Pakartotinis rūgšties ir tulžies poveikis selektyviai sukelia storosios žarnos fenotipo ekspresiją heterogeninėje bareto epitelio ląstelių linijoje | laboratorinis tyrimas

Pakartotinis rūgšties ir tulžies poveikis selektyviai sukelia storosios žarnos fenotipo ekspresiją heterogeninėje bareto epitelio ląstelių linijoje | laboratorinis tyrimas

Anonim

Anotacija

Bareto epitelis yra ikivėžinė specializuota stulpelio metaplazija distalinėje stemplėje. Mes parodome neoplastinės Barrett ląstelių linijos (BAR-T) ląstelių fenotipo pokyčius, paveiktus rūgštimi ir tulžies druska - dviem svarbiais gastroezofaginio refliuksato komponentais. Ląstelių fenotipai BAR-T ląstelių linijoje buvo kiekybiškai įvertinti naudojant fluorescencinį ląstelių rūšiavimą (FACS), naudojant monokloninius antikūnus prieš žymenis: citokeratinas 8/18 (CK8 / 18) stulpeliui, CK4 - plačiakampiui, mAbDas-1 storosios žarnos epitelinių ląstelių fenotipui ir p75NTR stemplės progenitoriams. Ląstelės kiekvieną dieną 5 min buvo veikiamos 200 μM glicohenodeoksicholio rūgšties, esant pH 4, pH 6 ir 7, 4, arba tik iki rūgšties (pH 4) iki 6 savaičių. BAR-T ląstelių liniją sudarė 35 ± 5, 2% CK8 / 18, 32 ± 3, 5% mAbDas-1, 9, 5 ± 3% CK4 ir 4 ± 2, 5% p75NTR teigiamų ląstelių. Vienkartinis rūgšties ir (arba) tulžies poveikis nepakeitė ląstelių fenotipų. Tačiau lėtinis gydymas mažiausiai 2 savaites žymiai padidino storosios žarnos fenotipo ir CK8 / 18 teigiamų ląstelių raišką ( P <0, 05), tai patvirtina FACS analizė. Tulžies druska, kurios pH yra 4, ir tulžies druska, po kurios seka rūgštis (pH 4) iš eilės, buvo stipriausi stimuliatoriai ( P <0, 01) storosios žarnos fenotipo ląstelių indukcijai. Plaukelio (CK4 + ) fenotipas gydymo metu nepasikeitė. Cox-2 raiška buvo sukelta po ūmaus gydymo ir padidėjo iki dvigubai lėtinio gydymo metu, ypač reaguojant į rūgštinį pH. Darome išvadą, kad BAR-T ląstelės gali būti panaudotos kaip „ in vitro “ modelis aplinkos veiksnių ir jų įtakos ląstelių fenotipui bei molekuliniams pokyčiams stemplės vėžio patogenezėje tyrimui.

Pagrindinis

Barrett'o epitelis (BE) yra įgytas metaplastinis pokytis distalinio stemplės kvadrato formos sankryžoje, atsirandančioje dėl lėtinės gastroezofaginio refliukso ligos (GERL). 1, 2, 3 Epidemiologiniai tyrimai rodo stiprų ryšį tarp GERL ir stemplės adenokarcinomos, 4, 5, 6, 7, o piktybinio formavimo rizika yra nuo 30 iki 125 kartų didesnė pacientams, sergantiems GERL, komplikuotiems BE. 8, 9 BE kilmė ir patologinė progresija bei gastroezofaginio refliukso indėlis į ligos procesą buvo išsamiai ištirti naudojant gyvūnų modelius. 1, 10, 11, 12, 13 Metaplastinis BE procesas atrodo kaip apsauginė adaptacija 14 arba regeneracinis gijimo mechanizmas. Hipotezuojama, kad „pleuripotentinės ląstelės“ iš vietinio stemplės stratifikuoto plokščiojo epitelio arba stemplės poodinių liaukų latakų epitelio gali sukelti specializuotą stulpelinį epitelį. 16, 17 Tačiau tai galima dar labiau nustatyti aprašant ląstelės fenotipą ir molekulinius įvykius, susijusius su metaplazijos → displazijos → karcinomos seka. 18

Rūgštis ir tulžis, du pagrindiniai gastroezofaginio refliuksato komponentai, sąveikaudami sukelia gleivinės pažeidimus. 19 Tiriant stemplės biopsijas ir adenokarcinomos ląstelių linijas, buvo tiriami molekuliniai reiškiniai, atsirandantys dėl GERL žmonėms. Vienas tulžies arba rūgšties impulsas savarankiškai padidina ląstelių išgyvenamumą ir proliferaciją, taip pat sumažina apoptozę, galbūt, sukeldamas Cox-2 ekspresiją, per MAPKinazės 20, 21, 22, 23 ir ERK kelią. Tiek rūgštis, tiek tulžis buvo pasiūlyti skatinti žarnyno tipo diferenciaciją stemplės keratinocituose, indukuojant transkripcijos faktorius NF-κB ir Cdx-2. Įrodyta, kad rūgštis skatina villino ekspresiją normaliuose stemplės biopsijos audiniuose, išaugintuose organų kultūroje 27 ir tulžyje, esant neutraliam pH, ir sukelianti DNR pažeidimą stemplės ląstelių linijose. 28 Visų šių eksperimentų metu rūgščių ir (arba) tulžies poveikis buvo tik trumpalaikis keletą minučių ar valandų, daugiausia naudojant vėžio ląstelių linijas ir organų kultūras. Tačiau nėra pranešimų apie ląstelių fenotipo ar molekulių pokyčius, atsirandančius dėl ilgalaikio (savaičių) rūgšties ir tulžies poveikio, kaip in vivo pacientams, sergantiems GERL.

