Apdorojimo signalizacijos kelio perprogramavimas su neapdorota citrina ir saldžiu apelsinu yra kritinis ankstyvojo reagavimo į „candidatus liberibacter asiaticus“ elementas | sodininkystės tyrimai

Apdorojimo signalizacijos kelio perprogramavimas su neapdorota citrina ir saldžiu apelsinu yra kritinis ankstyvojo reagavimo į „candidatus liberibacter asiaticus“ elementas | sodininkystės tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Genų ekspresijos profiliavimas
  • Augalų veisimas

Anotacija

Citrusinių vaisių, užkrėstų Candidatus Liberibacter asiaticus ( C Las), užkrėtimas huanglongbingu (HLB) padarė didžiulius nuostolius citrusinių vaisių pramonėje. Citrusinių rūšių ar artimų giminaičių atsparių genotipų nenustatyta. Tarp citrusinių veislių šiurkščioji citrina ( Citrus jambhiri ) buvo laikoma tolerantiška dėl savo sugebėjimo po užkrėtimo suteikti sveiką naujo augimo pylimą . Skirtumas tarp tolerancijos ir jautrumo dažnai nustatomas atsižvelgiant į augalo reakcijos į patogeną greitį ir intensyvumą, ypač ankstyvąsias gynybos reakcijas. RNR-seq duomenys buvo surinkti iš trijų biologinių C Las ir pakartotinai užkrėstų neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų replikų 0 ir 7 savaitę po užkrėtimo. Skirtingai išreikštų genų (DEG) funkcinė analizė parodė, kad mitogeno aktyvintos baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos kelyje dalyvaujantys genai buvo labai sureguliuoti neapdorotoje citrinoje. MAPK skatina WRKY ir kitų transkripcijos veiksnių, galinčių įjungti kelis su gynyba susijusius genus, transkripciją. Potinklinio tinklo praturtinimo analizė papildomai atskleidė skirtingus kelių funkcinių kategorijų reguliavimo modelius, ir tai rodo, kad DEG, turinčios skirtingas funkcijas, buvo perprogramuojamos. Apskritai su gynyba susijusių genų ekspresijos amplitudė yra daug didesnė neapdorotoje citrinoje nei saldiklyje. Kiekybinis atsparumo ligoms atsakas gali prisidėti prie ilgalaikio HLB toleravimo lygio, stebimo neapdorotoje citrinoje.

Įvadas

Huanglongbingas (HLB) arba citrusinių vaisių žalinimas yra viena iš labiausiai naikinamų augalų ligų pasaulyje. 1 Ligą sukelia bakterija Candidatus Liberibacter asiaticus ( C Las), kurioje gyvena floemai, α-proteobakterijos, ir ją platina vabzdžių pernešėjas Azijos citrusinių vaisių psichozė ( Diaphorina citri ). 2 Paprastai pripažįstama, kad po užkrėtimo ar pasėjimo CLas bakterijos migruoja per filemą ir ten kaupiasi, todėl susidaro sieto kamščiai, kurie prisideda prie HLB simptomų. 3 Kadangi C Las genome nenustatyta toksinų, ląstelių sienelę ardančių fermentų ar specializuotų sekrecijos sistemų, manoma, kad ligos simptomai yra dėl šeimininkų metabolizmo pusiausvyros sutrikimo, kurį sukelia maistinių medžiagų išeikvojimas ar trukdymas maitintis. 4 Santykį tarp augalų šeimininkų ir su jais susijusių mikrobų iš esmės lemia augalų įgimta imuniteto sistema. Augalai išsivystė dviem imuninės sistemos sluoksniais: su patogenais susijusių (arba su mikrobais susijusių) molekulinių modelių (PAMP) - suaktyvėjusio imuniteto (PTI) ir efektoriaus sukelto imuniteto. PTI tarpininkauja modelio atpažinimo receptoriai (PRR), atpažįstantys PAMP, tuo tarpu efektoriaus sukeltą imunitetą tarpininkauja atsparumo (R) baltymai, atpažįstantys patogeno efektorius. 5 Šių imunitetų sistemų vaidmuo sergant citrusinių žaliuojančia liga ir citrusinių augalų transkriptiniu atsaku mažai suprantamas, ypač atsižvelgiant į ankstyvą grubios citrinos reakciją į HLB infekciją.

Citrusinių rūšių ar artimai susijusių giminaičių HLB atsparumo šaltinio nenustatyta. Folimonova ir kt. 6 klasifikavo 30 citrusinių genotipų atsaką į HLB nuo jautraus iki tolerantiško. Jie klasifikavo „Eureka“ citriną ir persų kalkes kaip tolerantiškas, turinčias mažai HLB simptomų arba jų visai neturinčius, o ryški bakterijų titro ir ligos sunkumo sąsaja nebuvo nustatyta. Zhang ir kt. 7 taip pat pranešė, kad HLB paveiktos citrinos skiltelės turėjo didesnį C Las titrą, išgyvenamumą ir patogeno perdavimo greitį nei pummelo ( Citrus maxima ) skiltelės. Citrusinis limonas Burmas. F., kurį reprezentuoja „tikrosios“ citrinos, tokios kaip „Eureka“, turi trijų rūšių ( C. maxima , C. reticulata ir C. medica ) genomo indėlį ir skiriasi nuo šiurkščios citrinos, nors yra giminingos. Ankstesnis mūsų tyrimas taip pat parodė, kad šiurkšti citrina toleruoja HLB. 9 Kai neapdoroti citrinmedžiai užkrėsti ir simptomiški, juos galima atgaivinti toliau augant naujiems ūgliams, kurių ligos simptomai yra mažai ar visai nėra, ir jie pakartoja šį ciklą daugelį augimo sezonų. Priešingai, saldusis apelsinas nuolat slopina augimą ir galutinai sumažėja. 9

Suprasti tolerantiškų ir jautrių citrusinių vaisių genotipų reakcijų į HLB skirtumus yra būtina kuriant genetines strategijas, kurios gali sukelti tolerantiškas, o gal net atsparias veisles. Dauguma citrusinių vaisių ir citrusinių vaisių sąveikos su transkriptiniais tyrimais atlikta su skirtingais saldžiųjų apelsinų, 10, 11, 12, 13 ir mandarino šaknų audiniais (lapais, vaisiais ir šaknimis); 14, o tik dviejuose tyrimuose buvo atkreiptas dėmesys į tolerantiškų neapdorotų citrinų 9 ir US-897 genotipų lapus. 10 US-897 yra tarpgenerinis Citrus spp. Hibridas. ir Poncirus spp., ir gali nesuteikti visiško supratimo apie HLB atsaką citrusinių vaisių veislėse. 9 Naudoti palyginamąjį metodą augalų ir mikrobų sąveikai suprasti gali būti sudėtinga, nes tolerantiškų genotipų kandidatų genų reakcija ir poveikis gali skirtis jautrių medžių genetiniame fone dėl epistazės. Ankstesni tyrimai parodė, kad atsparumas ir jautrumas dažnai gali priklausyti nuo naudojamo gynybos mechanizmo greičio ir dydžio bei patogeno gebėjimo slopinti šeimininko reakciją. 4, 15, 16 Buvo pranešta, kad saldžiųjų apelsinų užkrėtimas C Las nesukelia reikšmingo su gynyba susijusių genų indukcijos ankstyvosiose infekcijos proceso stadijose. 10, 11 Todėl svarbu sužinoti, ar HLB tolerantiška neapdorota citrina atpažįsta C Las buvimą ankstyvoje infekcijos stadijoje ir ar yra gynybinis atsakas. Citrusinių medžių lapai lauke gali likti besimptomiai, o C Las titras atliekant atvirkštinės transkripcijos-kiekybinę PGR (RT-qPCR), gali likti nenustatomas net dvejus metus po pirminio C Las persodinimo psyllidide dėl būtinybės aukšto bakterijų titro aptikimui. Melagingi neigiami ir klaidingi teigiami reiškiniai yra paplitę dėl žemo bakterijų titro fonemoje, dėl PGR amplifikacijos inhibitorių buvimo filemoje ir dėl nespecifinio amplifikavimo. 18 C Las šiltnamio efektą sukeliančiuose augaluose gali būti neaptinkamas 5–9 savaites 10 arba 20 savaičių. 9 C Las infekcijos laiko tyrimo metu Fan ir kt. 9 žmonės pranešė, kad daugiau reagavimo į stresą genų yra skirtingai modifikuoti žalioje citrinoje nei saldoje apelsinoje. Tačiau tyrime ankstyvose infekcijos stadijose (5 savaites) nenustatyta jokių genų, turinčių reikšmingą klaidingų atradimų dažnį (FDR). Kitame tyrime nebuvo pastebėta jokios reikšmingos su gynyba susijusių genų indukcijos saldžiuose apelsinuose, pasėtuose C Las per 5–9 savaites 10 . Abiejuose minėtuose tyrimuose transkripcijos analizei buvo naudojamas Affymetrix citrusų mikrotraumas. Tačiau nežinoma, kiek unikalių citrusinių vaisių genų iš tikrųjų vaizduojami luste. Klaidinantis mikro matricos rezultatų aiškinimas taip pat gali atsirasti dėl nespecifinės hibridizacijos. 14 Tačiau naujos kartos RNR sekos nustatymo technologija gali atskleisti retus ir nežinomus nuorašus, tokiu būdu pateikiant tikslesnį ir tikslesnį transkripto vaizdą. 13, 19

