Apriboti ngf indukciją kiaušidžių stromoje sukelia selektyvų folikulų aktyvavimą per mtor signalizacijos kelią | ląstelių mirtis ir liga

Apriboti ngf indukciją kiaušidžių stromoje sukelia selektyvų folikulų aktyvavimą per mtor signalizacijos kelią | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Signalizavimas apie augimo faktorių
  • Policistinių kiaušidžių sindromas
  • Chirurgija
  • TOR signalizacija

Anotacija

Žinduolių kiaušidėse pirmykščiai folikulai išlieka ramybės būsenoje, kol juos suaktyvina juos supanti mikroaplinka. Jau seniai pranešama, kad kiaušidžių intervencija, pavyzdžiui, kiaušidžių cistektomija, kiaušidžių pleišto rezekcija ar lazeriu gręžiami policistinių kiaušidžių sindromo metodai, keičia folikulų vystymąsi nežinomu (-ais) mechanizmu (-ais). Čia mes sukūrėme pelių modelį, kai vienos kiaušidės buvo dalinai pašalintos iš kiaušidžių vienašališkai, nepažeistos priešingos kiaušidės. Mes nustatėme, kad sužalojimas pagreitino folikulų aktyvaciją ir vystymąsi per mTORC1 signalizacijos kelią. Be to, pirmykščių folikulų stimuliacija buvo apribota arti pjūvio vietos, kur mTORC1 kelias parodė nuoseklų aktyvavimą, prasidedantį intersticinėse ląstelėse ir einant link pirmykščių folikulų. Bendras ir su polisomais susijęs RNR-seq atskleidė nervų augimo faktoriaus (NGF) šeimos nario padidėjimą abiejose frakcijose, o imuninis dažymas parodė ribotą NGF indukciją šalia pjūvio vietos. Kultūrinėse naujagimių kiaušidėse NGF parodė folikulų aktyvacijos padidėjimą, be to, NGF inhibitorius K252a veiksmingai blokavo pirminių folikulų aktyvaciją, stimuliuojamą operacijos. Mes prilyginame žinduolių ovuliaciją nedidelėms audinių traumoms, kurios organizme vyksta natūraliai ir cikliškai. Kadangi NGF padidėjimas lydėjo aktyvuotų pirmykščių folikulų kaupimosi po ovuliacijos, mūsų tyrimas gali būti bendras selektyvaus folikulų aktyvacijos mechanizmas, kurį sukelia lokalizuotas NGF padidėjimas intersticinėse ląstelėse ir tarpininkaujantis mTOR signalizacijos keliu. Be to, NGF inhibitorius K252a ir mTOR inhibitorius rapamicinas yra geri kandidatai apsaugoti folikulų rezervą nuo per didelio išsekimo po kiaušidžių operacijos.

Pagrindinis

Žinduoliams plačiai pritarta, kad pirmykščiai folikulai kiaušidėse susirenka iki galo ir iki gimimo ar aplink juos išlieka ramūs, kartais dešimtmečius. 1 Per visus reprodukcinius metus pradinių folikulų skaičius palaipsniui mažėja, o menopauzės metu baseinas išsenka. 2 Todėl pirmykščių folikulų pritraukimas yra vienas iš veiksnių, lemiančių, kiek laiko išliks pradinių folikulų fondas. Žmonėms viena iš dažniausių sterilumo priežasčių yra priešlaikinis kiaušidžių nepakankamumas (POI), kuris pasireiškia maždaug 1–2% moterų iki 40 metų ir kuriam būdingas menstruacinio ciklo išnykimas ir susijęs su ankstyvu pirmykščio skysčio išsekimu. folikulai. 3

Pirmykščių folikulų aktyvinimas apima perėjimą iš pirminio folikulo į pirminį folikulą, o tai reiškia kiaušialąsčių augimą, granuliozinių ląstelių diferenciaciją iš plokščiųjų į kuboidines ir kaktos ląstelių atsinaujinimą. 4 Naudojant transgeninius pelių modelius, pagrindinis perėjimo būdas - intraocitų PI3K / mTOR kelias - tampa esminiu perėjimo nuo pirminių-pirminių folikulų metu. Iš tiesų, ankstyvas pradinių folikulų išeikvojimas pastebimas pelėms, kurioms trūksta šio kelio genų, tokioms kaip Pten , Akt1 , Foxo3 , rpS6 ar Tsc1 / Tsc2 . 5, 6, 7 Tačiau kadangi šį kelią gali suaktyvinti įvairūs hormonai, augimo faktoriai ir citokinai, tai, kaip priešakiniai ekstraocitų signalai reguliuoja vidinių oocitų signalizacijos kelio aktyvavimą, išlieka menkai suprantami. Neseniai atliktas Liu ir kt. Tyrimas . pateikiamas vaizdas, kaip suaktyvinami žinduolių pirmykščiai folikulai; tai yra, pradinę folikulą supanti mikroaplinka gali suaktyvinti mTORC1-KITL signalizaciją priešgranulozinėse ląstelėse, o šios ląstelės sukelia neaktyvių oocitų aktyvavimą per KIT-PI3K signalizaciją. 8 Todėl Liu ir kt. Tyrimas . sukūrė esminį ryšių tinklą tarp priešgranulozinių ląstelių ir oocitų. Vis dėlto neaišku, kodėl tam tikru metu suaktyvinamas tik ribotas skaičius pirmykščių folikulų, ir kaip procesą kontroliuoja jį supanti mikroaplinka.

