Abipusis rorγt acetiliacijos ir funkcijos reguliavimas p300 ir hdac1 | mokslinės ataskaitos

Abipusis rorγt acetiliacijos ir funkcijos reguliavimas p300 ir hdac1 | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių biologija
  • T-pagalbininkas 17 ląstelių

Anotacija

T helperio 17 (Th17) ląstelės vaidina ne tik svarbų vaidmenį saugantis nuo bakterinių ir grybelinių infekcijų, bet ir dalyvauja autoimuninių ligų patogenezėje. Su retinoine rūgštimi susijęs našlaičių receptorius (RORγt) yra pagrindinis transkripcijos veiksnys, dalyvaujantis Th17 ląstelių diferenciacijoje per tiesioginį transkripcijos aktyvinimą interleukino 17 (A) (IL-17). Kaip pati RORγt yra reguliuojama, neaišku. Čia mes pranešame, kad p300, kuris turi histono acetiltransferazės (HAT) aktyvumą, sąveikauja su R81 ir jos acetilinimu K81 liekanoje. P300 numušimas žemina RORγt baltymo ir RORγt tarpininkaujamo geno ekspresijos reguliavimą Th17 ląstelėse. Be to, p300 gali skatinti RORγt tarpininkavimą transkripcijos aktyvacijai. Įdomu tai, kad histono deacetilazės (HDAC) HDAC1 taip pat gali sąveikauti su RORγt ir sumažinti jo acetiliacijos lygį. Apibendrinant, mūsų duomenys atskleidžia anksčiau neįvertintą posttransliacinį RORγt reguliavimą, atskleidžiant pagrindinį mechanizmą, kuriuo histono acetiltransferazė p300 ir histono deacetilazė HDAC1 tarpusavyje reguliuoja RORγt tarpininkaujamą IL-17 transkripcijos aktyvaciją.

Įvadas

T helperio 17 (Th17) ląstelės dalyvauja tiek įgimtame imunitete, tiek adaptacinėse imuninėse reakcijose. Šios ląstelės vaidina ne tik svarbų vaidmenį apsaugant nuo bakterinių ir grybelinių infekcijų, bet ir dalyvauja autoimuninių ligų, įskaitant išsėtinę sklerozę, artritą, Krono ligą, uveitą ir psoriazę, patogenezėje 1, 2 .

Th17 ląstelės, gaminančios interleukiną 17 (A) (IL-17A) ir IL-17F, buvo aprašytos kaip atskiras T pagalbinių ląstelių pogrupis, besiskiriantis nuo Th1, Th2 ir reguliuojančių T (Treg) ląstelių. IL-17A ir IL-17F yra ekspresuojami periferinio kraujo CD4 + T ląstelėse ir skatina proinflammatorinių citokinų bei chemokinų, įskaitant IL6 ir CXCL8 3, gamybą. Transformuojantys augimo faktoriaus β (TGF-β), IL-23 ir priešuždegiminiai citokinai (pvz., IL-1β ir IL-6) yra būtini žmogaus Th17 diferenciacijai ir IL-17A, IL-17F, IL-23 ekspresijai. receptorių (IL-23R) ir su retino rūgštimi susijusių našlaičių receptorių (RORγt) 4 . Šių genų reguliavimą sustiprina IL-21 indukcija, veikianti autokrininiu būdu 5 . Įrodyta, kad norint diferencijuoti Th17, reikalingi transkripcijos faktoriai RORγt ir RORα kartu su kitais esminiais transkripcijos veiksniais, tokiais kaip signalo keitiklis ir 3 transkripcijos aktyvatorius (STAT3), arilo angliavandenilių receptoriai (Ahr), interferono reguliavimo faktorius 4 (IRF4), su runtu susijęs transkripcijos faktorius 1 (Runx1), B-ląsteles aktyvinantis transkripcijos koeficientas (BATF), Sox5 ir c-MAF - 6, 7, 8, 9 . Be to, RORγt deficitinės T ląstelės slopina Th17 ląstelių diferenciaciją, silpnina IL-17A ir IL-17F raišką ir priešinasi autoimuninėms ligoms. Priešingai, per didelis RORγt ekspresas sukelia IL-17 raišką ir sukelia sunkesnį eksperimentinį autoimuninį encefalomielitą (EAE) nei natūraliai pasitaiko laukinio tipo pelėms 7, 10, 11 . Šie tyrimai kartu rodo, kad RORγt yra liniją apibūdinantis transkripcijos faktorius, kuris vaidina pagrindinį deterministinį vaidmenį diferencijuojant Th17 ląsteles ir nukreipia Th17 specifinių genų, įskaitant IL-17A, IL-17F, IL-21 ir transkripcinį aktyvavimą. IL-23R.