Šiame tyrime 7 savaites po inokuliacijos buvo atlikta viso genomo neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų lapų transkripcijos analizė, siekiant nustatyti genus, kurie buvo suaktyvinti kaip ankstyvojo atsako į C Las dalį. Lapo mėginiai, surinkti iškart po inokuliacijos (0 savaitė), buvo naudojami kaip atskaitos taškas, o tai nebuvo padaryta ankstesniuose citrusinių augalų C Las transkripcijos tyrimuose. 4, 10, 11 Naudojant 0 savaitę kaip atskaitos tašką, būtų galima sumažinti natūralų biologinių replikacijų kitimą ir maksimaliai padidinti genų, kurių ekspresijai reikšmingą įtaką turėjo C Las, skaičių. Atskirai išanalizuotas paslėptos ir C Las inokuliuotos neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino atsakas, o vėliau buvo lyginami du duomenų rinkiniai, siekiant nustatyti biologinius mechanizmus, susijusius su kiekvienu genotipu ir infekcija, palyginti su apsimestine inokuliacija. Transkripto analizė nustatė statistiškai reikšmingus diferencijuotai išreikštus genus (DEG) tarp neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino, reaguojant į C Las. Pastebėtas ryškus citrinos ir saldaus apelsino gynybinio atsako skirtumas C Las-inokuliuotuose lapuose. Ne tik buvo nustatyti du skirtingi DEG rinkiniai, bet taip pat pastebėta didesnė gynybinio atsako genų profilio amplitudė neapdorotoje citrinoje, palyginti su saldžiu apelsinu. Šis tyrimas pateikia išsamią ankstyvojo transkripcijos perprogramavimo, kuris vyksta neapdorotoje citrinoje, reaguojant į C Las, apžvalgą.

Rezultatai

C Las aptikimas ir HLB simptomų vystymasis

Lapų mėginiai, surinkti 7 savaitę, nepasižymėjo būdingu dėmėtumu, o C- Las buvo neigiami RT-qPCR. Tęsiama C- Las RT-qPCR analizė buvo atlikta kas dvi savaites po pasėjimo. Teigiamas C Las patvirtinimas užkrėstuose augaluose nebuvo gautas su neapdorota citrina ir saldžiu apelsinu iki 23 savaičių po pasėjimo. Tačiau net po 8 mėnesių neapdorota citrina neparodė jokių augimo slopinimo požymių, todėl buvo stebimas tolesnis naujų ūglių augimas, turintis nedaug simptomų arba visai jų neturinčių; tačiau tipiškas dėmėtas dėmėtumas paprastai būdavo pastebimas ant subrendusių, senesnių lapų (1 paveikslas). Priešingai, subrendę ir senesni C Las-inokuliuotų saldžiųjų apelsinų lapai buvo pastebėti sunkios dėmės, o augimas buvo labai slopinamas, eksperimento pabaigoje retais atvejais išauginant naujus ūglius (1 paveikslas). Viso eksperimento metu C- Las nebuvo aptiktas RT-qPCR mėginiuose iš nė vienos iš paslėptos neapdorotos citrinos ar saldaus apelsino.

Lyginamoji RNR-seq analizė

Lyginant tolerantiškos rupios citrinos ir jautraus saldaus apelsino RNR-seq duomenis, buvo imtasi naudojant 7 savaitę surinktus mėginius. 0-ą savaitę gauti RNR-seq duomenys buvo naudojami kaip atskaitos taškas. Iš viso buvo seka 24 cDNR bibliotekos (2 apdorojimai × 2 veislės × 3 replikacijos × 2 laiko taškai), sukuriantys 1274.9 mln. Skaitymų ir 740.4 mln. Unikalių skaitymų (papildomoji byla 1, papildoma S1 lentelė). Skaitymai buvo nukirpti ir suderinti su Citrus Clementina genomu, kurį galima rasti „Phytozome“ svetainėje (//www.phytozome.net). Išreikšti genai ir transkripto izoformos buvo identifikuoti ir komentuoti naudojant C. Clementina genomo v.1 rinkinį, susidedantį iš 301, 4 Mb, paskirstyto per 1398 pastolius. RNR seq analizė buvo atlikta nepriklausomai, naudojant poros palyginimą tarp 7 savaitės ir pradinės 0 savaitės, į kurią buvo pasėjama ir užkrėstos neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino, naudojant DEseq kiekvienam gydymui. 22

