Hipoksijos sukelto faktoriaus-1α (hif-1α) transkripcijos reguliavimas šilumos šoko faktoriais hsf2 ir hsf4 | onkogenas

Hipoksijos sukelto faktoriaus-1α (hif-1α) transkripcijos reguliavimas šilumos šoko faktoriais hsf2 ir hsf4 | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Angiogenezė
  • Krūties vėžys
  • Ląstelių signalizavimas
  • Genų reguliavimas

Anotacija

Hipoksijos sukeliamas faktorius-1α (HIF-1α) yra pagrindinis angiogenezės ir kitų ląstelių reakcijų į hipoksinį stresą tiek normaliose, tiek navikinėse ląstelėse reguliatorius. Norėdami nustatyti naujus mechanizmus, kurie reguliuoja HIF-1α ekspresiją, sukūrėme viso genomo ekraną išreikštų sekų žymėms (EST), kurie, transkriptuojant antisensine kryptimi, padidina HIF-1α taikinio, kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), gamybą. žmogaus krūties vėžio ląstelėse. Mes išsiaiškinome, kad 2 ir 4 baltymų šilumos smūgio faktoriaus (HSF) baltymai, kurie anksčiau buvo naudojami kontroliuojant daugybę genų, kurie moduliuoja ląstelių augimą ir diferenciaciją bei apsaugo nuo aplinkos ir ląstelių streso poveikio, kartu veikia palaikydami pastovų HIF-1α transkripcija ir VEGF gamyba šiose ląstelėse. Parodome, kad abu HSF jungiasi prie nepertraukiamo šilumos šoko elemento (HSE) sekų, kurias nustatėme HIF-1α promotoriaus srityje, ir kad bet kurio HSF reguliavimas suaktyvina HIF-1α transkripciją. Mes taip pat parodome, kad HSF2 ir HSF4 išstumia vienas kitą iš HSF / HSE kompleksų HIF-1α promotoriuje, kad HIF-1α transkripcija taip pat būtų suaktyvinta dėl bet kurios HSF ekspresijos. Šie rezultatai tvirtina, kad HSF2 ir HSF4 reguliuoja HIF-1α transkripciją ir kad norint palaikyti HIF-α ekspresiją represuotoje būsenoje, būtina kritinė šių HSF pusiausvyra. Mūsų išvados atskleidžia anksčiau neįtariamą HSF vaidmenį kontroliuojant VEGF ir kitus genus, suaktyvintus kanoniniu HIF-1α tarpininkavimu.

Įvadas

Angiogenezę - naujų kraujagyslių susidarymo procesą - normaliuose audiniuose ir navikuose reguliuoja daugiausia deguoniui jautrus signalinis kelias, apimantis hipoksijos sukeltą faktorių-1 (HIF-1) ir kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF) (Mazure). et al., 1996, 1997; Semenza, 2003; Ng ir kt., 2006; Pouyssegur ir kt., 2006; Brahimi-Horn ir Pouyssegur 2007; Fraisl ir kt., 2009). Normoksinėmis sąlygomis pastovus HIF-1 (HIF-1α) α subvieneto lygis yra griežtai kontroliuojamas prolilhidroksilinimo būdu. Hipoksijos metu slopinamas HIF-1α baltymo hidroksilinimas ir dėl to skaidymasis, o HIF-1α kaupiasi - sąveikaudamas su HIF-1 β subvienetu ir jungdamasis prie specifinių DNR sekų (hipoksijos reakcijos elementų; HRE) transkripciją reguliuojančioje srityje. genų, skatinančių ląstelių augimą, ir aktyvinančių šiuos genus. Tarp genų, kuriuos aktyvuoja HIF-1α, yra VEGF, kuris kartu su kitais HIF-1 reguliuojamais genais, koduojančiais fibroblastų augimo faktorius, gliukozės pernešėją 1 ir eritropoetiną, palengvina O 2 atimtų ląstelių išgyvenimą ir dauginimąsi (Semenza, 2003; Pouyssegur ir kt.). al., 2006; Brahimi-Horn ir Pouyssegur, 2007; Fraisl ir kt., 2009). HIF-1α ekspresijos reguliavimas arba skilimo blokada taip pat gali vykti esant normalioms vėžinių ląstelių sąlygoms, taip prisidedant prie naviko progresavimo (Jiang ir kt., 1997; Isaacs ir kt., 2002; Chi ir Karliner, 2004; Busca ir kt.)., 2005). Nors HIF-1α ekspresijos reguliavimas vertimo ir posttransliacijos lygmenimis buvo išsamiai ištirtas (Semenza, 2003; Pouyssegur ir kt., 2006; Brahimi-Horn ir Pouyssegur, 2007; Fraisl ir kt., 2009), palyginti mažai. yra žinoma apie mechanizmus, turinčius įtakos HIF-1α transkripcijai (Jiang ir kt., 1997; Page et al., 2002; Busca ir kt., 2005; Pipinikas ir kt., 2008; Nardinocchi ir kt., 2009).

Mūsų laboratorija sukūrė funkcijomis pagrįstą strategiją, naudojančią antisensines RNR, papildančias lentivirusinių EST rinkinį, kad atsitiktinai būtų galima suaktyvinti chromosomų genus (Lu et al., 2004). Taikydami šį metodą ir fluorescenciniu būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimo (FACS) ekraną, leidžiantį išskirti ląstelių klonus, kuriuose yra padidėjusi VEGF ekspresija (Liliental ir Cohen, ruošiantis), mes nustatėme anksčiau neįtariamą šilumos šoko transkripcijos veiksnių (šilumos šoko) vaidmenį. faktoriai; HSF) reguliuojant kanoninį HIF-1α / VEGF signalizaciją. Mes parodėme, kad šilumos šoko faktoriai HSF2 ir HSF4, kurie anksčiau buvo žinomi dėl savo sugebėjimo moduliuoti ląstelių augimą ir diferenciaciją, taip pat dėl ​​ląstelių atsako į stresą (Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004; Chang ir kt.) 2006 m.; Akerfelt ir kt., 2007; Morimoto, 2008; Zhang ir kt., 2008) kartu veikia palaikydami pastovų HIF-1α mRNR lygį, prisijungdami prie šilumos šoko elemento (HSE) vietų promotoriaus regione. HIF-1α genas ir reguliuojantis HIF-1α transkripciją.