Ankstesni mūsų duomenys parodė, kad E3 deubiquitinazė USP17 teigiamai reguliuoja RORγt Th17 ląstelėse 12 . Neseniai atliktame tyrime nustatyta, kad C ląstelių, turinčių deficitą T ląstelių, sumažėjo RORγt sąlygotos IL-17A ir IL-17F ekspresija in vitro ir kad pelės, kurioms trūko CNS2, buvo atsparios EAE, kurios priežastis galėjo būti JmjC įsisavinimas CNS2 domeno turintis baltymas 3 (JMJD3) ir histono acetiltransferazė p30013. Be to, „Fanpan“ parodė, kad HIF1α ir RORγt sukėlė RORγt taikinių genų transkripciją ir Th17 ląstelių diferenciaciją, įdarbindami p300 į IL-17A promotorių 14 . Vis dėlto, ar p300 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant RORγt, ir koks yra jo mechanizmas, nežinoma.

p300 (dar žinomas kaip Ep300 arba KAT3B), adenoviruso E1A susijęs 300 kDa baltymas, yra transkripcinis kofaktorius ir branduolinis fosfoproteinas, turintis vidinį acetiltransferazės aktyvumą, ir jis reguliuoja histonus, kad modifikuotų chromatino organizaciją. Be to, p300 gali reguliuoti nehistoninius baltymus, įskaitant branduolio transkripcijos faktorius, tokius kaip p53, NF-κB ir Foxp3 15, 16, 17 . Šių transkripcijos veiksnių acetilinimas gali modifikuoti jų transkripcinį aktyvumą, pakeisdamas jų stabilumą, tarpląstelinės lokalizacijos ir (arba) DNR jungimosi aktyvumą 18 .

Histono acetiltransferazės ir histono deacetilazės turi abipusę įtaką histono acetiliacijos pusiausvyros būsenai. Histono acetiltransferazės paprastai veikia kaip transkripcijos aktyvatoriai, o histonų deacetilazės, katalizuojančios histonų decetilinimą, paprastai reguliuoja chromatino struktūrą, modifikuoja histono ir nehistono baltymus ir slopina genų ekspresiją 19, 20 . I klasės histono dezacetilazės pošeimos nariai yra HDAC1, HDAC2, HDAC3 ir HDAC8 21 ; HDAC1, kaip transkripcinis koaktyvatorius, veikia histono deacetilinimo aktyvumą ir vaidina svarbų vaidmenį biologiniuose procesuose, tokiuose kaip ląstelių proliferacija, diferenciacija ir ląstelių ciklo progresavimas 20 . Neseniai daugelyje tyrimų HDAC aktyvumas buvo susietas su tokiomis ligomis kaip vėžys, plaučių hipertrofija ir širdies hipertrofija 22, 23 .

Ankstesni tyrimai parodė, kad histono acetiltransferazės-deacetilazės kompleksai reguliuoja Foxp3 tarpininkaujamą transkripcijos slopinimą 24, o p300 ir deacetilazė Sirt2 tarpusavyje reguliuoja autoacetiliaciją 25, 26 . Be to, p300 ir HDAC1 abipusiškai reguliuoja adenozino monofosfato suaktyvintą baltymų kinazę (AMPK) 27 . Vis dėlto neaišku, ar p300 ir HDAC1 tarpusavyje reguliuoja RORγt acetiliaciją ir funkcija.

Čia mes pranešame, kad RORγt yra acetilinamas Th17 ląstelėse. p300 sąveikauja, stabilizuoja ir acetiliuoja RORγt, o p300 numušimas sumažina RORγt baltymų lygiu ir sumažina RORγt tarpininkaujamą genų ekspresiją. p300 taip pat skatina IL-17 transkripcinį RORγt tarpininkavimą. Be to, HDAC1 sąveikauja ir decetiliuoja RORγt, sukeldamas RORγt tarpininkaujamos IL-17 transkripcijos slopinimą. Mūsų rezultatai atskleidžia anksčiau nežinomą mechanizmą, pagal kurį p300 ir HDAC1 tarpusavyje reguliuoja RORyt tarpininkaujamą IL-17 transkripcijos aktyvaciją.

Rezultatai

RORγt yra acetilinamas žmogaus Th17 ląstelėse

RORγt yra pagrindinis transkripcijos faktorius Th17 ląstelėse, o RORγt raiška lemia Th17 diferenciaciją. Pirmiausia mes išbandėme, ar RORγt yra acetilinamas laikinai transfekuotose ląstelėse. „Flag-RORγt“ buvo perneštas į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams, ir mes pastebėjome, kad RORγt buvo acetilinamas (1 pav. A). Be to, mes nustatėme, kad RORγt taip pat buvo acetilinamas Th17 ląstelėse. Be to, RORγt acetilinimas žymiai pagerėjo esant HDAC inhibitoriams (1 pav. B). Visi šie duomenys rodo, kad RORγt yra acetilinamas in vivo .

