Rasgrp3 riboja makofaguose atsirandantį panašų receptorių sukeltą uždegiminį atsaką, suaktyvinant mažą rap1 gtpazę | gamtos komunikacijos

Rasgrp3 riboja makofaguose atsirandantį panašų receptorių sukeltą uždegiminį atsaką, suaktyvinant mažą rap1 gtpazę | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Uždegimas
  • Signalo perdavimas
  • Į rinkliavas panašūs receptoriai

Anotacija

Priimančiosios imuninės ląstelės gali aptikti ir sunaikinti įsiveržusius patogenus per modelio atpažinimo receptorius. Mažos rapo GTPazės veikia kaip konservuoti molekuliniai jungikliai, jungiantys tarpląstelinius signalus su įvairiomis ląstelių reakcijomis, tačiau jų, kaip reguliatorių, veikiančių signalus į Toll-panašių receptorių (TLR) signalus, vaidmuo nebuvo iki galo išaiškintas. Mes pranešame, kad Ras guanino nukleotidus atpalaiduojantis baltymas 3 (RasGRP3), guanino nukleotidų mainų faktorius, aktyvinantis Rasą ir Rap1, riboja proinflammatorinių citokinų (ypač IL-6) susidarymą makrofaguose, aktyvuodamas Rap1, kai aktyvinamas žemas TLR agonistų kiekis. . Mes parodėme, kad RasGRP3, dominuojantis RasGRPs narys makrofaguose, blogina TLR3 / 4/9 sukeltą IL-6 gamybą ir palengvina dekstrano sulfato natrio sukeltą kolitą ir kolageno sukeltą artritą. RasGRP3 trūkumu turinčiose RAW264.7 ląstelėse, gautose redaguojant CRISPR-Cas9 genomą, TLR3 / 4/9 sukelta Rap1 aktyvacija buvo slopinama, o ERK1 / 2 aktyvacija buvo sustiprinta. Mūsų tyrimas rodo, kad RasGRP3 riboja uždegiminį atsaką, aktyvuodamas Rap1 dėl žemo intensyvumo patogeno infekcijos, nustatydamas ribą, užkertančią kelią per dideliam uždegiminiam atsakui.

Įvadas

Šeimininko imuninėje sistemoje yra apsauginiai receptoriai, būtent modelio atpažinimo receptoriai (PRR), skirti aptikti ir pašalinti įsibrovusius patogenus, aktyvinant signalizacijos kelius pasroviui ir gaminant priešuždegiminius citokinus bei I tipo interferonus (IFN, pavyzdžiui, IFNα / β). 1 . Į rinkliavas panašūs receptoriai (TLR) gali aptikti patogenų komponentus ir inicijuoti mitogenų suaktyvintų baltymų kinazių (MAPK) ir branduolio faktoriaus-KB (NF-κB) kelių, taip pat Tanką surišančios kinazės (TBK) 1-IFN, aktyvavimą. reguliavimo faktoriaus (IRF) 3 kelias per adapterio molekules MyD88 (mieloidinis diferenciacijos faktorius 88) ir Toll-interleukino (IL) -1 receptoriaus domeno turintis adapterio molekulė-1 (dar žinomas kaip TRIF) 1 . Tinklelinės rūgšties indukuojami 1 geno ( RIG-I ) receptoriai daugiausia dalyvauja nustatant dvigrandinę RNR ir aktyvuojant IFNα / β gamybą per adapterio molekulės mitochondrijų antivirusinius signalus teikiantį baltymą (dar žinomą kaip IPS-1, VISA ir CARDIF). 1 . Į Nod panašūs receptoriai dalyvauja reguliuojant IL-1β gamybą per uždegiminę aktyvaciją 1 . Neseniai buvo nustatyta, kad citoplazminiai DNR jutikliai atpažįsta dvigrandinę DNR ir aktyvina IFNα / β pirmiausia per IFN genų stimuliatorių (STING, dar žinomus kaip TMEM173, MITA ir ERIS) 2 . Tikslus PRR signalų signalo derinimas yra labai svarbus norint pašalinti patogenus ir išvengti žalos šeimininkų ląstelėms. Ištirtas neigiamas PRR signalizacijos reguliavimas, toks kaip tarpininkaujant trumpoms signalizacijos tarpininkų izoformoms, E3 ubikvitino ligams, deubiquitiniting fermentams ir fosfatazėms, 1, 3 . Tačiau dėl skirtingo invazijos intensyvumo natūralios infekcijos eigoje ląstelės-šeimininkės turi atskirti infekcijos stiprumą ir tinkamai reaguoti, kad būtų išvengta per didelės reakcijos, kurios mechanizmai nebuvo aiškiai suprantami, žalos.

Su Ras susijusios mažos GTPazės, įskaitant mažų GTPazių Ras, Rab, Rho, Ran ir ARF pogrupius, tarnauja kaip kritiniai molekuliniai jungikliai, jungiantys tarpląstelinius signalus į tarpląstelinius signalizacijos kelius, kuriuos inicijuoja įvairūs receptoriai, tokie kaip augimo faktoriaus receptoriai ir G baltymų jungiami receptoriai 4. . Pereinant nuo į GTP susietos „įjungtos“ ir į su BVP susijusios „išjungtos“ būsenos, su Ras susijusios mažos GTP bazės buvo įtrauktos į įvairius ląstelių funkcijų aspektus, tokius kaip adhezija, migracija, proliferacija, diferenciacija, baltymų pernešimas ir navikogenezė 4 . Iki šiol mažai žinoma apie su Ras susijusių mažų GTPazių vaidmenį įgimtame imunitete. Norint, kad TLR2 sukeltų NF-κB būtų aktyvuotas 5, „Rac1“, kuris yra „Rho“ mažų GTPazių grupės šeimos narys, turi aktyvuoti fosfatidilinozitido 3-kinazės (PI3K) -Akt kelią. Konstituciniu požiūriu aktyvus Ras skatina IL-1 sukeltą p38 MAPK aktyvaciją, o Rap1a (Ras-artumas-1a), kuris yra GTP grupių Ras šeimos porūšio narys, antagonizuoja Ras, o dominuojantis neigiamas Ras slopina IL-1 sukeltą NF. -κB ir AP-1 aktyvacija 6, 7 . Ankstesnis mūsų tyrimas atskleidė, kad dominuojantis neigiamas Ras sutrikdė CpG oligodeoksinukleotido (ODN) sukeltą TLR9 signalą ir slopino naviko nekrozės faktoriaus α (TNFα) 8 susidarymą. Mūsų tyrimai taip pat parodė, kad Rab mažos GTPazės, įskaitant Rab7b ir Rab10, dalyvauja reguliuojant TLR4 ir TLR9 signalizacijos kelią 9, 10, 11 . Rap1 yra visur išreikštas daugumoje audinių ir tarpininkauja plačiajai ląstelių veiklai 12, 13 . Rap1 signalas vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant ląstelių ir ląstelių bei ląstelių matricos adheziją, reguliuodamas integrinus ir kitas adhezijos molekules 12, 13, 14 . Tačiau nepaisant to, ar kitos mažos GTPazės (pavyzdžiui, Rap1) yra susijusios su TLR signalizavimu, gali prireikti papildomų tyrimų.

Ras guanino nukleotidus atpalaiduojantis baltymas (RasGRP) yra vienas GEF tipas (GTP / BVP mainų faktorius), atsakingas už Ras ir (arba) Rap aktyvaciją 14, 15 . Kiekviename baltyme yra Ras mainų motyvas sąveikauti su Ras ir (arba) Rap, CDC25, EF rankomis, kad surištų Ca 2+, ir C1 domenas, kad prisijungtų diacilglicerolis (DAG), 14, 15, 16 . RasGRPs yra ekspresuojami skirtingais leukocitais ir reguliuoja ląstelių aktyvaciją. RasGRP1 daugiausia ekspresuojamas T limfocituose 16, 17, 18, 19 . RasGRP1 - / - pelėms būdingas ryškus atskirų teigiamų timocitų vystymosi trūkumas; T-ląstelių receptorių tarpininkaujamų tarpląstelinių signalų reguliuojamų kinazių (ERK1 / 2) aktyvacija yra visiškai blokuojama RasGRP1 - / - timocituose ir Jurkato ląstelių linijoje, kuriai trūksta RasGRP1 baltymo 18, 19. Įrodyta, kad RasGRP2 yra aktyvus trombocitų aktyvumas 20, 21 . Kita vertus, RasGRP3 yra geriausiai ekspresuojamas B ląstelėse ir reikalingas optimaliam ERK1 / 2 aktyvavimui B-ląstelių receptorių kryžminant 22, 23 . RasGRP4 yra labai ekspresuojamas putliosiose ląstelėse ir yra susijęs su alerginiu atsaku 24, 25 . Pasiūlytas RasGRP tarpininkaujamo Ras / ERK reguliavimo modelis kaip laipsniška limfocitų aktyvacijos kontrolė. 26, 27 . Tačiau ar RasGRPs vaidina laipsnišką makrofagų aktyvavimą reaguojant į įgimtus dirgiklius, vis dar nėra gerai suprantama.