Rezultatai

VEGF ekspresijos reguliavimas pagal HSF4 trūkumą

MCF-7G ląstelių, užkrėstų lentivirusiniu 40 000 sekvenuotų EST rinkiniu kontroliuojant tetraciklino represuotų promotorių (Bibl et al., 2004) rinkinys buvo tiriamas FACS, kad būtų išskirti klonai, kuriuose susilieja VEGF genas. su GFP reporterio geno baltymu buvo padidinta (Liliental ir Cohen, ruošiant). Tarp jų buvo C16 klonas, kuriame ląstelės parodė keturis kartus didesnę GFP fluorescenciją nei pradinių ląstelių linija MCF-7G, kaip nustatyta FACS analize (1a pav.). DNR sekos nustatymas atskleidė, kad C16 klone yra chromosomiškai įterptas EST („GenBank“ vaizdo klonas 3395089), atitinkantis dalį baltymą koduojančio šilumos šoko faktoriaus 4 (HSF4) - transkripcijos reguliatoriaus, anksčiau buvusio šilumos šoko baltymų (HSP) ekspresijai - dalį. chaperonai, kurie padeda baltymams sulankstyti ir apsaugo ląsteles nuo proteotoksinio streso (Nakai ir kt., 1997; Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004; Min ir kt., 2004; Fujimoto ir kt., 2004, 2008; Akerfelt ir kt.) al., 2007). Šis HSF4 EST buvo nukreiptas antisense kryptimi, palyginti su lentivirusiniu promotoriumi.

Image

HSF4 numušimo poveikis VEGF raiškai. ( a ) FACS: kairioji smailė (juoda) rodo bazinę fluorescenciją, kurią perduoda GFP reporterio genas pradinėse MCF-7G (tai yra pVEGF-GFP / MCF-7) ląstelėse. Dešinė smailė (pilka) rodo GFP tarpinamą signalą Nr. 16 klone. ( b ) Western blot: 1 juostos laukinio tipo MCF-7 ląstelės, kultivuojamos 24 valandas terpėje, kurioje yra 1 μM tetraciklino (WT, Tet +); 2 juosta, HSF4 EST integruotos MCF-7 ląstelės, kultivuojamos kaip 1 juostoje (EK-F4, Tet +); 3 ir 4 juostos, atitinkamai laukinio tipo MCF-7 arba EK-F4 ląstelės, 24 valandas buvo auginamos terpėse, kuriose nėra tetraciklino. Skaičiai rodo santykinį HSF4 lygį normalizavus α-tubuliną, išreikštą kaip raukšlės indukcija kontroliuojant (laukinio tipo MCF-7 ląstelės, auginamos terpėse, kuriose nėra tetraciklino). c ) Pusiau kiekybinis RT – PGR. GUSB (β-gliukuronidazė) buvo naudojamas kaip VEGF amplifikacijos kontrolė. Kultūros sąlygos esant (Tet +) arba neturint (Tet–) tetraciklino buvo tokios, kaip b punkte. 1 juosta, laukinio tipo MCF-7 ląstelės; 2 juosta, HSF4 EST integruotos MCF-7 ląstelės; 3 juosta, laukinio tipo MCF-7 ląstelės; 4 juosta, HSF4 EST integruotos MCF-7 ląstelės. d ) realaus laiko PGR (žr. Medžiagos ir metodai). Šablonai buvo RNR išskirti iš laukinio tipo MCF-7 ląstelių, auginamų 24 valandas terpėje, kurioje nėra tetraciklino (WT), arba MCF-7 ląstelių, turinčių chromosomiškai integruotą HSF4 EST, auginamą tomis pačiomis sąlygomis (EK-F4). Skaičiai parodo VEGF mRNR lygius normalizavus GUSB mRNR lygį kaip indukcija per kartų kontrolę (laukinio tipo MCF-7 ląstelės be tetraciklino). e ) viso baltymo, išskirto iš laukinio tipo MCF-7 ląstelių, apdorotų transfekcijos buferiu, kaip nurodyta Medžiagos ir metodai (pavyzdys), arba siRNR, sudaryto iš atsitiktinai sukramtytos sekos (SC), antisense oligonukleotido, atitinkančio HSF4 koduojančios sekos segmentas (AS-F4), arba siRNR, atitinkanti HSF4 koduojančios sekos segmentą. Skaičiai parodo santykinius HSF4 lygius, išreikštus indukcijos koeficientu per „Mock“ kontrolę po α-tubulino normalizavimo. f ) Pusiau kiekybinis RT – PGR. Mock, Scramble, AS-F4 ir si-F4 yra tokie, kaip e punkte. ( g ) Realaus laiko PGR buvo atlikta, kaip nurodyta d punkte. Mock, si-F4 ir AS-F4 yra tokie, kaip e punkte. Skaičiai parodo VEGF mRNR lygius normalizavus GUSB mRNR lygį kaip indukcija raukšle per „Mock“ kontrolę. h ) Išskiriamo VEGF koncentracijos matavimas su fermentais susietos imunosorbentinės analizės metu MCF-7 kondicionuotoje terpėje. Mock ir si-F4 yra tokie, kaip e punkte.

