Metalo proteazių sistemos, lemiančios onkogeninio notch1 aktyvaciją, visuma ir specifiškumas | leukemija

Metalo proteazių sistemos, lemiančios onkogeninio notch1 aktyvaciją, visuma ir specifiškumas | leukemija

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Lėtinė limfocitinė leukemija
  • Tikslinė terapija

Anotacija

Oncogeninės NOTCH1 mutacijos būna daugiau kaip 50% T-ląstelių limfoblastinių leukemijų (T-ALL). Norint suaktyvinti NOTCH1, reikalingas dvigubas proteolitinis perdirbimas tarpląsteliniame receptoriaus srityje (S2) ir transmembraniniame domene (S3). Šiuo metu kuriamos anti-NOTCH1 terapijos, pagrįstos S3 perdirbimo slopinimu per mažų molekulių γ-sekretazės inhibitorius. Čia pateikiame proteazės sistemos, atsakingos už NOTCH1 S2 apdorojimą T-ALL, apibūdinimą. I laipsnio NOTCH1 heterodimerizacijos (HD), NOTCH1 HD II klasės ir NOTCH1 JME alelių, pasižyminčių padidėjusiu ir abejotinu S2 apdorojimu, analizė rodo, kad tiek ADAM10 (dezintegrinas, tiek metalo proteazė 10), metaloproteazė, anksčiau susijusi su laukinio tipo NOTCH1 aktyvavimu žinduoliams. ląstelės ir ADAM17, artimai susijusi proteazė, galinti perdirbti NOTCH1 in vitro , prisidedanti prie oncogeninių NOTCH1 formų aktyvacijos. Nepaisant šio akivaizdaus funkcinio dubliavimo, ADAM10 slopinimo pakanka, kad būtų užtemdytas NOTCH1 signalizavimas T-ALL limfoblastuose. Šie rezultatai suteikia papildomos įžvalgos apie mechanizmus, kurie kontroliuoja onkogeninių NOTCH1 mutantų aktyvaciją ir identifikuoja ADAM10 kaip galimą terapinį taikinį onkogeninio NOTCH1 slopinimui T-ALL.

Įvadas

NOTCH1 signalizacijos kelias vaidina lemiamą vaidmenį skatinant įvairius T ląstelių vystymosi etapus, o aberacinis NOTCH1 signalizavimas yra pagrindinis onkogeninis įvykis T-ląstelių ūminės limfoblastinės leukemijos (T-ALL) patogenezėje. 1, 2, 3

NOTCH1 receptorius yra I tipo transmembraninis baltymas, veikiantis kaip ligando aktyvuotas transkripcijos faktorius. 4 Poilsio sąlygomis NOTCH1 tarpląstelinės heterodimerizacijos (HD) ir Lin / NOTCH pakartojimo (LNR) domenai, esantys tarpląstelinėje receptoriaus dalyje, sudaro molekulinį užraktą, kuris užkerta kelią spontaniškam NOTCH1 aktyvavimui. Fiziologinį NOTCH1 signalizavimą sukelia receptoriaus sąveika su delta tipo ir Jagged ligando baltymais, ekspresuojamais netoliese esančių ląstelių paviršiuje. Ši ligando ir receptoriaus sąveika sukelia konformacinius HD – LNR komplekso pokyčius ir priverčia kitaip šifruoti HD domeno C-galinę dalį proteazės skilimui vadinamojoje S2 vietoje. Šis pradinis tarpląstelinės receptoriaus dalies pjūvis yra PRIMS1, skirtas tolesniam proteolitiniam perdirbimui prezenilino y-sekretazės kompleksu S3 vietoje, esančioje receptoriaus transmembraniniame regione. Skylant γ-sekretazę, tarpląstelinė NOTCH1 dalis išsiskiria iš membranos, persikelia į branduolį ir sužadina tikslinių genų ekspresiją kartu su RBPJ / CSL DNR jungiančiu baltymu ir transmikcinio koprontinio šeimos narių nariais. -aktyvatoriai. 5

