Imuninių receptorių pertvarkymų, kaip genetinių žymenų, patikimumas, siekiant minimaliai stebėti likusią ligos būklę | kaulų čiulpų transplantacija

Imuninių receptorių pertvarkymų, kaip genetinių žymenų, patikimumas, siekiant minimaliai stebėti likusią ligos būklę | kaulų čiulpų transplantacija

Anonim

Dalykai

  • Limfoproliferaciniai sutrikimai
  • Transliaciniai tyrimai

Minimalios likutinės ligos (MRD) aptikimas yra galinga daugelio hematologinių piktybinių navikų, įskaitant VISUS, prognozės priemonė. 1 Kelios žymeklių grupės yra plačiai naudojamos stebėti piktybinio klono koncentraciją, įskaitant 'kloninių B-ląstelių (BCR) arba T-ląstelių (TCR) genų receptorių pertvarkymų 2 nustatymą VISI. Piktybiniam klonui būdingo klono pertvarkymo, kuris paprastai sudaro 20–90% pradiniame kaulų čiulpų mėginyje, nustatymas yra gana nesudėtinga užduotis. 2 Stebėti šį pertvarkymą po terapijos yra sudėtinga, nes piktybinių ląstelių koncentracija mėginyje gali būti labai maža. Naujausia MRD aptikimo pažanga, pagrįsta kiekybiniu realaus laiko PGR (qPCR) 3 ir didelės perėjimo sparta (HTS) 4, 5, 6, leidžia aptikti piktybinius klonus, kurių koncentracija yra viena iš 10 5 ir net 10 6 ląstelėms. Nors teigiama, kad MRD aptikimas leidžia tiksliai numatyti gydymo leukemija rezultatus skirtingose ​​klinikinėse aplinkose, šios informacijos vertę kartais sugadina klaidingai teigiami ir klaidingai neigiami MRD matavimo rezultatai. 7 Viena iš galimų klaidingai teigiamų rezultatų priežasčių aptariama toliau.

IgD ir TCR genai, naudojami MRD stebėjimui, yra patys įvairiausi genai žmogaus organizme. Brandinimo metu jie formuojami naudojant specifinį V (D) J rekombinacijos mechanizmą kiekviename iš T arba B ląstelių klonų, sujungiant po vieną iš kiekvieno V, D ir J genomo segmentų ir įterpiant atsitiktinius nukleotidus į segmentų jungtis. Nustatyta, kad pagrindinė teorinė TCRβ grandinės įvairovė žmonėms yra 10 14 skirtingų variantų 8 ir iki 10 18 BCR sunkiųjų grandinių. 9 Kadangi nepriklausomos rekombinacijos normalioje ląstelėje, sukeliančioje tą pačią receptorių seką, tikimybė yra labai maža, to paties leukeminio TCR ar BCR pertvarkymo aptikimas po terapijos iš pirmo žvilgsnio vienareikšmiškai rodo piktybinių ląstelių buvimą. Tačiau naujausi tyrimai rodo, kad skirtingų TCR ar BCR pertvarkymų generavimo tikimybė gali skirtis keliais dydžiais. Be to, kai kuriuos sekų variantus buvo galima rasti beveik kiekviename individe (vadinamieji viešieji klonotipai 10, 11, 12 ). Taigi norint įvertinti patikimą MRD, būtina įvertinti TCR ir BCR pertvarkymo tikimybes.

Imuninio receptoriaus nukleotidų sekos generavimo tikimybė yra visų galimų įvykių, kurie lemia šios sekos susidarymą, derinių, įskaitant V, D, J genų segmentų atranką, nukleotidų ištrynimus iš genų segmentų kraštų ir atsitiktinių intarpų, tikimybių suma. (N) nukleotidai. 8, 9 Čia mes išanalizavome 63 TCRβ pertvarkymus, įskaitant 56 anksčiau paskelbtus piktybinių klonų pertvarkymus ir 7 klonų pertvarkymus, kuriuos nustatėme 10 pacientų, sergančių ūmine T ląstelių ar B ląstelių limfoblastine leukemija, Biomed 2 pradmenimis 2 amplifikacijai ir Sanger sekos nustatymui. . Naudodami tikimybinį generavimo modelį (išsamiai aprašytą 8 nuorodoje ir papildomoje informacijoje) ir savo vidinę programinę įrangą, mes apskaičiavome generavimo tikimybes kiekvienam iš 63 piktybinių TCRβ pertvarkymų (1 papildoma lentelė). Norėdami įvertinti, kaip piktybinių TCRβ pertvarkymų tikimybės atitinka sveikų T-ląstelių klonų tikimybes, apskaičiavome 145 atskirų sveikų donorų TCRβ repertuaro generavimo tikimybių pasiskirstymą (nuorodos 13, 14, 15 ir mūsų neskelbti duomenys), gautus anksčiau naudojant mūsų NGS („Illumina HiSeq“, San Diegas, Kalifornija, JAV) pagrįsta technologija. 16 Mes apskaičiavome du skirtingus tikimybės pasiskirstymus: (1) TCR, kurie randami tik vienam asmeniui („unikalūs klonai“, iš viso 40 667 025), ir (2) TCR, kurie yra bent dviem asmenims („bendri klonai“) ', Iš viso 2 524 069) (1a pav.). Apskritai piktybinių klonų pasiskirstymas buvo panašus į unikalių klonų pasiskirstymą. Tačiau 9 iš 63 patogeninių persitvarkymų turėjo didelę bendrų klonų generavimo tikimybę (maždaug 1 x 10–9 ).