Iš viso buvo identifikuoti ir išmatuoti 33 930 unikalių nuorašų, tačiau 1884 genai neturėjo jokių atitinkamų Arabidopsis ortologų (2 papildoma byla, papildoma S1 lentelė). Dėl genų, kurie atitinka vieną Arabidopsis identifikatorių, dubliavimosi, buvo gauti tik 14 393 Arabidopsis identifikatoriai. Iš viso 3266 DEG buvo nustatyti kombinuotoje užkrėstoje ir pasėlyje užkrėstoje neapdorotoje citrinoje ir saldiklyje, palyginus 7 ir 0 savaites (2 papildoma byla, papildoma S2 lentelė). Tiksliau, 1518 ir 1129 DEG buvo nustatyti atitinkamai neapdorotos ir C Las inokuliuotos neapdorotos citrinos mėginiuose. Saldžiam apelsinui 1944 ir 2396 laipsniai buvo nustatyti atitinkamai imituotuose ir C Las inokuliuotuose mėginiuose. Tolesnė analizė parodė, kad 860 DEG sutampa tarp neapdorotos ir C Las inokuliuotos neapdorotos citrinos mėginių (2a paveikslas), tuo tarpu 1499 DEG sutampa tarp maketų ir C Las inokuliuotų saldžiųjų apelsinų mėginių (2b paveikslas). Iš viso buvo atrinkta 2024 DEG, kad būtų galima atlikti tolesnę funkcinę analizę, pašalinus modeliuotus ir C Las inokuliuotus persidengiančius genus (2 papildomas failas, papildoma S3 lentelė). Pašalinus iš dalies sutampančius genus, atitinkamai buvo gauti atitinkamai 658 ir 269 laipsniai neapdorotos citrinos mėginių ir C Las inokuliuotų mėginių mėginiuose ir 445 D ir 897 laipsnių mėginių ir C Las inokuliuotų saldžiųjų apelsinų mėginiuose ( 2 papildoma byla, papildoma S3 lentelė). Tarp 269 DEG, užkrėstų neapdorotų citrinų mėginių, 76 buvo sureguliuoti ⩾ 3 kartus (log2), sutrumpintai kaip log-fold change (LFC), tuo tarpu DEG su tokiu sumažėjusio reguliavimo laipsniu nebuvo pastebėta (3 paveikslas). C Las-inokuliuotuose saldžiųjų apelsinų pavyzdžiuose buvo 897 DEG, iš kurių 119 DEG buvo sureguliuojami ⩾ 3 LFC, o 11 DEG buvo padidinta gu 3 LFC sureguliuota tarp 445 DEG, identifikuotų make-inokuliuotuose mėginiuose. Genai, susiję su gynybiniu atsaku, tokie kaip MAPK signalizacijos kelyje, WRKY transkripcijos veiksniai ir kiti su patogeneze susiję genai buvo identifikuoti tarp labai išreikštų (⩾ 4 LFC) genų C Las-inokuliuotuose neapdorotos citrinos mėginiuose (lentelė) 1). Abiejų C Las inokuliuotų saldžiųjų apelsinų ir šiurkščiosios citrinos mėginiuose labai sureguliuoti genai buvo nereglamentuoti (3 paveikslas). Žemai sureguliuotų DEG skaičius buvo šiek tiek didesnis nei iš naujo sureguliuotų DEG DAL-inokuliuotuose saldžiųjų apelsinų pavyzdžiuose, tuo tarpu sureguliuotų DEG skaičius buvo daug didesnis nei C -Las inokuliuotų saldžiųjų apelsinų pavyzdžiuose sumažintų DEG skaičius. Iš viso C ir Las inokuliuotų neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų mėginiuose 29% ir 25% DEG buvo atitinkamai LFC ⩾ 3, tuo tarpu tik 1% DEG neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino pavyzdžiuose buvo paslėpti gauti LFC ⩾ 3. Šie rezultatai rodo, kad bendras genų transkripcijos lygis buvo didesnis C Las inokuliuotuose mėginiuose, nei makroinokuliuotuose neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino mėginiuose.

Image

Skirtingai išreikštų genų Venno diagramos maketuose ir C Las inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje ( a ) ir saldžiajame apelsine ( b ). Žymiai aukščiau sureguliuotų genų skaičius parodytas (pirmasis) raudonai, o žymiai sumažėjusių genų (antras) mėlynai.

Visas dydis

Image

Svarbių diferencijuotai išreikštų genų (DEG) pasiskirstymas: a ) C Las-inokuliuota neapdorota citrina; b ) į maketą užkrėstos neapdorotos citrinos; c ) C užkrėstas saldžiu apelsinu; d ) užkrėsta saldžia apelsinu.

Visas dydis

RT-qPCR buvo išanalizuoti 9 su gynybiniu atsaku susijusių genų ekspresijos lygiai, kad būtų patvirtinti RNR seq analizės rezultatai. Kaip parodyta 4 paveiksle, santykinis tirtų genų išraiškos lygis buvo vienodas tarp RT-qPCR ir RNR-seq duomenų, su keliomis išimtimis, tačiau klaidų diapazone, rodantis, kad RNR-seq duomenys buvo patikimi.

Image

Santykinė devynių diferencijuotų genų (DEG), susijusių su atsparumo ligai reakcija, nustatyta RT-qPCR. Pateikiamos standartinės klaidų juostos. ATL6 : ubiquitin -protein ligase ; DIC2 : 2 dikarboksilato nešiklis; T29M8.8 : į etileną reaguojantis transkripcijos faktorius; PUB22 : ubiquitin -protein ligase PUB22; CBF4 : DEHIDDRACIJA - RESPO ; Ciclev10023060m: hipotetinis baltymas; JAZ1 : JASMONATE-ZIM-DOMAIN PROTEINAS; MPK3 : MITOGENO AKTYVUS BALTASIS KINASAS 3; WRKY70 : WRKY transkripcijos koeficientas 70.

Visas dydis

Funkcinių kategorijų ir potinklinio tinklo praturtinimo analizė

Norint nustatyti specifinius C Las infekcijos paveiktus genų ontologijos (GO) terminus, buvo naudojamas Fišerio ekstrahavimo testas ir potinklinio tinklo praturtinimo analizė (SNEA), kaip pateikta „Blast2GO“ ir „Pathway Studio“ („Elsevier / Ariadne Genomics“). Remiantis Fišerio palyginimais poromis C Las-inokuliuotų ir inokuliuotų genų, palyginti su neapdorotais citrinų ir saldžiųjų apelsinų mėginiais, GO terminai, susiję su hormonais, gynybine reakcija, taip pat su stomataline ir fotosintetiniu aklimatizacija, buvo žymiai per dideli (3 papildomas failas)., Papildomos lentelės S1 ir S2). Saldus oranžinis buvo nustatytas tik 1 GO terminas (FDR ⩽ 0, 05), atsakas į chitiną, o neapdorotų citrinų mėginiuose - 19 GO terminų (2 lentelė). Trys pagrindiniai neapdorotos citrinos GO terminai buvo atsakas į chitino, etileno biosintetinį procesą ir kvėpavimo takų sprogojimą, susijusį su gynybine reakcija ir reakcija į bakterinės kilmės molekules (2 lentelė). Nors šiurkščioje citrinoje buvo nustatytas mažesnis DEG skaičius nei saldžiuose apelsinuose, daugiau gynybinio atsako GO buvo siejama su grubios citrinos transkriptiniu atsaku į C Las infekciją nei saldžiu apelsinu ir tai gali atspindėti „tolerancijos“ reakciją, pastebėtą grubioje citrinoje . Fišerio testo rezultatai parodė, kad „ATP surišimas“ buvo labiausiai praturtintas GO molekulinės funkcijos terminas neapdorotoje citrinoje, galbūt atspindint didelį genų, kuriems taikoma transkripcijos reguliacija, ankstyvą neapdorotos citrinos reakciją į C Las infekciją (papildomoji byla 3), Papildoma lentelė S1). Saldžiųjų apelsinų RNR-seq duomenyse statistiškai reikšmingų GO terminų molekulinių funkcijų kategorijoje nerasta (3 papildoma byla, papildoma S2 lentelė). Norėdamas išgauti reguliavimo tinklus, SNEA naudoja visuotinį išraiškos reguliavimo tinklą, ištrauktą iš visos „PubMed“ duomenų bazės ir viso teksto žurnalų. Taikant neparametrinį Mann-Whitney testą, SNEA nustatė reikšmingą ( P ⩽ 0, 05), per daug atstovaujamą ( P ⩽ 0, 05) ontologijas tarp aukštyn ir žemyn reguliuojamų DEGS, rodančių kiekvieno potinklio praturtėjimą. Iš viso buvo nustatyta 32 ir 44 ontologijos, susijusios su reguliuojamais DEG C las-inokuliuotuose neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų mėginiuose, o 26 ir 22 ontologijos, susijusios su žemai sureguliuotais DEG, buvo rastos atitinkamai grubioje citrinoje ir saldiklyje (papildoma 4 byla, papildoma S1 ir S3 lentelės). Trys svarbiausi atnaujintų genų ontologijos C Las-inokuliuotuose neapdorotos citrinos mėginiuose buvo siejami su gynybine reakcija, biotiniu stresu ir augalų gynyba (3a lentelė). Palyginimui, augalų imunitetas, jazonato atsakas (JA) ir šešėlių vengimas buvo pagrindiniai ontologiniai terminai, nustatyti C Las inokuliuotuose saldžiųjų apelsinų mėginiuose (3b lentelė). Tarp žemai sureguliuotų DEG, šaknų fototropizmas, sėklos plotis ir ląstelių išsiplėtimas buvo 3 pagrindinės ontologijos, nustatytos C Las inokuliuotuose neapdorotos citrinos mėginiuose; kadangi šaknies fototropizmas, atsakas į etileno stimuliaciją ir žaliuojančios spalvos buvo pagrindinės ontologijos, išskiriamos saldžiai apelsinuose (3a ir b lentelės). Neapdorotų neapdorotų citrinų mėginių fotosintezė, redukcinis pentozės-fosfato ciklas ir sėklų ilgis buvo trys svarbiausi ontologiniai tyrimai, nustatyti aukščiau sureguliuotiems DEG. Kita vertus, augalų reakcija, azoto apykaita ir biotinis stresas buvo pagrindinės ontologijos, nustatytos nustatant žemai sureguliuotus DEG. Kalbant apie saldžiųjų apelsinų inokuliaciją, odelių išsivystymas, atsakas į auksino dirgiklį ir jonų homeostazė buvo pagrindinės ontologijos, nustatytos atpažįstamiems genams, o meristemos vystymasis, meristemos inicijavimas ir lapų dydis buvo pagrindinės ontologijos, susijusios su žemai sureguliuotais genais (Papildomas failas 4, papildomos S2 ir S4 lentelės).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Transkripcijos veiksniai