Aktyvinančios NOTCH1 mutacijos yra daugiau kaip 50% žmogaus T-ALL atvejų. Šios mutacijos paprastai lemia padidėjusį receptoriaus apdorojimą membranoje arba padidintą aktyvuotos ląstelinės NOTCH1 formos stabilumą branduolyje. Mutacijos, sukeliančios padidėjusį NOTCH1 aktyvavimą membranoje, apima keletą veikimo mechanizmų. NOTCH1 I klasės HD mutacijos paprastai susideda iš taškinių mutacijų arba mažų kadrų intarpų, sukeliančių HD – LNR domenų konformacijos pokyčius. 7 NOTCH1 II klasės HD mutacijos yra didesni intarpai, esantys HD srities distalinėje dalyje, kurie išstumia S2 vietą už apsauginio HD – LNR komplekso ribų. 7 Galiausiai, NOTCH1 JME mutacijos susideda iš intarpų tarpląsteliniame juxtamembraniniame receptoriaus regione, išstumiančiame HD – LNR kompleksą ir S2 vietą jame, atokiau nuo plazminės membranos. 8 Atsižvelgiant į griežtą NOTCH1 išsiskyrimo iš plazmos membranos reikalavimą receptoriui suaktyvinti, mažų γ-sekretazės komplekso inhibitoriai, kurie blokuoja S3 apdorojimą, efektyviai blokuoja NOTCH1 signalizaciją ir, kaip įrodyta, gali pakenkti augimui ir proliferacijai. kai kurios T-ALL ląstelių linijos, turinčios aktyvinančias mutacijas NOTCH1. 6, 9 Svarbu tai, kad NOTCH1 apdorojimas S2 vietoje taip pat reikalingas receptoriaus aktyvavimui, kas rodo, kad S2 skilimo slopinimas galėtų būti panaudotas kaip terapinis taikinys gydant T-ALL. Dvi glaudžiai susijusios ADAM (dezintegrino ir metaloproteazės) metaloproteazės - ADAM10 ir ADAM17 - buvo įtrauktos į įvairių organizmų NOTCH receptorių S2 apdorojimą. 10, 11, 12, 13, 14 genetiniai tyrimai parodė, kad ADAM10 ortologai Kuzbanian ir sup-17 yra atsakingi už NOTCH apdorojimą atitinkamai Drosophila ir Caenorhabditis elegans . 10, 11, 12. Panašiai pelių išmušimo modelių analizė parodė, kad Adams10 neturinčioms pelėms trūksta NOTCH receptorių apdorojimo ir jie turi su NOTCH susijusius fenotipus. 15 Be to, selektyvus Adam10 abliacija T ląstelėse, naudojant Adam10 sąlyginį išmušimą, sąlygojo vystymosi defektus, panašius į tuos, kurie pastebėti NOTCH1 turinčiuose timocituose. 16, 17 Tačiau specifinis metaloproteinazių apdorojimo mechanizmas, susijęs su NOTCH signalizavimu, išlieka ginčytinas. Pirmiausia buvo nustatyta, kad ADAM17 yra alternatyvi proteazė, galinti perdirbti NOTCH1 in vitro. 13 Be to, naujausia ataskaita parodė, kad ADAM10, bet ne ADAM17 yra būtini atliekant ligandų sukeltą tarpląstelinį skilimą 2 vietoje (S2), ir pasiūlyta nežinomų proteazių, turinčių galimybę apdoroti NOTCH signalus, buvimo. 18 Priešingai, Bozkulak ir Weinmaster 19 parodė, kad onkogeninės NOTCH1 formos gali būti tiek ADAM10, tiek ADAM17 substratas.

Čia mes toliau tyrėme skirtingą ADAM proteazių vaidmenį aktyvinant onkogenines NOTCH1 formas T-ALL. Tiksliau, mes paklausėme, kas yra proteolitinės mašinos, atsakingos už NOTCH1 S2 skaidymą T-ALL? Ar skirtingos onkogeninės NOTCH1 formos yra apdorojamos vienodai? Ar S2 skaidymą skatinančių fermentų slopinimas gali veiksmingai panaikinti onkogeninį NOTCH1 signalą T-ALL?

medžiagos ir metodai

Ląstelės ir ląstelių kultūra

HeLa ląstelės ir pelių embriono fibroblastai buvo auginami Dulbecco modifikuotame Eagle terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo, 100 V / ml penicilino G ir 100 μg / ml streptomicino, 37 ° C, drėgnoje atmosferoje, esant 5% CO 2 . Laukinio tipo ir Adam10 trūkumu turintys fibroblastai buvo daktaro Carlo Blobelio (Specialiosios chirurgijos ligoninė, Kornelio universitetas, Niujorkas, JAV) dovana. „Adam17“ nulio ląstelės buvo daktaro Paulo Saftigo (Christian-Albrechts Universität Kyie, Kylis, Vokietija) dovana. T-ALL ląstelių linijos buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus vaisiaus serumo, 100 V / ml penicilino G ir 100 μg / ml streptomicino, 37 ° C, drėgnoje atmosferoje, esant 5% CO 2 .