Savo laboratorijoje sukūrėme storosios žarnos epiteliui specifinį antikūną - mAbDas-1 (dar vadinamą 7E12H12, IgM izotipu), kuris reaguoja tik su storosios žarnos epiteliu, o ne su jokia kita virškinimo trakto dalimi, įskaitant storojo žarnos epitelį., skrandis ir žvynelinis stemplės epitelis. 29, 30. Reaktingumas yra intensyvesnis šalia ląstelės membranos. mAbDas-1 reaguoja su glikoproteinu, vadinamu storosios žarnos epitelio baltymu (CEP), kuris selektyviai ekspresuojamas storosios žarnos epitelyje. 31 Nors mAbDas-1 nereaguoja su normalia stemplė, įskaitant virškinimo trakto jungties gleivinę, jis gali nustatyti BE, taip pat adenokarcinomą, atsirandančią dėl BE, kurio jautrumas 97% ir 100% specifiškumas, ir rodo, kad BE iš tikrųjų yra storosios žarnos fenotipo metaplazija. 32 Tai patvirtino keli nepriklausomi tyrimai. 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 Be to, mAbDas-1 gali aptikti storosios žarnos metaplaziją dar prieš histologinį BE pasirodymą, kas rodo „priešbareto“ stadiją. Duomenys rodo, kad CEP ekspresija vyko prieš histologinį BE ir išliko vystantis metaplazijai ir progresuojant karcinomai.

Cox-2 buvo susijęs su neoplastiniu progresu Bareto stemplėje. 22, 24, 40 atvejų. Padidėjęs Cox-2 kiekis nustatytas Barrett audiniuose 41 ir keliais stemplės adenokarcinomos atvejais 22, 40, 42, 43, 44 audiniuose , nors priežastinis ryšys dar nenustatytas. Cox-2 ekspresija paprastai yra susijusi su uždegiminėmis ar streso reakcijomis. 45 Cox-2 per didelis ekspresas susijęs su apoptozės slopinimu, padidėjusiu piktybinių navikų invaziškumu ir sustiprinta audinių prostaglandinų 46, 47, 48, 49 sinteze virškinimo trakto vėžiuose.

Citokeratinas 8/18 (CK8 / 18), stulpelio epitelio žymeklis, nėra išreikštas stemplės plokščiagarbiu epiteliu. Gauta pranešimų apie kai kurių adenokarcinomų padidėjusį CK8 / 18 baltymo ekspresiją 50, tačiau jo ekspresija stemplės adenokarcinomoje nežinoma. Beveik daugiasluoksniame epitelyje, nustatant imunocitochemiją, buvo stebimas CK8 / 18. 51 Šis židinio daugiasluoksnis epitelis BE viduje apima ląsteles, kurios tuo pat metu ekspresuoja ir plokščiadugnius, ir stulpelinius citokeratino žymenis, panašiai kaip stemplės gleivinės liaukos latako epitelis 34 ir neoplastinė telomerazės įamžinta Barrett ląstelių linija (BAR-T). 52

Mes panaudojome BAR-T ląstelių liniją kaip modelį, skirtą nustatyti specifinį ląstelių fenotipą heterogeninėje 52 ląstelių populiacijoje, kurie galėtų parodyti molekulinius ir (arba) ląstelių fenotipinius pokyčius po lėtinio rūgšties ir tulžies poveikio. Mes panaudojome specifinius ląstelių fenotipo žymenis: kolonėlėms CK8 / 18, plačialapiams CK4, storosios žarnos fenotipui - mAbDas-1, o p75NTR - kaip stemplės progenitorių 53, 54 žymenis ir kiekybiškai įvertinome ląsteles, parodančias kiekvieną fenotipą. Palyginome visų šių žymenų išraišką paeiliui BAR-T ląstelėse po vienkartinės 5 minučių ekspozicijos (ūmaus poveikio) rūgšties (pH 4) ar tulžies, esant pH 7, 4, arba tulžies, kai pH 4, ir toliau tęsėme panašų procesą. poveikis kiekvieną dieną iki 6 savaičių (lėtinis poveikis). Cox-2 baltymo ekspresija buvo stebima lygiagrečiai kaip ląstelių atsako į išorinį stresą, kurį sukelia apdorojimas rūgštimi ir tulžimi, rodiklis.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Ląstelių linija, terpė ir ląstelių kultūra