Jau seniai pranešama, kad kiaušidžių intervencija keičia kiaušidžių vystymąsi nežinomu (-ais) mechanizmu (-ais). Manoma, kad policistinių kiaušidžių sindromas pasireiškia 5–10% reprodukcinio amžiaus moterų, o chirurginis gydymas pleišto rezekcija ar kiaušidžių „gręžimu“ yra tipiškas anovuliacijos pasirinkimas, priešingai nei klomifenas ar žmogaus menopauzės gonadotropinai. 9 Moterims, kurioms atliekamos dvišalių endometriomų procedūros, yra nedidelė, bet neabejotina PO po operacijos rizika, o menopauzė gali įvykti anksčiau nei įprasta. Palyginami tyrimai pranešė, kad po cistektomijos iškart sumažėjo antralinių folikulų skaičius ir AMH kiekis serume, tačiau dalinis atsistatymas paprastai pastebimas po kelių mėnesių. Darant prielaidą, kad operacija pašalins tiek augančius, tiek neaugalius folikulus, rezultatai rodo, kad mažėjantis pirminis folikulų fondas bandys atkurti folikulų vystymąsi po operacijos. Neseniai atliktame tyrime nustatyta, kad pelių kiaušidžių suskaidymas skatino pirminių folikulų vystymąsi į vėlyvą antrinę stadiją, sutrikdydamas Hippo signalizacijos kelią. 12 Tačiau toks kiaušidžių sužalojimas pirminiams folikulams ir pagrindiniam (-iams) mechanizmui (-ams) lieka nepakitęs. Mes klausiame, ar tai yra bendras pirminio folikulų atrankos pradinis mechanizmas.

Taikydami pelių modelį su vienašaliu kiaušidžių operacija, parodėme ribotą pirminių folikulų aktyvaciją šalia chirurginio pjūvio. Tada dinaminė p-rpS6 ekspresija iš somatinių ląstelių į pirmykščius folikulus atskleidė somatinio mTOR signalinio kelio dalyvavimą folikulų aktyvavime. Be to, mes nustatėme, kad lokalus nervų augimo faktoriaus (NGF) padidėjimas kiaušidžių stromoje veikė prieš mTOR signalizaciją, kad po operacijos būtų suaktyvinti pirmykščiai folikulai.

Rezultatai

Pirminių folikulų suaktyvinimas po kiaušidžių operacijos

Norėdami stebėti chirurginės intervencijos poveikį kiaušidžių vystymuisi, mes sukūrėme pelės modelį atsitiktinai pašalindami 1/3 vienos kiaušidės ir palikdami nepažeistą priešingos pusės kiaušidę (1A pav.). Kai pirmykščiai folikulai iškart suaktyvėja, kai jie suaktyvinami, pirmą kartą po 3 savaičių surinkome kiaušides, kad galėtume stebėti folikulų vystymąsi po operacijos. Remdamiesi kiaušidžių morfologija, aiškiai nustatėme pjūvį ir šalia vietos stebėjome pirminių folikulų ar ankstyvųjų antrinių folikulų grupes (1B paveikslas, viršutinė plokštė). Nepaisant bendro folikulų skaičiaus sumažėjimo, skirtingose ​​vystymosi stadijose folikulų procentas operacinėje kiaušidėje labai pasikeitė. Palyginti su kontroline puse, pradinių folikulų dalis sumažėjo, tuo tarpu chirurginėje pusėje labai išaugo augančių folikulų dalis (1B pav.). Realaus laiko PGR rezultatai taip pat aptiko padidėjusią genų, susijusių su folikulų augimu ir vystymusi ( Cyp17a1 , Cyp19a1 , Star , Lhr ir Fshr ) ekspresiją operuotose kiaušidėse (papildomas paveikslas S1A). Mūsų rezultatai rodo, kad kiaušidžių sužalojimas gali suaktyvinti pirmykščius folikulus ir skatinti folikulų vystymąsi bei augimą.

Image

Folikulų aktyvacijos ir vystymosi pagreitis po kiaušidžių rezekcijos. ( A ) Kiaušidžių rinkimo po operacijos laikas. Trečdalis vienos poros kiaušidžių buvo pašalintos, o kontrolinės pusės kiaušidės liko nepažeistos. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 1, 3, 6, 12, 24, 48 arba 21 dienai po operacijos. Dvi inhibitorių injekcijos buvo sušvirkštos 12 val. Prieš operaciją ir netrukus po jos. Kiaušidės buvo surinktos atitinkamai po 6 val. Arba 21 dienos (žalios rodyklės). ( B ) Dėl sužalojimo padidėjo kiaušidžių vystymasis. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 3 savaitėms po operacijos. Viršutinė panelė, kiaušidžių histologija naudojant hematoksilino ir eozino (H&E) dažymą. Taškinė linija, originalus chirurginis pjūvis. Rodyklės, pirminių folikulų sankaupos. Apatinis skydelis, folikulų pasiskirstymas poromis kontrolinėse (C) ir chirurginiu būdu gydomose (S) kiaušidėse ( n = 5). Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± SEM ** P <0, 01, palyginti su kontroliniais. Primas, pirmykštis folikulas; Prima, pirminis folikulas; Sek., Antrinis folikulas; Ankstyvas, ankstyvas priešakinis folikulas; Vėlyvasis, vėlyvasis antralinis folikulas; CL, geltonkūnis. ( C ) Vakarų kiaušidžių baltymų blotai, naudojant specifinius p-Mek, p-Erk1 / 2, p-Akt (S473), Akt, p-p70S6k (T389), p70S6k, p-rpS6 (S235 / 6), rpS6 antikūnus. ir β -tubulinas. β- tubulinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. ( D ) Dinaminiai p-rpS6 pokyčiai arti pjūvio vietos 0 h (a), 1 h (b), 6 h (c) ir 48 h (d) metu po operacijos. Vidurinis ir dešinysis skydeliai, didesnis kairiojo skydo padidinimas, rodantis pirmykščius folikulus šalia pjūvio. Raudoni rėmeliai ir padidinti vaizdai buvo parodyti atitinkamai vidurinėje ir dešinėje plokštėse. Taškinė linija, chirurginis pjūvis. Juodos rodyklės, lokalizuota p-rpS6 išraiška šalia pjūvio. Raudonos rodyklės, priešgranuliuotos ląstelės. Juodos strėlės galvutės, pirmykščiai oocitai. Visi strypai = 100 μm