Dabartiniame tyrime mes ištyrėme RasGRPs vaidmenį makrofagų aktyvavime tiriant TLR. Mes nustatėme, kad RasGRP3 (unikalus RasGRP narys, aktyvinantis ir Ras, ir Rap1) 28, bet ne RasGRP1, 2 ir 4, riboja proinflammatorinių citokinų gamybą makrofaguose, aktyvindamas Rap1 jutant ypač mažą TLR ligandų kiekį. Padidindamas Rap1-GTP, RasGRP3 gali nustatyti ribą, užkertančią kelią per dideliam uždegiminiam atsakui į žemą infekcijos lygį.

Rezultatai

Makrofagai pirmiausia išreiškia RasGRP3

Ištyrę RasGRP1–4 raiškos profilius pelių pilvaplėvės makrofaguose ir iš pelių kaulų čiulpų gaunamuose makrofaguose, mes nustatėme, kad RasGRP3 parodė aukščiausią ekspresijos lygį, iš eilės seka RasGRP2 arba RasGRP4 (1a, b pav.). Po gydymo lipopolisaharidu (LPS), RasGRP3 buvo greitai ir reikšmingai sumažintas (1c pav.). Panašūs rezultatai gauti, kai pilvaplėvės makrofagus stimuliuoja poli (I: C), CpG ODN, vezikulinio stomatito virusas, Sendai virusas ar 1 tipo herpes simplex virusas (1d – h pav.). Be to, mes nustatėme, kad RasGRP2 ir RasGRP4 buvo nepakankamai sureguliuoti, o RasGRP1 buvo sureguliuoti LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN (papildomas 1 pav.).

Image

Iš C57BL / 6 laukinio tipo pelių pilvaplėvės makrofagai ( a ) ir kaulų čiulpų gauti makrofagai ( b ) buvo tiriami QGR -PGR naudojant RasGRP1–4 raišką. ( c - h ) Pilvaplėvės makrofagai buvo gydomi 100 ng ml −1 LPS ( c ), be 10 μg ml −1 poli (I: C) ( d ), 5 μM CpG ODN ( e ), vezikulinio stomatito virusu (arba be jo). VSV; MOI = 1; f ), Sendi virusas (SeV, MOI = 1; g ) arba 1 tipo herpes simplex virusas (HSV-1; MOI = 1; h ), kaip nurodyta. RasGRP3 mRNR lygiai buvo tiriami Q-PGR metodu . ( i ) Pilvaplėvės makrofagai buvo apdoroti 100 ng ml −1 LPS, kaip nurodyta, ir RasGRP1-4 baltymų lygis buvo tiriamas atliekant Western blot analizę. RasGRP1-4 mRNR lygio Q-PGR tyrimai PMA apdorotuose (0, 5 ng ml-1 12 val.) THP-1 ląstelėse ( j ) ir žmogaus MDM ( k ). Duomenys pateikiami kaip trijų egzempliorių mėginių vidurkis ± sd ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

Baltymų lygyje mes nustatėme, kad RasGRP1 ir RasGRP4 buvo žemi / neigiami (ilgas ekspozicijos laikas), tuo tarpu pilGR pilų ir makrofagų RasGRP2 ir RasGRP3 buvo aukšti (trumpas ekspozicijos laikas) (1i pav.). Po LPS gydymo visi RasGRP2 / 3/4 lygiai sumažėjo, tuo metu sukeliant RasGRP1.

Mes taip pat ištyrėme RasGRP1–4 raiškos profilius žmogaus THP-1 monocitinėse ląstelėse, apdorotose forbole-12-miristato-13-acetatu (PMA), ir žmogaus periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse išgaunamuose makrofaguose (iš monocitų gaunamų makrofagų, MDM). Mes nustatėme, kad RasGRP3 taip pat buvo vyraujantis RasGRP narys žmogaus makrofaguose (1 pav., K). Po gydymo LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN, RasGRP3 , panašiai kaip RasGRP2 ir RasGRP4 , buvo greitai sureguliuotas , o RasGRP1 buvo sureguliuotas šiais TLR agonistais (papildomi 2 ir 3 pav.). Šie rezultatai rodo, kad RasGRP3 gali būti pagrindinis makrofagų išreikštas RasGRP narys ir gali būti įgimtas aktyvinant makrofagus.

RasGRP3 tyla skatina uždegimą sukeliančią citokinų gamybą

Toliau mes ištyrėme RasGRP1–4 vaidmenį atliekant TLR atsaką į makrofagus po atskirų RasGRP nutraukimo. Mes nustatėme, kad RasGRP3 numušimas pelių pilvaplėvės makrofaguose (2a pav.) Šiek tiek padidino IL-6 raišką, kai stimuliavome ląsteles 100 ng ml −1 LPS (plačiausiai naudojama dozė) (2b pav.). Atsižvelgdami į siūlomas RasGRP (analoginis) ir SOS (skaitmeninis) savybes aktyvinant Ras / ERK limfocituose 26, 27, mes dar kartą išanalizavome RasGRP3 funkciją pilvaplėvės makrofaguose, naudodami mažas dirgiklio dozes. Kai stimuliuojami 1 ng ml − 1 LPS, pilvaplėvės makrofagai, kuriems buvo sunaikintas RasGRP3, sukūrė žymiai aukštesnį IL-6 lygį (2c, d pav.). Palyginti su IL-6, kiti uždegimo mediatoriai, tokie kaip TNFα ir indukuojama azoto oksido sintazė (iNOS), bet ne IL-1β, taip pat reikšmingai buvo sureguliuoti pagal RasGRP3 numušimą (papildomas 4a – c pav.). Kai stimuliuojami mažomis poli (I: C) arba CpG ODN dozėmis, pilvaplėvės makrofagai, kuriems buvo sunaikintas RasGRP3, sukūrė daugiau IL-6 (2e – h pav.). Šie rezultatai rodo, kad RasGRP3 neigiamai reguliuoja pelių makrofagų reakciją į TLR agonistus.

Image

( a ) Pilvaplėvės makrofagai 48 valandas buvo laikinai transfekuoti kontrolinėmis (Ctrl) arba RasGRP3 specifinėmis siRNR. RasGRP3 mRNR lygiai buvo tiriami Q-PCR metodu, o RasGRP3 baltymas buvo tiriamas atliekant Western blot analizę (įterptas vaizdas). ( b - h ) a ląstelės buvo apdorotos 100 ng ml −1 LPS ( b ), 1 ng ml −1 LPS ( c, d ), 2, 5 μg ml −1 poli (I: C) ( e, f ) arba 0, 5 μM CpG ODN ( g, h ) nurodytą laiką. Toliau IL-6 lygis buvo nustatytas naudojant Q-PCR ( b, c, e, g ) arba ELISA (supernatantai; d, f, h ). Duomenys pateikiami kaip trijų egzempliorių mėginių vidurkis ± sd ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (dispersijos analizė).

Visas dydis

Tačiau IL-6 susidarymui tai neturėjo įtakos, kai nutildėme RasGRP1, RasGRP2 ar RasGRP4 pilvaplėvės makrofaguose ir stimuliavome makrofagus 100 ng ml −1 LPS, 1 ng ml −1 LPS, 2, 5 μg ml −1 poli (I: C) arba 0, 5 μM CpG ODN (papildomas 5 pav.). Šie duomenys rodo, kad tik RasGRP3 vaidina svarbų ir neigiamą vaidmenį reguliuojant makrofagų aktyvaciją ir proinflammatorinių citokinų gamybą TLR aktyvavimo metu.

PMA apdorotose THP-1 ląstelėse ir žmogaus MDM mes taip pat ištyrėme RasGRP3 numušimo poveikį uždegimą sukeliantiems citokinams. Mes nustatėme, kad RasGRP3 numušimas tiek THP-1 ląstelėse, tiek MDM žymiai padidino IL-6, TNFα, IL-1β ir iNOS gamybą pasiuntinio RNR lygyje ir (arba) baltymų lygiuose po gydymo mažomis LPS, Poly (I) dozėmis. : C) arba CpG ODN (3a – n pav.). Šie duomenys rodo, kad RasGRP3, panašiai kaip jo vaidmuo pelių makrofaguose, neigiamai reguliuoja TLR sukeltus uždegiminius atsakus žmogaus makrofaguose.

Image

( a ) THP-1 ląstelės 12 val. buvo apdorotos 0, 5 ng ml- 1 PMA, kad diferencijuotų į makrofagus, ir 48 valandas buvo laikinai perkeltos į kontrolines (Ctrl) arba RasGRP3 specifines siRNR. RasGRP3 mRNR lygiai buvo tiriami Q-PCR metodu, o RasGRP3 baltymas buvo tiriamas atliekant Western blot analizę (įterptas vaizdas). ( b - e ) a ląstelės nurodytą laiką buvo apdorotos (Med) 1 ng ml –1 LPS, 2, 5 μg ml – 1 poli (I: C) arba 0, 5 μM CpG ODN arba be jo. Toliau IL-6 ( b ), TNF α ( c ), IL-1 β ( d ) ir iNOS ( e ) mRNR kiekiai buvo nustatyti Q-PCR. ( f ) Žmogaus periferinės mononuklearinės ląstelės, kultivuojamos 5 dienas naudojant makrofagų kolonijas stimuliuojantį faktorių (M-CSF) (MDM), 48 valandas buvo laikinai transfekuotos kontrolinėmis (Ctrl) arba RasGRP3 specifinėmis siRNR. RasGRP3 mRNR lygiai buvo tiriami Q-PCR metodu, o RasGRP3 baltymas buvo tiriamas atliekant Western blot analizę (įterptas vaizdas). ( g - j ) f ląstelės nurodytą laiką buvo apdorotos (Med) 1 ng ml −1 LPS, 2, 5 μg ml −1 poli (I: C) arba 0, 5 μM CpG ODN arba be jo. Toliau IL-6 ( g ), TNF α ( h ), IL-1 β ( i ) ir iNOS ( j ) mRNR kiekiai buvo nustatyti Q-PCR. ( k - n ) Kultūros supernatantai, gauti iš b, c arba g, h, buvo nustatyti IL-6 ( k, m ) ir TNFα ( l, n ) lygiams ELISA metodu. Duomenys pateikiami kaip trijų egzempliorių mėginių vidurkis ± sd ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (dispersijos analizė).