Plazmidės konstrukcijos

PcDNA3 NOTCH1 L1601P-ΔPEST koduoja dvigubą HD (L pakeitimas P į 1601 poziciją) plius ΔPEST (apipjaustymas 2472 padėtyje) mutanto formą NOTCH1, pažymėtą FLAG etiketės epitopu C gale. „PcDNA3 NOTCH1 L1601P-PEST“ konstrukcija buvo dr. Iannis Aifantis (Niujorko universitetas, Niujorkas, NY, JAV) dovana. „PcDNA3 NOTCH1 Jurkat JME17“ mutantas buvo gautas klonuojant dalinį NOTCH1 nuorašą (19–29 egzonai), amplifikuotą PCR iš Jurkato ląstelių, kuriame yra 51 bazės, esančios NOTCH1 geno 28 egzone, vidinis tandeminis dubliavimasis unikaliu BamH1 ir NotI apribojimu. „pcDNA3 NOTCH1“ svetainėse. 8 pcDNA3 NOTCH1 P12 mutantas buvo gautas klonuojant dalinį NOTCH1 nuorašą (19–29 egzonai), amplifikuotą PGR iš P12-ICHIKAWA ląstelių, turinčių 42 bazių, esančių NOTCH1 geno 27 egzone, vidinį tandemą dubliavimą unikaliame BamH1 ir PcDNA3 NOTCH1 NotI restrikcijos vietos. „PcDNA3.1 TACE“ vektorius, užkoduojantis visą ilgį laukinio tipo pelę „Adam17“, pažymėtą „myc tag“ epitopu C gale, buvo daktaro Joaquino Arribaso (Vall d'Hebron universiteto ligoninė, Barselona, ​​Ispanija) dovana. „PcDNA3 ADAM10“ konstrukcija buvo daktaro Falko Fahrenholzo (Johaneso Gutenbergo universiteto Biochemijos institutas, Maincas, Vokietija) dovana. Jis koduoja viso ilgio galvijų ADAM10 su HA žyma C gale.

Narkotikai ir inhibitoriai

Rekombinantiniai metalo proteazių inhibitoriai TIMP1 (Calbiochem PF019; Calbiochem, San Diego, CA, JAV), TIMP2 (Calbiochem PF021) ir TIMP3 (Sigma T9197; Sigma, St Loius, MO, JAV) buvo naudojami 125 nM. E junginys (Alexis Biochemicals, San Diegas, CA, JAV) buvo naudojamas esant 10 nM koncentracijai. Cisteino proteazės inhibitorius E-64 (Sigma E3132) buvo naudojamas esant 100 μM, o serino proteazės inhibitorius PMSF (Sigma P7626) esant 1 mM.

Liuciferazės reporterio tyrimai

NOTCH1 ekspresijos plazmidės (pcDNA3) buvo laikinai transfekuotos naudojant FuGene (Roche, San Franciskas, Kalifornija, JAV) transfekcijos reagentą kartu su pGaLUC dirbtinės liuciferazės reporterio konstruktu (dr. Tasuku Honjo dovana Kyoto universitete, Japonija), kuriame yra šeši tandemai RBPJ. / CSL rišančios vietos. PRL plazmidė, vektorius, ekspresuojantis Renilla luciferazės geną, kontroliuojamą citomegaloviruso promotoriaus, buvo naudojama kaip vidinė kontrolė. Bendra DNR buvo palaikoma pastovi, pridedant tuščią vektorių, jei reikia. Visi perpylimai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Ląstelių lizatai buvo surinkti 48 val. Po transfekcijos, o luciferazės tyrimai buvo atlikti naudojant Dual Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, JAV) LUMAT LB 9507 liuminometru (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, JAV).

Vakarų dėmė

Antikūnai prieš aktyvuotą NOTCH1 (NOTCH1 Val 1774; Cell Signaling, Beverly, MA, JAV), Renilla luciferazė (Chemicon 4410; Chemicon, Temecula, CA, JAV), β tubulinas (sc-8035; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). JAV), α aktinas (sc-1615 Santa Cruz Biotechnology), ADAM17 (SC-6416; Santa Cruz Biotechnology) ir ADAM10 (Chemicon 19026; Chemicon) buvo naudojami imunoblotų tyrimuose pagal gamintojo instrukcijas.