Visas dydis

Norėdami įvertinti, kuris signalizacijos kelias gali suaktyvinti pirmykščius folikulus po kiaušidžių operacijos, mes surinkome kiaušides skirtingu laiko momentu ir įvertinome PI3K / Akt, mTORC1 ir Erk / MAPK kelių pokyčius, naudodami Western blot analizę. Anksčiau buvo pranešta, kad šie trys keliai yra stimuliuojami pažeidžiant audinius. 13, 14, 15, kaip parodyta 1C paveiksle, Mek, Erk1 / 2 Erk / MAPK kelyje fosforilinimo lygiai, Akt PI3K kelyje ir S6K1 bei rpS6 mTORC1 kelyje padidėjo iškart po operacijos ir pasiekė apytiksliai 1 val. vėliau. Vėliau aukštesnė fosforilinimo būsena kurį laiką buvo palaikoma, o po to palaipsniui mažėjo. Žymus Erk / MAPK kelio sumažėjimas įvyko praėjus 6 valandoms po operacijos, tuo tarpu PI3K ir mTOR keliuose tai įvyko po 12 valandų. Visų signalizacijos takų veikla buvo atkurta baziniame lygyje po 24 valandų (papildomas paveikslas S1B). Signalizacijos kelių stimuliacija rodo jų dalyvavimą folikulų aktyvavime po kiaušidžių operacijos.

Ankstesnis tyrimas parodė p-rpS6 indukciją pirmykščiuose folikuluose po to, kai naujagimio pelių kiaušidės buvo gydomos mTOR aktyvatoriais. Po to buvo nustatytas 16 p-rpS6 imuninis dažymas, siekiant nustatyti pirminių folikulų aktyvaciją po operacijos. Kartu su imunoblotavimo rezultatais p-rpS6 ekspresija buvo iš karto indukuota intersticinėse ląstelėse prie pjūvio vietos, o po to reikšmingai padidėjo (1Da-c pav.). Mes pažymėjome, kad reikšmingas p-rpS6 padidėjimas buvo apribotas tik pjūvio metu ir parodė dinaminius pokyčius pirmykščių folikulų viduje. Kartu su p-rpS6 plitimu tarp žaizdų esančiose intersticinėse ląstelėse, p-rpS6 pradėtas ekspresuoti pirminių folikulų ląstelėse ir pirmuonių folikulų oocituose praėjus 1 valandai po operacijos (1Db paveikslas); ir po 6 val. stipresni p-rpS6 signalai pirmiausia buvo nukreipti į pirminių folikulų oocitus (1Dc pav.). Praėjus 48 val. Po operacijos, p-rpS6 signalai tiek pirminiuose folikuluose, tiek intersticinėse ląstelėse buvo atkurti iki kontrolinio lygio (1Dd pav.). Tada p-rpS6 teigiami pradiniai folikulai kontroliuojamose ir sužeistose kiaušidėse buvo suskaičiuoti praėjus 6 valandoms po operacijos ir parodė reikšmingą sužeistų kiaušidžių padidėjimą (~ 55%), palyginti su kontrolinėmis (~ 15%) (papildomas paveikslas S1C). Tačiau 48 valandas po sužalojimo jokio skirtumo nepastebėta (papildomas paveikslas S1C). Kadangi Foxo3a ekspresija migruoja iš oocitų branduolio į citoplazmą aktyvuotuose pirminiuose folikuluose, 17 mes taip pat panaudojome šią molekulę aktyvuotų pirminių folikulų žymėjimui sužeistose kiaušidėse praėjus 6 val. Po operacijos. Kaip parodyta papildomame S1D paveiksle, Foxo3a ekspresija pirmykščių folikulų oocituose buvo perkelta iš branduolio į citoplazmą šalia pjūvio, o branduolinis dėmes oocitai išlaikė per atstumą nuo žaizdos. Šie rezultatai rodo, kad signalai, sukeliantys folikulų aktyvaciją po operacijos, atsirado iš kiaušidžių intersticinių ląstelių, atsirandančių maždaug per 6 valandas po operacijos.

Traumos sukeltą folikulų aktyvaciją blokuoja mTOR inhibitorius rapamicinas

Dėl ryškių p-rpS6 signalų pokyčių iš stromos į pirmykščius folikulus po operacijos, mes hipotezavome, kad mTOR signalizacijos kelias dalyvauja pradinių folikulų indukcijoje šalia pjūvio vietos. Pelėms buvo sušvirkštos dvi specifinių inhibitorių injekcijos, apimančios mTOR inhibitorių rapamiciną, PI3K inhibitorių AKT VIII ir MAPK inhibitorių U0126 12 val. Prieš operaciją ir netrukus po jos (1A pav.). Palyginti su nepažeista kiaušidžių kontrole, visi inhibitoriai parodė specifinį jų atitinkamų signalizacijos kelių blokavimą pažeistose kiaušidėse praėjus 6 valandoms po operacijos (2a paveikslas, raudoni rėmeliai). Po to skirtingose ​​vystymosi stadijose esantys folikulai buvo įvertinti poromis, kiaušidėmis, surinktomis po 3 savaičių. Tik rapamicinu gydytoje grupėje buvo panašios folikulų proporcijos tarp kontrolinės ir pažeistų kiaušidžių (2b paveikslas). Pelėms, kurios buvo gydomos Akt VIII ir U0126, folikulų vystymosi pagreitis vis dar buvo stebimas kaip augančių folikulų procentinės dalies padidėjimas (2b paveikslas). Be to, tik rapamicinu gydytoms pelėms buvo parodytas visiškas p-rpS6 slopinimas ant chirurgiškai gydytų kiaušidžių, kai Foxo3a 6 valandas po operacijos išlaikė savo branduolinį dažymą pirmykščiuose oocituose (2c paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad mTOR signalo perdavimo kelio stimuliacija kiaušidžių stromoje yra svarbi pradinio folikulo sužalojimo suaktyvinimui.