Iš viso buvo nustatyti 68 transkripcijos veiksniai (4 lentelė). Neapdorotos citrinos C Las-inokuliuotuose ir maketiniuose-inokuliuotuose mėginiuose buvo nustatyta aštuoniolika transkripcijos faktorių (TF), iš kurių 12 buvo susiję su augalų imunitetu, ir kurių 12 transkripcijos lygis buvo ⩾ 3 LFC. Tik viena TF ⩾ 3 LFC buvo pastebėta į paslėptą neapdorotą citriną. ERF-1 buvo vienintelis TF, aptinkamas tiek iš C Las, tiek iš inokuliuotos neapdorotos citrinos mėginių, jis buvo sureguliuotas C Las inokuliuotuose mėginiuose, o sumažintas - reguliuojamas neapdorotų citrinų pavyzdžiuose. Iš viso su C -Las inokuliuotuose saldžiųjų apelsinų mėginiuose buvo nustatyta 34 TF, o 7 - inokuluotuose mėginiuose. C Las inokuliuotos neapdorotos citrinos mėginiai turėjo 15 padidinto reguliavimo, palyginti su 3 žemyn sureguliuojamais TF, tuo tarpu C Las inokuliuotame saldžiajame apelsine buvo nustatyti 26, reguliuojami palyginti su 10 žemyn reguliuojamų TF. Nustatyta, kad tik EIN3 yra sureguliuotas tiek C Las-, tiek maketo-inokuliuotame saldiklyje. Kai kurios TF šeimos, tokios kaip ATAF1, bHLH, ERF, MYC2, MYB ir WRKY, yra specialiai susijusios su augalų gynybos ir imuniteto reguliavimu. Didesnis su gynyba susijusių TF skaičius buvo rastas C Las inokuliuotuose mėginiuose, nei modeliuotuose inokulijuotuose mėginiuose. ERF-1, MYC2, RAP2.4, TFIID ir WRKY70 buvo siejami su jazonato ir etileno metabolizmo padidinimu. WRKY TF ekspresija buvo stipresnė C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje nei saldžiuose apelsinuose (4 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Labai išreikštos DEG

DEG, dalyvaujantys signalo perdavime, buvo stebimi ir ryškiai išreiškiami C Las-inokuliuotuose tiek grubios citrinos, tiek saldžiųjų apelsinų lapuose (1 lentelė). Genui AT3G47570 , kuris koduoja baltymą, kuris funkcionuoja baltymų fosforilinimo srityje per transmembraninio receptoriaus baltymo tirozinkinazės signalizacijos kelią, geną labiausiai (117 kartų) paveikė citrusinių vaisių sekos, gautos RNR seq rezultatuose. R-genas, AT2G20142 (TIR domeno šeimos baltymai) ir RBOHD (kvėpavimo sutrikimas ) buvo labiau sureguliuoti grubioje citrinoje nei saldžiuose apelsinuose. Du MAPK genai ( MPK3 ir MKK9 ) buvo sureguliuoti žalioje citrinoje (atitinkamai LFC 3.1 ir 1.51), tuo tarpu saldžiųjų apelsinų buvo reguliuojami tik MPK3 (LFC = 2.79). MAPKKK19 , JAZ8 , JAZ1 , PUB22 (susijęs su kvėpavimo takų sprogimu, dalyvaujančiu gynybos reakcijoje), DIC2 (etileno biosintezės procesas), AT1G73805 (salicilo rūgšties (SA) tarpininkaujantis signalizacijos kelias), CBF4 ( abscisinės rūgšties signalizacija), CYP94C1 (signalo perdavimas), MPK3 , WRKY ( WRKY 40 , WRKY 41 , WRKY 46 , WRKY 33 , WRKY 70 ), ACS6 , ERF-1 ir ERF9 , kurios visos yra susijusios su signalo perdavimo perdavimu, buvo 50 geriausių atnaujintų (LFC ⩾ 3) DEG. C Las inokuliuotos neapdorotos citrinos mėginiuose. Labiausiai aukščiau reguliuojamų (LFC ⩾ 3) genų, esančių C Las-inokuliuotame saldiklyje, buvo keletas DEG, dalyvaujančių signalizacijos keliuose, pavyzdžiui, AT1G73805 (SAR trūkumas 1), CBF4 , CYP94C1 ir JAZ8, taip pat kiti genai, tokie kaip SRG3 (glicerolio metabolinis procesas), F12M16.17 (pernešėjas), AT3G27640 (nuo DNR priklausomas pernešėjas) ir PP2-B15 (flomo baltymas) (1 lentelė, 2 papildoma byla, papildoma S3 lentelė). WRKY transkripcijos koeficientas, WRKY 41 (LFC = 3, 00), buvo 89 vietoje tarp labiausiai išreikštų DEGs C Las inokuliuotų saldžiųjų apelsinų, tuo tarpu WRKY40 (LFC = 4, 94) buvo 10 vietoje pagal labiausiai atnaujintų genų C Las sąrašą. -inokuliuota grubi citrina. CKI1 (citokininų perduota signalizacija), EBF1 (neigiamas etileno signalizacija), MJB24.15 ( brassinosteroidinis dirgiklis), PIL1 (signalizacija raudona šviesa), CYP71B37 ir F4H6.15 (hipotetinis baltymas) buvo vieni labiausiai žeminamų DEG C Las. -inokuliuota grubi citrina. MMI9.1 (augalų invertazės / pektino metilesterazės inhibitorius), UGE1 (UGE1 (UDP-D-gliukozė / UDP-D-galaktozės 4-epimerazė 1), AHP4 (citokininų sukelta signalizacija), PRP2 (ląstelių sienelių organizacija) ir AT3G62950 ( ląstelių redokso homeostazė) buvo viena iš labiausiai sumažėjusių DEG reikšmių C Las-inokuliuotame saldiklyje.