Image

( A ) Vėliava pažymėtas RORγt buvo perkeltas į HEK293T ląsteles, apdorotas arba su HDAC inhibitoriais, arba be jų, ir ląstelių lizatai buvo analizuojami naudojant nurodytus antikūnus. ( B ) Neaktyvios CD4 + T ląstelės buvo išrūšiuotos iš PBMC ir kultivuojamos Th17 poliarizacijos sąlygomis 7 dienas. Ląstelės buvo apdorotos arba su HDAC inhibitoriais, arba be jų. Iš Th17 ląstelių lizatų imuninis nusėdimas buvo atliekamas su RORγt arba kontroliniais IgG antikūnais ir analizuojami naudojant nurodytus antikūnus. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

p300 sąveikauja su RORγt ir stabilizuoja jį

Norėdami įvertinti, ar tam tikri acetiltransferazės gali iš naujo sureguliuoti RORyt sukeltą transkripcijos aktyvaciją, mes kartu su IL-17 promotoriumi kotransfekavome 5 HAT ir RORγt į HEK293T ląsteles, kad patikrintume HAT poveikį RORγt tarpininkaujamai transkripcijos aktyvacijai, p300 reikšmingai padidino RORγt tarpininkavimą. aktyvacija tarp 5 HAT (papildomas 1 paveikslas). Be to, Western blot analizė, kurioje buvo lyginamos anksčiau negyvos žmogaus CD4 + T ir Th17 ląstelės, parodė, kad p300 baltymo lygis yra didesnis Th17 ląstelėse (2A pav.). Vėliau, siekiant nustatyti, ar p300 yra susijęs su RORγt, buvo atliktas koimuninis nusodinimas. HA-p300 ir Flag-RORγt buvo laikinai transfekuotos į HEK293T ląsteles, ir ląstelių lizatai buvo analizuojami naudojant antikūnus prieš HA žymę. Bendras nusėdimas tarp p300 ir RORγt parodė, kad p300 sąveikauja su RORγt (2B pav.). Be to, endogeninis IP taip pat parodė, kad p300 sąveikauja su RORγt žmogaus Th17 ląstelėse (2 pav. C). p300 lokalizacija daugiausia buvo branduolinė, o RORγt taip pat buvo stebimas branduolyje. Šie rezultatai leidžia manyti, kad p300 kolokalizuojasi su RORγt HeLa ląstelėse, suderinamai su p300 ir RORγt sąveika (2 papildomas paveikslas).

Image

( A ) Neaktyvios CD4 + T ląstelės buvo diferencijuotos į Th17 ląsteles in vitro . RORγt ir p300 baltymų lygiai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę. ( B ) HEK293T ląstelės buvo laikinai transfekuotos vėliava pažymėtu RORγt ir (arba) HA pažymėtu p300. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-HA antikūną ir analizuojamas atliekant Western blot analizę, kaip nurodyta. ( C ) Endogeninė sąveika tarp p300 ir RORγt Th17 ląstelėse. ( D ) Vėliava pažymėtas RORγt buvo kotransfekuotas didėjančiais His-pažymėto p300 kiekiais į HEK293T ląsteles. Ląstelės buvo analizuojamos atliekant Western blot analizę. ( E ) Vėliava pažymėtas RORγt buvo kotransfekuotas His-pažymėtu p300 į HEK293T ląsteles. Ląstelės nurodytą laiką buvo apdorotos CHX ir analizuojamos atliekant Western blot analizę. ( F ) Naivios CD4 + T ląstelės buvo kultivuojamos Th17 poliarizacijos sąlygomis 7 dienas. Th17 ląstelės buvo transduotos lentivirusu, turinčiu arba shCK, arba shp300. Ląstelės buvo gydomos puromicinu 3 dienas ir buvo įvertintas baltymų kiekis. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

Ankstesni tyrimai parodė, kad acetilinimas gali turėti įtakos baltymų stabilizavimui 17, 28, todėl mes ištyrėme, ar p300 gali stabilizuoti RORγt. Mes pastebėjome, kad nuo dozės priklausomas RORγt baltymo lygio padidėjimas teigiamai koreliavo su baltymo p300 lygiu (2 pav. D). Norėdami patvirtinti šį rezultatą, Flag-RORγt mes transfekavome į HEK293T ląsteles su His-p300 arba be jo, tada nurodytais laiko momentais apdorojome ląsteles baltymų sintezės inhibitoriumi cikloheksimidu (CHX). Taigi, mes patvirtinome, kad RORγt stabilizaciją gali teigiamai reguliuoti p300 (2E pav.). Norėdami toliau tirti P300 tarpininkaujantį RORγt stabilizavimą labiau fiziologinėmis sąlygomis, mes sukūrėme shRNR konstrukciją, nukreiptą į p300 žmogaus Th17 ląstelėse, kad sumažintume endogeninį p300 lygį ir pastebėjome, kad p300 numušimas sumažino RORγt baltymo lygį (2 pav. F).

p300 acetiliuoja RORγt ties K81 liekana

p300 yra acetiltransferazė, pasižyminti vidiniu acetiltransferazės aktyvumu. Ankstesni duomenys parodė, kad p300 gali acetiliuoti transkripcijos faktorius, tokius kaip Foxp3 ir p53 15, 29 . Norėdami nustatyti, ar p300 gali acetiliuoti RORγt, vėliava pažymėtos p300 ir Myc pažymėtos RORγt plazmidės buvo perkeltos į HEK293T ląsteles, tada ląsteles apdorojome HDAC inhibitoriais. Imuninis nusodinimas buvo atliktas naudojant anti-Myc antikūną, ir rezultatai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę naudojant nurodytus antikūnus. Mūsų duomenys rodo, kad p300 acetiliuoja RORγt (3 pav. A) ir tai daro priklausomai nuo dozės (3 pav. B). Be to, norėdami nustatyti, ar RORγt acetilinimas yra susijęs su p300 žmogaus Th17 ląstelėse, mes panaudojome shRNR konstrukciją, nukreiptą į p300 žmogaus Th17 ląstelėse, kad sumažintume endogeninį p300 lygį ir stebėjome, kad p300 numušimas sumažino RORγt acetiliacijos lygį (3 pav. C). .