Visas dydis

Norėdami pateikti papildomų įrodymų, nutildėme RasGRP1, 2 ir 4 raišką žmogaus THP-1 ląstelėse ir MDM (papildomas 6a, b pav.). Po gydymo nurodytais TLR agonistais nustatėme, kad šių RasGRP numušimas neturėjo įtakos IL-6 ir TNFα raiškai (papildomas 6c, d pav.), Dar kartą patvirtindamas, kad RasGRP3, bet ne RasGRP1, 2 ar 4, yra neigiamas TLR sukeltų uždegiminių reakcijų makrofaguose reguliatorius.

RasGRP3 slopina priešuždegiminį citokinų gamybą

Norėdami dar labiau patikrinti RasGRP3 funkciją kontroliuodami makrofagų aktyvaciją, mes ištyrėme IL-6 raišką RAW264.7 makrofaguose, stabiliai viršijančius RasGRP3 (4a pav.). Mes nustatėme, kad šios ląstelės gamino mažiau IL-6 nei kontrolinės ląstelės, kai buvo stimuliuojamos maža LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN doze (4b pav., C).

Image

( a - c ) RAW264.7 ląstelės, stabiliai transfekuotos vėliava pažymėtu RasGRP3, buvo ištirtos dėl RasGRP3 ekspresijos atliekant Western blot ( a ), arba apdorotos 1 ng ml −1 LPS, 2, 5 μg ml −1 poli (I: C) arba be ) arba 0, 5 μM CpG ODN 6 h ( b, c ). Tada IL-6 mRNR ir IL-6 baltymai buvo tiriami atitinkamai naudojant Q-PCR ( b ) ir ELISA ( c ). ( d ) Kaulų čiulpų gauti makrofagai buvo iš anksto apdoroti dimetilsulfoksidu (DMSO) arba GÖ-6983 (200 nM) 30 min., po to stimuliuoti LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN, kaip nurodyta. Thr133 fosforilinimas RasGRP3 buvo tiriamas naudojant fosfo-RasGRP3 (Thr133) Ab. ( e - g ) Pilvaplėvės makrofagai, gauti iš laukinio tipo pelių, arba RasGRP3 ar RasGRP3-T133A transgeninės pelės, buvo tiriamos, norint nustatyti RasGRP3 raišką, naudojant „Western blot“ ( e ), arba buvo gydomi 1 ng ml −1 LPS, 2, 5 μg ml - arba be jų. 1 poli (I: C) arba 0, 5 μM CpG ODN 6 h ( f, g ). IL-6 mRNR lygis ir baltymai buvo tiriami atitinkamai naudojant Q-PCR ( f ) ir ELISA ( g ). Duomenys pateikiami kaip trijų egzempliorių mėginių vidurkis ± sd ir atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. *** P <0, 001 (dispersijos analizė).

Visas dydis

Ankstesniuose tyrimuose nustatyta, kad norint suaktyvinti RasGRP3 limfocituose 23, 29, 30, reikalingas baltymo kinazės C fosforilinimas Thr133 . Mes ištyrėme Thr133 fosforilinimą RasGRP3 po TLR sujungimo ir nustatėme, kad visos baltymo kinazės Cinhibitor GÖ-6983 gali slopinti TLR sukeltą fosforilinimą RasGRP3 Thr133 (4d pav.). Norėdami dar labiau apibūdinti RasGRP3 vaidmenį TLR signalizacijoje, mes sukūrėme transgenines peles, kurios perdėtai ekspresuoja RasGRP3 ir RasGRP3 ir turinčias Thr133 mutaciją Ala (RasGRP3-T133A) (papildomas 7 pav. Ir 4e pav.). Pilvaplėvės makrofaguose, gautuose iš transGRgeninių pelių RasGRP3 ir RasGRP3-T133A, mes ištyrėme IL-6 susidarymą, kurį sukėlė TLR3 / 4/9 ligacijos. Mes nustatėme, kad RasGRP3 transgeniniai makrofagai žymiai sumažino IL-6 gamybą, o RasGRP3-T133A makrofagai - padidėjusią IL-6 gamybą (4f pav., G). Todėl mūsų duomenys įtikinamai rodo, kad RasGRP3 yra neigiamas TLR signalizacijos reguliatorius.

Žmogaus THP-1 ląstelėse mes taip pat ištyrėme RasGRP3 perdėto ekspresijos poveikį TLR sukeltai IL-6 ir TNFα gamybai. Mes nustatėme, kad per didelis laukinio tipo RasGRP3 ekspresija slopino IL-6 ir TNFα po gydymo LPS, Poly (I: C) ar CpG ODN (papildomas 8a – g pav.). Per didelis RasGRP3-T133A ekspresija skatino TLR3 / 4/9 sukeltą IL-6 ir TNFα gamybą. Žmogaus storosios žarnos vėžio mėginiuose mes nustatėme RasGRP3, G558R mutaciją (G1672 mutavo į A; papildomas 8h pav.). Kai per daug ekspresuota THP-1 ląstelėse, RasGRP3-G558R skatino IL-6 ir TNFα gamybą (papildomas 8a – f pav.). Šie duomenys rodo, kad RasGRP3 neigiamai kontroliuoja uždegiminių citokinų gamybą žmogaus makrofaguose.

„RasGRP3“ riboja IL-6 gamybą aktyvuodama „Rap1“

Ankstesni tyrimai atskleidė, kad RasGRP3 yra išskirtinis tuo, kad gali efektyviai suaktyvinti mažas GTPazes Ras ir Rap1 (nuoroda 28). Po numalšinimo RasGRP3 pilvaplėvės makrofaguose (5a pav.), Mes nustatėme, kad Rap1-GTP (5b – e pav.), Bet ne Ras-GTP (5f – i pav.) Lygis buvo žymiai sumažėjęs po TLR ligandų dirgiklių., nurodant, kad „Rap1“ (bet ne „Ras“), suaktyvinta „RasGRP3“, gali būti atsakinga už ankstyvus TLR signalizacijos įvykius.

Image

a ) RasGRP3 numušimo efektyvumas pilvaplėvės makrofaguose, ištirtas atliekant Western blot analizę. Rap1-GTP ( b - e ) ir Ras-GTP ( f - i ) lygiai po gydymo LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN. Ekstraktai, į kuriuos įpilta BVP arba GTPγS, buvo naudojami kaip neigiamos arba teigiamos Rap1-GTP ir Ras-GTP kontrolės, kaip rekomenduojama. Nurodytos molekulės juostos intensyvumas buvo nustatytas ir apskaičiuotas kaip GTP surišto Rap1 ( c - e ) arba Ras ( g - i ) prie Rap1 arba Ras įėjimo. Duomenys ( c - e, g - i ) pateikiami kaip trijų pakartojimų vidurkis ± se. ( j - m ) pilvaplėvės makrofagai 48 valandas buvo transfekuoti kontrolinėmis siRNR (Ctrl) arba Rap1a specifinėmis siRNR (Rap1a). Rap1a lygiai buvo nustatyti naudojant Q-PCR ir Western blot ( j ). Tada ląstelės buvo apdorotos 1 ng ml −1 ( k, l ) arba 100 ng ml −1 ( m ) LPS, o IL-6 lygis buvo išmatuotas Q-PCR ( k, m ) arba ELISA ( l ). ( n - p ) Laukinio tipo (WT) pelių arba RasGRP3 transgeninių pelių kaulų čiulpų makrofagai 48 valandas buvo transfekuoti kontrolinėmis siRNR (Ctrl) arba Rap1a specifinėmis siRNR (Rap1a). Toliau Rap1a lygis buvo tiriamas atliekant vakarinį blotinimą ( n ). Po 6 h apdorojimo 1 ng ml –1 LPS, ląstelės buvo tiriamos dėl IL-6 lygio Q-PCR ( o ) ir ELISA ( p ). K - m, o, p klaidų juostos nurodo trigubų mėginių vidurkį ± sd. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (dispersijos analizė, kaip nurodyta arba palyginti su laukinio tipo ląstelėmis ir kontrolinėmis siRNR).