Image

Traumos sukeltą folikulų aktyvaciją blokuoja mTOR inhibitorius rapamicinas. Pelės buvo gydomos specifiniais signalo perdavimo inhibitoriais 12 valandų prieš operaciją, o kita injekcija buvo atlikta iškart po operacijos. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 val. Arba 3 savaitėms po operacijos. C, kontrolinės kiaušidės; S, chirurginiu būdu apdorotos kiaušidės; rapamicinas, mTORC1 inhibitorius; Akt VIII, Akt inhibitorius; U0126, MAPK inhibitorius. a ) Specifinis atitinkamų signalizacijos kelių slopinimas inhibitoriais. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 val., Kad būtų galima atlikti Vakarų imunoblotų analizę. Raudonas blokas parodo atitinkamo signalo žymens fosforilinimo lygį po gydymo specifiniu inhibitoriumi. b ) Folikulų pasiskirstymas porose kiaušidėse ( n = 5) po gydymo inhibitoriais. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 3 savaitėms po operacijos. Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± SEM ** P <0, 01, * P <0, 05, palyginti su kontroliniais. Primas, pirmykštis folikulas; Prima, pirminis folikulas; Sek., Antrinis folikulas; Ankstyvas, ankstyvas priešakinis folikulas; Vėlyvasis, vėlyvasis antralinis folikulas; CL, geltonkūnis. c ) p-rpS6 (kairėje) ir Foxo3a (dešinėje) imuninis dažymas šalia pjūvio po gydymo rapamicinu. Pažeistos kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 valandoms po operacijos. Taškinės linijos, pjūvis; strėlės, pirmykščiai folikulai. Strypai = 100 μm

Visas dydis

Postranskripcinis mTOR signalizacijos kelio reguliavimas po kiaušidžių operacijos

Kaip pagrindinis molekulinis centras, integruojantis kelis signalizacijos kelius, mTORC1 yra pagrindinis baltymų sintezės reguliatorius, jungiantis maistinių medžiagų jutimą prie ląstelių augimo ir proliferacijos. 18 Kadangi mTORC1 inhibitorius rapamicinas gali veiksmingai užkirsti kelią chirurgijos sukeltai folikulų aktyvacijai, mes pabandėme ištirti mechanizmą transliacijos požiūriu, atlikdami polisomų profiliavimą. Polisomų profiliavimas buvo plačiai naudojamas tiriant ląstelių transliacijos būklę įvairiomis fiziologinėmis sąlygomis ir aplinkos įtampai. 19, 20, kaip parodyta 3a paveiksle (viršutinis kanalas), kiaušidžių pažeidimas padidino transliacijos padidėjimą visame pasaulyje praėjus 6 val. Po operacijos, o polisomos ir 40S-60S-80S srities po kreive santykis padidėjo 26, 8%, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. (3b pav.). Tačiau šį padidėjimą visiškai sustabdė gydymas rapamicinu (3a paveikslas, apatinis kanalas; ir 3b pav.). Tada mes išskirėme sumines ir polisomines mRNR RNR-seq analizei. Abiem atvejais palyginome kontrolę ir priešingos pusės chirurginiu būdu apdorotos kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 valandoms po operacijos. Genai, aptikti pagal bendrą ir polisominių RNR-seq reikšmingą sutapimą, rodo, kad dauguma transkribuotų mRNR buvo perkeltos (4a paveikslas ir papildoma S1 lentelė). Tada palyginome diferencijuotai išreikštus baltymus koduojančius genus tarp neoperuotų ir operuotų kiaušidžių iš viso ir su polisomais susijusių mėginių (FDR <0, 05). Tarp 2280 ir 1498 genų, kurie buvo atitinkamai diferencijuoti bendroje ir polisominėse frakcijose, 596 genų ekspresija buvo persidengusi; 1684 buvo diferencijuotai išreikšti visame mėginyje, o 902 - tik polisomų frakcijose (4b paveikslas ir papildoma S2 lentelė). Skirtingai išreikšti genai buvo toliau patvirtinti atsitiktine tvarka atrinktų genų realiojo laiko RT-PGR kiekvienoje frakcijoje (4c paveikslas ir papildomas S2A paveikslas). Rezultatai atspindi post-transkripcijos reguliavimo egzistavimą po kiaušidžių operacijos. KEGG analizė naudojant diferencijuotai išreikštus genus polisomų mėginiuose atskleidė, kad neuroaktyviosios ligandų ir receptorių sąveikos buvo tarp pagrindinių būdų, reaguojančių į žalą (FDR <0, 001) (4d paveikslas ir papildoma S3 lentelė). Kasdami neuroaktyvius ligandų ir receptorių sąveikos genus, mes nustatėme, kad NGF (bet ne kiti neurotropinų (NT) šeimos nariai) žymiai padidėjo operuotų kiaušidžių tiek bendroje, tiek polisominėje frakcijose (papildomas S2B paveikslas). Visų mRNR, surinktų skirtingais laiko momentais po operacijos, RT-PGR parodė dinaminę NGF ekspresiją, tuo tarpu NGF mRNR poslinkis į polisomines frakcijas ir vakarų blotinimo rezultatas parodė padidėjusį NGF transliaciją praėjus 6 valandoms po operacijos (4e pav.). Įdomu tai, kad NGF imunohistochemija parodė lokalizuotą NGF apribojimą intersticinėse ląstelėse netoli pjūvio (4f pav.). Rezultatai rodo, kad lokalizuota NGF indukcija intersticinėse ląstelėse gali dalyvauti reguliuojant selektyvų folikulų aktyvavimą po operacijos.