Diskusija

Dabartiniame tyrime buvo tiriami transkriptominiai pokyčiai, susiję su HLB ankstyvoje C Las infekcijos stadijoje, sergant HLB tolerantiška neapdorota citrina ir HLB jautriai saldžiu apelsinu. C Las aptikimas citrusiniuose vaisiuose yra atidėtas po pradinės inokuliacijos; medžiai išlieka akivaizdžiai besimptomiai, kol bakterijų titras pasieks tokį lygį, kad jį būtų galima patikimai aptikti naudojant RT-qPCR. C -Las inokuliuotų neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų augalų infekcija mūsų tyrime negalėjo būti patvirtinta RT-qPCR praėjus 23 savaitėms po augalų pasėjimo. Ankstesnis tyrimas pranešė, kad HLB gali būti aptiktas saldaus apelsino pavidalu per 5–9 savaites po pasėjimo šiltnamio sąlygomis. Dviejuose tyrimuose patvirtinti reikalingo laiko skirtumas gali būti susijęs su skirtingų inokuliacinių šaltinių, turinčių skirtingus bakterijų titrus, naudojimu ir, galbūt, su augalų amžiaus ir augimo sąlygų skirtumais. Stoveris ir kt. 26 nustatė, kad pasėjant Kuharske citrange, gaunami mažesni C Las titrai nei kitiems sėjimo šaltiniams, tokiems kaip citrina ir saldieji apelsinai. Kadangi ir Kuharske, ir Carrizo yra citrinos, mūsų tyrime panaudotas užpildas qPCR gali užtrukti ilgiau nei ankstesnio tyrimo „Lisabonos“ citrina. Tinkamo laiko nustatymas mėginių paėmimui, siekiant apibūdinti ankstyvą atsaką į infekciją, taip pat gali būti problemiškas. Mūsų tyrimo metu birūs mėginiai buvo imami per 0, 5, 7, 9, 12 ir 17 savaites, siekiant nustatyti tinkamą laiko momentą, kuris parodytų ankstyvą atsaką. Preliminarūs RNR-seq duomenys parodė, kad DEG skaičius, keičiantis ekspresijai, buvo maksimalus 7 savaitę; todėl šis laiko momentas buvo pasirinktas išsamiai sekai ir analizei (duomenys nepateikti).

Reikia nustatyti tinkamą statistinį testą, kad būtų galima nustatyti, ar pastebėti konkretaus geno gautų sekų (skaitytų skaičių) skirtumai yra reikšmingi, tai yra, ar skirtumas yra didesnis, nei būtų galima tikėtis dėl natūralių atsitiktinių variacijų. 22 Be to, labai svarbu suplanuoti eksperimentą taip, kad būtų sumažintas natūralus genų ekspresijos kitimas (ne dėl gydymo efekto) ir maksimalus identifikuotų DEG skaičius. Ankstesni tyrimai, tiesiogiai lyginantys C lasa ir paslėptus augalus arba tolerantiškus ir jautrius genotipus, po inokuliacijos 0 savaitę negalėjo pakankamai sumažinti biologinio kitimo. Dėl to buvo nustatyta nedaug ankstyvos stadijos DEG. 4, 10, 11, 27 Šiame tyrime genų ekspresija 0 savaitę buvo naudojama kaip atskaitos taškas, siekiant sumažinti atsitiktinių variacijų lygį tarp atskirų augalų. Norint identifikuoti C Las sukeltus DEG, lyginamai analizei buvo pasirinkti tik tie DEG, kurie 7 savaitę buvo vienareikšmiškai išreikšti C Las inokuliuotuose, o ne inokuliuotuose mėginiuose 7 savaitę. Taikydami šį metodą, nustatėme didesnį DEG skaičių reaguojant į C Las inokuliaciją, nei atlikdami tiesioginius C Las inokuliuotų neapdorotų citrinų ir saldaus apelsino palyginimus 7 savaitę. Šis metodas nebuvo naudojamas ankstesniuose C Las užkrėstų transkriptų tyrimuose. citrusiniai. Tačiau mes neidentifikuosime tų genų, kurių absoliutus ekspresijos lygis buvo aukštas tiek 0, tiek 7 savaitę po inokuliacijos. Mes spėjame, kad kai kurie iš šių genų gali vaidinti svarbų vaidmenį prieš C Las, nors šie genai nebūtinai buvo sukelti C Las.

Genų ekspresija, susijusi su tolerancija ir jautrumu C Las

Augalų ligų atsparumas paprastai skirstomas į dvi kategorijas: kokybinį atsparumą, kurį nustato pagrindiniai R-genai, ir kiekybinį atsparumą, kurį nustato keli genai, turintys nedidelį poveikį. 28 Pirmąją gynybos pakopą, PTI, sukelia PAMP / DAMP suvokimas su membranomis įtvirtintais PRR, po to suaktyvinant MAPK kaskadą ir pasroviui transkripcijos veiksnius, sukeliančius imuninį atsaką. Antrąją gynybos pakopą sukelia patogeno efektoriai, sąveikaudami su R baltymu (efektoriaus sukeltas imunitetas), kai R baltymo ir patogeno efektoriaus sąveika bėgant laikui svyruoja tarp suderinamų ir nesuderinamų reakcijų. Augalų patogenai plačiai skirstomi į biotrofus ir nekrotrofus. Augalų gynybą nuo biotrofinių patogenų daugiausia lemia didelis atsparumas genams. 29 C Las yra privalomas biotrofinis patogenas ir šiuo metu nenustatyta atsparių citrusinių vaisių veislių. R-genų sukeliamas atsparumas paprastai sukelia padidėjusį jautrumą (HR), kuris, kaip manoma, kovoja su biotrofiniais patogenais ribodamas jų prieigą prie vandens ir maistinių medžiagų. 29 R genų sukeliamas atsparumas taip pat suaktyvina nuo SA priklausomą signalizavimą, sukeldamas numanomų gynybos efektorinių genų eilutės aktyvaciją. SA signalizacijos suaktyvinimas vyksta visame augale, siekiant nustatyti sisteminį įgytą atsparumą (SAR) nuo vėlesnių patogeninių infekcijų. 29 SAR metu kalcio ir ligninas nusėda augalų ląstelių sienelėse ir augalai įgyja sugebėjimą greitai nustatyti HR. Fan et al. 9 atstovai pranešė, kad C las-inokuliuotuose tiek žalios citrinos, tiek saldaus apelsino lapuose buvo pastebėti fimoemo sietų elementai, sujungti su kaliozais, ir floemų slopinimo slopinimas buvo pastebėtas, tačiau šiurkščių citrinų ir saldžiųjų apelsinų floemų pernešimas turėjo mažiau įtakos. Mūsų tyrime buvo nustatyta, kad floemo baltymas 2 (PP2–15) yra vienas labiausiai reguliuojamų genų C Las infekuotame saldiklyje, bet ne C Las infekuotoje neapdorotoje citrinoje. Keli kiti tyrimai taip pat pranešė, kad floemo baltymo 2 (PP2) genai yra padidėję HLB užkrėstuose lapuose. 4, 9, 10, 11, 14 Be į kraujagyslių audinių diferenciaciją, į lektiną panašus baltymas (PP2) yra susijęs ir su sieto plokštelių užsandarinimu, reaguojant į žaizdas, ir kaip gynyba nuo patogenų ir vabzdžiai. 30 PP2 kaupimasis sietinėse plokštelėse kartu su flomo nekroze ir translokacijos srauto užsikimšimas atrodo esminis citrusinių vaisių žalojimo ligos simptomų vystymosi veiksnys. 50-ies dienų po inokuliacijos PP2-B15 buvo labiausiai reguliuojamas genas C Las-inokuliuotose „Sanhu“ raudonojo mandarino šaknyse. Zhong ir kt. 14 spėliojo, kad į PP2 panašūs genai turi aktyvų vaidmenį gynyboje nuo įsibrovėlių bakterijų po to, kai augalas buvo užkrėstas C Las.