Image

( A ) Myc pažymėti RORγt ir Flag pažymėti p300 buvo kotransfekuoti į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-Myc antikūną, o Western blot analizuoti naudojant nurodytus antikūnus. ( B ) Myc-pažymėtas RORγt buvo kotransfekuotas didinant vėliavos žymėto p300 dozes į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams. Ląstelių lizatai imuniniu būdu buvo nusodinami anti-Myc antikūnais ir analizuojami atliekant Western blot analizę. ( C ) Neaktyvios CD4 + T ląstelės buvo diferencijuotos į Th17 ląsteles. Th17 ląstelės buvo transduotos lentivirusiniu konstruktu, turinčiu arba shCK, arba shp300. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-RORγt antikūną ir analizuotas naudojant nurodytus antikūnus. ( D ) HA pažymėtas p300 buvo kotransfekuotas RORγt sutrumpinimo mutantais arba laukinio tipo RORγt į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-Flag antikūną ir analizuotas naudojant nurodytus antikūnus. ( E ) Myc pažymėti laukinio tipo RORγt arba K81R mutantai buvo kotransfekuoti su Flag-p300 į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-Myc antikūną ir analizuotas naudojant nurodytus antikūnus. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

Pilname ilgyje RORyt yra N-galinis domenas, vyrio srities domenas ir ligandą surišantis domenas. Norėdami pažymėti R3γ regioną, kurį acetiliuoja p300, RORγt sutrumpinimo mutantai arba laukinio tipo RORγt buvo kotransfekuoti HA pažymėtu p300 į HEK293T ląsteles. Atliktas imuninis nusėdimas, o rezultatai parodė, kad p300 acetiliuoja RORγt N-galo srityje (3D pav.). Toliau mes apžiūrėjome RORγt, siejamo su p300, N-galinę sritį imunoprecipitacijos būdu ir nustatėme, kad taško mizas lizino 81 į argininą reikšmingai sumažino p300 tarpininkaujamą acetiliaciją (3 pav. E).

HDAC inhibitoriai padidina RORγt acetiliaciją ir RORγt tarpininkaujamą IL-17 transkripciją

Norėdami ištirti HDAC inhibitorių poveikį RORγt acetiliacijai ir RORγt tarpininkaujamai transkripcijai, mes HEX293T ląstelėse pernešėme vėliavos žymėtą RORγt ir HA pažymėtą p300, esant HDAC inhibitoriams. Mes pastebėjome, kad HDAC inhibitoriai žymiai padidino RORγt acetiliaciją, palyginti su neapdorota kontrole (4 pav. A). Be to, IL-17A luciferazės reporteris buvo kotransfekuotas HA-p300 arba Flag-RORγt į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams arba jų neturint. Šiame eksperimente mes pastebėjome, kad RORyt tarpininkaujant IL-17 transkripcijai, palyginti su DMSO inhibitoriais, dramatiškai padidėjo esant HDAC inhibitoriams (4 pav. B). Vėliau, kai Th17 ląstelės buvo apdorotos DMSO arba HDAC inhibitoriais, RT-PCR analizė parodė, kad RORγt tarpininkaujamų genų ekspresija buvo dramatiškai padidinta, esant HDAC inhibitoriams, palyginti su tik DMSO kontrole (4 pav. C).

Image

( A ) Vėliava pažymėti RORγt ir HA-p300 buvo kotransfekuoti į HEK293T ląsteles, apdorotas arba su HDAC inhibitoriais, arba be jų. Ląstelių lizatai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-Flag antikūnu ir analizuojami nurodytais antikūnais. ( B ) Vėliavos ženklu pažymėtas RORγt ir HA pažymėtas p300 buvo kotransfekuoti IL-17 luciferazės reporteriu į HEK293T ląsteles, esant HDAC inhibitoriams. Ląstelės lizuojamos ir išmatuotas luciferazės aktyvumas. ( C ) Th17 ląstelės buvo apdorotos DMSO arba HDAC inhibitoriais ir išanalizuotos naudojant RT-PGR. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM; * p <0, 05, ** p <0, 01.