RNR trukdžiai

Lentivirusinis vektorius, ekspresuojantis trumpą plaukų smeigtukų RNR (shRNR), nukreiptą į žmogaus ADAM10, buvo įsigytas iš „Open Biosystems“ (pGIPZ V2LHS-94294; Open Biosystems, Huntsville, AL, JAV). Lentivirusiniai vektoriai, išreiškiantys šRNR, nukreipiančius į pelę Adam10 ir pelę Adam17, buvo sukurti klonuojant atitinkamus ilgus oligonukleotidus su kamieno kilpos struktūra pLKO-puro vektoriuje (dr. William Hahn dovana, Dana Farber Cancer Institute, Bostonas, MA). Tikslinės sekos buvo šios: pelė Adam10 , 5′-CCGGCCTGCCATTTCACTCTGTC-3 ′; pelė Adam17 , 5′-CCGGGACTTCTTCAGTGGTCATGT-3 ′. Atitinkamose kontrolėse buvo šios sušifruotos stiebo sekos: peles „ Adam10“ sušukuota , 5′-CCGGGGTATATGCGCCATACACTACCC-3 ′; pelė Adam17 sukramtytas , 5′-CCGGATCTTCTACGTGGGTTAGCT-3 ′. „Lentivirus“ gamyba ir infekcija buvo vykdoma, kaip aprašyta anksčiau. 20

Kiekybinis realaus laiko PGR

Visa RNR iš T-ALL ląstelių linijų buvo ekstrahuota RNR vandeniniu rinkiniu (Ambion, Austin, TX, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Papildomos DNR buvo sugeneruotos naudojant „SuperScript RT-PCR“ sistemą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir išanalizuotos naudojant kiekybinį realaus laiko PGR, naudojant SYBRGreen RT-PCR pagrindinių reagentų rinkinį ir 7300 realaus laiko PGR sistemą, abi iš „Applied Biosystems“ ( Foster City, CA, JAV). Santykiniai išraiškos lygiai buvo pagrįsti GAPDH lygiais kaip kontrolinė kontrolė. Grunto sekos buvo tokios: GAPDH pirmyn: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ′; GAPDH atvirkštinė: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ′; „DELTEX 1“ į priekį: 5′-AAGAAGTTCACCGCAAGAGGATT-3 ′; „DELTEX 1“ atbulinė eiga: 5′-CTAGGTAGCTAGCGTCCGGGTAG-3 ′.

Ląstelių augimo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas atliekant 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromido (MTT) tyrimą trimis tiražais, naudojant ląstelių proliferacijos rinkinį I (Roche).

Statistinė analizė

Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant Studento t- testą.

Rezultatai

ADAM proteazių slopinimas silpnina NOTCH1 mutantų alelių aktyvumą

Norėdami išsiaiškinti ADAM proteazių vaidmenį skleidžiant ir suaktyvinant NOTCH1 žmogaus ląstelėse, mes atrinkome labai aktyvius NOTCH1 mutantus, apdorotus kanoninėje S2 vietoje, tokius kaip NOTCH1 L1601P ΔPEST alelį, NOTCH1 JME17 Jurkat alelį ir NOTCH1 P12 alelį. 6, 7, 8 NOTCH1 L1601P priklauso I klasės HD mutantams, kurie ardo HD – LNR pakartojimo kompleksą, palengvindami S2 skilimą. Šis alelis buvo sujungtas su C-galo PEST domeno sutrumpinimu, kad padidėtų jo vidinis aktyvumas padidėjus NOTCH1 stabilumui tarpląstelinėje dalyje. Neseniai aprašytas NOTCH1 JME17 alelis yra labai aktyvių juxtamembrane išsiplėtimo mutacijų pavyzdys, susideda iš 17 aminorūgščių įterpimo į tarpląstelinę juxtamembrane receptoriaus sritį ir aktyvinimui reikalingas S2 skilimo vietos vientisumas. 8 NOTCH1 P12 alelis priklauso II klasės HD mutantams, jam būdingas įterpimas rėme, kuris išstumia HD srities C-galo dalį už LNR komplekso ribų, sukurdamas alternatyvią S2 skilimo vietą. 7 Liuciferazės reporterio tyrimas rodo, kad NOTCH1 L1601P ΔPEST , NOTCH1 JME17 ir NOTCH1 P12 mutantų alelių ekspresija sąlygoja maždaug 8, 38 ir 160 kartų NOTCH1 signalizacijos aktyvavimą, palyginti su baziniais lygiais (1a pav.). Trijų NOTCH1 mutantų aktyvumas taip pat priklauso nuo receptoriaus apdorojimo S3 vietoje, todėl, slopindamas γ-sekretazės kompleksą junginiu E, labai selektyviu γ-sekretazės inhibitoriumi, dramatiškai sumažina NOTCH1 aktyvumą (1b paveikslas). .