Visas dydis

Norėdami patvirtinti, kad Rap1 yra RasGRP3 taikinys TLR signalizuojant makrofagus, nutildėme Rap1a ir Rap1b raišką pilvaplėvės makrofaguose. Mes nustatėme, kad „Rap1a“, bet ne „Rap1b“ ​​numušimas gali padidinti LPS sukeltą IL-6 gamybą esant 1 ng ml −1, bet ne 100 ng ml −1 (5j – m pav.), Kurie buvo panašūs į „RasGRP3“ numušimo poveikį. . Šie duomenys rodo, kad RasGRP3 gali reguliuoti IL-6 gamybą aktyvuodamas Rap1a.

Norėdami gauti daugiau įrodymų, nutildėme „Rap1a“ kaulų čiulpų makrofaguose iš transGRgeninių pelių RasGRP3 (5n pav.) Ir ištyrėme IL-6 gamybą po TLR agonistų dirgiklių. Mes nustatėme, kad aukštesnis IL-6 lygis buvo rastas Rap1a numušimo grupėje, o Rap1a nutildymas gali pakeisti RasGRP3 transgeno poveikį TLR sukeltos IL-6 gamybai (5o pav., P).

„RasGRP3“ numušimas skatina ERK1 / 2 aktyvaciją

Tada mes išnagrinėjome „RasGRP3“ numušimo poveikį TLR sukeltiems signalizacijos keliams (6a – o pav.). Mes nustatėme, kad RasGRP3 nutildymas pilvaplėvės makrofaguose sustiprino ERK1 / 2 aktyvaciją, skatinamą mažomis LPS, Poly (I: C) ar CpG ODN dozėmis (6a pav. - e, i, l, n). Tačiau JNK1 / 2 ir p38 MAPK aktyvacijai, taip pat IKKα / β-IκBα eigai reikšmingos įtakos neturėjo RasGRP3 numušimas po LPS gydymo (6a, f, g pav.).

Image

( a - d ) Pilvaplėvės makrofagai, 48 valandas perkrėsti kontrolinėmis siRNR (Ctrl) arba RasGRP3 specifinėmis siRNR (RasGRP3), 48 valandas buvo gydomi nurodytais LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN kiekiais ir skirtingu laiku. nurodytos molekulės buvo tiriamos atliekant Western blot analizę. ( e - o ) a - d rezultatai buvo kiekybiškai įvertinti nustatant juostos intensyvumą ir apskaičiuoti kaip fosforilintos signalizacijos molekulės iki visų atitinkamų molekulių. Duomenys buvo pateikti kaip trijų pakartojimų vidurkis ± se. ( p, q ) Nurodyti pilvaplėvės makrofagai 30 min buvo iš anksto apdoroti PD98059, Wortmannin arba nešikliu, o po to 6 valandas apdoroti 1 ng ml –1 LPS. IL-6 lygis buvo nustatytas naudojant Q-PCR ( p ) ir ELISA ( q ). Klaidų juostos nurodo trigubų mėginių vidurkį ± sd. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (dispersijos analizė, kaip nurodyta arba, palyginti su laukinio tipo ląstelėmis, transfekuotomis kontrolinėmis siRNR).

Visas dydis

Kadangi PI3K-Akt kelias taip pat vaidina lemiamą vaidmenį reguliuojant TLR atsaką 1, 31, mes ištyrėme Akt (Ser473) fosforilinimą. Netikėtai sužinojome, kad fosfo-Akt lygis iš pradžių buvo sumažėjęs, o po to palaipsniui atstatomas pilvaplėvės makrofaguose po LPS, Poly (I: C) ar CpG dirgiklių (Papildomas 9 pav.). Mažos TLR agonistų dozės galėjo pailginti defosforilinimo proceso trukmę. RasGRP3 nutildytose ląstelėse Akt defosforilinimas buvo pagreitintas, išlaikant mažesnį aktyviojo Akt lygį (6a – d pav., H, j, m, o); be to, Aktfosforilinimas po 30 minučių po LPS stimulų taip pat buvo slopinamas dėl RasGRP3 numušimo (6a pav., h).

Kai makrofagai buvo iš anksto apdoroti MEK / ERK inhibitoriumi PD98059, RasGRP3 numušimo poveikis IL-6 gamybai buvo priešingas (6 pav., Q), rodantis, kad RasGRP3 numušimo sukelta ERK1 / 2 aktyvacija gali būti atsakinga už padidėjusį TLR4- sukėlė IL-6 gamybą makrofaguose. Kai makrofagai buvo iš anksto apdoroti PI3K inhibitoriumi Wortmannin, LPS sukelta IL-6 gamyba taip pat žymiai padidėjo, tiek kontroliuojamuose, tiek ir su RasGRP3 nutildytuose makrofaguose, o tai parodė, kad RasGRP3 numušimo sukeltas IL-6 padidėjimas gali atsirasti dėl pagreitėjusio Akt. defosforilinimas.

RasGRP3 riboja IL-6 gamybą in vivo

Norėdami suprasti RasGRP3 vaidmenį per TLR sukeltą įgimtą imuninį atsaką in vivo , mes uždavėme RasGRP3 transgeninėms pelėms (papildomas 7 pav.) Skirtingomis LPS dozėmis į pilvaplėvės ertmę. Kai buvo naudojamos didelės LPS dozės (pavyzdžiui, 20 mg kg −1 arba 200 μg kg − 1 ), IL-6 lygis RasGRP3 transgeninių pelių ir laukinio tipo pelių serume buvo palyginamas (papildomas 10 pav.). Tačiau, kai mes vartojome mažas LPS dozes (10 arba 1 μg kg −1 ), IL-6 lygis buvo žymiai mažesnis RasGRP3 transgeninių pelių serume, palyginti su laukinio tipo pelėmis (7a, b pav.). Panašiai, kai mes sukėlėme iššūkį transgeninėms pelėms su mažomis poli (I: C) arba CpG ODN dozėmis, IL-6 koncentracija serume taip pat reikšmingai sumažėjo transGRG3 transgeninėse pelėse (7c pav., D). Mes taip pat ištyrėme TNFα kiekį serume. Tačiau mes nustatėme, kad pelių, gydomų mažomis TLR agonistų dozėmis, serume nebuvo aptikta TNFα. Šie duomenys gali parodyti, kad RasGRP3 veikia kaip neigiamas įgimto TLR atsako reguliatorius į žemą agonistų kiekį in vivo .

Image

( a - d ) Laukinio tipo pelėms, RasGRP3 arba RasGRP3-T133A transgeninėms pelėms buvo įšvirkštas nurodytas LPS ( a, b ), Poly (I: C) ( c ) arba CpG ODN ( d ) kiekis į pilvaplėvės ertmę. Po dviejų su puse valandos IL-6 koncentracija serume buvo nustatyta ELISA metodu. ( e - g ) Švitintos laukinio tipo pelės buvo į pilvaplėvės ertmę suleistos laukinio tipo RasGRP3 arba RasGRP3-T133A transgeniniais pilvaplėvės makrofagais praėjus 8 dienoms po kaulų čiulpų transplantacijos. Praėjus dviem dienoms po makrofagų perkėlimo, į pilvaplėvės ertmę buvo sušvirkšta LPS ( e ), Poly (I: C) ( f ) arba CpG ODN ( g ). Po dviejų su puse valandos IL-6 koncentracija serume buvo nustatyta ELISA metodu. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd ( n = 11 a, n = 12 b, n = 11 c, n = 9 d ir n = 5 e, f ir g ). Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. ** P <0, 01; *** P <0, 001 (Manno – Whitney U testas arba dispersijos analizė, palyginti su laukinio tipo grupe).

Visas dydis

Norėdami dar labiau iliustruoti RasGRP3 indėlį į IL-6 gamybą makrofaguose, laukinio tipo arba RasGRP3 transgeninius makrofagus perkėlėme į švitintas laukinio pelės rūšis. Peritoniniu būdu suleidus mažas LPS, poli (I: C) arba CpG ODN dozes, mes nustatėme, kad pelių, paruoštų su RasGRP3 transgeniniais makrofagais, IL-6 lygis buvo žymiai sumažėjęs, o pelių, paruoštų su RasGRP3-T133A transgeniniais makrofagais, kiekis žymiai padidėjo. (7e – g pav.). Šie duomenys leidžia manyti, kad makrofaguose esantis RasGRP3 sukeliamas IL-6 gamybos slopinimas yra esminis mechanizmas, ribojantis uždegiminius atsakus infekcinės ligos metu.