Mūsų tyrime SNEA konkrečiai nustatė „gynybinį atsaką“ ( P = 1, 77E – 06) ir „augalų imunitetą“ ( P = 0, 0003) kaip per daug reprezentuojamus ontologijas tarp aukščiau sureguliuotų genų (3a ir 3b lentelės) C Las-inokuliuotuose lapuose. atitinkamai neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino. C jazono neapdorotoje neapdorotoje citrinoje taip pat buvo žymiai daugiau „jazonato atsako“ ir „pilvo judėjimo“ ontologijų. Kaliozės kaupimasis, sintetinamas tarp ląstelės sienelės ir plazmos membranos, taip pat stomatalinis uždarymas yra klasikiniai PTI žymenys. 31 Be to, PTI metu indukuojami SA, JA ir etileno hormonai. DEG, susiję su R geno tarpininkavimu, kuris aktyvuoja nuo SA priklausomą signalizacijos kelią, mūsų tyrime nerastas. EDS1 ir PAD4, kurie vaidina svarbų vaidmenį signalizuojant SA, ir NPR1 , pagrindinis SA reguliatorius, 32 taip pat nebuvo reikšmingai sužadinti nė viename iš šiame tyrime analizuotų mėginių. Wang 33, 41 nurodė, kad C Las sudėtyje yra CLIBASIA_00255, kuris koduoja salicilato hidroksilazę, kuri gali paversti salicilo rūgštį (SA) katecholiu, metabolitu, kuris nesukelia atsparumo atsako. „AT1G73805“, sisteminio įgyto atsparumo trūkumas 1 ( SARD1 ), tačiau buvo labai išreikštas C Las inokuliuotų neapdorotų citrinų (LFC = 4, 35) ir saldžiųjų apelsinų (LFC = 9, 00) mėginiuose. SARD1 , augalui būdingas DNR surišantis baltymas, yra pagrindinis teigiamas SA sintezės reguliatorius. Jis buvo indukuotas po sąlyčio su SA ir JA. 34 SARD1 išmušimas pakenkia baziniam pasipriešinimui ir SAR. 31 Norint suprasti SARD1 mechanizmą citrusinių vaisių gynybos sistemoje, reikia papildomų tyrimų. Šiame tyrime nustatyta DEG analizė SNEA aiškiai nustatė, kad padidėjusio jautrumo reakcija ir ląstelių žūtis yra per didelės reprezentatyvios ontologijos ( P ⩽ 0, 05) tarp reguliuojamų DEG, esančių C Las-inokuliuotuose neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų lapuose. tačiau ši ontologija nebuvo nustatyta neapdorotose citrinų ir saldžiųjų apelsinų pavyzdžiuose užkrėstuose pavyzdžiuose (4 papildoma byla). A total of 4 and 7 DEGs associated with hypersensitive response and cell death were identified in C Las-inoculated leaves of rough lemon, respectively, whereas 8 and 16 DEGs associated with hypersensitive response and cell death were identified in C Las-inoculated leaves of sweet orange, respectively. Among the identified DEGs, BAP2 , GLIP1 and ACL5 , associated with inhibition of cell death, were found in C Las-inoculated samples of sweet orange, whereas only BAP2 was found in C Las-inoculated samples of rough lemon. Arabidopsis C2 domain proteins, BAP1 , and its homologue BAP2 , negatively regulate biotic and abiotic cell death. 35 ACL5 controls Arabidopsis xylem morphogenesis through the prevention of premature cell death. 36 Treatment of Arabidopsis plants with GLIP1 protein systemically inhibited cell death in distant leaves inoculated with A. brassicicola , where cell death would be otherwise strongly induced. 37 MPK3 , PLA2A , RBOHD , RPM1 , SAUL1 , SOBIR1 , VTC2 , and WRKY22 , all of which are associated with hypersensitive response and cell death, were upregulated in C Las-inoculated leaves of sweet orange, whereas SOBIR1 , MKK9 , RBOHD , and MPK3, also associated with hypersensitive response and cell death, were upregulated in C Las-inoculated leaves of rough lemon.

Starch, which accumulates extensively in photosynthetic cells, as well as in phloem elements and vascular parenchyma cells of leaf blades and petioles, has also been observed to accumulate in the xylem parenchyma and phelloderm of HLB-affected 'Valencia' orange trees but not in control (non-infected) samples. 38 Albrecht and Bowman 4 found that glucose-6-phosphate/phosphate transporter ( GPT2 ), which mediates the import of glucose-6-phosphate, an essential substrate for starch biosynthesis, was more highly upregulated in infected 'Cleopatra' mandarin than in sweet orange. In the present study, GPT2 expression was significantly induced to a high degree in infected rough lemon but not in sweet orange. A total of 19 enzymes belonging to the starch and sugar metabolism pathway were identified. Fourteen were identified in C Las-inoculated sweet orange and 5 in mock-inoculated sweet orange, whereas 6 sugar and starch metabolism enzymes were identified in mock-inoculated rough lemon and 2 in C Las-inoculated rough lemon. Synthase (ec:2.4.1.12), diphosphatase (ec:3.6.1.9), and glycogenase (ec:3.2.1.1) were also found to be upregulated in C Las-inoculated leaves of sweet orange, while saccharogen amylase (ec:3.2.1.2) was upregulated in mock-inoculated sweet orange. Synthases (ec:2.4.1.12, and ec:2.4.1.14) were upregulated in mock-inoculated rough lemon, while hexokinase type IV glucokinase (ec:2.7.1.1) and fructokinase (phosphorylating) (ec:2.7.1.4) were found in C las-inoculated samples of rough lemon (Supplementary File 5, Supplementary Tables S1 and S2). Although no symptoms of HLB were observed in inoculated leaves of rough lemon and sweet orange, a greater number of DEGs related to sugar and starch metabolism were found in inoculated leaves of sweet orange than in inoculated rough lemon leaves (Supplementary File 5, Supplementary Tables S1 and S2). These data indicate that transcriptomic reprogramming in carbohydrate metabolism and defense is occurring in response to C Las even before symptoms are visibly observed or positive RT-qPCR results for HLB were found. Previous studies have observed that many genes involved in photosynthesis are repressed in response to HLB, most likely due to increased accumulation of sucrose/glucose levels in leaves. 10, 11, 39 In our study, SNEA analysis indicated that photosynthesis ( P =0.001), as an ontology term, was the most significant in DEGs obtained from mock-inoculated rough lemon, whereas defense response ( P =1.77 E−06), as an ontology term, was the most significant term among the DEGs obtained for C Las-inoculated rough lemon (Supplementary File 4, Supplementary Table S2). These data suggest that a dramatic shift from photosynthesis- to defense-related gene expression occurs in rough lemon as an early response to C Las. In previous proteome studies, it was found that accumulation of starch synthase increased, but the production of photosynthesis-related proteins decreased in infected rough lemon, 40 and most significantly, upregulated proteins of infected sweet orange were involved in stress/defense response. 39

Regulation of WRKY expression by MAPKs

The peptide flg22, a bacterial flagella protein recognized by most plants, activates a MAPK cascade which then leads the activation of WRKY-type transcription factors, key regulators of plant defense. 41 Flagella in C Las, however, have not been observed in any of the numerous electron micrographs of these bacteria infecting plants and psyllids. 2 The reduced genome of C Las and their transmission by psyllids may allow it to avoid PTI. C Las, however, still possesses 57 genes coding for products that function in cell envelope biogenesis and the outer membrane, including lipopolysaccharides, and most flagellar genes, which might function as PAMPs. 33 Elongation factor Tu (EF-Tu) is one of the most abundant bacterial proteins and is recognized as a PAMP by Arabidopsis . 42 The plant PRR for EF-Tu is the LRR-RLK EF-Tu receptor ( EFR ), which belongs to the same subfamily (LRRXII) as FLS2 . 42 In this study, upregulation (LFC=2.84) of EFR was only found in inoculated sweet orange. No expression of FLS2 was observed in C Las-inoculated leaves of either rough lemon or sweet orange.