Image

Gydymas rapamicinu slopina visuotinio transliacijos padidėjimą po kiaušidžių operacijos. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 valandoms po operacijos. a ) Kontrolinių (C) ir chirurginiu būdu gydytų (S) kiaušidžių polisomų profiliai su rapamicino injekcijomis arba be jų. ( b ) Polisomų / 40S-60S-80S santykis buvo išmatuotas išmatuojant plotus po polisomos ir 40S-60S-80S smailėmis. Buvo atlikti trys savarankiški eksperimentai. Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± SEM; ** P <0, 01, parodantis reikšmingą transliacijos padidėjimą operuotų kiaušidžių metu, palyginti su kontrolinėmis, neoperuotomis kiaušidėmis

Visas dydis

Image

Postranskripcinis genų ekspresijos reguliavimas po kiaušidžių operacijos. Pora kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 val. Po operacijos, kad būtų nustatyta RNR visuma arba polisoma. C, kontrolinės kiaušidės; S, chirurginiu būdu apdorotos kiaušidės. a ) Venno diagrama, rodanti visų aptiktų genų ir polisomų RNR-seq sutapimą. ( b ) Buvo palygintos visų ir polisomų mėginių LogFC (kartų pokyčio) vertės. Polisominės frakcijos ( x ašis) logFC vertės (S palyginti su C) buvo nubraižytos pagal visos frakcijos ( y ašies) logFC reikšmes. Duomenų taškai yra spalvoti atsižvelgiant į kiekvienos frakcijos pokyčius. Mėlyna, genai, kurie nebuvo diferencijuoti kiekvienoje frakcijoje; raudoni genai, parodantys išraiškos pokyčius abiejose sąlygų grupėse, turėjo aukštas (arba mažas) logFC reikšmes (> 1, 0 / <- 1, 0); žali, diferencijuotai išreikšti genai arba polisomų frakcijoje, arba bendroje frakcijoje. c ) RNR seq duomenų tikru laiku patvirtinimas kiekvienoje frakcijoje atsitiktinės atrankos būdu. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SEM ** P <0, 01, palyginti su kontrolinėmis kiaušidėmis. ( d ) diferencialiai išreikštų RNS-Seq genų KEGG analizė (FDR <0, 001). e ) Realaus laiko RT-PGR buvo atlikta Ngf ekspresijai bendrame (viršutiniame skydelyje) ir polisomomis susijusiose mRNR (apatiniame skydelyje). Bendros mRNR buvo surinktos praėjus 1, 3, 6, 12, 24 arba 48 valandoms po kiaušidžių operacijos. Kiaušidės buvo surinktos praėjus 6 val. Po operacijos, norint atlikti polisomų profiliavimą. RNR išskyrimui ir realaus laiko PGR buvo renkamos frakcijos, vaizduojančios laisvą RNR (mėlyna, 1–3 frakcijos), 40–60–80S (žalia, 4–11) ir polisoma (raudona, 12–25). Pradinis (apatinis skydelis), NGF baltymo ekspresijos Western blot ir β -tubulino ekspresija buvo naudojami kaip vidinė kontrolė. f ) Diferencinė NGF išraiška proksimaliniame (P) ir distaliniame pjūvio plotuose (D) praėjus 6 valandoms po operacijos (raudoni rėmeliai). Apatinis, P arba D sričių amplifikacija raudonais kadrais. Strypas = 100 μm

Visas dydis

NGF veikia prieš mTORC1 intersticinėse ląstelėse, kad po operacijos suaktyvintų pirmykščius folikulus

Norint įvertinti, ar NGF aktyvina pirmykščius folikulus, naujagimių (P2.5) pelių kiaušidės buvo gydomos NGF ir surinktos analizei in vitro kultūros sistemoje. Western blot analizė parodė dinaminius Akt, p70S6K ir rpS6 fosforilinimo pokyčius per pirmąsias 24 gydymo valandas (5a paveikslas). Naudodami Kitl (rinkinio ligandą) kaip žymeklį, kad įvertintume folikulų augimą po 24 valandų auginimo, mes pastebėjome, kad NGF žymiai padidino Kitl mRNR ir kad šį padidėjimą galima visiškai užblokuoti naudojant mTORC1 inhibitorių rapamiciną (5b pav.). Folikulų skaičius taip pat parodė, kad gydymas NGF paspartino folikulų vystymąsi po 5 dienų auginimo in vitro (5c paveikslas). Tada vietoj rapamicino buvo atliktas išankstinis gydymas NGF inhibitoriumi K252a, atliekant dvi injekcijas 12 valandų prieš operaciją ir netrukus po jos. Skirtingai nuo visiško p-rpS6 blokavimo tiek kontroliuojamose, tiek ne operuotose kiaušidėse, gydymas K252a veiksmingai slopino p-rpS6 ekspresijos padidėjimą operuotose kiaušidėse 6 valandas po operacijos (6a pav.). Po trijų savaičių, kai buvo surinktos kiaušidės folikulų išsivystymui tikrinti, pradiniai folikulai vis dar buvo aptikti šalia pjūvio vietos, o folikulų proporcijos skirtinguose etapuose neparodė skirtumų tarp suporuotų kontrolinių ir chirurginiu būdu gydytų kiaušidžių (6b paveikslas). Mūsų rezultatai rodo, kad chirurgija paskatino lokalizuotą NGF reguliavimą intersticinėse ląstelėse, kurios per mTORC1 signalizacijos kelią suaktyvino aplinkinius pirmykščius folikulus.