RasGRP3 slopina dekstrano sulfato natrio sukeltą kolitą

Mūsų duomenys rodo, kad RasGRP3 neigiamai reguliuoja TLR sukeltą uždegiminį atsaką tiek in vitro, tiek in vivo . Tada mes ėmėmės toliau nagrinėti, ar RasGRP3 dalyvavo uždegiminių ligų patogenezėje. Natrio dekstrano sulfato (DSS) sukeltas kolitas yra tipinis uždegiminis modelis tiriant uždegiminių žarnyno ligų (IBD) vystymąsi ir kontrolę. Norėdami parodyti RasGRP3 tarpininkaujamo makrofagų reakcijų reguliavimo vaidmenį DSS sukeltas kolitas, mes perkėlėme RasGRP3 transgeninius makrofagus į švitintas laukinio tipo peles ir skyrėme DSS. Mes nustatėme, kad pelių, rekonstruotų su RasGRP3 transgeniniais makrofagais, kūno svoris sumažėjo lėčiau, palyginti su pelių, paruoštų su laukinio tipo makrofagais (8a pav.). 10 dieną po DSS apdorojimo gaubtinės žarnos buvo surinktos ir ištirtos dažant hematoksilinu ir eozinu (H&E). Mes nustatėme, kad storosios žarnos, gautos iš RasGRP3 grupės, parodė lengvesnį kolitą nei tos, kurios gautos iš laukinio tipo grupių, tuo tarpu storosios žarnos, gautos iš RasGRP3-T133A transgeninių pelių, parodė sunkiausią kolitą (8b pav., C). Serume IL-6 lygis buvo mažesnis RasGRP3 grupėje, palyginti su laukinio tipo grupėje (8d pav.). Taip pat buvo tiriami TNFα lygiai. Tačiau TNFα kiekis serume DSS gydymo 10-ą dieną nebuvo nustatomas atliekant fermentais susietą imunosorbentų tyrimą (ELISA). Šie duomenys parodė, kad RasGRP3 slopina uždegiminių ligų, tokių kaip IBD, vystymąsi.

Image

Apšvitintoms laukinio tipo pelėms į pilvaplėvės ertmę buvo injekuotos laukinio tipo RasGRP3 arba RasGRP3-T133A transgeniniai pilvaplėvės makrofagai praėjus 8 dienoms po kaulų čiulpų transplantacijos. Po dviejų dienų po makrofagų perkėlimo pelės 7 dienas buvo maitinamos 2, 5% DSS vandenyje. Kūno svoris buvo nustatytas nurodytomis dienomis ( a, n = 8 vienai grupei). 10 dieną po DSS gydymo storosios žarnos buvo surinktos ir ištirtos dažant H&E ( b ), patologas įvertino kolito uždegimą ( c, n = 5 vienai grupei), o IL-6 lygis serume buvo išmatuotas ELISA metodu ( d, n = 5 vienai grupei). B punkte uždegiminių ląstelių infiltracija buvo parodyta strėlių galvutėmis, kriptų abscesai buvo pažymėti žvaigždutėmis ir dideli limfoidiniai mazgeliai (N). Atkreipkite dėmesį į infiltruotų uždegiminių ląstelių diferencinį pasiskirstymą (išsibarstę palyginti su visuotine ir gleivine, palyginti su gleivine). Rezultatai a, c, d buvo pateikti kaip vidurkis ± sd. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. ns, nereikšmingas; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (dispersijos analizė, palyginti su laukinio tipo grupėmis). Svarstyklės, 100 μm.

Visas dydis

RasGRP3 slopina kolageno sukeltą artritą

Mūsų duomenys rodo, kad RasGRP3 neigiamai reguliuoja IL-6 gamybą TLR3 / 4/9 aktyvavimo metu tiek in vitro, tiek in vivo . Tačiau fiziologinė ar patologinė šių stebėjimų reikšmė nebuvo išaiškinta. Ligos modeliai parodė, kad IL-6 gali sukelti vietinį chemokino gamybą ir skatinti vietinį uždegimą reumatoidinio artrito (RA) ir išsėtinės sklerozės metu 32, 33 . Daugybė tyrimų parodė, kad IL-6 vaidina svarbų vaidmenį sergant RA 32, 33 . Todėl mes išbandėme, ar RasGRP3 gali turėti įtakos kolageno sukelto artrito (CIA) vystymuisi.

0 ir 21 dienomis mes imunizavome RasGRP3 arba RasGRP3-T133A transgenines peles II tipo vištienos kolagenu ir nustatėme, kad RasGRP3 transgeninių pelių artrito sunkumas reikšmingai sumažėjo, palyginti su laukinio tipo pelėmis (52 diena po pirminės imunizacijos; 9a pav.). Klinikiniai rodikliai ir letenų storio duomenys taip pat parodė, kad RasGRP3 transgeninėms pelėms buvo sumažėjęs CIA vystymasis (9b, c pav.). RasGRP3-T133A grupėje CŽV išsivystymas pagerėjo, kaip rodo nuolatiniai sunkūs klinikiniai požymiai (9a – c pav.). RasGRP3 transgeninėms pelėms buvo nustatyta mažesnė kaulo ir kremzlės erozija nei laukinio tipo pelėms (120 diena), aiškesnė sąnario ertmė ir mažesnė sinovinio audinio žala (9d, e pav.). RasGRP3-T133A transgeninėms pelėms kaulų ir kremzlių pannusinės erozijos, taip pat sąnario ertmės ir sinovinio audinio pakitimai buvo sunkesni nei laukinio tipo (9d, e pav.).

Image

( a ) Laukinio tipo pelės arba RasGRP3 arba RasGRP3-T133A transgeninės pelės buvo imunizuotos PBS arba kolagenu, kaip nurodyta antrinei imunizacijai. 52 dieną po pirminės imunizacijos buvo nufotografuoti letenos. ( b, c ) Nurodytais laikotarpiais po pirmosios imunizacijos buvo įvertinti ir užregistruoti klinikiniai balai ( b ) ir letenų storis ( c ). Duomenys buvo pateikti kaip penkių pelių kiekvienos grupės vidurkis ± sd. ns, nereikšmingas; *** P <0, 001 (dispersijos analizė (ANOVA), palyginti su laukinio tipo grupe; atitinkamai 50, 60 ir 70 dieną). ( d ) 120 dieną po pirminės imunizacijos buvo ištirti visi kojų sąnariai dažant H&E. Rodyklių galvos žymi kaulų ir kremzlių erozijų vietas. B, kaulas; C, kremzlė; P, pannus; S, sinoviumas. e ) Kaulų ir kremzlių erozijų sąnario audiniuose histomorfometrinis įvertinimas, atitinkantis dažymą d . Duomenys buvo pateikti kaip penkių aukštų laukų vidurkis ± sd (ANOVA, palyginti su laukinio tipo grupe). f ) 52 dieną po pirminės imunizacijos IL-6 lygis serume buvo ištirtas ELISA metodu. Duomenys buvo pateikti kaip penkių pelių kiekvienoje grupėje vidurkis ± se (ANOVA, palyginti su laukinio tipo grupe). Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus.

Visas dydis

Be to, mes nustatėme, kad IL-6 lygis transgeninių pelių RasGRP3 pelių serume buvo žymiai mažesnis, o RasGRP3-T133A transgeninių pelių serume buvo žymiai didesnis nei laukinio tipo pelių (52 diena po pirminės imunizacijos; 9f pav.). Šie duomenys rodo, kad RasGRP3 riboja audinių pažeidimus artrito vystymosi metu.

RasGRP3 išmušimas RAW264.7 ląstelėse skatina IL-6 gamybą

Mes įrodėme neigiamą RasGRP3 vaidmenį TLR sukeltoje uždegiminėje reakcijoje, panaudodami RasGRP3 perraišką, numušimą ar transgeninę perraišką. Norėdami patvirtinti šias išvadas, mes panaudojome RasGRP3 RAW264.7 ląstelėse, naudodamiesi genomo redagavimo technika, sugrupuoti norminiai elementai įsiterpė į trumpą palindrominį pakartojimą (CRISPR) / CRISPR susietą baltymo (Cas) sistemą. Buvo išbandytos keturios pagrindinės RNR (gRNR) sekos ir tik viena gRNR sėkmingai sunaikino RasGRP3, o tai patvirtino DNR sekos nustatymas ir Western blot tyrimas (10a pav.).

Image

( a ) RAW264.7 ląstelės, kotransfekuotos orientacinę RNR koduojančia plazmidė ir Cas9 koduojančia plazmidė, buvo surūšiuotos ir atrinktos pavieniams klonams. RasGRP3 išeikvojimas buvo tiriamas atliekant Western blot analizę. ( b - g ) Laukinio tipo RAW264.7 ląstelės arba RasGRP3 turinčios RAW264.7 ląstelės (RasGRP3 - ) buvo gydomos (Med) arba be (Med) 1 ng ml −1 LPS, 2, 5 μg ml −1 poli (I: C). arba 0, 5 μM CpG ODN, kaip nurodyta. Tada IL-6 ( b ), TNF α ( c ), IL-1 β ( d ) ir iNOS ( e ) mRNR kiekiai buvo nustatyti Q-PCR metodu, o IL-6 ( f ) arba TNFα ( g ) - kultūros supernatantai buvo išmatuoti ELISA metodu. Duomenys buvo pateikti kaip trigubų mėginių vidurkis ± sd. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 (ANOVA). Rap1-GTP ( h ) ir Ras-GTP ( i ) lygiai po gydymo LPS, Poly (I: C) ar CpG ODN, kaip nurodyta. Ekstraktai, į kuriuos įpilta BVP arba GTPγS, buvo naudojami kaip neigiamos arba teigiamos Rap1-GTP ir Ras-GTP kontrolės, kaip rekomenduojama. ( j, k ) Laukinio tipo arba RasGRP3 - RAW264.7 ląstelės skirtingu laiku buvo apdorojamos LPS, Poly (I: C) arba CpG ODN, o nurodytų signalinių molekulių aktyvacija ląstelių lizatuose buvo įvertinta Western blot metodu. . Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus.