Visas dydis

HDAC1 sąveikauja ir deacetiliuoja RORγt

Norėdami toliau ištirti, kuris HDAC yra atsakingas už pastebėtą poveikį, mes apžiūrėjome kelių HDAC poveikį p300 tarpininkaujamam RORγt acetiliavimui ir nustatėme, kad HDAC1 sumažino p300 tarpininkaujamą RORγt acetiliaciją (3 papildomas paveikslas). Vėliau, norėdami nustatyti HDAC1 baltymo lygį naiviose ir Th17 poliarizuotose T ląstelėse, mes panaudojome Western blot analizę ir nustatėme, kad HDAC1 baltymų lygis Th17 ląstelėse buvo didesnis, palyginti su anksčiau negyvomis CD4 + T ląstelėmis (5A pav.). Norėdami patikrinti, ar HDAC1 yra susijęs su RORγt, mes perkėlėme „Myc-HDAC1“ ir „Flag-RORγt“ į HEK293T ląsteles, o bendrojo nusodinimo rezultatai parodė, kad HDAC1 sąveikauja su RORγt (5B pav., C). Be to, endogeninis IP taip pat parodė, kad HDAC1 sąveikauja su RORγt žmogaus Th17 ląstelėse (5 pav., E). HDAC1 turi histono deacetilazės aktyvumą, todėl mes siekėme nustatyti, ar HDAC1 gali sumažinti RORγt acetiliacijos lygį. Mes nustatėme, kad HDAC1 sumažino RORγt acetiliaciją (5 pav. F). Be to, HDAC1 sumažino R3γ acetilinimą, kurį sukelia p300 (5G pav.). Visi šie duomenys leidžia manyti, kad HDAC1 sąveikauja ir decetiliuoja RORγt.

Image

( A ) Neaktyvios CD4 + T ląstelės buvo diferencijuotos į Th17 ląsteles. HDAC1 ir RORγt baltymų lygis buvo tiriamas atliekant Western blot analizę. ( B, C ) Vėliavos ženklu pažymėtas RORγt ir Myc pažymėtas HDAC1 buvo kotransfekuotos į HEK293T ląsteles. Ląstelių lizatai buvo išgryninti kartu su anti-Myc arba anti-Flag antikūnais ir analizuojami atliekant Western blot analizę su nurodytais antikūnais. ( D, E ) Endogeninė HDAC1 ir RORγt sąveika žmogaus Th17 ląstelėse. ( F ) Vėliava pažymėtas RORγt ir Myc pažymėtas HDAC1 buvo kotransfekuoti į HEK293T ląsteles. Imuninis nusėdimas buvo atliktas naudojant anti-Flag antikūną ir analizuotas naudojant nurodytus antikūnus. ( G ) Vėliava pažymėtas RORγt ir HA pažymėtas p300 buvo kotransfekuoti su Myc pažymėtu HDAC1 į HEK293T ląsteles. Ląstelių lizatai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-Flag antikūnu ir analizuojami atliekant Western blot analizę. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

p300 ir HDAC1 tarpusavyje reguliuoja RORγt funkciją

Norėdami ištirti mechanizmą, pagal kurį p300 reguliuoja RORγt, mes sukūrėme shRNR konstrukciją, nukreiptą į p300, kad sumažintume endogeninį p300 lygį, o RT-PCR duomenys rodo, kad nutildyti p300 žemyn sureguliuoti Th17 susiję genai, įskaitant IL-17A, IL-17F ir IL- 23R (6A pav.). Taigi, sunaikinus p300, sumažėja RORγt tarpininkaujama genų ekspresija Th17 ląstelėse. Be to, norėdami toliau įvertinti Th17 citokinų baltymų lygius, mes panaudojome ELISA, kad parodytume, jog p300 numušimas sumažino IL-17A ir RORγt raišką (6 pav. B). RORγt yra transkripcijos faktorius, kuris tarpininkauja IL-17 promotoriaus aktyvumui. Norint nustatyti, ar p300 skatina RORyt tarpininkaujantį IL-17 transkripciją, IL-17 liuciferazės reporteris buvo kotransfekuotas HA-p300 arba Flag-RORγt į HEK293T ląsteles. Buvo išanalizuota luciferazės raiška ir nustatyta, kad p300 pagerina RORγt tarpininkaujant IL-17 transkripcijai priklausomai nuo dozės (6 pav. C). Be to, kai IL-17 luciferazės reporteris buvo kotransfekuotas arba HA-p300, arba Flag-RORγt į HEK293T ląsteles, esant Myc-HDAC1, rezultatai parodė, kad HDAC1 slopina nuo P300 priklausomą, RORγt tarpininkaujamą IL-17 transkripciją (pav. . 6D). Šie duomenys kartu rodo, kad p300 sustiprina RORγt tarpininkavimą, kurį slopina HDAC1.