Image

Pirminių folikulų suaktyvinimas NGF per mTOR signalizacijos kelią. P3 kiaušidės 24 valandas buvo gydomos NGF, rapamicinu arba NGF kartu su rapamicinu. Po dvidešimt keturių valandų jie buvo nuplauti ir auginimas buvo tęsiamas dar 96 valandas. a ) mTOR signalizacijos kelio stimuliavimas po gydymo NGF. Kiaušidės buvo surinktos per 1, 3, 6, 12 arba 24 valandas. Kiaušidžių baltymai buvo aptikti Western blot metodu, naudojant specifinius antikūnus PI3K ir mTOR signalizacijos keliams. b ) Kitl raiška kiaušidėse iš skirtingų grupių grupių po 24 valandų gydymo. Actb išraiška buvo naudojama kaip vidinė kontrolė. c ) Kiaušidžių ( n = 5) folikulų skaičiavimas po gydymo NGF. Kiaušidės buvo surinktos po 96 valandų auginimo in vitro . Visi pateikti duomenys yra gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM * P <0, 05, palyginti su kontroliniais. Primas, pirmykštis folikulas; Prima, pirminis folikulas. Sekundinis antrinis folikulas

Visas dydis

Image

Folikulų aktyvacijos slopinimas NGF inhibitoriumi K252a po kiaušidžių operacijos. Pelėms buvo atliktos dvi K252a injekcijos prieš operaciją ir netrukus po jos. Kiaušidės buvo surinktos atitinkamai po 6 ir 3 savaičių. a ) Kiaušidžių baltymų vakariniai blotai su specifiniais p-rpS6 (S235 / 6) ir β -tubulino antikūnais. β- tubulinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. Apatinio skydelio Western blot'ų densitometrija buvo kiekybiškai įvertinta ir parodyta p-rpS6 ir β -tubulino santykiais. Santykiai pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiai ± SEM. * P <0, 05; ** P <0, 01. b ) Kiaušidžių morfologija ir folikulų skaičius nustatomas praėjus 3 savaitėms po operacijos. Viršutinis skydelis, pažeistų kiaušidžių dažymas H&E; punktyrinės linijos, chirurginis pjūvis; raudonas rėmelis, pirmykščiai folikulai šalia pjūvio vietos, parodyti dešinėje nuotraukoje (juodos rodyklės). Visi strypai = 100 μm . Apatinis skydelis, folikulų pasiskirstymas porose kiaušidėse ( n = 5) po gydymo K252a. Kontrolinių ir chirurgiškai gydytų kiaušidžių skirtumų nepastebėta. Primas, pirmykštis folikulas; Prima, pirminis folikulas; Sek., Antrinis folikulas; Ankstyvas, ankstyvas priešakinis folikulas; Vėlyvasis, vėlyvasis antralinis folikulas; CL, geltonkūnis

Visas dydis

Padidėjęs pirmykščių folikulų aktyvacija po ovuliacijos

Žinduolių kiaušidėse ovuliacijos procesas yra panašus į nedidelę traumą, kuri organizme įvyksta natūraliai ir cikliškai. Mes spėjame, kad ovuliacija taip pat suaktyvins pirmykščius folikulus per panašų mechanizmą. Kiaušidės buvo surinktos skirtingais laiko momentais (NC, PMSG 48 val., HCG 10, 12, 14 ir 18 val.) Po superovuliacinės stimuliacijos. Western blot analizė parodė NGF ir p-rpS6 ekspresijos padidėjimą po hCG injekcijos ir abu pasiekė piką hCG po 14 h (7a pav.). Tada folikulų aktyvacija buvo įvertinta dažant p-rpS6, o folikulų skaičiavimo rezultatai parodė laipsnišką p-rpS6 teigiamų folikulų padidėjimą ovuluotose kiaušidėse nuo hCG 10–18 val. Esant 18 hCG, beveik 68% suskaičiuotų pirmykščių folikulų yra teigiami p-rpS6, tai yra 4 kartus ir 2, 8 karto daugiau nei atitinkamai stimuliuotų (NC) ir PMSG gruntuotų (PMSG 48 h) kiaušidėse (7b paveikslas). . Imuninis dažymas taip pat parodė p-rpS6 teigiamų pradinių folikulų padidėjimą kiaušidėse, surinktose hCG 18 val., Ir tiek p-rpS6 teigiami, tiek neigiami pirminiai folikulai buvo aptinkami tame pačiame vaizde (7c pav.). Rezultatai rodo, kad ovuliacija gali suaktyvinti pirmykščius folikulus padidinus NGF ir mTOR signalizacijos kelią.

Image

Ovuliacija sukelta pirmykščio folikulo aktyvacija. Pelėms, esant P25, buvo sušvirkšta viena ipm PMSG, o po 48 val. - dar viena hCG injekcija. Kiaušidės buvo renkamos nurodytais laiko momentais (NC, PMSG 48 val., HCG 10 val., HCG 12 val., HCG 14 val. Ir hCG 18 val.). NC, kontroliuokite gyvūnus be jokios hormonų injekcijos. ( a ) NGF ir p-rpS6 baltymų ekspresija imunoblotu. ( b ) p-rpS6 teigiamų pradinių folikulų proporcijos. P-rpS6 dažymui buvo naudojami du nuoseklūs pjūviai iš kiekvienos kiaušidės ir iš kiekvienos grupės buvo parinktos mažiausiai trys kiaušidės. * P <0, 05; ** P <0, 01, palyginti su NC kontrole. c ) p-rpS6 ekspresija superovuliuotose pelių kiaušidėse, praėjus 48 val. po PMSG (kairiajame skydelyje) ir 18 val. po hCG (dešiniame skydelyje). Juodos strėlės, p-rpS6-neigiami pirmykščiai folikulai; raudonos strėlės, p-rpS6 teigiami pirmykščiai folikulai. Strypas = 100 μm . d ) schema, rodanti selektyvų pirmtakų folikulų aktyvavimą pelių kiaušidėse. Kiaušidžių operacija ar ovuliacijos sukeltas sužalojimas iškart stimuliavo lokalizuotą NGF ekspresiją intersticinėse ląstelėse (rožinė sritis). Tada buvo suaktyvintas stromos mTOR signalizacijos kelias, o po to sekė nuoseklus aktyvinimas mTOR signalo perdavimo keliu priešgranulozinėse ląstelėse ir link oocitų. Taigi pirmykščiai folikulai buvo galutinai suaktyvinti. Tačiau tie pirmykščiai folikulai, esantys atstumu nuo stimulų, išlaikė ramybės būseną (balta sritis)