Image

Įvairių NOTCH1 mutantų alelių ekspresija sukelia konstitucinį NOTCH signalą. ( a ) NOTCH / CSL luciferazės reporterio tyrimai HeLa ląstelėse, išreiškiančiuose I klasės HD NOTCH1 mutantą (HD-ΔP), II klasės HD NOTCH1 mutantą (P12) ir NOTCH1 JME alelį (JME). ( b ) γ-sekretazės inhibitoriaus E junginio poveikis NOTCH1 signalo perdavimui, kurį sukelia IL ekspresijos HD NOTCH1 mutantas (HD-ΔP), II klasės HD NOTCH1 mutantas (P12) ir NOTCH1 JME alelis (JME) HeLa ląstelėse. ( c ) TIMP1, TIMP2 ir TIMP3 metaloproteazės inhibitorių poveikis NOTCH1 signalo perdavimui, kurį sukelia I klasės HD, II klasės HD ir NOTCH1 JME alelių ekspresija HeLa ląstelėse. DMSO, dimetilsulfoksidas; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

Norėdami išsiaiškinti metaloprotezių ir kitų proteolitinių sistemų vaidmenį skleidžiant ir aktyvuojant NOTCH1, mes transfekavome HeLa ląsteles ekspresijos vektoriais, turinčiais NOTCH1 suaktyvintus alelius, ir apdorojome selektyviųjų ir plačiųjų proteazių inhibitorių, įskaitant TIMP1, baltymą, kuris jungiasi su ir slopina tirpias metalo proteazes; TIMP2, tirpių ir membranoje surištų metaloprotezių inhibitorius; ir TIMP3, platus metaloproteazių inhibitorius, galintis slopinti tirpių, membranų surištų ir ADAM metaloprotezių aktyvumą. Šiuose eksperimentuose gydymas TIMP1 neturėjo įtakos NOTCH1 HD klasės I, HD klasės II ir JME alelių perdirbimui (1c paveikslas). TIMP2 sumažino mūsų NOTCH1 HD I klasės mutanto aktyvumą ir tam tikru mastu NOTCH1 JME alelio aktyvumą, bet ne II HD klasės konstrukto aktyvumą (1c paveikslas). Priešingai, visų trijų mutantų aktyvumas buvo nuosekliai ir reikšmingai slopinamas esant TIMP3 (1c pav.). Galiausiai, cisteino proteazių slopinimas E64 ir serino proteazių su PMSF slopinimas neturėjo įtakos NOTCH1 mutantų alelių aktyvumui (duomenys nepateikti). Šie duomenys rodo, kad ADAM proteazės yra pagrindiniai fermentiniai mechanizmai, atsakingi už onkogeninių NOTCH1 formų S2 apdorojimą.

Norėdami apibūdinti specifinių ADAM proteazių poreikį NOTCH1 mutantų aktyvumui, pirmiausia išbandėme onkogeninių NOTCH1 alelių aktyvumą shRNR numušant „Adam10“. Atsižvelgiant į nusistovėjusį „Adam10“ vaidmenį apdorojant ir aktyvinant laukinio tipo NOTCH1, „Adam10“ inaktyvinimas shRNR pelių fibroblastuose lėmė reikšmingą išreikšto NOTCH1 HD klasės I, II klasės ir JME NOTCH1 alelių aktyvumo sumažėjimą (pav. 2a). Panašiai, „Adam17“ ShRNA numušimas taip pat sutrikdė visų trijų NOTCH1 mutantų aktyvumą (2b paveikslas). Panašiai egzogeninio Adam10 arba Adam17 ekspresija pelių embrionų fibroblastuose, gautuose iš Adam10 ir Adam17, be nokauto, efektyviai padidino NOTCH1 signalo aktyvaciją išreiškiant aktyvuotas NOTCH1 formas šiose ląstelėse (2c ir d paveikslai). Norėdami toliau išanalizuoti galimus „Adam10“ ir „Adam17“ vaidmenis, susijusius su NOTCH1 aktyvumo reguliavimu, mes išbandėme abiejų proteazių inaktyvavimo poveikį vienu metu, numušdami „Adam17“ ląstelėse, kuriose trūksta „Adam10“, ir atvirkščiai , numušdami „Adam10“ Adam17 išmuštuose pelių embrioniniuose fibroblastuose. . Šie eksperimentai parodė, kad tuo pačiu metu „Adam10“ ir „Adam17“ inaktyvinimas sąlygojo ryškesnį onkogeninių NOTCH1 mutantų aktyvumo sumažėjimą (2e ir f pav.). Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad nors ir Adam10, ir Adam17 yra kompetentingi perdirbti NOTCH1, šios proteazės vaidina nereikalingą vaidmenį perdirbant NOTCH1 mutantų alelius.