Image

Sveikų donorų ir 63 piktybinių klonų TCRβ persiskirstymo tikimybių pasiskirstymas. Linijos rodo kiekvieno piktybinio klono perstatymo generavimo tikimybę. a ) rausvos spalvos - unikalūs sveikų donorų klonai, žali - sveikų donorų bendri klonai, mėlynos spalvos - piktybinių klonų pertvarkymai. Kietos raudonos linijos rodo piktybinių klonų, rastų bent vienam sveikam asmeniui, persitvarkymą. b ) rausva spalva - unikalūs sveikų donorų klonai, žali - sveikų donorų bendri klonai, mėlyna spalva - identiški sveikų asmenų piktybiniams klonams, kurių CDR3 seka neatitinka jokio skirtumo, arba violetinė - unikalūs piktybinių klonų persitvarkymai. Kietos raudonos linijos rodo piktybinius klonus, aptinkamus bent viename sveikus asmenyje, turinčius vieną CDR3 sekos neatitikimą arba jo visiškai neatitinkantį.

Visas dydis

Be to, mes ieškojome piktybinių TCRβ klonų CDR3 nukleotidų sekų tų pačių 145 sveikų asmenų repertuare (1A lentelė) ir nustatėme, kad 5 iš 63 piktybinių klonų pertvarkymų (CDR3 nukleotidų sekos) yra bent viename sveikame donore . Vienam pertvarkymui mes stebėjome identiškas nukleotidų CDR3 sekas 20 iš 145 sveikų asmenų. Tolesnė sveikų TCR klonų, kurių CDR3 buvo identiški piktybiniams klonams, analizė parodė, kad kai kurie iš jų turėjo skirtingą V geną (1A lentelės, H0 skliausteliuose). Vis dėlto, net jei būtų taikomas šis griežtas kriterijus (identiškas V genas), 5 piktybinių klonų pokyčiai buvo rasti bent viename sveikame asmenyje. Kaip ir buvo galima tikėtis, sveikų donorų aptikti piktybinių klonų TCR perstatymai turėjo didelę generacijos tikimybę (1a paveikslas, vientisos raudonos linijos, 1A lentelė, generacijos tikimybė).

Pilno dydžio lentelė

Norėdami įvertinti, ar rastų klonų (5 iš 63) skaičius yra artimas numatomam, atlikome Monte-Carlo modeliavimą. Iš kiekvieno iš 76 sveikų TCR repertuarų, turinčių daugiau nei 200 000 klonotipų, atsitiktine tvarka pasirinkome 63 TCRβ klonus ir ieškojome jų kituose 144 repertuaruose ir pakartojome procedūrą septynis kartus (iš viso 7 × 76 modeliavimas). Modeliavimas parodė, kad kitiems asmenims vidutiniškai buvo rasta 6 iš 63 atsitiktinai pasirinktų klonų (mediana 6, 95% pasikliautinasis intervalas: 2, 16). Taigi sveikiems donorams nustatytas piktybinių klonotipų skaičius yra beveik numatomas.

qPCR metodas, plačiai naudojamas MRD aptikimui, neturi absoliutaus specifiškumo, nes CDR3 specifiniai fluorescenciniai zondai gali atkaitinti panašias sekas. Taigi mes taip pat ieškojome sveikų TCRβ klonų su CDR3 seka, homologiški piktybiniams CDR3 klonams (1B lentelė). Iš viso 18 iš 63 piktybinių klonų buvo dalijamasi TCRβ pertvarkymais su tais pačiais V ir J genais ir sveikų asmenų CDR3 seka turėjo ne daugiau kaip vieną nukleotido neatitikimą. Generacijos tikimybės pasiskirstymas pagal šiuos 18 perstatymų atitinka bendrų sveikų klonotipų pasiskirstymą, o kitų piktybinių persitvarkymų pasiskirstymas atitinka unikalių klonų pasiskirstymą (1b pav.).