During PTI, activation of the MAPK cascade leads to the activation of WRKY-type transcription factors and other key regulators of plant immunity. 43 It is thought that the MAPK cascade regulates plant immunity through the activation of defense-related genes via direct phosphorylation of downstream transcription factors, such as WRKYs and ERF s. 44, 45 MKK9 is upstream of MPK3 , and MAPKKK19 is upstream of MKK9 (Figure 5). In our study rough lemon exhibited a stronger MAPK response than sweet orange (Table 1). After the perception of flg22, MPK6 activates ethylene biosynthesis through the phosphorylation of ACS6 . 46 ACS6 was highly upregulated in C Las-inoculated rough lemon but not sweet orange. We also observed the strong upregulation of ERF1 (LFC=3.18) and ERF9 (LFC=3.31) in C Las-inoculated leaves of rough lemon (Tables 3a and b, Figure 5). In response to pathogen attack, ET and JA cooperate through transcriptional induction of ET response factor 1 ( ERF1 ). 47 Activation of the MAPK cascade induces members of the WRKY family of transcription factors and defense-related genes 48 in tobacco. 49 For example, WRKY22 is activated via a MAPKcascade induced by flg22. 50 In our study, WRKY22 expression was only found in sweet orange, however, the upregulation was only moderate (LFC=1.96). These data were much lower than the upregulation of group 1 WRKY ( WRKY33 , WRKY70 and WRKY40 ) TFs in rough lemon. Emerging evidence has indicated that group I WRKY transcription factors, which contain a conserved motif in the N-terminal region, are also activated by MAPK-dependent phosphorylation, underlining their importance in plant immunity. 51

Image

MAPK cascades as central signaling components in citrus pathogen defense. Upregulated genes in rough lemon are shown in green, and upregulated genes in sweet orange are shown in orange.

Visas dydis

Our study indicates that WRKY transcription factor genes may play an important role in the tolerance to HLB exhibited by rough lemon. A total of eight WRKYs were identified in our RNA-seq analysis; with five in C Las-inoculated rough lemon and three in sweet orange. The magnitude of upregulation of all the WRKY genes in C Las-inoculated rough lemon was highly significant (LFC ⩾ 3), while only WRKY41 approached an increase of LFC=3.00 in C Las-inoculated sweet orange. Higashi et al. 52 indicated that WRKY41 may be a key regulator in the crosstalk between the salicylic acid and jasmonic acid pathways. 52 In our study, WRKY41 was upregulated in inoculated samples of both rough lemon and sweet orange. In response to mock-inoculation, however, only rough lemon exhibited downregulation (LFC=−1.62) of WRKY42 and no significant difference was observed in sweet orange. The magnitude of the changes in the expression level of all of the WRKYs was higher in C Las-inoculated rough lemon than in C Las-inoculated sweet orange (Tables 3a and b). In Arabidopsis , WRKY46 was specifically induced by salicylic acid (SA) and the biotrophic pathogen Pseudomonas syringae . 30, 53 The WRKY33 transcription factor in Arabidopsis is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens. 30 Previous studies have presented evidence indicating that WRKY70 regulates plant disease resistance, 53 and identified WRKY70 as a node of convergence for integrating salicylic acid (SA)- and jasmonic acid (JA)-mediated signaling events during plant response to bacterial pathogens. 30 Over-expression of WRKY70 in Arabidopsis resulted in the suppression of several JA responses, including expression of a subset of JA-responsive and Alternaria brassicicola responsive genes. SA-induced expression of WRKY46 , WRKY70, and WRKY53 is mainly dependent on NPR1 . 30 In our study, expression of NPR1 did not respond significantly to either mock- or C Las-inoculation, however, WRKY46 and WRKY70 were strongly upregulated in C Las-inoculated rough lemon. Martinelli et al. 54 reported that several WRKY members were more highly upregulated in fully ripe fruits than in young leaves of C las infected sweet orange. 54

ABA-induced activation of MAPKs in rough lemon

Taip pat įrodyta, kad MAPK kaskados (5 pav.) Yra susijusios su ABA signalizavimu. 55 Šiame tyrime visi MAK 3 , MAPKKK19 ir MKK9 buvo žymiai iš naujo sureguliuoti C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje (papildomi failai, papildomi S1 ir S2 paveikslai) ir gali atlikti tam tikrą vaidmenį ABA signalizacijos kelyje, kaip siūloma ankstesniame Arabidopsis tyrimas. „Blast2GO“ taip pat parodė, kad stipriai atspindi ABA signalizuojančio GO terminą C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje (6 papildoma byla). MPK3 suaktyvina tiek H 2 O 2, tiek ABA Arabidopsis daigais, o per didelis MPK3 ekspresija padidino ABA jautrumą ABA sukeltam augimo sustabdymui po sudygimo. 56 MPK9 , kuris yra geriau ekspresuojamas apsauginėse ląstelėse, taip pat aktyvuojamas ABA ir parodyta, kad jis tarpininkauja ABA signalizavimui apsauginėse ląstelėse. 57 MPK3 / MPK6 neigiamai reguliuoja ABA signalizaciją augaluose. 58 WRKY TFs šeima yra pagrindinis augalų apsaugos ir SA tarpininkavimo signalizacijos reguliatorius, tačiau taip pat dalyvauja ABA tarpininkaujant signalizavimui. 59 Buvo pranešta, kad AtWRKY40 yra neigiamas ABA signalo reguliatorius sėklų daigumo metu, taip pat sąveikauja su AtWRKY18 ir AtWRKY60, kad slopintų į stresą reaguojančių genų ekspresiją. 53 Mūsų tyrime WRKY40 buvo labai padidintas (LFC = 4, 9) C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje. Be to, jis buvo labiausiai išreikštas tarp visų reguliuojamų WRKY C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje, tačiau nebuvo išreikštas užkrėstose saldžiuose apelsinuose. An ir Mou 32 teigė, kad nors žinoma, kad ABA vaidina lemiamą vaidmenį prisitaikant prie abiotinio streso, jos vaidmuo reaguojant į biotinį stresą nėra toks aiškus. Tačiau apskritai ABA laikoma neigiamu atsparumo ligoms reguliatoriumi. 55

Greitas reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) susidarymas yra vienas iš anksti aptinkamų įvykių po ABA suvokimo. Augalinis PAMP atpažinimas taip pat skatina greitą ir laikiną ROS susidarymą oksidacinio sprogimo metu. 55 Įdomu tai, kad ABA suaktyvintos MAPK kaskados komponentus taip pat suaktyvina ROS, tai rodo, kad ABA ir ROS gali suartėti MAPK lygiu, reguliuodami gimdos uždarymą. Ankstesni pipirų padidėjusio jautrumo (HR) tyrimai atskleidė, kad HR sukeltų ląstelių žūties ir gynybinių reakcijų suaktyvinimas yra susijęs su signalo perdavimo keliais, kuriuos koordinuoja gynybinės signalizacijos molekulės, tokios kaip ROS ir augalų gynybiniai hormonai. 61 Mūsų dabartiniame tyrime PUB22 (kvėpavimo takų sprogimas gynyboje) buvo labai sureguliuotas tiek su C Las-inokuliuota neapdorota citrina (LFC = 5, 08), tiek su saldžiu apelsinu (LFC = 5, 42). RBOHD (kvėpavimo takų sprogojanti oksidazė-D) taip pat buvo sureguliuotas C Las inokuliuota grubia citrina (LFC = 3, 15) ir saldžiu apelsinu (LFC = 2, 88). ROS tarpininkauja ABA signalizavimui apsauginėse ląstelėse. 62 Nors dauguma sąsajų tarp ABA ir MAPK nėra gerai suprantamos, akivaizdu, kad šie keliai yra komplekso ląstelių signalizacijos tinklo, egzistuojančio augaluose, dalis, siekiant integruoti įvairius aplinkos nurodymus, tokius kaip patogeno problemos, maistinių medžiagų būklė ar vystymosi programos. 55 „ AtRbohD“ ir „ AtRbohF“ iš pradžių buvo aprašyti „ Arabidopsis“ kaip pagrindiniai augalų gynybos komponentai. Nuo RBOH priklausoma ROS generacija yra susijusi su patogeno atpažinimu oksidacinio sprogimo metu, susietam su MAMP / PAMP suvokimu, ir per HR, kuris yra susijęs su patogeno avirulencijos veiksnių atpažinimu per atsparumo baltymus. 37