Image

ADAM10 ir ADAM17 tarpininkauja onkogeninių NOTCH1 mutantų alelių aktyvacijai. ( a ) NOTCH / CSL luciferazės reporterio tyrimai su pelių fibroblastų, išreiškiančių I klasės HD NOTCH1 mutantą (HD-ΔP), II klasės HD NOTCH1 mutantą (P12) ir NOTCH1 JME alelį (JME), esant šRNR, nukreiptai į Adam10 ( Adam10 shRNR) arba kontrolinė neaktyvi shRNR (kontrolė). Western blot analizė rodo veiksmingą Adam10 numušimą ląstelėse, ekspresuojančiose Adam10 shRNR. ( b ) NOTCH / CSL luciferazės reporterio testai pelių fibroblastuose, ekspresuojančiuose aktyvuotus NOTCH1 mutantus, esant šRNR, taikomam į Adam17 (Adam17, šRNR), arba į kontrolinę neaktyvią ŠRNR (kontrolė). Western blot analizė rodo veiksmingą Adam17 numušimą ląstelėse, ekspresuojančiose Adam10 shRNR. ( c ) NOTCH / CSL reporterio tyrimai, naudojant Adam10 trūkumą turinčius pelių fibroblastus, išreiškiančius onkogeninius NOTCH1 alelius, pakartotinai išreiškiant Adam10. ( d ) NOTCH / CSL reporterio testai Adam17 trūkumų turinčiuose pelių fibroblastuose, išreiškiančiuose onkogeninius NOTCH1 alelius dėl Adam17 pakartotinės ekspresijos. ( e ) NOTCH / CSL reporterio tyrimai, naudojant Adam10 trūkumą turinčius pelių fibroblastus, išreiškiančius onkogeninius NOTCH1 alelius, esant ADR17 išnaikinimui shRNR. ( f ) NOTCH / CSL reporterio tyrimai naudojant Adam17 trūkumų turinčius pelių fibroblastus, išreiškiančius onkogeninius NOTCH1 alelius, esant SHRNR numuštam ADAM10. Eksperimentai rodo trigubų kopijų vidutinį ir standartinį nuokrypį nuo tipinių eksperimentų. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas mažiausiai tris kartus. MEF, pelių embriono fibroblastai.

Visas dydis

ADAM10 slopinimas panaikina NOTCH1 signalizaciją žmogaus T-ALL

Neseniai atlikta NOTCH1 mutantų baltymų, ekspresuotų C2C12 pelių mioblastų ląstelių linijoje, biocheminė analizė parodė, kad tiek ADAM10, tiek ADAM17 gali efektyviai apdoroti onkogenines NOTCH1 formas. 18 Tačiau genetiniai duomenys iš „Adam10“ sąlyginio išmušimo pelių parodė, kad „Adam10“ yra griežtai reikalingas NOTCH1 apdorojimui ir aktyvavimui T- 16 ląstelėse , 17, todėl padidėja galimybė, kad T ląstelių limfoblastai gali būti labiau priklausomi nuo ADAM10 apdorojimo, nei buvo prognozuojama. remiantis NOTCH1 mutantų heterologinėje sistemoje analize. Norėdami ištirti specifinį ADAM10 poreikį skaidydami ir aktyvuodami NOTCH1 žmogaus T-ALL ląstelėse, pirmiausia išanalizavome šių proteazių raišką T-ALL ląstelių linijose. Western blot analizė parodė skirtingą ADAM10 ir ADAM17 ekspresijos lygį skirtingose ​​T-ALL ląstelių linijose, turinčiose aktyvinančias mutacijas NOTCH1 , kai CUTLL1, CEM ir Jurkat ląstelės rodo aukštą lygį, o RPMI8402 ir DND41 rodo santykinai žemą ekspresijos lygį (3a pav.). ADAM17 buvo vienodai išreikštas aukštu lygiu daugumoje T-ALL ląstelių linijų, išskyrus DND41 ir RPMI8402, kurios atitinkamai parodė labai žemą ir neaptinkamą ADAM17 ekspresijos lygį (3a pav.).