Image

( A ) Naivios CD4 + T ląstelės buvo išrūšiuotos iš PBMC ir kultivuojamos Th17 poliarizacijos sąlygomis 7 dienas. Th17 ląstelės buvo persodintos lentivirusu, turinčiu arba shCK, arba shp300. Tada ląstelės 3 dienas buvo gydomos puromicinu ir analizė atlikta naudojant RT-PGR. ( B ) Neaktyvios CD4 + T ląstelės buvo diferencijuotos į Th17 ląsteles. Th17 ląstelės buvo transduotos lentivirusu, turinčiu arba shCK, arba shp300. ELISA buvo atlikta norint nustatyti IL-17A lygį Th17 ląstelėse. ( C ) Vėliava pažymėtas RORγt ir HA pažymėtas p300 buvo kotransfekuoti IL-17 liuciferazės reporteriu į HEK293T ląsteles. Ląstelės lizuojamos ir išmatuotas luciferazės aktyvumas. ( D ) Vėliavos ženklu pažymėtas RORγt, HA pažymėtas p300 ir Myc pažymėtas HDAC1 buvo kotransfekuoti IL-17 luciferazės reporteriu į HEK293T ląsteles. Ląstelės lizuojamos ir išmatuotas luciferazės aktyvumas. ( E ) Darbinis modelis, rodantis abipusį RORγt acetiliacijos ir RORγt funkcijos reguliavimą p300 ir HDAC1. Kiekvienas paveikslas atspindi> 3 nepriklausomus eksperimentus. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM; ** p <0, 01.

Visas dydis

Diskusija

CD4 + T ląstelių funkcinį diferenciaciją lemia linijai būdingi transkripcijos veiksniai

Ankstesni tyrimai parodė, kad T-bet vaidina determinuotą vaidmenį diferencijuojant Th1, tuo tarpu GATA3 ir Foxp3 yra svarbūs diferencijuojant Th2 ir Treg, atitinkamai 30, 31 . Naujausi duomenys parodė, kad RORγt yra pagrindinis transkripcijos veiksnys, kuris kartu su kitais transkripcijos veiksniais skatina Th17 ląstelių diferenciaciją 9 .

Daugybė tyrimų parodė, kad post-transliacijos modifikacijos, įskaitant acetilinimą, fosforilinimą, metilinimą, sumoilinimą ir ubikvitinaciją, veikia šiuos kritinius transkripcijos veiksnius. Pavyzdžiui, ubiquitino ligazė Stub1 skatina Foxp3 skilimą ir taip neigiamai moduliuoja Trego ląstelių slopinamąjį aktyvumą 32, o TIP60 teigiamai reguliuoja ThPOK tarpininkaujamą eomesodermino represiją žmogaus CD4 + T ląstelėse 28 . Abipusis Foxp3 acetiliacijos reguliavimas ir transkripcijos represijos vyksta veikiant histono acetiltransferazei Tip60 ir histono deacetilazėms HDAC7 ir HDAC9 24 . Deubiquitinazė USP17 teigiamai reguliuoja RORγt tarpininkaujamą IL-17 transkripciją 12 . Vis dėlto neaišku, ar histono acetiltransferazės ir deacetilazės reguliuoja RORγt.

Čia mes parodėme, kad RORγt yra acetilinamas Th17 ląstelėse in vivo ir kad RORγt acetilinimas žymiai pagerėja esant HDAC inhibitoriams (trichostatinas A (TSA), nikotinamidas (NAM) ir EX-527). Kartu šie HDAC inhibitoriai gali slopinti didžiąją dalį histonų deacetilazių 17, 28 . TSA yra I ir II klasės histonų deacetilazių inhibitorius, NAM - III klasės histonų deacetilazių inhibitorius, o EX-527 yra plačiai naudojamas sirtuino fermentų 33, 34 inhibitorius. Ateityje atliktame tyrime nustatysime, kuris HDAC inhibitorius yra atsakingas už pastebėtą poveikį.

p300 sąveikauja, stabilizuoja ir acetiliuoja RORγt savo K81 liekanoje. P300 numušimas sumažina RORγt baltymų lygiu ir sumažina IL-17 transkripciją. Ankstesni tyrimai parodė, kad daugelis posttransliacinių modifikacijų turi kritinį poveikį p53 stabilumui ir funkcijai 35 . Be to, acetilinimas vaidina svarbų vaidmenį veikiant p53 p300 15, 36 . Įrodyta, kad tinkami mažų molekulių p300 inhibitoriai pakenkia Foxp3 + Treg ląstelių funkcijai ir skatina priešvėžinį imunitetą 29 . Todėl bus įdomu ištirti R3γ acetilinimą ir funkcinį reguliavimą p300. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad p300 polikubiquitinavo p53 per ubikvitino ligazės aktyvumą, nepriklausomą nuo jo lizino acetiltransferazės aktyvumo 37, 38 . Be to, anksčiau buvo aprašytas panašus Smad7 ir p53 mechanizmas 39, 40 . Todėl, ar p300 ubikvitino ligazės aktyvumas taip pat gali reguliuoti RORγt, reikia toliau tirti.