Visas dydis

Aprašyti du alternatyviai sujungti nuorašai, užkoduojantys skirtingas HSF4 izoformas, HSF4a ir HSF4b, turinčių skirtingą transkripcijos aktyvumą (Nakai ir kt., 1997; Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004; Min ir kt., 2004; Akerfelt) et al., 2007; Fujimoto et al., 2004, 2008); kadangi RT – PGR rezultatai parodė, kad tiek HSF4a, tiek HSF4b mRNR yra ekspresuojamos MCF-7 ląstelėse, MCF-7 ląstelėse buvo aptiktas tik HSF4a užkoduotas baltymo izoformas, atliekant Western blot analizę. HSF4 EST gebėjimas reguliuoti VEGF raišką buvo parodytas tiesiogiai, naudojant MCF-7G išvestą ląstelių kloną - EK-F4, kuriame yra HSF4 EST, įterptas į chromosomą, kontroliuojamą, esant antisense orientacijai, iš tetraciklino represuotų. citomegalo viruso (CMV) promotorius (1b – d paveikslai). Neatlikus tetraciklino represijų, HSF4 baltymo gausumas EK-F4 ląstelėse buvo maždaug penktadalis didesnio nei tėvų ląstelių linijos (1b paveikslas). Panašiai, RT – PGR analizė parodė, kad VEFG mRNR padidėjo daugiau nei tris kartus (1c ir d paveikslai), kai buvo suaktyvintas CMV promotorius, skatinantis HSF4 EST antisense transkripciją. Antiessensinės HSF4 EST transkripcijos pokytis pridedant tetraciklino grąžino VEGF mRNR į normalų lygį (1c paveikslas).

Papildomi įrodymai, kad stimuliuojantis HSF4 reguliavimas daro įtaką VEGF ekspresijai, buvo gauti įvedant antisense oligodeoksinukleotidą (AS-F4), papildantį HSF4, arba, kaip alternatyva, HSF4 specifinę dvigubos grandinės siRNR (si-F4) į MCF-7 ląsteles. Abu atvejai, dėl kurių HSF4a baltymas sumažino iki ∼ 40% normalaus transfekuotų ląstelių telkinyje, sukėlė abipusį VEGF mRNR gausos padidėjimą, kaip rodo RT – PCR analizė (1e – g paveikslai). Fermentais susietų imunosorbentų tyrimo matavimai parodė didesnį VEGF baltymo kaupimąsi auginimo terpėje per 96 valandų augimo periodą ląstelėse, transfekuotose HSF4 siRNR, nei ląstelėse, panašiai transfekuotose atsitiktinai sukramtyta siRNR (1h pav.). Visi šie eksperimentai rodo, kad HSF4 trūkumas MCF-7 ląstelėse padidina VEGF mRNR ir baltymų gamybą.

HSF4 poveikis VEGF ekspresijai vyksta per HIF-1α

VEGF gamybą daugiausia kontroliuoja transkripcijos veiksniai, apimantys HIF-1, HIF-2 ir SP1 (Jiang ir kt., 1997; Mazure ir kt., 1996, 1997; hipoksijos reakcijos elementas -> VEGF kaskados diferencijuotai reguliuoja kraujagyslių atsaką. navikų augimo greitis. Cancer Res 60: 6248–6252. "href =" / articles / onc2010623 # ref43 "> Tsuzuki ir kt., 2000; Bos ir kt., 2001; Semenza, 2003; Olenyuk ir kt., 2004 ; Pouyssegur ir kt., 2006; Brahimi-Horn ir Pouyssegur, 2007; Fraisl ir kt., 2009). Mes pastebėjome, kad cis veikianti mutacija, užkertanti kelią HUC-1α transkripcijos suaktyvinimui liuciferazės reporterio gene, sujungtame su HRE VEGF promotoriaus (Mazure ir kt., 1996, 1997; hipoksijos reakcijos elementas -> VEGF kaskados diferencijuotai reguliuoja kraujagyslių atsaką ir augimo greitį navikuose. Cancer Res 60: 6248–6252. "href =" / articles / onc2010623 # ref43 "> Tsuzuki ir kt., 2000; Olenyuk ir kt., 2004; Pore ir kt., 2004) panaikino padidėjusį luciferazės aktyvumą, kuris kitu atveju pastebimas mažinant HS reguliavimą. F4 (2a pav.). Šios išvados reikšmė, būtent, kad HSF4 sumažėjusio reguliavimo VEGF gamybai poveikis yra per HIF-1α, buvo patvirtinta atliekant Western blot (2b paveikslas) ir RT – PCR analizę (2c paveikslas); šios analizės parodė, kad tiek HIF-1α mRNR, tiek baltymai yra padidėję EK-F4 ląstelėse, ir kad tetraciklino, kuris atmeta chromosomiškai įterpto HSF4 EST antisensinę transkripciją šiose ląstelėse, pridėjimas pakeitė šį padidėjimą. Remiantis šiais rezultatais, MCF-7 ląstelių, transfekuotų vienos grandinės DNR oligonukleotidu, papildančiu HSF4 mRNR (AS-F4) arba siRNR, nukreipto prieš HSF4 mRNR (si-F4), populiacija taip pat parodė HIF-1α mRNR padidėjimą ( 2c pav.).