BAR-T ląstelės buvo auginamos specialioje papildytoje keratinocitų terpėje (KBM2) iš Cambrex Bioscience (East Rutherford, NJ, JAV), kaip aprašyta Jaiswal et al aprašytame protokole . 20 druskos rūgšties buvo naudojama mitybinės terpės pH sureguliuoti iki eksperimentinių sąlygų. Tulžies rūgštis, glikohenodeoksicholio rūgštis, GCDA (Sigma, Sent Luisas, MI, JAV), buvo praskiesta iki optimalios 200 μM 20 koncentracijos, auginant terpę, sureguliuotą iki arba pH 4 (tulžies pH 4), pH 6 (tulžies pH). 6) arba pH 7, 4 (tulžis) prieš dedant į ląstelių kultūrą. Ūminiam poveikiui palaikyti 0, 1x106 ląstelės, augančios šešių šulinėlių plokštelėse, buvo inkubuotos rūgštyje ir (arba) tulžyje 5 minutes per 24 valandas. Lėtinės ekspozicijos metu ląstelės buvo veikiamos 5 minutes kasdien, iki 6 savaičių. Ląstelių perdavimo dieną gydymas nebuvo atliekamas. Laikas buvo optimizuotas iš panašių tyrimų, parodžiusių, kad 5 minučių pakako, kad būtų galima indukuoti signalo perdavimo takus, reguliuojančius ląstelių mechanizmus be ląstelių pažeidimų. 22, 23, 24 ląstelės buvo praplaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) prieš ir po inkubacijos su norima gydymo terpe. Kontrolinės neapdorotos ląstelės buvo auginamos lygiagrečiai specialioje terpėje, kaip minėta aukščiau, esant pH 7, 4. Norėdami ištirti galimą rūgšties ar tulžies poveikį galimo derinio metu, mes ištyrėme gydymą rūgštimi, po kurios seka tulžis (A → B), tulžis, po kurios seka rūgštis (B → A) arba rūgštis, po kurios seka rūgštis (A → A), su PBS. plauti tarp procedūrų. Ląstelės buvo papildytos kultūrine terpe ir eksperimento metu buvo leistos augti inkubatoriuje esant 37 ° C ir 5% CO 2 .

Antikūnai

Pagrindiniai naudojami antikūnai buvo pelių monokloniniai antikūnai - mAbDas-1 (IgM izotipas), sukurti mūsų laboratorijoje prieš žmogaus storosios žarnos epitelio baltymą CEP. 29, 31 „Cox-2“ monokloninis antikūnas (IgG izotipas) buvo gautas iš „Cayman Chemicals“ (Ann Arbor, MI, JAV). Monokloniniai antikūnai prieš CK8 / 18 (IgG klonas M20) ir CK4 (IgG) buvo gauti iš „Abcam“ (Kembridžas, MA, JAV), o p75NTR antikūnai (IgG) buvo gauti iš „Novus Biologicals“ (Littleton, CO, JAV). Anti-aktino IgG (klonas AC-40) buvo gautas iš „Sigma“. Isotipui būdingas pelių IgM, IgG (MOPC-IgM ir IgG), biotiniluotas triušių antivirusinis IgM ir streptavidino peroksidazės rinkinys buvo gauti iš „Dako Corp.“ (Carpinteria, CA, JAV). Karbocianino fluoroforo 2-konjuguotas ožkų antivirusinis IgG ir fikoeritrinu (PE) konjuguotas ožkos antivirusinis pelės IgM (antriniai antikūnai) buvo gauti iš „Jackson Immunologicals“ (Westgrove, PA, JAV). Kolokalizacijos eksperimentams buvo naudojamas PE-IgM mAbDas-1 ir CY2-IgG CK8 / 18. Imunogoldu (10 nm) pažymėtas antrinis IgM buvo gautas iš Electronmicroscopy Sciences (Fort Vašingtonas, PA, JAV).

Fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas

Ląstelių, ekspresuojančių įvairius žymenis turinčius baltymus, skaičiui nustatyti buvo naudojamas fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas (FACS). Ląstelės buvo fiksuotos ir permirkytos Cytofix / Cytoperm reagentu (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, JAV) 20 minučių 4 ° C temperatūroje. Po fiksavimo ląstelės buvo du kartus plaunamos PBS. Maždaug 0, 5 × 106 ląstelių reakcijos buferyje (1% ožkos serumo, 2 mM EDTA PBS) buvo inkubuojami 1 valandą arba per naktį 4 ° C temperatūroje su pirminiais antikūnais. Ląstelės buvo du kartus praplaunamos 30 tūrių FACS plovimo buferio (0, 5% BSA, 2 mM EDTA ir 0, 005% NaN3 PBS) ir inkubuojamos su atitinkamais fluorescencija pažymėtais antriniais antikūnais 45 minutes kambario temperatūroje. Po paskutinio skalavimo ląstelės buvo tiriamos citometru „Cytomics FC500“. Kadangi ląstelės buvo dažytos įvairaus intensyvumo ir nebuvo ryškių aštrių smailių, teigiamų ląstelių skaičius buvo apskaičiuotas naudojant Overtono kaupiamosios histogramos atimties metodą. 55