Kiekybinis gynybos signalizavimas

Apžvalgoje Eulgem 16 teigė, kad R tarpininkaujama atsparumas, bazinė gynyba ir SAR yra susijusios gynybos sistemos, turinčios panašius reguliavimo komponentus ir veiksmingos prieš biotrofinius patogenus. Skirtumai tarp nuorašo profilių, susijusių su R tarpininkaujamu pasipriešinimu ir bazine gynyba, yra kiekybiniai, o ne kokybiniai. 16 Mūsų rezultatai rodo, kad su gynyba ir reakcija susiję DEG gali būti tarpininkaujami tiek bazinės gynybos, tiek R-tarpininkaujant pasipriešinimo mechanizmams. C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje ir saldžiajame apelsine buvo sukelti atskiri DEG rinkiniai. Pastebėjome, kad bendroji pasaulinė mRNR raiškos (padidintos ir sureguliuotos) profiliai C -las ir inokuliuotose neapdorotose citrinose ir saldžiuose apelsinuose buvo panašūs (2 papildomas failas, papildoma lentelė S1). Tačiau jautraus saldaus apelsino gynybinio atsako išraiškos amplitudė buvo mažesnė nei tolerantiškoje šiurkščioje citrinoje (3 pav., 5 lentelė). Pasipriešinimą reguliuoja įvairių gynybos mechanizmų reagavimo lygio pokyčiai ir kiekybiniai patobulinimai, kurie daro gynybos atsaką efektyvesnį. 15, 16, 63 Signalizacijos mechanizmą, kuris kontroliuoja gynybos mechanizmų įjungimą, sudaro labai sujungtas tinklas. Pasipriešinimo lygio skirtumai dažnai slypi specifinių gynybos reakcijų greičiu ir intensyvumu. Atsparūs augalai dažnai greičiau ir energingiau reaguoja į patogenus nei jautrūs augalai. Taigi svarbu suprasti, kaip augalai supranta patogeno buvimą ir pradeda tolesnį atsaką. Nors aukščiau ir žemyn sureguliuotų genų raiškos profilis mūsų tyrime buvo panašus į tolerantišką šiurkščią citriną ir jautrų saldų apelsiną, žemai sureguliuotų DEG dalis, kurių LFC ⩽ –3 buvo atitinkamai 0, 0% ir 5, 8% neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų, o pakoreguotų DEG, turinčių LFC ⩾ 3, dalis buvo atitinkamai 29, 0% ir 25, 1% C Las inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje ir saldžiajame apelsine. Vis dėlto užkrėstose neapdorotose citrinose ir saldžiuose apelsinuose DEG dalis, kuri buvo žemyn reguliuojama, buvo 3, 8% ir 1, 2%, palyginti su neapdorota citrina ir saldžiu apelsinu, o pakoreguotų genų dalis buvo atitinkamai 1, 0% ir 1, 1%. RT-qPCR parodė, kad 9 atrinktų genų transkripcijos amplitudė buvo didesnė C -Las-inokuliuotuose, nei atlikus modeliuotuosius-inokuliuotus. Apskritai šie duomenys atitiko ekspresijos lygius, gautus iš RNR-seq duomenų. T29M8.8 , AGP16 , PUB22 , CBF , AT1G32928 , JAZ1 , MPK3 ir WRKY70 LFC vertės taip pat buvo didesnės C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje nei C Las-inokuliuotoje saldoje apelsine . Vis dėlto reikia pažymėti, kad kai kurių genų ekspresijos lygiai RNR-seq duomenyse ir RT-qPCR duomenyse, įskaitant DIC2 , EXL2 ir HSP90.1 , buvo šiek tiek nesutapami. Mūsų rezultatai parodė, kad C Las-inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje, paimtoje 7 savaitę po inokuliacijos, buvo daugiau DEG su LFC ⩾ 3. C C Las inokuliuotoje neapdorotoje citrinoje atsparumas ir gynybinės reakcijos suaktyvėja greičiau ir greičiau nei C Las inokuliuotame saldiklyje. Natūraliai neapdorotų citrinų ir saldžiųjų apelsinų augaluose buvo mažiau WRKY ir su gynyba susijusių genų nei C Las inokuliuotuose augaluose. Šie duomenys rodo, kad saldusis apelsinas nesugeba veiksmingai nuslopinti patogeno, todėl suderinama šeimininko ir patogeno sąveika. Maleck ir kt. 64 nustatė, kad apibrėžti aukščiau sureguliuotų genų rinkiniai yra labiau išreiškiami pagreitinta tvarka nesuderinamos sąveikos metu. Tao ir kt. 15 pasiūlė mechanizmą, kuris paprastai naudojamas tiek R-geno, tiek bazinės gynybos reakcijose, kai signalo įvestis į genų ekspresijos išvestį vyksta kiekybiškai nustatytu būdu. Šis mechanizmas greičiausiai apima reguliatorius, kuriuos paprastai naudoja abi gynybos sistemos, pavyzdžiui, WRKY ir gynybos atsako genai (4 ir 5 lentelės).

Pilno dydžio lentelė

Išvados

Dabartiniame tyrime pateikiama lyginamoji neapdorotos citrinos ir saldaus apelsino reagavimo į imitaciją ir C las-inokuliaciją per 7 savaites po inokuliacijos transkripcijos analizė, siekiant nustatyti ankstyvą atsaką į C Las infekciją tolerantiškoje (šiurkščioje citrinoje) ir jautrūs (saldžiai oranžiniai) medžiai. Šiurkšti citrina ir saldus apelsinas gali atpažinti C Las per patogeno atpažinimo receptorius ir suaktyvinti augalų imuninę sistemą dar prieš tai, kai galima gauti teigiamų RT-qPCR rezultatų CLas. Mūsų kolektyviniai rezultatai rodo, kad kiekybinis atsparumas ligoms gali prisidėti prie patvarios HLB tolerancijos, kurią turi šiurkšti citrina, kuriai būdingas aiškus genų transkripcinis reguliavimas įvairiose funkcinėse kategorijose. Signalizacijos keliai, kuriuos naudoja skirtingos gynybos sistemos, susilieja ir nukreipia persidengiančius genų rinkinius. Gynybos atsako DEG, tarpininkaujant bazinei gynybai, ir R tarpininkaujantys pasipriešinimo mechanizmai buvo pagreitinti ir sustiprinti C Las inokuliacija. Įrodyta, kad kai kurie transkripcijos veiksniai daro lemiamą įtaką atsparumui ligoms. Atsiranda reguliavimo grandinės, jungiančios signalizaciją ir genų reguliavimą, kurios leidžia manyti, kad sudėtinga transkripcijos aktyvatorių ir represorių sąveika puikiai suderina su gynyba susijusio transkripto išraišką. Šis tyrimas pateikia naujų įžvalgų apie sudėtingą transkripcijos reguliavimo tinklą, atsirandantį per ankstyvą grubios citrinos ir saldaus apelsino reakciją į C Las.

Papildoma informacija

„Excel“ failai

  1. 1.

    1 papildoma byla

  2. 2.

    2 papildoma byla

  3. 3.

    3 papildoma byla

  4. 4.

    4 papildoma byla

  5. 5.

    5 papildoma byla

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    6 papildoma byla