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime parodėme lokalų pirminių folikulų aktyvavimą po kiaušidžių traumos. Operacijos sukeltas trumpalaikis mTORC1 signalų padidėjimas intersticinėse ląstelėse buvo būtinas folikulų aktyvacijai arti pjūvio vietos. Žaibiškai padidėjus transliacijos lygiui pažeistoje kiaušidėje, buvo nustatyta, kad neurotrofinio augimo faktoriaus šeimos narys NGF dalyvavo aktyvinant neveikiančius folikulus per mTOR signalizacijos kelią. Mes siūlome, kad po kiaušidžių operacijos, greitai padidėjus NGF lygiui šalia pjūvio vietos, būtų suaktyvintas vietinis stromos mTOR signalizacijos kelias, po to sekantis mTORC1 aktyvinimas iš priešgranuliuotų ląstelių į kiaušialąstes ir galiausiai suaktyvinantis neveikiančius folikulus ( 7d pav.). Tai gali būti bendras atrankinio pirmtakų folikulų įdarbinimo mechanizmas, kuris nustatomas signalizuojant apie supančios mikroaplinkos pokyčius.

Jau seniai pripažinta, kad ramybėje esantys pirmykščiai folikulai yra nuolat slopinami ir neveikia tol, kol juos suaktyvina juos supanti mikroaplinka. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad folikulų aktyvacija inicijuojama padidinus mTORC1 signalus priešgranulozinėse ląstelėse. 8, 21 Mūsų tyrimas taip pat nustatė laipsnišką pirminių folikulų aktyvaciją operuotose kiaušidėse, tačiau pirminiai signalai prasidėjo aplinkinėse intersticinėse ląstelėse. Atrodo, kad nuoseklų ir ribotą pirmykščių folikulų aktyvavimą atspindi šie aspektai: pirma, po kiaušidžių operacijos, nors iš karto stimuliuojama daug signalizacijos kelių, tik mTORC1 signalų aktyvacija buvo apribota pjūviu, parodant dinaminius pokyčius skirtingose ​​ląstelėse. tipai; antra, du folikulų aktyvavimo žymenys, p-rpS6 ir Foxo3a, rodė diferencialinę išraišką pirmykščiuose oocituose proksimaliniame ir distaliniame pjūvio plotuose; trečia, palyginti su kitais inhibitoriais, tik išankstinis gydymas mTOR inhibitoriumi rapamicinu blokavo poveikį folikulų vystymuisi, kurį paspartino kiaušidžių sužalojimas; galiausiai, rapamicinu gydytose kiaušidėse, lydint visam mTORC1 signalų slopinimui, folikulų aktyvacijos slopinimas taip pat atsispindėjo Foxo3 branduolio vietoje oocituose šalia pjūvio. Kadangi pirminis folikulų aktyvinimas nepriklauso nuo gonadotropino, pirminio folikulo perėjimą koordinuoja lokaliai gaminami reguliavimo veiksniai, kuriuos gamina pirmykščių folikulų priešgranulinės ląstelės, augimo folikulų granulozės ląstelės ir (arba) stromos ląstelės. 1, 22 Naudojant kiaušidžių chirurgijos modelį, mūsų rezultatai parodo svarbų intersticinio mTOR signalo perdavimo kelią, atsižvelgiant į ribotą ir nuoseklų pirminių folikulų aktyvavimą šalia pjūvio.

Kai sužalojama, žaizda patiria keturias skirtingas, bet persidengiančias fazes: hemostazę, uždegimą, proliferaciją ir atsinaujinimą. 23 Kadangi pagrindiniai ląstelių vidaus organų signalizacijos keliai, susiję su ląstelių atsaku tiek normaliomis, tiek patologinėmis sąlygomis, PI3K / Akt / mTOR ir MAPK keliai buvo išsamiai ištirti po pirminės mechaninės traumos, kai šios kaskados paprastai yra susijusios su ląstelių išgyvenimu ir audinių regeneracija. 12, 14, 24 mTOR, dar žinomas kaip „mechanistinis TOR“, yra didžioji serino / treonino kinazė, veikianti reguliuodama pagrindinius ląstelių atsakus į energijos ar maistinių medžiagų pokyčius ląstelėje. Jis egzistuoja dviejuose biochemiškai ir funkciškai skirtinguose kompleksuose - mTORC1 ir mTORC2, kurie skiriasi savo jautrumu rapamicinui. Pirminiai mTORC1 efektoriai yra p70S6K1 (ribosominio baltymo p70S6 kinazė) ir 4E-BP1 (4E jungiantis baltymas-1). P70S6K1 aktyvacija fosforilina jo pasroviui esantį rpS6 (ribosomų baltymą S6), kuris inicijuoja įvairius su vertimu susijusius veiksmus. 25, 26 Šiame tyrime su polisomais susijusių mRNR padidėjimas žymi reikšmingą bendrojo vertimo padidėjimą po kiaušidžių operacijos. This may be one common mechanism that tissues use to respond to trauma and prepare for wound healing. 27 In the ovary, although there is controversy regarding the existence of female germline stem cells, the long-held view on primordial follicles concerns their non-renewable property. 28, 29 Therefore, it is certain that primordial follicles will be recruited into the growing pool to replenish the loss caused by ovarian damage. Such accelerated depletion of primordial follicles can also be seen in animals with unilateral ovariectomy or in women in their perimenopausal years. 30, 31, 32 In this study, only the mTOR inhibitor rapamycin completely blocked the injury-induced activation of primordial follicles. It is possible that the other two pathways participate in regulating other aspects of tissue remodeling as they do in the central nervous system, including neuronal or vascular regeneration. 15, 33, 34 However, our study revealed that only the mTOR signaling pathway (especially the mTOR signaling pathway in interstitial cells) was specifically involved in regulating primordial follicle activation within the injury penumbra.