CEP imunocitocheminis lokalizavimas BAR-T ląstelėse

  1. Imunoperoksidazės dažymas: Imuniniam dažymui BAR-T ląstelių citospininis preparatas buvo fiksuotas ir dažomas anksčiau aprašytu metodu. 29, 32 Trumpai tariant, ląstelės buvo inkubuotos 1:20 skiedžiant mAbDas-1 per naktį 4 ° C temperatūroje, po to 1 val. Su biotinu konjuguotu triušio antivirusiniu pelių antriniu IgM (1:50) 1 valandą, naudojant fermento avidino – biotino reagentą. 30 min., Galiausiai su peroksidazės substratu spalvai sukurti.

  2. Imunofluorescencinis dažymas: netiesioginis BAR-T ląstelių citospinų imuninis dažymas buvo atliktas naudojant tuos pačius reagentus ir metodą, kaip nurodyta FACS tyrime. Nedažyti stikleliai buvo žiūrėti naudojant Zeiss fluorescencinį mikroskopą, kurio dydis buvo 20, naudojant tinkamus filtrus.

  3. Elektronų mikroskopija: tikslesnė CEP lokalizacija buvo atlikta elektroniniu mikroskopu (EM), naudojant imunogoldo žymėjimo techniką. Paciento, sergančio BE, biopsijos audinys buvo fiksuotas ir įterptas į histogelį (ruošiant 5–6 μm pjūvius). Audinių pjūviai buvo inkubuojami su mAbDas-1 (1:20) per naktį, o po to su imunogolidu pažymėtu antriniu antikūnu (1: 5) per naktį. Po to audinys buvo paruoštas laikantis standartinės EM metodikos.

Vakarų botas

Bendras baltymas iš BAR-T ir storosios žarnos vėžio ląstelių LS180 buvo gautas taip. Ląstelės buvo homogenizuotos lizės buferyje (200 mM HEPES, 5 mM KCl, 0, 5 mM MgCl2, EDTA 0, 1 mM, SDS 0, 1% ir proteazės inhibitoriaus kokteilis (Sigma)), centrifuguotos ir supernatantas surinktas. Buvo išmatuotas bendras baltymo kiekis ir 10 μg bendro baltymo išsiskyrė atliekant 10% SDS-PAGE gelio elektroforezę. 31, 56, pernešę baltymus į nitroceliuliozės membraną per naktį, blotai buvo užblokuoti 1% neriebaus pieno ir po to inkubuojami su pirminiu antikūnu mAbDas-1 per naktį 4 ° C temperatūroje. Membrana buvo inkubuota su biotiniluotu antriniu antikūnu 1 valandą, o chemiliuminescencijos reakcija (Perkin Elmer Chemiluminescence kit) buvo atlikta pagal gamintojo protokolą. Autoradiografai buvo sukurti po 5–15 min. Tie patys blotai buvo inkubuojami ir su anti-aktino antikūnais kaip baltymų įkrovos kontrolė.

Platinimo tyrimas

Ląstelių proliferacija buvo išmatuota naudojant 5-brom 2'deoksiuridino (BrdU) įterpimo kolorimetrinį tyrimą (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, JAV). Maždaug 0, 1x104 ląstelių iš kiekvienos grupės buvo pasodintos į 96 šulinėlių plokštelę trimis egzemplioriais; po apdorojimo rūgštimi ir (arba) tulžies druska 24 valandas, 2 valandas pridedama BrdU. Po to ląstelės 30 min buvo fiksuotos 15–25 ° C temperatūroje, į kiekvieną duobutę buvo pridedama 100 μl anti-BrDU POD konjuguoto antikūno (praskiesto santykiu 1: 100) ir inkubuojama 90 min tamsoje, kambario temperatūroje. Po šulinėlių tris kartus praplaunant plovimo buferiu, kiekviename šulinyje buvo pridėta 100 μl substrato tirpalo ir inkubuota 15–25 ° C temperatūroje 5–30 min. Absorbcija buvo nuskaityta naudojant „Molecular Devices“ kinetinių plokštelių skaitytuvą, esant 450 nm bangos ilgiui.

Statistinė analizė

Visoms statistinėms analizėms buvo naudojama „GraphPad Instat3“ programinė įranga (San Diegas, CA, JAV). Atliekant dispersijos analizę, Tukey atliko daugybinių palyginimų testą, kad nustatytų gautų duomenų reikšmingumą, žymimą * ( P <0, 05) arba ** ( P <0, 01) palyginant neapdorotas kontrolines ir eksperimentines ar apdorotas grupes ir § ( P < 0, 05) palyginimui tik su rūgštimi ar tik tulžimi apdorotomis grupėmis. Stulpeliai žymi ± sem

REZULTATAI

Telomerazės būdu nemirtinga gerybinė Barrett'o ląstelių linija yra nevienalytis ląstelių mišinys, išreiškiantis stulpelių, storosios žarnos ir plačiakampių epitelinių ląstelių fenotipus