Įrodyta, kad HDAC inhibitoriai sumažina baltymų kiekį ir aktyvumą bei padidina visuotinį acetiliacijos lygį, todėl pasikeičia ląstelių proliferacija, apoptozė ir genų ekspresija 41, 42 . Šioje ataskaitoje mes pateikėme įrodymų, kad HDAC inhibitoriai padidina RORγt acetiliaciją ir RORγt tarpininkaujamą IL-17 transkripciją. Naujausi duomenys parodė, kad histono dezacetilazės inhibitorius ITF2357 sumažina IL-6R gamybą ir RORγt ekspresiją, slopina poliarizaciją link Th17 ląstelių ir sustiprina Trego ląstelių poliarizaciją IL-6-STAT3-IL17 keliu pelėms 43 . Deacetilazės inhibitorius TSA skatina slopinamąją Trego ląstelių funkciją 44 . Tačiau Zhijianas parodė, kad TSA mažina Foxp3 ekspresiją ir Trego ląstelių skaičių 45 . Mūsų rezultatai prieštarauja ankstesnių tyrimų rezultatams, nes skiriasi veiksniai, tokie kaip gydymo laikas, naudojamo HDAC inhibitoriaus klasė ir mėginių šaltinis. Todėl mūsų rezultatai rodo, kad HDAC inhibitoriai gali sustiprinti genų transkripciją slopindami HDAC.

Baltymų acetiltransferazės ir deacetilazės reguliuoja transkripcinių veiksnių acetiliacijos ir deacetilinimo pusiausvyrą, taip darydamos įtaką dalyvaujančių genų ekspresijai. HAT, kurie prideda acetilo grupę prie lizino liekanų, yra susiję su genų transkripcijos aktyvumu. Tačiau HDAC, kurie silpnina acetilinimo lygius, pašalindami acetilo grupes iš savo substratų, yra susiję su transkripcine represija 46 . Šioje ataskaitoje mes pastebėjome, kad HDAC1 sąveikauja ir deacetiliuoja RORγt ir slopina RORγt tarpininkaujamą transkripcijos aktyvaciją, todėl HDAC1 gali būti atsakingas už pastebėtą poveikį. Ankstesnis straipsnis parodė, kad HDAC1, paprastai laikomas transkripcijos branduoliu, turi histono deacetilazės aktyvumą ir slopina genų transkripciją 20 .

RORγt dalyvauja autoimuninėse ligose. Čia mes parodome, kad RORγt yra acetilinamas, o šį acetiliavimą tarpusavyje reguliuoja histono acetiltransferazė p300 ir histono deacetilazė HDAC1. Mūsų darbas rodo, kad p300 ir HDAC1 gali būti nauji taikiniai gydant RORγt sukeliamas autoimunines ligas.

Metodai

Reagentai

Anti-RORγ (sc293150), anti-p300 (sc-585), anti-Myc, anti-HA, pelės IgG ir žiurkės-IgG antikūnai buvo gauti iš „Santa Cruz Biotechnology“. Antiaktinai ir anti-FLAG (M2) antikūnai, TSA (# 052M4111V) ir baltymų inhibitorių kokteilis (# 083M4021V) buvo gauti iš „Sigma-Aldrich“. Anti-HDAC1 antikūnas (# 5356S) buvo gautas iš Cell Signaling Technology. Antiacetilizino antikūnas (ICP0380) buvo nupirktas iš ImmuneChem (Kanada), o EX-527 (S1541) - iš Selleck. „Anti-CD3 / CD28 Dynabeads“ buvo įsigyti iš „Invitrogen“. Žmogaus IL-17A Platinum ELISA rinkinys (BMS2017) buvo įsigytas iš „eBioscience“. Baltymų A / G-agarozės rutuliukai (A10001) buvo gauti iš bendrovės Abmart (Kinija).

Ląstelių kultūra ir transfekcija

HEK293T ląstelės buvo palaikomos DMEM (Hyclone), turinčioje 10% galvijų vaisiaus serumo (FBS) (131212, ExCell Biology), ir pagal gamintojo instrukcijas buvo perpiltos polietilenimino (PEI) reagentu (23966, Polysciences). Ląstelės buvo kultivuojamos 37 ° C / 5% CO 2 inkubatoriuje ir surinktos 48 valandas po transfekcijos.

Žmogaus ląstelių rūšiavimas ir Th17 ląstelių diferenciacijos tyrimai

Iš sveikų donorų buvo išskirtos periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC), o CD4 + T ląstelės buvo gautos naudojant magnetinius rutulius. Naivios T ląstelės buvo surūšiuotos pagal CD4 + CD25 žemo CD45RA aukščio FACS. Vėliau naivios T ląstelės buvo diferencijuotos į Th17 ląsteles X-VIVO15 (04-418Q, Lonza), turinčiose 10% žmogaus kraujo (Gibco), 1% nepakeičiamų aminorūgščių, 1% natrio piruvato, 1% L-glutamino ir 1% penicilino / streptomicino, stimuliuojant anti-CD3 / CD28 dynabeads, esant ląstelių ir granulių santykiui 1: 1, esant citokinams (50 ng / ml rhIL-6 (206-IL-010, R&D), 100 ng / ml rhIL-23 (1290-IL-010, R&D), 1 ng / ml rhTGF-β (240-B-002, R&D) ir 10 ng / ml rhIL-1β (201-LB-005, R&D)). Ląstelės buvo kultivuojamos 37 ° C / 5% CO 2 inkubatoriuje 7 dienas ateityje.