Image

HSF4 numušimo poveikis HIF-1α ekspresijai. ( a ) Schema (viršutinės plokštės) ir VEGF promotoriaus luciferazės reporterio tyrimo rezultatai (apatinės plokštės). Laukinio tipo (WT) MCF-7 arba HSF4 EST integruotos (EK-F4) ląstelės buvo transfekuotos laukinio tipo 1, 4 kb VEGF promotoriaus varomu LUC reporteriu (1, 4 kb wt) arba HRE mutavusiomis ląstelėmis. 1, 4 kb VEGF promotoriaus varomas LUC reporteris (HRE-mt) 24 valandas; alikvotinės dalys, turinčios pusę EK-F4 ląstelių arba 1/5 WT ląstelių, nebuvo apdorotos. Pusė EK-F4 ląstelių ir 1/5 WT ląstelių 24 valandas buvo apdorotos 1 μM tetraciklinu (Tet +), o 3/5 WT ląstelių 8 valandas buvo veikiamos HSF4 antisense oligo (AS-F4) arba HSF4 siRNR. (si-F4) 36 valandas, o luciferazės aktyvumas buvo įvertintas trimis tiražais. Skaičiai rodo luciferazės aktyvumą normalizavus CMV promotoriaus sukeltą β-galaktozidazės aktyvumą, kaip raukšlės indukcija per WT Tet + kontrolę. ( b ) Western blot: 1 juosta, baltymai buvo išskirti iš laukinio tipo MCF-7 ląstelių, auginamų esant 1 μM tetraciklino 24 valandas (WT, Tet +); 2 juosta, MCF-7 ląstelės, turinčios chromosomiškai integruotą HSF4 EST, auginamas tomis pačiomis sąlygomis (EK-F4, Tet +); 3 juosta, laukinio tipo MCF-7 ląstelės, auginamos be tetraciklino (WT, Tet-); 4 juosta, kaip ir 2 juosta, išskyrus tai, kad ląstelės buvo auginamos terpėse, kuriose nėra tetraciklino (EK-F4, Tet-). Skaičiai rodo HSF4 lygius normalizavus α-tubulino kiekį, išreikštą kaip raukšlės indukcija kontroliuojant (laukinio tipo MCF-7 ląstelės be tetraciklino). 5 juosta, su transfekcijos buferiu apdorotos laukinio tipo MCF-7 ląstelės („Mock“); 6 juosta, MCF-7 ląstelės, apdorotos HSF4 antisense oligo (AS-F4); 7 juosta, MCF-7 ląstelės, apdorotos siRNR iki HSF4 (si-F4). Skaičiai parodo HIF-1α lygį normalizavus α-tubuliną, išreikštą kaip raukšlės indukcija kontroliuojant „Mock“. c ) realaus laiko PGR. WT, EK-F4, Mock, AS-F4, si-F4 ir Tet +/− yra tokie, kaip pavaizduota 1 paveiksle. Skaičiai rodo HIF-1α mRNR lygius normalizavus GUSB mRNR lygį kaip raukšlės indukcija per Mock valdymą.

Visas dydis

HSF2 taip pat reikalingas norint palaikyti HIF-1α transkripcijos represijas

Aukščiau pateiktos išvados rodo, kad HSF-4 sumažėjęs reguliavimas padidina HIF-1α mRNR ir baltymo gamybą, tai reiškia, kad HSF4 veikia kaip HIF-1α ekspresijos slopiklis. Tačiau per savo tyrimus stebėtinai pastebėjome, kad atsitiktinai padidėjęs mRNR, koduojančio HSF4a arba HSF4b izoformą, padidėjimas taip pat padidino HIF-1α ekspresiją (3a ir b pav.) Ir tokiu pat laipsniu kaip HSF4 trūkumas (plg. 1 ir 3 paveikslus). - pareikšdamas, kad HSF4 veiksmai HIF-1α ekspresijai yra sudėtingesni nei paprastos transkripcijos represijos. Yra žinoma, kad atskiri HSF veikia kartu su kitais HSF šeimos nariais arba jiems priešinasi (Mathew ir kt., 2001; Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004; Xing ir kt., 2005; Loison). et al., 2006; Akerfelt ir kt., 2007; Ostling ir kt., 2007; Sandqvist ir kt., 2009; Yamamoto ir kt., 2009) ir mes padarėme hipotezę, kad HSF4 gali dalyvauti kartu su kitu HSF šeimos nariu HIF-1α transkripcijos. Norėdami ištirti šią galimybę, mes išbandėme dviejų kitų HSF baltymų, kurie, kaip žinoma, gaminami žmogaus ląstelėse (tai yra, HSF1 ir HSF2), reguliavimo sumažėjimą (Fujimoto ir Nakai, 2010). Kadangi žemas HSF1 reguliavimas neturėjo pastebimo poveikio HIF-1α ekspresijai, siRNR prieš HSF2 arba antisense oligonukleotidas, papildantis HSF2 nuorašą (AS-F2), padvigubintos HIF-1α baltymo koncentracijos padidėjimą nuo dviejų iki keturių kartų padidino ir mRNR, atitinkamai (4a ir b paveikslai). Šie radiniai, lygiagrečiai HIF-1α ekspresijos pokyčiams, vykstantiems HSF4 žeminančio reguliavimo metu (2 paveikslas), rodo, kad norint palaikyti pastovų HIF-1α transkripcijos slopinimą reikia HSF2 kartu su HSF4. Aprašyti du alternatyviai sujungti transkriptai, užkoduojantys skirtingas HSF2 izoformas, HSF2α ir HSF2β, pasižyminčių skirtingu transkripcijos aktyvumu (Pirkkala ir kt., 2001), o RT – PCR rezultatai parodė, kad tiek HSF2α, tiek HSF2β mRNR yra ekspresuojamos MCF-7 ląstelėse (duomenys nerodyta). Abiejų iš dviejų HSF2 izoformų, kurių molekulinė masė yra panaši ir kurios nebuvo pašalintos atliekant Western blot analizę tinkamomis sąlygomis (4c paveikslas), perprodukcija iš CMV promotoriaus padidino HIF-1α baltymą ir mRNR (4c ir d paveikslai). buvo pastebėtas perprodukuojant HSF-4.

Image

HIF-1α transkripcijos indukcija per daug ekspresuojant HSF4 izoformas. ( a ) Western blot: MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos vien vektoriu (CON) arba plazmidės konstruktu, ekspresuojančiu HSF4a (OE4a) arba HSF4b (OE4b) 24 šulinėlių plokštelėse. Skaičiai, esantys HSF4a arba HIF-1α juostose, žymi HSF4a arba HIF-1α lygius normalizavus α-tubuliną, išreikštą kaip raukšlės indukcija kontroliuojant. b ) realaus laiko PGR. CON, OE4a ir OE4b yra tokie patys kaip a punkte. Skaičiai parodo HIF-1α mRNR lygį normalizavus GUSB mRNR lygį kaip indukcija kartų per kontrolę.