Daugumoje ląstelių buvo stebimas silpnas CK8 / 18 ir mAbDas-1 dažymas. Kiekybiškai įvertinus bent šešis eksperimentus 55, pastebėta, kad maždaug 32 ± 3, 5% BAR-T ląstelių turėjo storosios žarnos fenotipą (mAbDas-1 teigiami) ir 35 ± 5, 2% išreiškė stulpelinį žymeklį CK8 / 18. Tik 9, 5 ± 3% ląstelių buvo teigiamos dėl plazminių ląstelių žymens CK4, o labai maža ląstelių populiacija (4 ± 2, 5%), nuspalvinta p75NTR, apie kurią pranešta kaip apie stemplės pirmtakų ląstelių žymeklį. 53, 54 mAbDas-1 dažymas imunoperoksidazės (1ai pav.) Parodė silpną difuzinį citoplazmos dažymą, padidėjusį dažymą ląstelių periferijoje, o tai daugiau akivaizdu atliekant imunofluorescencijos tyrimą (1b paveikslas). 1aii parodyta pelės IgM izotipo kontrolė imunoperoksidazės tyrimui. MAbDas-1 reaktyvumo imunologinis lokalizavimas elektroniniu mikroskopu BE biopsijos audinyje (1c pav.) Dar patvirtino padidėjusią CEP ekspresiją link ląstelės membranos. BAR-T ląstelių ir storosios žarnos vėžio ląstelių LS180 ląstelių lizato Western blot analizė (kaip teigiama kontrolė) parodė atskirą aukštos molekulinės masės baltymą (CEP)> 200 kDa (1d pav.). Storosios žarnos ląstelės, kuriose iš pradžių buvo nustatytas CEP, turi daug didesnę baltymo ekspresiją nei BAR-T ląstelės.

Image

Imuninis Bar-T ląstelių padengimas. ( a ) (i) dažymas mAbDas-1 peroksidaze. (ii) MOPC IgM kontrolė. ( b ) mAbDas-1 fluorescencinis dažymas. c ) Imunologinis CEP lokalizavimas Barretto epiteliniame audinyje. d ) BAR-T ląstelių ir LS180 storosios žarnos vėžio ląstelių Western blot analizė.

Visas dydis

Dviejų spalvų FACS analizė parodė, kad beveik visos mAbDas-1 teigiamos ląstelės taip pat buvo dažytos CK8 / 18 (2ai – iii pav.). 2 pav. Parodytas dvigubo dažymo fluorescenciniu mikroskopu vaizdas, skirtas CEP ir CK8 / 18 koekspressijai. CK4 teigiamos ląstelės nedažė CEP (duomenys nepateikti).

Image

a ) Dvispalvis imunofluorescencijos tyrimas. b ) Rūgšties ir tulžies poveikis Cox-2 (viršutinė panelė) ir CEP (apatinė panelė) ekspresijai BAR-T ląstelėse. (i) ir (ii) rodo vienos spalvos dažymą atitinkamai CEP ir CK8 / 18, (iii) ir (iv) rodo dvigubą spalvų kolokalizaciją atitinkamai FACS analizės ir imunofluorescencinės mikroskopijos būdu.

Visas dydis

Vienkartinio rūgšties ir tulžies poveikio CEP ir CK8 / 18 raiškai

Daugybė ekspozicijų tą pačią dieną lėmė didelę ląstelių žūtį (> 80%) dėl membranos suskaidymo, todėl tolesnė šių ląstelių analizė nebuvo atlikta. Kai BAR-T ląstelės kasdien buvo apdorojamos rūgštimi ir (arba) tulžimi 5 minutes (tik kartą per dieną), po 1 savaitės buvo pastebėtas laipsniškas CEP ekspresijos padidėjimas. Indukcija tęsėsi antrą savaitę ir trečią savaitę pasiekė plokščiakalnį, kuris tęsėsi iki 6 savaičių (maksimali eksperimentų trukmė). Po 2 gydymo savaičių vien rūgštis sukėlė CEP ekspresiją iki 1, 55 karto ( P <0, 05) ir tulžį esant pH 7, 4, taip pat esant pH 6–1, 4 karto ( P <0, 05), palyginti su tokios pačios trukmės negydytomis ląstelėmis. . Tačiau gydymas tulžimi, esant 4 pH, CEP teigiamų ląstelių padidėjo 2, 1 karto ( P <0, 01), palyginti su negydytomis ląstelėmis, augančiomis 2 savaites (3 paveikslas). Padidėjusi CEP išraiška, stebima FACS (Overtono metodas), parodyta 2b paveiksle (apatinė plokštė).

Image

Tęstinio BAR-T ląstelių apdorojimo rūgštimi ir tulžimi poveikis CEP ekspresijai.