Pilno dydžio lentelė

MRD stebėjimas yra labai svarbus renkantis efektyviausią strategiją terapijai po remisijos, įskaitant kraujodaros kamieninių ląstelių transplantaciją. Nors šiuolaikiniai MRD stebėjimo metodai, pagrįsti qPCR ar HTS, yra pakankamai aukšti, jie niekada neatsako už stebimų imuninių genų pertvarkymų generavimo dažnį. Todėl yra tikimybė, kad sveikose imuninėse ląstelėse nepriklausomai gali susidaryti TCR arba BCR sekos, identiškos tai, kas būdinga piktybiniam klonui. Tokiu atveju MRD stebėjimo duomenys gali tapti klaidinantys, nes po chemoterapijos aptiktas pertvarkymas nebūtinai rodo navikinių ląstelių buvimą.

Čia parodyta, kad piktybinėse ląstelėse randami TCRβ pertvarkymai su gana didele generavimo tikimybe. Be to, kai kurie iš šių pertvarkymų (4 iš 9) yra įprastų asmenų TCR repertuaruose. Sveikų asmenų, turinčių tą pačią CDR3 seką kaip piktybiniai klonai, skaičius taip pat yra gana mažas - dažniausiai 1–5 iš 145. Taigi iš pirmo žvilgsnio tikimybė padaryti klaidingą išvadą atliekant MRD stebėseną yra gana menka. Tačiau reikia paminėti, kad nepriklausomo identiško persitvarkymo tikimybė tame pačiame organizme yra žymiai didesnė nei kitų asmenų. Be to, tik tiesioginiais seka pagrįsti metodai gali atskirti identišką CDR3 seką nuo labai panašios (su vienu neatitikimu). Kai naudojami qPCR pagrįsti metodai, savarankiškai suformuotas pertvarkymas su vienu neatitikimu gali sukelti klaidingai teigiamą signalą, nes naudojamas fluorescencinis zondas, papildantis CDR3 sritį arba CDR3 specifinį pradmenį. Šiame tyrime 18 iš 63 analizuotų piktybinių TCRβ pertvarkymų galėjo generuoti klaidingai teigiamus signalus.

Čia mes sutelkė dėmesį į TCRβ pertvarkymus, kurie yra naudojami tiek B, tiek T ALL MRD stebėti. Ig sunkiųjų grandinių (IGH), kurios taip pat dažnai naudojamos MRD stebėsenai, rizika gauti klaidingai teigiamą rezultatą iš esmės yra mažesnė, nes perstatytuose IGH genuose yra daugiau pridėtų atsitiktinių nukleotidų sankryžose, be to, hipermutacijos vyksta genomiškai koduotuose regionuose. Tuo pačiu metu kiti imuninių receptorių lokusai, kurie taip pat naudojami MRD stebėjimui (Ig lengvosios grandinės IGL, IGK ir TCR gama), apima tik du genomo segmentus V ir J ir mažiau pridėtų nukleotidų sankryžoje, o tai padidina klaidingai teigiamų riziką. rezultatai. Taigi, norint įvertinti klaidingai teigiamų MRD stebėjimo rezultatų riziką naudojant kitus IG žymenis, reikalingi papildomi tyrimai.

Taigi, mūsų duomenys rodo, kad atliekant MRD stebėjimą, imuninio geno pertvarkymai turėtų būti įvertinti atsižvelgiant į jų nepriklausomo surinkimo tikimybę. Šis įvertinimas gali būti atliekamas dviem būdais: (1) perskaičiavimo tikimybės apskaičiavimas naudojant matematinį modeliavimą arba (2) tiesioginė pertvarkytos sekos paieška pagrįstų sveikų donorų IG arba TCR repertuaro duomenų rinkinyje. Atlikus tokią analizę, žymenų kandidatai gali būti klasifikuojami pagal jų galimą patikimumą MRD stebėsenai. Tais atvejais, kai klonotipai pasižymi dideliu generavimo dažniu, MRD analizė turėtų būti paremta kitais specifiniais leukemijai būdingais genetiniais žymenimis.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento kaulų čiulpų transplantacijos svetainėje (//www.nature.com/bmt)