    ( Papildoma informacija yra susieta su internetine straipsnio versija ląstelių tyrimų svetainėje .)