Visas dydis

Tulžimi apdorotos ląstelės, kurių pH 4, taip pat parodė CK8 / 18 baltymo ekspresijos indukciją per 2 savaites iki 1, 62 karto ( P <0, 01) (1 lentelė). Tik rūgštimi gydyta grupė per 2 savaites išreiškė 1, 37 karto ( P <0, 05) didesnį CK8 / 18 baltymą, palyginti su negydytomis ląstelėmis, o tulžis, kurio pH 7, 4, nepakeitė CK8 / 18 ekspresijos. Ląstelių kiekybinis vienalyčio CEP arba CK8 / 18 ekspresijos tyrimas, taip pat CEP ir CK8 / 18 ekspressija tose pačiose ląstelėse atliekant dviejų spalvų baltymų lokalizacijos FACS analizę po įvairių gydymo būdų, parodyta 1 lentelėje. Padidėjusi baltymų ekspresija tiek baltymai, CEP, tiek CK8 / 18, buvo akivaizdūs rūgšties pH 4 ir tulžies pH 4 apdorotose ląstelėse.

Pilno dydžio lentelė

Šie stebėjimai rodo, kad ląstelės, ekspresuojančios stulpelinius ir storosios žarnos fenotipo žymenis, dažniausiai buvo sukeltos reaguojant į rūgšties ar tulžies druskos gydymą, nes ląstelių, ekspresuojančių CK4 baltymą, skaičius nepakito. Apdorojimas tiek rūgšties, tiek tulžies druska gali atskirai sukelti panašius pokyčius storosios žarnos ir stulpelio fenotipo žymenų ekspresijoje BAR-T ląstelėse. Tačiau tulžies druska rūgščiame pH 4 buvo veiksmingesnė, palyginti su atskirai ( § P <0, 05) (1 lentelė).

Pakartotinio gydymo rūgštimi ar tulžimi druska poveikis

Norėdami ištirti nuoseklųjį rūgštingumo ir tulžies druskos poveikį, BAR-T ląstelės buvo veikiamos rūgštiniu pH 4 5 minutes, po to pakartotinai veikdamos tuo pačiu (A → A) kiekvieną dieną 2 savaites, kurios paskatino CEP ekspresiją 1, 7 karto. ( P <0, 05), palyginti su negydytomis ląstelėmis. Panašus 2 savaičių gydymas tulžimi esant pH 7, 4, pradėjus gruntuoti rūgštimi (pH 4) (A → B), padidino CEP išraišką 1, 96 karto ( P <0, 05), o trečioji grupė - rūgštimi (pH 4) po tulžies esant neutraliam pH. pradėjimas (B → A) indukuoja CEP iki 2, 4 karto ( P <0, 01), palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis. B → A taip pat buvo reikšmingesnis ( § P <0, 05) nei vien rūgštis arba tulžis, sukeldami CEP ekspresiją (4 paveikslas).

Image

Tolesnis BAR-T ląstelių gydymas rūgštimi ar tulžimi 2 savaites iš eilės CEP ekspresijai. * P <0, 05 arba ** P <0, 01 palyginimui tarp neapdorotos kontrolinės ir eksperimentinės ar gydytų grupių ir § P <0, 05 palyginimui tarp gydomų grupių.

Visas dydis

Rūgšties ir tulžies poveikis Cox-2 ekspresijai BAR-T ląstelėse

Dvidešimt trys ± 1, 2% BAR-T ląstelių buvo nudažytos Cox-2 baltymo ekspresijai kontroliuojamoje negydytoje būsenoje. Skirtingai nuo kitų baltymų, Cox-2 buvo indukuotas ankstyvą pirmąją gydymo savaitę, vien tik rūgštis (pH 4) padidėjo 1, 4 karto, o tulžies - 1, 5 karto, esant pH 4, palyginti su tokios pačios trukmės negydytomis ląstelėmis. Antrąją savaitę jis padidėjo iki 1, 75 karto ( P <0, 05) vienkartine rūgštimi ir dvigubai ( P <0, 01) tulžimi esant pH 4, palyginti su negydytomis kontrolinėmis ląstelėmis. Atsakas į gydymą tulžies druska esant 7, 4 pH ir 6 buvo minimalus iki 2 savaičių, kai padidėjo iki 1, 54 karto ( P <0, 05), palyginti su neapdorotomis ląstelėmis (5 paveikslas). Tipinė FACS padidėjimo srauto schema parodyta 2b paveiksle (viršutinė plokštė). Šis padidėjęs Cox-2 lygis buvo palaikomas ilgiau nei 3 savaites, su nedideliais pokyčiais iki 6 savaičių. Dvigubos spalvos imunofluorescencija parodė, kad 12 ± 2% visų (negydytų) Cox-2 teigiamų ląstelių buvo CEP ir (arba) CK8 / 18 teigiamos. Po 2 savaičių stimuliavimo rūgštimi ir (arba) tulžimi, Cox-2 ekspresija CEP ir (arba) CK8 / 18 ekspresuojančiose ląstelėse (pagrindinėje ląstelių populiacijoje) buvo padvigubinta. Tačiau Cox-2 ekspresija CEP ir / CK8 / 18 neigiamose ląstelėse taip pat padidėjo maždaug 1, 5 karto (1 lentelė).