Image

ADAM10 inaktyvacija sutrikdo NOTCH1 signalizaciją T-ALL. a ) Western blot analizė ADAM10 ir ADAM17 ekspresijai T-ALL ląstelių linijose. ( b ) aktyvuoto NOTCH1 baltymo (ICN1) Western blot analizė T-ALL ląstelių linijose, ekspresuojančiose shRNR konstrukciją, nukreiptą į ADAM10, arba neaktyvią kontrolinę SHRNR. ( c ) Deltex1 NOTCH1 taikinio geno atvirkštinė transkripcija-PGR analizė T-ALL ląstelių linijose, išreiškiančiose shRNR konstruktą, nukreiptą į ADAM10, arba neaktyvią kontrolinę SHRNR.

Visas dydis

Tada mes atlikome ADN10 RNR numušimą skirtingose ​​T-ALL ląstelių linijose, turinčiose NOTCH1 HD I klasės mutacijas (KOPTK1), NOTCH1 HD II klasės mutacijas (P12 ICHIKAWA) ir NOTCH1 JME mutacijas (Jurkat). Stebėtina, kad net jei ADAM10 shRNR ekspresija sąlygojo tik dalinį ADAM10 reguliavimą, tai virsta efektyviu NOTCH1 aktyvacijos slopinimu (3b pav.) Ir NOTCH1 taikinio geno Deltex1 transkripciniu slopinimu (3c paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad selektyvus ADAM10 inaktyvinimas gali veiksmingai sumažinti onkogeninio NOTCH1 reguliavimą žmogaus T-ALL limfoblastuose. Remiantis šia teze, ADAM10 sureguliavimas per shRNR numušimą sutrikdė KOPTK1 ląstelių augimą - T-ALL ląstelių liniją, jautrią NOTCH1 signalo slopinimui γ-sekretazės inhibitoriais 6 (4 pav.). Be to, ADAM10 numušimas KOPTK1 ląsteles padidino iki mažo (10 nM) junginio E, labai aktyvaus γ-sekretazės inhibitoriaus, koncentracijos (4 paveikslas). Iš viso šie eksperimentai identifikuoja NOTCH1 S2 apdorojimą ir ADAM10 kaip taikinius, skirtus NOTCH1 signalo slopinimui T-ALL, ir rodo, kad T-ALL gydymui gali būti naudojamas kombinuotas ADAM ir γ-sekretazės NOTCH1 skilimo slopinimas.

Image

ADAM10 inaktyvacijos poveikis T-ALL ląstelių augimui. Ląstelių augimo KOPTK1 ląstelėse, ekspresuojančiose kontrolinę neaktyvią ŠRNR arba shRNR, nukreipiančią į ADAM10, analizė, esant arba mažai (10 nM) koncentracijai junginio E (CompE), labai aktyvaus γ-sekretazės inhibitoriaus. Stulpeliai parodo vidutinį santykinį ląstelių skaičių ir standartinį nuokrypį, nustatytą naudojant kolorimetrinį 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromido (MTT) testą.