Bendras nusodinimas

Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos, praplautos lediniu PBS ir 30 minučių lizuojamos ant ledo baltymų lizės buferiu (50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA). 1% NP40, 0, 5% NaDOC ir 10% glicerolio), kurių sudėtyje yra baltymų inhibitorių (kokteilis, 1 mM Na 3 VO 4, 10 mM NaF ir 1 mM PMSF). Ląstelių lizatai buvo centrifuguojami 4 ° C temperatūroje, o supernatantai buvo imunoprecipipuoti sukant 1 valandą 4 ° C temperatūroje su antikūnais, po to 1 h su proteinA / G-agarozės granulėmis. Tada granulės buvo plaunamos lizės buferiu 4 kartus, atliktas vakarinis blotinimas ir imuninis nusodinimas, kaip aprašyta anksčiau 47 .

HAT tyrimas

P300 ekspresijos plazmidė ir RORγt ekspresijos plazmidė buvo kotransfekuotos į HEK293T ląsteles. Prieš imant ląsteles, ląstelės buvo apdorotos HDAC inhibitoriais (gydymas per naktį 50 μM EX-527 ir 4 val. Gydymas 1 mM NAM ir 400 nM TSA). Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos ir atliktas imuninis nusodinimas.

Liuciferazės tyrimai

IL-17 luciferazės reporterių vektoriai, β-gal ir plazmidės buvo pernešti į HEK293T ląsteles. Po 48 valandų ląstelės buvo surinktos, praplautos lediniu PBS, 30 minučių lizuojamos ant ledo, naudojant luciferazės lizės buferį, tada analizuojamos naudojant dvigubą luciferazės reporterių rinkinį (Promega).

Realaus laiko kiekybinė PGR

RNR buvo ekstrahuota iš 1 × 106 ląstelių, naudojant TRIzol (Invitrogen), ir cDNR buvo perrašyta atvirkščiai pagal gamintojo instrukcijas, pateiktas SYBR reagentui („PrimeScript RT reagentų rinkinys“, „TaKaRa“). Atlikta realiojo laiko kiekybinė PGR (SYBR Premix Ex TaqTM, TaKaRa), β-aktino ekspresija tarnauja kaip vidinė kontrolė. Buvo naudojama „ABI Prism 7500“ sekos aptikimo sistema (taikomosios biosistemos). Šie pradmenys buvo naudojami qPCR eksperimentams.

p300 į priekį: 5′- GGGAGTAAATGGAGGTGTAGG-3,

p300 atvirkštinis: 5′-AGGAAATATGGCTTGGACGAG-3 ′.

IL-17 A-priekis: 5′-ACCAATCCCAAAAGGTCCTC-3 ′,

IL-17A atvirkštinė: 5′-GGGGACAGAGTTCATGTGGT-3 ′.

„IL-17F“ į priekį: 5′-CCTCCCCCTGGAATTACACT-3 ′,

IL-17F atvirkštinis: 5′-ACCAGCACCTTCTCCAACTG-3 ′.

IL-23R pirmyn: 5′-CATGACTTGCACCTGGAATG-3 ′,

IL-23R atvirkštinė: 5′-GCTTGGACCCAAACCAAGTA-3 ′.

β-aktino pirmyn: 5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3 ′,

β-aktino reversas: 5′-CAGGGCAGTGATCTCCTTCT-3 ′.

Virusų perdavimas

PLKO.1-shCK arba PLKO.1-shp300 kartu su VSVG ir del8.9 buvo kotransfekuoti į HEK293T ląsteles, naudojant PEI. Po 48 valandų viruso supernatantai buvo surinkti ir inkubuojami per naktį su Th17 ląstelėmis, esant 8 μg / ml polibreno. Vėliau antrą dieną supernatantai buvo pakeisti šviežia X-VIVO15 terpe, o puromicinas buvo pridėtas prie Th17 ląstelių 3 dienas, kad būtų parinkti teigiami klonai. Buvo panaudotos šios pradmenų sekos.

shCK: 5′-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3 ′, shp300: 5′- CAGACAAGTCTTGGCATGGTA-3 ′.

ELISA

Žmogaus IL-17 Platinum ELISA rinkinys buvo naudojamas pagal gamintojo protokolą (eBioscience).

Konfokalinis tyrimas

„Myc“ pažymėti RORγt ir „Flag“ pažymėti p300 buvo kotransfekuoti į „HeLa“ ląsteles, kurios buvo fiksuotos, permeabilizuotos ir nudažytos anti-Myc arba anti-p300. Ląstelės taip pat buvo nudažytos DAPI, kad vizualizuotų branduolius. Ląstelės buvo tiriamos konfokaline mikroskopija.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Dviejų grupių palyginimai buvo atlikti naudojant Studento t-testą. Skirtumai buvo vertinami statistiškai reikšmingai, esant * p <0, 05.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Wu, Q. et al. Abipusis RORγt acetiliacijos ir funkcijos reguliavimas p300 ir HDAC1. Mokslas. Rep. 5, 16355; „doi“: 10.1038 / srep16355 (2015).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.