Visas dydis

RasGRP3 trūkumu turinčiose RAW264.7 ląstelėse (RasGRP3 - ) po gydymo LPS, Poly (I: C) ar CpG ODN žymiai padidėjo uždegimą sukeliančių mediatorių, tokių kaip IL-6, TNFα, IL-1β ir iNOS, gamyba (2 pav. 10b – g). Mechanistiniams tyrimams mes ištyrėme Rap1 ir Ras būklę, susijusią su GTP, taip pat MAPK ir Akt aktyvaciją. Mes nustatėme, kad RasGRP3 - RAW264.7 ląstelės parodė sumažėjusį Rap1-GTP lygį, pagreitino Akt defosforilinimą ir sustiprino ERK1 / 2 aktyvaciją (10h – k pav.). Tačiau RasGRP3 išeikvojimas neturėjo įtakos Ras aktyvinimui ir JNK1 / 2 bei p38 signalizacijos keliams (10i – k pav.). Šie duomenys rodo, kad RasGRP3 yra neigiamas TLR signalizacijos kelio reguliatorius ir riboja uždegimą sukeliančių citokinų gamybą, aktyvuodamas Rap1, bet skatindamas ERK1 / 2 aktyvaciją makrofaguose.

Norėdami atmesti tikslinį RasGRP3 išeikvojimo poveikį, mes padidinome laukinio tipo RasGRP3 ir RasGRP3-T133A raiškos RasGRP3 ląstelėse (papildomas 11 pav.). Mes nustatėme, kad RasGRP3, bet ne dominuojantis neigiamas RasGRP3-T133A, galėtų išgelbėti RasGRP3 išeikvojimo poveikį uždegimą sukeliančių citokinų gamyboje po mažų dozių TLR3 / 4/9 agonistų gydymo (papildomas 11a – f pav.).

Diskusija

Tinkamas šeimininko imuninių ląstelių atsakas į TLR agonistus yra nepaprastai svarbus palaikant imunitetą. Tai reikalinga veiksmingam patogenų pašalinimui ir šeimininko apsaugai nuo didžiojo uždegimo ir autoimuniteto 1, 3 . Neigiami TLR signalizacijos reguliatoriai nebuvo visiškai išaiškinti 3 . Mūsų tyrimas rodo, kad RasGRP3, reguliuojantis tiek Ras, tiek Rap1, neigiamai reguliuoja uždegimą sukeliančių citokinų (ypač IL-6) gamybą, aktyvuodamas Rap1 ir slopindamas ERK1 / 2 aktyvaciją, reaguodamas į žemą TLR agonistų kiekį, kuris gali tarnauti kaip ankstyvosios reguliavimo priemonės, skirtos apriboti makrofagų uždegiminį atsaką į silpną infekciją. Neigiamas RasGRP3 poveikis reguliuojant TLR atsaką į žemą TLR ligandų kiekį gali reikšti įgimtą „stabdymo“ mechanizmą, kuris apsaugo makrofagus nuo per daug aktyvavimo, jei infekcija nėra pavojinga mirtinai.

RasGRP šeimos nariai yra labai ekspresuojami imuninėse ląstelėse 14, 15 . RasGRP1 / 3 vyrauja T ir B ląstelėse ir atlieka svarbų vaidmenį kuriant T ir B ląsteles, atitinkamai 18, 19, 22, 23 . RasGRP2 daugiausia aptinkamas trombocituose ir gali skatinti krešėjimą 21 . Iš pradžių pranešama, kad RasGRP4 yra putliųjų ląstelių organizme ir gali būti susijęs su alergijos bei astmos reguliavimu 24, 25 . Teoriškai, visi RasGRP nariai gali būti suaktyvinti atliekant TLR ligaciją, nes buvo manoma, kad TLR signalizacija gali sukelti DAG susidarymą ir padidinti ląstelėje esantį kalcio 1, 3 kiekį . Mes nustatėme, kad RasGRP3, bet ne RasGRP1, 2 ar 4, slopino TLR sukeltą priešuždegiminį citokinų gamybą makrofaguose, o tai gali paaiškinti gausus RasGRP3 išraiška makrofaguose. Be to, DGK, kurie DAG paverčia fosfatidine rūgštimi, makrofaguose yra išreikšti šališku pavidalu. Makrofagai teikia pirmenybę DGK-α ir DGK-ζ (neigiamas RasGRP1 reguliatorius), tuo tarpu DGK-ı (neigiamas RasGRP3 reguliatorius) yra retai aptinkami makrofaguose 34, 35, 36, o tai gali leisti suaktyvinti RasGRP3 TLR sukeltai produkcijai. iš DAG.

Su Ras susijusių mažų GTPazių vaidmuo TLR signalizacijoje nėra aiškiai apibrėžtas. TLR atsakų metu gauta nedaug duomenų apie Ras, Rac ir Rab mažas GTPazes, tuo tarpu Rap1 vaidmuo įgimtai TLR reakcijai nebuvo išaiškintas. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Viena ataskaita, kurioje buvo naudojami splenocitai arba CD3 + T ląstelės, parodė, kad Rap1a trūkumas padidino TNFα gamybą, gydant ionomicinu ar PMA37. Ankstesni tyrimai, kuriuose buvo naudotos transgeninės ar išmuštos pelės, parodė, kad Rap1a dalyvauja reguliuojant T-ląstelių adheziją ir imunologinių sinapsių susidarymą. 38, 39, 40, 41, 42 . Neutrofiluose ir makrofaguose Rap1 taip pat dalyvavo ląstelių adhezijoje ir fagocitozės reguliavime . 43, 44, 45, 46, 47 . Šie tyrimai aiškiai parodė svarbų „Rap1“ vaidmenį signalizuojant apie integriną, tai yra, apie signalą „iš vidaus“, susijusį su integrinais. Palyginti su ankstesnėmis ataskaitomis, mūsų tyrimas nustatė „Rap1“ aktyvacijos vaidmenis signalizuojant išorės TLR: „RasGRP3“ aktyvuota „Rap1“ neigiamai reguliuoja TLR sukeltą uždegiminių citokinų gamybą. Rap1 kažkada buvo laikomas antagonizuojančia maža GTPaze Ras 12, 13, 14 . Gali būti, kad RasGRP3-Rap1-GTP antagonizuoja TLR signalo aktyvavimą dėl Ras sukelto tarpininkavimo, sukeldamas slopintą IL-6 gamybą. Tačiau mūsų duomenys nepatvirtina šio pasiūlymo. Mes nustatėme, kad RasGRP3 gali suaktyvinti Rap1, tačiau nepaveikė Ras-GTP lygio reaguojant į žemą TLR agonistų kiekį. Todėl mūsų tyrimas parodė, kad Rap1-GTP, suaktyvintas RasGRP3, sukelia neigiamą TLR signalizacijos reguliavimą per Rap1 tarpininkaujamą neigiamo signalo perdavimo kelią. Bent jau mūsų sistemoje (žemas TLR agonistų lygis), RasGRP3, selektyviai aktyvuodamas Rap1, nereglamentuoja Ras signalizacijos TLR aktyvavimo metu. Reikia toliau tirti priežastis, kodėl RasGRP3 pasirenka Rap1, bet ne Ras makrofaguose. Mes čia siūlome, kad skirtingas Ras ir Rap1 jautrumas mažam aktyvaus RasGRP3 lygiui gali prisidėti prie šio RasGRP3 selektyvumo.

Makrofagai visada yra pirmoje gynybos linijoje nuo patogeno infekcijos. Vienas pagrindinių klausimų, susijusių su TLR signalizavimu, yra tas, kaip makrofagai nusprendžia būti įjungti ar ne, kad būtų suaktyvinti naudojant TLR. Daugelio tyrimų metu nustatant makrofagų atsaką į TLR aktyvaciją naudojami dideli TLR agonistų kiekiai. Tačiau, ypač fiziologinėmis sąlygomis, makrofagai gali nuolat susidurti su endogeniniais arba egzogeniniais TLR ligandais. Taigi, norint išvengti dažno aktyvavimo, makrofagams reikia pakankamai neigiamų reguliavimo molekulių. Mūsų tyrimas, kuriame naudojami numušimo testai ir transgeninės pelės / ląstelės, rodo, kad „RasGRP3“ sąlygotas „Rap1“ aktyvavimas gali būti toks „stabdis“ makrofagams. Vartodamas didesnes ir įprastas TLR agonistų dozes, RasGRP3 nesugebėjo slopinti uždegiminių citokinų gamybos, tuo tarpu tik mažomis TLR agonistų dozėmis RasGRP3 sukelta Rap1 aktyvacija sukėlė neigiamą poveikį IL-6 gamybai. Todėl „RasGRP3“ gali nustatyti makrofagų ribą, kad būtų galima gaminti IL-6, aktyvinant Rap1, tokiu būdu išvengiant dažno makrofagų aktyvavimo fiziologinėmis sąlygomis.