Visas dydis

Image

HSF2 numušimo ar per didelis ekspresijos poveikis HIF-1α ekspresijai. a ) Realaus laiko PGR: MCF-7 ląstelės, apdorotos vien tik transfekcijos buferiu („Mock“, su transfekcijos buferiu apdorotos laukinio tipo MCF-7 ląstelės; si-F1, HSF1 su siRNR apdorotos MCF-7 ląstelės) arba nurodytais antisense oligonukleotidais arba siRNR. Skaičiai parodo HIF-1α mRNR lygius normalizavus GUSB mRNR lygį, kaip raukšlės indukcija per „Mock“ kontrolę. b ) Western blot. Mock, si-F2 ir AS-F2 yra tokie, kaip a punkte. Skaičiai rodo HSF2 arba HIF-1α lygius normalizavus α-tubuliną, išreikštą kaip raukšlės indukcija per „Mock“ kontrolę. ( c ) Western blot: MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos vien vektoriu (CON) arba plazmidės konstruktu, ekspresuojančiu HSF2α (OE2a) arba HSF2β (OE2b) 24 šulinėlių plokštelėse. Skaičiai, esantys HSF2α, HSF2β arba HIF-1α juostose, parodo jų lygius normalizavus α-tubuliną, išreikštą kaip raida indukcija, palyginti su kontrole. d ) realaus laiko PGR. CON, OE2a ir OE2b yra tokie patys kaip c punkte. Skaičiai parodo HIF-1α mRNR lygį normalizavus GUSB mRNR lygį kaip indukcija kartų per kontrolę.

Visas dydis

HSF4 ir HSF2 jungiasi prie HSE turinčių lokusų HIF-1α promotoriaus regione

Ankstesnis darbas parodė, kad HSF genų ekspresijos reguliavimas apima HSF prisijungimą prie DNR DNR, žinomo kaip HSE, dvigubų sruogų; HSE sekos, kurios yra labai konservuotos tarp plataus spektro eukariotų, susideda iš daugybės apverstų pentamerio nGAAn pakartojimų arba šios sekos varianto (Somasundaram ir Bhat, 2004; Xing ir kt., 2005; Akerfelt ir kt.) 2008; Fujimoto ir kt., 2008; Murphy ir kt., 2008). Remiantis mūsų įrodymais, kad HSF4 ir HSF2 yra HIF-1α transkripcijos reguliatoriai, 2 N kb DNR srities, esančios prieš HIF-1α transkripcijos pradžios vietą, analizė „Vector NTI“ motyvų programa atskleidė du netolygumus turinčius regionus, kuriuose gausu „ GAA / TTC “. pakartoja. Šių lokusų −901 / −864 (HSE1) ir −1463 / −1422 (HSE2) padėtys parodytos 5a paveiksle, palyginti su anksčiau nustatyta HIF-1α nuorašų iniciacijos vieta (žmogaus genomo BLAT paieška / UCSC genomas). Bioinformatika).

Image

HSF4 ir HSF2 jungiasi prie HIF-1α promotoriaus. a ) HIF-1α promotoriaus srities schema, vaizduojanti HSE1 ir HSE2 vietas bei jų sekas. Nukleotidai, identiški savo prigimtimi ir padėtimi kaip ir bendro HSE seka (GAA / TTC), pateikiami didžiosiomis raidėmis. Dviejų porų PGR pradmenų Ch-IP tyrimui (P1 – P2, P3 – P4) padėtys nurodytos rodyklėmis. Ištiesta rodyklė nurodo pagrindinę HIF-1α (žmogaus genomo BLAT paieška / UCSC genomo bioinformatika) transkripcijos pradžios vietą. b ) Ch-IP, naudojant MCF-7 ląstelių lizatus: agarozės geliai, kuriuose DNR fragmentai yra amplifikuoti naudojant pradmenis P1 ir P2 (259 bp, juostos 1–4 ir 9–18) arba naudojant pradmenis P3 ir P4 (461 bp), 5–8 juostos); D juosta, 100 bp DNR kopėčios; 1, 5 ir 18 juostos, įėjimo valdymas; 2 ir 6 juostos, anti-tubulino nuosėdų amplifikacija; 3 ir 7 juostos, anti-HSF2 nuosėdų amplifikacija; 4 ir 8 juostos, anti-HSF4 nuosėdų amplifikacija; 9, 10 ir 11 juostos, anti-tubulino nuosėdų, anti-HSF2 nuosėdų, anti-HSF4 kritulių iš amplifikuotos kontrolės kontroliuojamų ląstelių amplifikacija; 12, 13 ir 14 juostos, anti-tubulino nuosėdų, anti-HSF2 nuosėdų, anti-HSF4 nuosėdų iš HSF2-siRNR transfekuotų ląstelių amplifikacija; 15, 16 ir 17 juostos, anti-tubulino nuosėdų, anti-HSF2 nusodinimų, anti-HSF4 nuosėdų iš HSF4-siRNR transfekuotų ląstelių amplifikacija; PA nurodo juostą nuo pradmenų oligomerų amplifikacijos. c ) Ch-IP, naudojant MCF-7 ląstelių (viršutinė plokštė) arba HeLa ląstelių (apatinė panelė) lizatus. Agarozės geliai, kuriuose pavaizduoti DNR fragmentai, panaudojant pradmenis P1 ir P2 (259 bp). D juosta, 100 bp DNR kopėčios; 1 juosta, anti-HSF2 nuosėdų amplifikacija iš tuščių vektorių perkeltų ląstelių; 2 juosta, anti-HSF4 nuosėdų amplifikacija iš tuščių vektorių perkeltų ląstelių; 3 juosta, anti-HSF2 nuosėdų amplifikacija iš pcDNA3-HSF2α transfekuotų ląstelių; 4 juosta, anti-HSF4 nuosėdų amplifikacija iš pcDNA3-HSF2α transfekuotų ląstelių; 5 juosta, anti-HSF2 nuosėdų amplifikacija iš pcDNA3-HSF4a transfekuotų ląstelių; 6 juosta, anti-HSF4 nuosėdų amplifikacija iš pcDNA3-HSF4a transfekuotų ląstelių; 7 juosta, anti-tubulino nuosėdų amplifikacija; 8 juosta, įėjimo valdymas. PA nurodo juostą nuo pradmenų oligomerų amplifikacijos. d ) Gelio poslinkio tyrimas: rodyklės galvutė rodo DNR fragmentų, surištų su HSF, vietas. PB rodo laisvųjų [ 32 P] HSE86 zondų padėtis. 1 ir 9 juostos, tik [ 32 P] HSE86 zondas; 2 ir 10 juostos, [ 32 P] HSE86 su MCF-7 branduolių ekstraktais; 3 juosta, [32P] HSE86 su MCF-7 branduolių ekstraktais ir 50 nM nepaženklintu 86mu5 (kontrolinis oligonukleotidas); 4, 15 juostos, [ 32 P] HSE86 su MCF-7 branduolių ekstraktais ir nepaženklintu HSE86, koncentracija yra atitinkamai 12, 5 nM ir 50 nM; 5, 6, 11, 12 juostos [32P] HSE86 su MCF-7 branduolių ekstraktais ir nepaženklintu sintetiniu HSE1 oligonukleotidu, koncentracija atitinkamai yra 5, 0 nM, 2, 5 nM, 50 nM ir 25 nM; 7, 8, 13, 14 juostos [32P] HSE86 su MCF-7 branduolių ekstraktais ir nepaženklintu sintetiniu HSE2 oligonukleotidu, koncentracija atitinkamai yra 5, 0 nM, 2, 5 nM, 50 nM ir 25 nM.