Image

Tęstinio BAR-T ląstelių gydymo rūgštimi ir tulžimi poveikis Cox2 ekspresijai.

Visas dydis

Platinimo tyrimas

Atsižvelgiant į tai, kad BrDU įsiskverbimas į neapdorotą kontrolinę grupę yra 100, apdorotų grupių pokyčiai yra rūgšties pH 4, 97 ± 12; tulžies pH 7, 4, 98 ± 10; A + B pH 4, 90 ± 10; ir A + B pH 6, 105 ± 5. Todėl gydymas rūgštimi ir (arba) tulžies druska 2 savaites nepakeitė BAR-T ląstelių proliferacijos.

DISKUSIJA

Žarnyno metaplaziją stemplėje ir skrandyje galima suskirstyti į pilną arba plonąjį žarnyną ir neišsamų ar storosios žarnos fenotipą remiantis fermentų tyrimais ir glikoproteinų skirtumu žąsies ląstelėse. 57, 58, 59, 60 Atrodo, kad neišsamus ar storosios žarnos fenotipas turi didžiausią priešneoplastinį potencialą. Pranešama, kad gaubtinės žarnos tipo metaplazija, kurią nustatė mAbDas-1, buvo susijusi su skrandžio, 62 plonosiomis žarnyno 63 ir šlapimo pūslės karcinoma. 64, 65 Devyniasdešimt trys procentai skrandžio žarnyno metaplazijos, reaguojančios į mAbDas-1 (storosios žarnos fenotipas), buvo susiję su skrandžio vėžiu. 61, 62 Šios išvados patvirtina mAbDas-1 antikūnų, kaip preneoplastinių žymenų, turinčių piktybinį potencialą turinčių ląstelių storosios žarnos fenotipą, galimybes. Šis tyrimas rodo, kad rūgšties ir tulžies druskos poveikis per ilgesnį, mažiausiai 2 savaičių laikotarpį, gali sukelti palaipsnį storosios žarnos fenotipo žymens (mAbDas-1) padidėjimą stulpelio tipo ląstelėse (CK8 / 18-teigiamas) nevienalytėje Bareto ląstelėje. linija. Šis fenotipo žymenų pokytis nebuvo susijęs su jokiu proliferacijos pokyčiu, nors Cox-2 buvo reikšmingai sukeltas.

Ir rūgštis, ir tulžies druska atskirai galėjo sukelti laipsnišką storosios žarnos fenotipo ląstelių skaičiaus padidėjimą tęsiant 2 savaites. Įdomu tai, kad aiškiausia mAbDas-1 teigiamų ląstelių indukcija buvo pastebėta su tulžimi esant pH 4, taip pat tada, kai rūgštis veikiama netrukus po tulžies neutraliame pH (B → A). Pastarosios išvados pateikia klinikinio stebėjimo eksperimentinius įrodymus, kad sergantiems BE sergantiems GERL pacientams pastebimai padidėja tulžies druskos regurgitacija. 2 Visi šie teiginiai rodo, kad tulžies druskos poveikis in vivo kartu su rūgštimi daro žalingą poveikį. Ląstelių kultūros eksperimentuose nutraukus gydymą rūgštimis ir tulžies druska po 2 savaičių, kai buvo nustatyta maksimali mAbDas-1 teigiama ląstelė, atsirado CEP regresija. Tačiau pakartotinis rūgšties ir tulžies druskos poveikis greitai inicijavo CEP ekspresiją per 5 dienas, daug anksčiau nei ląstelės, kurios pirmą kartą veikiamos rūgštimi ir tulžimi (neskelbti duomenys). Tai gali suteikti papildomų eksperimentinių įrodymų, kad būtinas nuolatinis rūgščių slopinimas. Pranešama, kad pacientams, kuriems yra displazija BE, protonų siurblio inhibitorių terapija rodo, kad displazijos procesas pasikeitė; 66, 67, 68, tačiau nežinoma, ar pažeidimai pasikartos, nutraukus tokį gydymą.

Pranešama, kad BAR-T ląstelių linija yra nevienalytis skirtingų fenotipų 52 ir (arba) ląstelių, esančių skirtinguose diferenciacijos etapuose, mišinys. Mes stebėjome, kaip padidėja CK8 / 18 ekspresija BAR-T ląstelių linijoje, reaguojant su tulžimi esant pH 4, palyginti su atskirai rūgštimi ar tulžies druska, esant neutraliam pH. Citokeratinus sudaro tarpinis gijų tinklas, laikomas gana statiška struktūra, atsakinga už ląstelių mechaninį stabilumą. Pelių kepenų pažeidimo modelyje buvo pranešta apie CK8 / 18 svarbą palaikant nemechanines funkcijas, tokias kaip ląstelių funkcinis vientisumas ir apsauga nuo toksinio sužalojimo, kaip ir esant lėtinei cholestazei, atspindinčiai ląstelių streso reakciją. 69, 70 CK8 / 18 baltymo nereglamentavimas mūsų eksperimentiniame modelyje rodo panašaus apsauginio reiškinio galimybę Barrett stemplės ląstelėse, reaguojant į rūgščių ir tulžies sukeltą toksiškumą. Tolesnis tyrimas dėl koreliacijos tarp CK8 / 18 padidėjimo ir stemplės pažeidimo gali paaiškinti stulpelio metaplazijos atsiradimą distaliniame stemplėje, kaip pastebėta BE.