Visas dydis

Diskusija

Blokuojant aberacinį NOTCH signalą, slopinant proteolitinę sistemą, atsakingą už onkogeninių NOTCH1 receptorių, koduojamų NOTCH1 mutantinių alelių, perdirbimą ir aktyvavimą, atsiranda kaip molekuliškai tikslinė terapija T-ALL gydymui. 21, 22 Taigi, įrodyta, kad γ-sekretazės komplekso NOTCH1 S3 skilimo slopinimas veiksmingai panaikina NOTCH aktyvaciją ir sutrikdo T-ALL limfoblastų augimą. 6, 22, 23. Antroji NOTCH1 signalizacijos slopinimo strategija susideda iš anti-NOTCH1 slopinančių antikūnų, galinčių blokuoti S2 skilimo vietos prieigą prie ADAM proteazių. 24, 25 Kaip alternatyva, už S2 NOTCH1 apdorojimą atsakingos proteolitinės mašinos taip pat galėtų būti panaudotos kuriant anti-NOTCH1 terapiją. Iš tiesų, genetiniai modeliai ir biocheminiai tyrimai nustatė, kad fiziologiniam NOTCH receptorių aktyvinimui reikalingas jų proteolitinis apdorojimas S2 vietoje ADAM proteazės pagalba. Dvi ADAM proteazės, ADAM10 ir ADAM17, buvo pasiūlytos kaip NOTCH S2 perdirbimo fermentai. 10, 11, 12, 13, 14 Tačiau duomenys, gauti iš išmuštų pelių, patvirtina, kad ADAM10 gali būti svarbesni veiksniai, reguliuojantys NOTCH funkciją stuburiniams gyvūnams. 15 Be to, duomenys apie transgenines peles, išreiškiančias dominuojančią neigiamą Adam10 formą timocituose 16, ir naujausi radiniai, naudojant sąlyginį išmušimą, siekiant selektyviai pašalinti Adam10 funkciją T-ląstelėse 17, parodė, kad Adam10 inaktyvacija apsunkina T ląstelių vystymąsi dėl netinkamo aktyvavimo. NOTCH1 signalizacija užkrūčio liaukoje. Tačiau T-ALL aptinkami NOTCH1 mutacijų aktyvinimai dažnai keičia HD – LNR domenų, kurie paprastai kontroliuoja ADAM10 patekimą į S2, struktūrą, padidindami galimybę, kad S2 skilimą gali perdirbti alternatyvios T-ALL proteazės. Taigi, analizuojant ADAM10 ir ADAM17 vaidmenį perdirbant NOTCH1 I klasės ir II klasės HD mutantinius baltymus, ekspresuojamus heterologinėse sistemose, nustatyta, kad ADAM10 ir ADAM17, atrodo, geba perdirbti mutantinius NOTCH1 baltymus. 19 Čia mes patvirtinome ir išplėtėme šiuos rezultatus, parodydami, kad tiek ADAM10, tiek ADAM17 gali apdoroti NOTCH1 HD ir JME mutantų formas. Šių stebėjimų pasekmė yra tai, kad vienintelis ADAM10 arba ADAM17 slopinimas nepašalins NOTCH signalo perdavimo leukemijos limfoblastuose. Be to, selektyvus ADAM10 inaktyvavimas žmogaus T-ALL ląstelėse parodė, kad šios proteazės slopinimas yra pakankamas, kad būtų veiksmingai pakenkta onkogeniniam NOTCH1 aktyvavimui. Pabrėžus ADAM10 ir ADAM17 kaip pagrindinių proteazių apdorojimą ir aktyvinant ERBB signalizaciją 26, 27, 28, atsirado selektyvių ADAM10 ir ADAM17 inhibitorių, taip pat dvigubų inhibitorių, skirtų plaučių, krūties ir storosios žarnos vėžys. 29, 30, INCB7839, ADAM10 ir ADAM17 inhibitoriai, šiuo metu JAV yra klinikinių tyrimų metu gydant metastazavusį HER2 + krūties vėžį kartu su vieninteliu trastuzumabu ar trastuzumabu ir vinorelbinu. Atsižvelgiant į tai, kad aktyvuota NOTCH1 signalizacija, suaktyvinant NOTCH1 receptoriaus mutacijas arba inaktyvinant FBXW7 naviko slopintuvo geno mutacijas, yra beveik universali T-ALL, ADAM10 ir γ-sekretazės inhibitoriaus derinys yra logiškas ir patrauklus pasirinkimas. tikslinė terapija. Nors džiugina tai, kad ADAM10 ir ADAM17 aktyvumo slopinimas buvo gerai toleruojamas pacientams, sergantiems solidiniais navikais, belieka ištirti, ar ADAM inhibitoriaus vartojimas T-ALL gydymui iš pradžių sukels šalutinį poveikį virškinimo trakte ir kokiu mastu. stebimas vartojant γ-sekretazės inhibitorius. Šiame kontekste mūsų ADAM10 reikalavimo aktyvuoti onkogeninį NOTCH1 T-ląstelių limfoblastuose pateikimas pateikia išankstinius įrodymus, patvirtinančius galimą selektyvių ADAM10 proteazės inhibitorių, kaip anti-NOTCH1 agentų, vaidmenį T-ALL.