Visas dydis

Chromatino imunoprecipitacijos (Ch-IP) tyrimai buvo atlikti siekiant nustatyti, ar HIF-1α promotoriaus srities segmentai, kuriuose yra tariamos HSE sekos, iš tikrųjų jungiasi prie HSF4 ir (arba) HSF2. Šiuose eksperimentuose anti-HSF4 arba HSF2 antikūnų nusodinti kompleksai buvo naudojami kaip substratai 30 PGR ciklų, paruoštų oligonukleotidų poromis, atitinkančiomis HSE1 (pradmenis P1 ir P2) arba HSE2 (pradmenis P3 ir P4) turinčias vietas (5a pav.). Kaip matyti 5b paveiksle, iš MCF-7G ląstelių imunoprecipiduotos DNR amplifikacija PGR pagal bet kurį iš dviejų anti-HSF antikūnų davė DNR fragmentus, kurių ilgis yra 259 bp (5b paveikslas, kairysis skydelis, 3 ir 4 juostos) arba 461 bp. 5b paveikslas, kairysis skydelis, 7 ir 8 juostos). Šių fragmentų seka (duomenys nepateikti) patvirtino, kad juose yra tikėtinų HSE. MCF-7 ląstelių transfekcija naudojant HSF2 siRNR panaikino 259 bp DNR fragmento amplifikaciją HSF2 antikūno imuniniuose produktuose, bet ne HSF4 antikūno imuniniuose produktuose (5b paveikslas, dešinė panelė, 10 ir 13, 11 ir 14 juostų palyginimas); panašiai, MCF-7 ląstelių transfekcija naudojant HSF4 siRNR panaikino 259 bp DNR fragmento amplifikaciją HSF4 antikūno imuniniuose produktuose, bet ne HSF2 antikūno imuniniuose produktuose (5b paveikslas, dešinė plokštė, 11 ir 17 juostų ir 10 juostų palyginimas). ir 16). Šie radiniai patvirtina, kad HSF2 ir HSF4 kiekvienas jungiasi prie mažiausiai dviejų atskirų HSE HIF-1α promotoriuje.

Kartu reikalavimas, kad HSF2 ir HSF4 galėtų slopinti HIF-1α transkripciją, ir išvados, kad bet kurio baltymo perprodukcija taip pat gali suaktyvinti HIF-1α transkripciją, pasiūlė modelį, kuriame (a) HSF2 ir HSF4 yra komplekso komponentai. kuris tarpininkauja HIF-1α promotoriaus represijoms, ir (b) postuliuoto represinio komplekso normalios stechiometrijos sutrikimas trukdo komplekso gebėjimui atremti HIF-1α transkripciją. Remdamiesi aukščiau pateiktu modeliu, atlikdami papildomą Ch-IP analizę, mes pastebėjome, kad per didelis HSF2 arba HSF4 ekspresija sumažino kito HSF kiekį, esantį kompleksuose su DNR, turinčiais HSE vietas, kurias nustatėme HIF-1α promotoriuje. MCF-7 ląstelių transfekcija (5c paveikslas, viršutinė plokštė) plazmidėmis, ekspresuojančiomis HSF2α, padidino 259 bp DNR fragmento, imunoprecipiduoto HSF2 antikūnais (5c paveikslas, palyginimas tarp 3 ir 1 juostų), tačiau sumažino šio fragmento kiekį, imunoprecipituotą antikūnas prieš HSF4 (5c paveikslas, 4 ir 2 juostų palyginimas). Atvirkščiai, transfekcija plazmidėmis, ekspresuojančiomis HSF4a, davė priešingus rezultatus (5c paveikslas, 6 ir 2 juostų palyginimas ir 5 juostų palyginimas su 1). Šie rezultatai rodo kiekvieno HSF sugebėjimą išstumti kitą iš kompleksų HSE surišimo vietoje. Panašūs radiniai buvo pastebėti naudojant chromatiną, gautą iš „HeLa“ ląstelių (5c paveikslas, apatinė plokštė).