Paprastai TLR aktyvuoja pasroviui kylančius signalizacijos kelius, įskaitant MAPK, NF-KB ir TBK1-IRF3, per MyD88 ir (arba) nuo TRIF priklausomus mechanizmus 1, 3 . Savo tyrime pastebėjome padidėjusį ERK1 / 2 aktyvavimą RasGRP3 nutildytuose makrofaguose po TLR4, TLR3 ir TLR9 ligacijų. Ir atvirkščiai, kitiems MAPK (JNK ir p38), NF-κB ir TBK1-IRF3 keliams RasGRP3 reikšmingos įtakos neturėjo. MEK / ERK inhibitorius panaikino RasGRP3 numušimo poveikį, nurodydamas, kad pastebėtas IL-6 padidėjimas gali atsirasti dėl RasGRP3 numušimo įtakos ERK1 / 2 aktyvacijai. Anksčiau buvo įrodyta, kad „Rap1“ aktyvina MEK / ERK per BRAF 48, o tai priešingai nei „RasGRP3“ numušimo sukeltas „Rap1“ slopinimas, bet ERK1 / 2 aktyvacija, taip parodydama, kad „RasGRP3-Rap1“ gali reguliuoti ERK1 / 2 netiesiogiai ir nepriklausomai nuo „Rap1“ tarpininkaujamo BRAF / MEK / ERK aktyvinimas. Viena įdomių išvadų mūsų tyrime yra neigiama Akt koreliacija su ERK1 / 2 aktyvacija. Po RasGRP3 numušimo Akt defosforilinimas buvo pagreitintas ir Akt defosforilinimas buvo slopinamas, todėl bendras Akt aktyvacijos lygis buvo mažesnis. Tuo tarpu ERK1 / 2 aktyvaciją sustiprino „RasGRP3“ numušimas. Todėl RasGRP3 numušimo sukeltas ERK1 / 2 aktyvacija gali atsirasti dėl sutrikusio Akt fosforilinimo. Taigi, mes padarėme išvadą, kad RasGRP3 gali neigiamai reguliuoti ERK1 / 2 tarpininkaujamą uždegimą sukeliančio citokinų gamybą, pažeisdamas defosforilinimą, tačiau skatindamas Akt perfosforilinimą, kuris gali išlaikyti Akt aktyvesnėje būsenoje, ir, savo ruožtu, užkirsti kelią ERK1 / 2 aktyvacijai. . Anksčiau buvo pasiūlyta, kad PI3K / Akt signalizacijos kelias neigiamai reguliuoja TLR sukeltą uždegiminių citokinų gamybą 31 . Taigi, dėl RasGRP3-Rap1 padidinto fosfo-Akt lygio padidėjimo gali būti slopinamas IL-6 gaminimas. Tačiau tai, kaip fosfo-Akt užkerta kelią ERK1 / 2 aktyvavimui, nebuvo išspręsta mūsų tyrime ir reikės atlikti papildomą tyrimą.

Anksčiau RasGRP buvo naudojami tokioms autoimuninėms ligoms kaip sisteminė raudonoji vilkligė (SLE) ir RA 18, 25, 49, 50, 51, 52, 53, 54 . Buvo pranešta, kad PelGRP1 neturinčioms pelėms išsivysto limfoproliferaciniai sutrikimai, panašūs į tuos, kurie pastebėti sergantiems SLE 18, pagrįstą vėlesnėmis išvadomis, kad SLE sergantiems pacientams galima aptikti netinkamą funkcinės RasGRP1 ekspresiją ir nenormalų RasGRP1 izofermentų ekspresiją 49, 50 . RasGRP4-null mice demonstrated less severe inflammation in experimental colitis and arthritis 25, indicating an essential role of RasGRP4 in the development of inflammatory diseases. Similar to RasGRP1, aberrant splicing of RasGRP4 has been detected in SLE patients 51 . RasGRP3 is also associated with clinical features of SLE by using genome-wide association studies 52, 53, 54 . Our data demonstrate a negative role of RasGRP3 in regulating proinflammatory cytokine production by macrophages on low levels of TLR agonist stimuli. Our study suggests a potential protective role of RasGRP3 in inflammatory diseases. We demonstrate that RasGRP3 transgenic overexpression inhibits TLR agonists-induced IL-6 production, decreases the inflammation severity of DSS-induced colitis and relieves the clinical scores of CIA. Functionally, RasGRP3 may be more alike to RasGRP2, both of which can activate Rap1 (refs 20, 28). The contrast effects of RasGRP3 on experimental colitis and arthritis, as compared with RasGRP4 (ref. 25), may thus be attributed to differential selection of Rap1 or Ras as substrates. Whether RasGRP2 contributes to inflammatory diseases as colitis or arthritis, although expectable, may need investigations in the future. It should be noted that most of our data are obtained in transgenic mice model, which may need further confirmation in conditional knockout mice model (unavailable at present). The reconstitution experiments using bone marrow transplantation and transfer of transgenic macrophages in irradiated wild-type mice have greatly strengthened our study. Because of long observation duration of the CIA mice model, reconstitution experiments were not finished at present. However, based on our in vitro and in vivo studies, we conclude that RasGRP3 is a negative regulator of TLR-triggered inflammatory response and may protect host from inflammatory diseases, at least macrophage-dedicated inflammatory diseases. The G558R mutation of RasGRP3 detected in a colon cancer patient indicates that RasGRP3 may be associated with inflammation-related diseases, which may need validations in clinical samples derived from patients with SLE, RA or IBD.

In summary, our study has demonstrated that RasGRP3 can limit TLR-triggered proinflammatory cytokines (especially IL-6) production, possibly through the Rap1-Akt-ERK1/2 pathway. Under physiological conditions, macrophages are subjected to low amounts of pathogenic microorganisms, whose concentrations are far below the usual doses of stimuli in studies of TLR signalling. RasGRP3 may play an important role in regulating TLR response of macrophages under physiological conditions, thus setting a threshold for macrophages to be activated and decreasing the probability of inflammatory diseases.

Metodai

Mice and reagents

Wild-type C57BL/6 mice (6–8 weeks of age) were obtained from Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). All the animal experiments were approved by the Medical Ethics Committee of the Zhejiang University School of Medicine and conducted according to the Declaration of Helsinki Principles. Poly (I:C) and LPS (0111:B4) were purchased from Sigma (St. Louis, MO). C-class CpG ODN (ODN 2395) was obtained from Invivogen (San Diego, California). Antibodies specific to Flag-tag (ab125243), phospho-RasGRP3 (Thr133) (ab124843), RasGRP1 (ab37927) and RasGRP2 (ab137608) were from Abcam Inc. (Cambridge, MA). Ab for RasGRP4 (sc-292930) was obtained from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). Ab specific for RasGRP3 (3334) and Abs against total and phosphorylated forms of ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (4695, 9101), JNK1/2 (Thr183/Tyr185) (4668, 9252), p38 (Thr180/Tyr182) (9212, 9215), IKKα/β (Ser176/180) (2697, 8943), Akt (Ser473) (4060, 9272), Akt (Thr307) (9275) and IκBα (Ser32/36) (4814, 9246) were from Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Ab for β-actin (A1987) was from Sigma.

Ekspresinės plazmidės konstravimas

The recombinant vectors encoding mouse RasGRP3 (GenBank number NM_001166493) and human RasGRP3 (GenBank number NM_001139488), and vectors encoding Flag-tagged RasGRP3 were constructed by PCR-based amplification, and then subcloned into the pcDNA3.1 eukaryotic expression vector (Invitrogen, San Diego, CA) 9, 55 . Mutant forms of vectors, namely RasGRP3-T133A (mutation of Thr133 into Ala), RasGRP3-G558R (mutation of Gly558 into Arg) and H-RasG12V (mutation of Gly12 into Val), were prepared by using Mutanbest Kit according to manufacturer's instructions (TaKaRa, Shiga, Japan). All the clones were confirmed by DNA sequencing. Primer sequences used in cloning are listed in Supplementary Table 1.

Cell preparation, cell culture and transfection

RAW264.7 macrophages (ATCC, Manassas, VA) were cultured in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium containing 10% FCS (Gibco of Life Technologies, Grand Island, NY). For preparation of peritoneal macrophages, 1 ml PBS containing 3% sodium thioglycollate (Sigma) was intraperitoneally injected into abdominal cavity of each C57BL/6 mouse. Five days later, cells in the abdominal cavity were collected from 5 ml PBS injected intraperitoneally and then by centrifugation, and were allowed to adhere to plastic 100-mm culture dish (Corning Costar, Tewksbury, MA) for 12 h in complete RPMI-1640 medium. After removing floating cells by adding and aspirating 0.5 ml RPMI-1640 medium twice, peritoneal macrophages adhered to the dish were collected. Bone marrow-derived macrophages were obtained by culturing thigh bone-derived bone marrow cells in complete RPMI-1640 medium containing 20 ng ml −1 recombinant macrophage colony-stimulating factor (R&D Systems, Minneapolis, MN) for 5 days 9, 55 . For the culture of human MDM cells derived from healthy peripheral blood, CD14 + cells were isolated from mononuclear cells by using magnetic beads (Miltenyi Biotec Technology & Trading, Bergisch Gladbach, Germany) and cultured with 20 ng ml −1 recombinant macrophage colony-stimulating factor (R&D Systems) for 5 days 56 . For transient transfection of plasmids in RAW264.7 cells, the jetPEI reagents were used according to the manufacturer's instructions (Polyplus-Transfection Company, Illkirch, France).