Kolokalizuota CK8 / 18 ir CEP parodė, kad dauguma stulpelių ląstelių turėjo storosios žarnos fenotipą. Tačiau po gydymo, ypač tulžimi esant 4 pH, storosios žarnos fenotipą ekspresuojančių ląstelių skaičius buvo didesnis nei tų, kurios ekspresuoja CK8 / 18 fenotipą, ir tai rodo CEP ekspresiją nedideliame ląstelių, neigiamų CK8 / 18, procente, taip pat CK4. Nežinoma, ar šios CK8 / 18-neigiamos, bet CEP-teigiamos ląstelės atsirado iš pirmtakų, kaip rūgščių ir tulžies druskos gydymo rezultatas. Panašių kolokacijos tyrimų su labai mažu tokių ląstelių skaičiumi nebuvo galima atlikti su p75NTR teigiama populiacija. Tolesnis p75NTR pirmtakų praturtinimas yra būtinas, kad būtų galima galutinai įvertinti šių ląstelių indėlį diferencijuojant bet kurį specifinį fenotipą. Anksčiau mes pranešėme apie mAbDas-1 reaktyvumą kepenų progenitorių ląstelėse. 71 Šiame tyrime mes taip pat parodėme, kad vaisiaus stemplės gleivinė reaguoja su mAbDas-1, bet ne su suaugusiųjų stemplė. Taigi, mAbDas-1 reaktyvumas vaisiaus stemplės gleivinėje, jo praradimas normaliame suaugusiojo stemplėje ir aktyvumo atsinaujinimas BE, taip pat stemplės adenokarcinomoje gali būti svarbus užuomina apie BE giminės analizę. Būsimas tyrimas, kuriame bus panaudota P75NTR praturtintų ląstelių populiacija, išskaidžius jų diferenciaciją reaguojant į rūgštį ir (arba) tulžį, gali suteikti svarbios informacijos apie BE kilmę.

Savo tyrime stebėjome Cox-2 ekspresijos indukciją tiek storosios žarnos, stulpelio, tiek ne koloninės / ne koloninės ląstelių populiacijose, kurių fenotipas nežinomas, reaguojant į rūgščių ir (arba) tulžies gydymą. Tačiau atliekant bet kurį gydymą, reikšmingo CK4 ląstelių fenotipo indukcijos nebuvo. Nustatyta, kad normalus stemplės, 24 BE, 20, taip pat stemplės adenokarcinomos ląstelėse padidėjęs Cox-2 reguliavimas, reaguojant į ūminį rūgščių ir tulžies druskos gydymą. Siekiant geresnių Barretto karcinomų prognostinių rezultatų, buvo pasiūlyta 21 Cox-2 slopinimo terapija. Cox-2 reguliavimas buvo susijęs su padidėjusiu proliferacija, suaktyvėjusia MAPK keliais, dėl rūgščių ir tulžies druskos poveikio SEG-1 ląstelėms. 22, 23 Tokio proliferacijos nepolastinėse BAR-T ląstelėse nepastebėta. Šie skirtumai gali atsirasti dėl eksperimentuose naudojamų ląstelių linijų skirtumų (vėžio ląstelių linija SEG-1 prieš gerybines Barrett'o ląsteles) arba dėl įprastų 5% serumo pakeistų terpių naudojimo mūsų eksperimentuose siekiant išlaikyti ilgalaikes kultūras palyginti su serumu - nebenaudotos ląstelės, kurias tyrėjai panaudojo vienkartiniam gydymui.

Apibendrinant galima pasakyti, kad neneoplastinę Barrett ląstelių liniją (BAR-T), kurią sudaro tiek plokščiosios (CK4), tiek metaplastinės / stulpelinės ląstelės (villino ir alciano mėlynai teigiami), 52 parodome selektyvų CK8 / 18 padidėjimą. tipo stulpelio ląstelės, storosios žarnos fenotipas (teigiamas mAbDas-1) ir Cox-2 ekspresija po lėtinio (iki 6 savaičių) pakartotinio poveikio rūgščių ir tulžies druska. Buvo nustatyta, kad tulžis ir rūgštis kartu (A + B pH 4) yra stipresni nei atskirai. Tačiau vien rūgšties poveikis iškart po tulžies paruošimo taip pat buvo stiprus storosios žarnos fenotipo stimuliatorius. Kadangi įrodyta, kad mAbDas-1 reaktyvumas yra stipriai susijęs su priešvėžinėmis ligomis ir stemplės, skrandžio ir plonosios žarnos adenokarcinoma, šio fenotipo indukcija Barrett ląstelių linijoje gali būti eksperimentinis modelis, leidžiantis geriau suprasti Barrett'o metaplazijos patogenezę → displazija → stemplės adenokarcinoma.