Tai, kad HSF2 ir HSF4 gali specifiškai sąveikauti su HSE sekomis, buvo parodyta atliekant elektroforezinius mobilumo poslinkio testus, naudojant in vitro sintezuotus oligonukleotidus. [32P] pažymėtame HSE86 zonde yra trys tobuli nGAAn pentameriniai vienetai ir anksčiau buvo pranešta, kad jie jungiasi tiek su HSF2, tiek su HSF4 (Fujimoto ir kt., 2008). Kaip matyti 5d paveiksle, [32P] HSE86 inkubacija su MCF-7 ląstelių branduolių ekstraktais leido [32P] pažymėtą juostą perkelti į rodyklės nurodytą padėtį (2 ir 10 juostos) - tai patvirtina, kad HSF gali prisijungti konkrečiai prie šios HSE; nepaženklintas HSE86 pridėjimas iš dalies (4 juosta) arba didesnė koncentracija, visiškai (15 juosta) varžėsi dėl juostos poslinkio. Nepaženklinti sintetiniai oligonukleotidai, apimantys HIF1-1 promotoriaus HSE1 (5 ir 6 juostos) arba HSE2 (7 ir 8 juostos) seką, taip pat iš dalies konkuruoja su pažymėto zondo poslinkiu, o esant didesnėms koncentracijoms visiškai konkuruodavo (HSE1, 11 juostos ir 11 juostos). 12; HSE2, 13 ir 14 juostos). Šie rezultatai patvirtina, kad specifinės HIF-1α promotoriaus regiono vietos, kurias mes nustatėme kaip nenutrūkstamus HSE, sąveikauja su abiem HSF.

HSF2 ir HSF4 yra ekspresuojami keliuose audiniuose ir turi biologiškai skirtingas funkcijas bei specifines audinių funkcijas (Akerfelt ir kt., 2007; Fujimoto ir Nakai, 2010). Aukščiau pateikti rezultatai (5c pav.) Rodo, kad HSF sąveika su HIF-1α promotoriaus srities HSE taip pat įvyksta in vivo HeLa ląstelėse. Mes išbandėme HSF2 ir HSF4 numušimo ar perdėtos ekspresijos įtaką VEGF gamybai HeLa ir 293T ląstelių linijose. Kaip parodyta 6 paveiksle, atlikus šias manipuliacijas abiejų tipų ląstelėse padidėjo VEGF, panašiai kaip padidėjusiame MCF-7 ląstelėse, ir tai rodo, kad HSF poveikis VEGF gamybai yra didesnis už žmogaus krūties vėžio ląstelę. linija, naudojama atrasti šį HSF vaidmenį.

Image

HSF2 ar HSF4 numušimo ar per didelio ekspresijos poveikis VEGF gamybai 293T arba HeLa ląstelėse. Con, si-F2, si-F4, OE2a, OE2b, OE4a ir OE4b yra tokie patys kaip paveiksluose 2, 3, 4. a ) 293T ląstelės, praėjus 36 valandoms po transfekcijos. ( b ) HeLa ląstelės, praėjus 36 valandoms po transfekcijos.

Visas dydis

Diskusija

Čia pateiktos išvados atskleidžia iki šiol neįtariamą kanoninio HIF-1α / VEGF signalizacijos kelio ekspresijos reguliavimo mechanizmą, kurį sukelia HSFs 2 ir 4. Mūsų išvados rodo, kad HSF2 ir HSF4 poveikis VEGF raiškai ir tikriausiai taip pat kiti genai, kontroliuojami HIF-1α / HRE tarpininkaujant signalizacijai - turi įtakos santykiniam HSF4 ir HSF2 gausumui. Ankstesni tyrimai parodė, kad HIF-1α transkripciją gali sureguliuoti nehipoksiniai įvykiai, taip pat hipoksija - dėl to padidėja VEGF ir kitų HIF-1α taikomų genų ekspresija (Jiang et al., 1997; Page et al., 2002 m.; Busca ir kt., 2005; Pipinikas ir kt., 2008; Nardinocchi ir kt., 2009). Rezultatai leidžia manyti, kad HSF2 / HSF4 kompleksai HIF-1α promotoriaus HSE elementuose, kurie gali kiekybiškai skirtis skirtingose ​​normalių ar navikinių ląstelių rūšyse, gali būti vienas iš tokių hipoksinio reguliavimo mechanizmų.

HSF šeimos narių transkripcinis HSP reguliavimas reaguojant į šilumą, infekciją ir uždegimą, taip pat veikiant farmakologiniams agentams ir kitiems stresams, yra procesas, išsaugotas eukariotinėse ląstelėse (Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004). . Be to, kad HSF turi labai konservuotą DNR rišantį domeną, jie apima hidrofobines sritis, tarpininkaujančias dimerų ar trimerų formavimuisi (Yamamoto ir kt., 2009; Fujimoto ir Nakai, 2010). Žinduolių ląstelėse HSF1 yra pagrindinis veiksnys, kontroliuojantis streso sukeltą HSP raišką, tuo tarpu HSF4 ir HSF2 buvo selektyvesni transkripcijos reguliatoriai, kurie nekontroliuoja klasikinių HSP ekspresijos (Nakai ir kt., 1997; Mathew et al. 2001; Zhang ir kt., 2001; Loison ir kt., 2006 m. Naujausią apžvalgą, žr. Fujimoto ir Nakai, 2010). Nepaisant bendrų struktūrinių bruožų, jų gebėjimo formuoti homotrimetrus (Yamamoto ir kt., 2009) ir funkciškai svarbių sąveikų, vykstančių tarp HSF2 ir HSF4 HIF-1α promotoriaus HSE, HSE, nepririštos prie HSE, turi nepastebėta ankstesniame darbe, kad sąveikautų tarpusavyje (Mazure ir kt., 1997; hipoksijos reakcijos elementas -> VEGF kaskados diferencijuotai reguliuoja kraujagyslių atsaką ir augimo greitį navikuose. Vėžys Res 60: 6248–6252. "href =" / straipsniai / onc2010623 # ref43 "> Tsuzuki ir kt., 2000; Pirkkala ir kt., 2001; Fujimoto ir kt., 2004; Min ir kt., 2004); panašiai sąsajos tarp nesurištų HSF mūsų kartu nenustatyta. imunoprecipitacijos eksperimentai (duomenys nepateikti).