Kiekybinis PGR

Total cellular RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen) and complementary DNA was synthesized by using the AMV Reverse Transcriptase kit (Promega, Madison, WI). Specific primers used for quantitative PCR (Q-PCR) assays are listed in Supplementary Table 2. Q-PCR was performed on a MJR Chromo 4 Continuous Fluorescence detector (Bio-Rad, Hercules, CA) according to the manufacturer's protocol. The levels of indicated molecules were determined by evaluating the threshold cycle (Ct) of target gene after normalization against the Ct value of β - actin and calculated by using the formula 2 −(Ct of target gene−Ct of β - actin) (refs 9, 55).

RNR trukdžiai

We have synthesized and selected four small interfering RNA (siRNA) duplexes (Shanghai GenePharma Co., Shanghai, China) for the knockdown of each target, including RasGRP1-4, Rap1a and Rap1b. For transient knockdown, 21-nucleotide sequences of siRNAs were synthesized (Supplementary Table 3). siRNA duplexes were transfected into macrophages using INTERFERin-HTS according to the standard protocol (Polyplus-Transfection Company). Forty-eight hours later, the efficiency of RNA interference was determined by Q-PCR and/or western blot assays.

Citokinų matavimas

ELISA kits for mouse and human IL-6 and TNFα were obtained from R&D Systems. Cytokine concentrations in culture supernatants or serum were measured by ELISA as recommended 9, 55 . Briefly, 50 μl of diluted culture supernatants (tenfold) or serum (fourfold) were added to 50 μl of assay diluent in each well, mixed gently and incubated for 2 h at room temperature. After adding 100 μl per well of horseradish peroxidase-conjugated anti-IL-6 or anti-TNFα antibody and incubating the plate for 2 h at room temperature, 100 μl per well of substrate was added to the extensively washed plate. Finally, the optical intensity of each sample was determined by subtracting readings at 540 nm from the readings at 450 nm. Concentration of cytokines was calculated by using the formula established by the standard curve of standard samples.

Vakarų pūtimas

Total cell lysates were prepared by using cell lysis buffer (Cell Signaling Technology) containing phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) 9, 55 and protein concentration determined by the BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL). Cell extracts containing equal amounts of proteins were subjected to SDS–PAGE, transferred onto nitrocellulose membrane and blotted as per the standard protocol 9, 55 . The primary antibodies and horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies were used at a final concentration of 100 ng ml −1 diluted in a buffer containing 50 mM Tris.HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl and 0.05% Tween 20. The bands were revealed using Supersignal West Femto Maximum Sensitivity substrate (Pierce) and were imaged and analysed by using Syngene Bio Imaging Systems (Frederick, MD). Full-sized scans of western blottings are provided in Supplementary Fig. 12.

Determination of GTP-bound Ras and Rap1 levels

The examinations of Ras-GTP and Rap1-GTP levels were performed using the Ras Activation Assay Kit and the Rap1 Activation Assay Kit, respectively, as recommended by the manufacturer (Merck Millipore, Billerica, MA). The levels of GTP-bound Ras and Rap1 were evaluated by measuring the precipitated proteins by Raf-1 RBD agarose and Ral GDS RBD agarose, respectively. Briefly, extracts of macrophages were incubated with 10–30 μl of Raf-1 RBD agarose or Ral GDS RBD agarose for 45 min at 4 °C. After being washed three times in lysis buffer, the agaroses were resuspended in 40 μl of 2 × Laemmli buffer containing 50 mM dithiothreitol. After boiling the samples for 5 min, western blot assays were performed to examine Ras or Rap1 as suggested. Extracts loaded with GTPγS or GDP were used as positive and negative control, respectively.

CRISPR-Cas9-mediated depletion of RasGRP3

For the depletion of RasGRP3 in RAW264.7 cells, pc3-U6-guide RNA-CMV-RED (encoding gRNA and red fluorescent protein) and Cas9-IRES-EGFP (encoding Cas9 and green fluorescent protein) plasmids (kind gifts from Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Co., Shanghai, China) were cotransfected into RAW264.7 cells. Four target sequences for gRNA synthesis were tested: 5′-GAGGAAAAAAGTATCCAAAA-3′, 5′-GAATCGTGTTACTGATGCACCGA-3′, 5′-CTGAACTGGCAGGAAAACTC-3′ and 5′-GAACGACAGTTACTTGCCCAGAA-3′. After ligation of synthesized sequences into the pc3-U6-guide RNA-EGFP and cotransfection of the two plasmids into RAW264.7 cells, cells with both red and green fluorescence were then sorted by using Gallios Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA). Sorted cells were cultured for 3–5 days and clones propagated from single cell were picked out. The depletion of RasGRP3 was confirmed by both western blotting and DNA sequencing. Only the second target sequence could efficiently deplete RasGRP3 expression. The selected clones demonstrating unchanged RasGRP3 expression were used as wild-type clones, while the clones deficient for RasGRP3 were used as RasGRP3 clones.

Generation of RasGRP3 transgenic mice

The fertilized eggs were microinjected with the linearized vectors encoding Flag-tagged full-length RasGRP3 or RasGRP3-T133A under the control of cytomegalovirus promoter and were transplanted into the oviduct of pseudo-pregnant C57BL/6 mice (Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Co.) 55 . After the birth of transgenics, the founder mice were identified by PCR assays of genomic DNA derived from the tail of transgenic mice and hybridized with wild-type C57BL/6 mice to produce animals used for all the experiments.

In vivo modulation of TLR response

Indicated amounts of LPS, Poly (I:C) or CpG ODN in 200 μl of LPS were injected intraperitoneally. Serum concentrations of IL-6 and TNFα were determined by ELISA.

DSS-induced colitis and colitis histology

Indicated 8- to 12-week-old C57BL/6 mice received water containing 2.5% DSS for 7 days and normal water later 57 . On indicated days, body weight of each mouse was measured. On day 10 after DSS treatments, sera were collected for ELISA assays of IL-6 and TNFα, and the colons were subjected to H&E analysis for inflammation severity. Colons were rinsed with cold PBS to remove fecal material, and tissue sections were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. Five-micrometre-thick sections were stained with H&E. Colitis scores (0–4) were determined by a staff pathologist who did not know the experimental protocol. The criteria for evaluating colitis scores were as following 58 : score 0, no change from normal tissue; score 1, one or a few multifocal mononuclear cell infiltrates in the lamina propria accompanied by minimal epithelial hyperplasia and slight-to-no depletion of mucus from goblet cells; score 2, lesions tended to involve more of the intestine than grade 1 lesions, or were more frequent; score 3, lesions involved a large area of the mucosa, the submucosa but rarely transmural, or were more frequent than grade 2 lesions; score 4, lesions usually involved most of the intestinal section and were more severe than grade 3 lesions (sometimes transmural), epithelial hyperplasia marked with crowding of epithelial cells in elongated glands, loss of mucin-containing cells or presence of crypt abscesses and ulcers. Twenty separate microscopic fields were evaluated for each mouse.

Immunization protocols and manipulation of CIA

To establish the model of CIA in RasGRP3 or RasGRP3-T133A transgenic mice and in wild-type mice, all mice (6 weeks of age) were immunized intradermally at the base of the tail with 100 μg of chicken type II collagen in complete Freunds' adjuvant (Sigma) 59 . Twenty-one days after the primary immunization, the mice were boosted with a secondary immunization with same amount of type II collagen emulsified in incomplete Freunds' adjuvant (Sigma) intradermally in the tail but proximal to the primary injection site. Next, the clinical scores for each paw were evaluated and scored individually on a scale of 0–4, two to three times per week 59 . On day 120, whole paw joints were fixed in 4% phosphate-buffered paraformaldehyde, decalcified in EDTA and then embedded in paraffin. Specimens were longitudinally cut into 4-μm sections for H&E staining (Sigma-Aldrich). The histological alterations were then examined under a microscope.

Irradiation and transgenic macrophage transfer

Wild-type C57BL/6 mice were lethally irradiated with two doses of 500 Rads each mouse. Donor mice (wild-type, RasGRP3 or RasGRP3-T133A transgenic mice) were killed by CO 2 inhalation and the bones (forelimbs, hindlimbs and hips) were flushed with sterile PBS to obtain bone marrow stem cells. Cells were injected intraperitoneally (2 × 10 6 total cells per mouse) within 6–8 h after irradiation. On day 8, 2 × 10 6 peritoneal macrophages derived from wild-type, RasGRP3 or RasGRP3-T133A transgenic mice were intraperitoneally injected into the irradiated mice. On day 10, the mice were subjected to TLR agonists administration or DSS treatments in vivo .

Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo pakartoti nepriklausomai bent tris kartus. Results are given as mean±se or mean±sd Comparisons between two groups were done using Student's t -test or Mann–Whitney U -test. Multiple comparisons were done with one-way analysis of variance followed by Fisher's least significant difference analysis. Statistical significance was determined as P <0.05.

Papildoma informacija

How to cite this article: Tang, S. et al. RasGRP3 limits Toll-like receptor-triggered inflammatory response in macrophages by activating Rap1 small GTPase. Nat. Bendruomenė. 5:4657 doi: 10.1038/ncomms5657 (2014).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-12 and Supplementary Tables 1-3

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.