Mūsų įrodymai, kad HSF2 ir HSF4 gali reguliuoti HIF-1α transkripciją kartu su mūsų netiesioginių HSE-1 sekų atradimu HIF-1α promotoriaus regione, leido manyti, kad šie HSF jungiasi prie vietų, identifikuotų sekų analizės būdu, kaip įmanoma HSE. Mūsų Ch-IP ir elektroforetinio mobilumo poslinkio tyrimų rezultatai patvirtino šių vietų kaip HSE svarbą. Kadangi HSF1, kuris yra pagrindinis streso suaktyvinamas reguliatorius, jungiasi prie nuolatinių HSE, tiek HSF2, tiek HSF4 jungiasi pirmiausia su nenutrūkstamais HSE. Mūsų išvados taip pat atitinka ankstesnius įrodymus, kad skirtingi HSF gali turėti bendrų taikinių (Akerfelt ir kt., 2008; Fujimoto ir kt., 2008; Yamamoto ir kt., 2009). Kadangi trijų žinduolių ląstelėse identifikuotų trijų HSF DNR surišantys domenai yra labai panašūs (70, 5% tapatumas tarp HSF1 ir HSF2, 76, 2% identiškumas tarp HSF1 ir HSF4 ir 62, 4% identiškumas tarp HSF2 ir HSF4), HSF vis dėlto parodo skirtingą DNR surišimą. lengvatos (Somasundaram ir Bhat, 2004; Fujimoto ir kt., 2004, 2008; Yamamoto ir kt., 2009). Potencialiai tokios nuostatos gali turėti įtakos nustatant HSF / HRE kompleksų poveikį HIF-1α promotoriaus regione.

Mūsų duomenys rodo, kad tiek HSF2, tiek HSF4 gali sąveikauti su abiem HIF HIF-1α promotoriuje esančiais HSE ir abu reikia palaikyti pastovią HIF-1α transkripcijos represiją. Jie taip pat rodo, kad per didelis HSF2 arba HSF4 ekspresija sumažino kito HSF buvimą kiekviename HIF-1α HSE ir papildomai suaktyvino HIF-1α transkripciją. Įrodyta, kad HSF4 prisijungimas prie nenutrūkstamų HSE yra priklausomas nuo šio HSF sutrumpinimo (Yamamoto ir kt. , 2009), ir - kaip buvo pažymėta anksčiau - atskiri HSF šeimos nariai gali veikti kartu su kitais ar priešingai nei kiti. HSF šeimos nariai. Šie samprotavimai, kartu su mūsų išvadomis, kad pusiausvyros sutrikimas tarp HSF2 ir HSF4 kiekių panaikina nuolatinę HIF-1α transkripcijos represiją, verčia mus spėlioti, kad transkripciją ribojanti HSF2 ir HSF4 sąveika HSE elementuose gali būti susijusi su heteromultimerio susidarymu. . Nors ši sąvoka atitinka ir čia pateiktus pastebėjimus, ir ankstesnes žinias apie HSF jungimąsi su HSE, patvirtinti reikės HSF / HSE kompleksų struktūros analizės.

Atsižvelgiant į HSF veiksmų ląstelių tipo specifiškumą (Fujimoto ir Nakai, 2010) atrodo tikėtina, kad HSF poveikis HIF-1α transkripcijai, stebimam žmogaus krūties vėžio ląstelėse, gali skirtis kitų tipų ląstelėse ir gali būti skirtingai paveiktas šilumos šoko. ir kitos streso sąlygos skirtinguose ląstelių tipuose (žr. Mathew ir kt., 2001; Pirkkala ir kt., 2001; Chi ir Karliner, 2004; Xing ir kt., 2005; Loison ir kt., 2006; Akerfelt ir kt., 2007), 2008; Ostling ir kt., 2007; Sandqvist ir kt., 2009; Yamamoto ir kt., 2009). Nepaisant šių svarstymų, mūsų duomenys rodo, kad HSF2 ir HSF4 poveikis VEGF gamybai mažiausiai dviejose kitose ląstelių linijose - HeLa ir 293T ląstelėse - yra panašus į tuos, kurie pastebimi MCF-7 ląstelėse. Preliminarus fiziologinių stresų poveikio ekranas nenustatė streso sąlygų, kurios reguliuoja HIF-1α gamybą priklausomai nuo HSF ląstelių linijose, kurias mes ištyrėme.

Ankstesnis darbas parodė, kad HIF90 (Fujimoto ir kt., 2004; Min ir kt., 2004), kuris yra HSF4 transkripcijos kontrolės taikinys, reikalingas HIF-1α tarpininkaujant VEGF ekspresijai (Minet ir kt., 1999; Isaacs ir kt., 2002). Be to, kito HSF4 moduliuoto šilumos šoko baltymo HSP27 (Fujimoto ir kt., 2004; Min ir kt., 2004) ekspresija yra koreliuojama su naviko sukelta angiogeneze (Wartenberg ir kt., 2001). Kadangi buvo pagunda įtarti HSP90 arba HSP27 vaidmenį padidėjusioje VEGF gamyboje, kurią stebėjome per HSF4 ar HSF2 reguliavimą, realaus laiko PGR ir Western blot eksperimentais nepavyko aptikti jokio HSF2 ar HSF4 siRNR poveikio HSP90 baltymo gamybai. MCF-7 ląstelėse per 24 valandas po šių siRNR transfekcijos (duomenys nepateikti). Nors dėl HSF4 siRNR transfekcijos sumažėjo HSP27 ekspresija tiek mRNR, tiek baltymo lygiu tomis pačiomis eksperimentinėmis sąlygomis, HSP27 ekspresijos atkūrimas, kai HSF4 sumažino MCF-7 ląstelių reguliavimą, nesutrukdė HIF-1α transkripcijos padidėjimo - tai rodo, kad depresijos sumažėjimas HIF-1α transkripcija šiose ląstelėse nebuvo nepakankamo HSP27 ekspresijos pasekmė (duomenys nepateikti). Tačiau mūsų rezultatai neatmeta galimybės, kad HSF sukelti HSP išraiškos pokyčiai gali papildyti čia pateiktus reguliavimo mechanizmus.

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • 3395089