The NTs are a family of small polypeptide growth factors that contain 5 members, NGF, brain-derived neurotrophic growth factor, NT-3, NT-4/5 and NT-6. Evidence is mounting that NTs have important roles not only in the peripheral and central nervous systems but also in normal ovarian development and functioning. 35, 36, 37 In our study, in contrast to the other members of the neurotropins, polysome RNA-seq revealed a marked increase in NGF mRNA after ovarian surgery; and this was further verified by real-time PCR, western blotting and immunohistochemistry. Further studies using in vitro cultured newborn mouse ovaries demonstrated that the stimulatory effect of NGF on primordial follicles was mediated by the activation of the mTOR signaling pathway. When an inhibitor of the NGF receptor (TrkA), K252a, was injected into operated mice, it effectively blocked the increase in follicular activation in the operated ovary. NGF binds to its respective receptor TrkA and/or P75NTR to mediate different cellular functions through various downstream signaling pathways, such as PI3K, Erk/MAPK to mediate survival and differentiation, RhoA kinase for cytoskeletal organization and neurite outgrowth, or the JNK pathway for apoptosis through P75NTR only. 38 Investigators have also reported the involvement of mTOR signals in NGF-mediated survival, cell migration, or VEGF production in different cell types. 39, 40 As a wound exerts a disruptive effect on the normal anatomical structure of the ovary, healing occurs in a very orderly and efficient manner in order to restore its anatomic continuity and function. It is also possible that NGF participates in regulating other aspects during ovarian remodeling; for example, neural or vascular regeneration through other signaling pathways. However, at least in our study, the involvement of NGF in selective activation of primordial follicles was mediated by the mTOR signaling pathway.

Mammalian ovulation is a distinct biologic phenomenon that requires the rupture of follicles at the surface of the ovary. In the older experimental literature, ovulation was linked to acute inflammation responding to a variety of factors. 41 Thus, the process of ovulation may be similar to that of minor acute tissue trauma, but occurs naturally and undergoes cyclic phases in the body. In fact, our results showed significant increase of follicular activation after superovulation. As the expression of NGF has shown to be concomitant with the preovulatory rise of gonadotropins in ovaries of many species, 37 our collective data obtained from ovarian surgery suggested that a similar mechanism exists for ovulation-stimulated follicular activation. Findings from previous studies have suggested a possible role for NGF in many events surrounding ovulation. 34 In alpacas, for example, in vivo treatment with NGF induced ovulation. 42 Herein, in contrast to the many known functions of NGF in ovulation, we demonstrated a close link between the ovulatory rise in NGF levels and primordial follicle activation. This may represent a new mechanism by which NGF regulates initial follicular recruitment under physiologic conditions via the mTOR signaling pathway (Figure 7d).

In summary, our study showed selective activation of primordial follicles near the incision site after ovarian surgery. This trauma induced a local increase in NGF within interstitial cells, and is involved in regulating follicular activation through the mTOR signaling pathway. The injury accelerated follicular activation and development, and can be used to explain the success of polycystic ovarian syndrome treatment by ovarian wedge resection or ovarian laser or diathermy 'drilling.' Furthermore, although ovarian surgery has been widely applied for removing of ovarian cysts and in order to rescue follicles, it appears that it is much better to preserve primordial follicles so as to avoid the detrimental effects induced by the injury itself. Therefore, blocking the mTOR signaling pathway or NGF function may be a good choice for fertility preservation in women undergoing ovarian surgery.

medžiagos ir metodai

Eksperimentiniai gyvūnai

CD1 female mice at 6 weeks of age were obtained from Vital River Laboratories (Beijing, China) and housed in the animal facility at Nanjing Medical University. Mice were maintained under a 12/12-h dark–light cycle at 22 °C with free access to food and water. All animal protocols were approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of Nanjing Medical University. The mice were anesthetized with ketamine hydrochloride (80 mg/kg) and xylazine (16 mg/kg; K113, Sigma, St. Louis, MO, USA). Partial ovarian resection was performed unilaterally with the contralateral ovary left unoperated as a control (Figure 1a). Mice were killed at 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, or and 3 weeks, respectively, and paired ovaries were collected for analysis. In another experiment, inhibitors, including MAPK inhibitor U0126 (2 mg/kg, S1102, Selleckchem, Houston, TX, USA), Akt inhibitor Akt VIII (20 mg/kg, 612847-09-3, MCE, Shanghai, China), mTOR inhibitor rapamycin (2 mg/kg, R8781, Sigma) or NGF inhibitor K252a (500 ug/kg, 2013, Biovision, Milpitas, CA, USA), were separately injected into the mice 12 h before ovarian surgery with another injection performed just after the surgery. The dose for inhibitor injections were used according to previous reports. 43, 44, 45, 46, 47 Paired ovaries were collected at 6 h or 3 weeks for further analysis. To evaluate follicular activation after superovulation, CD1 mice at 25 days of age received one ip injection of PMSG (5 IU, 110253130, Ningbo, China) followed by another injection of hCG (5 IU, 110251282, Ningbo) 48 h later. Ovaries were collected 48 h post-PMSG and 10 h, 12 h, 14 h or 18 h post-hCG for western blot analysis and immunohistochemsitry.

Follicle counting

Ovaries from operated mice, superovulated mice, and in vitro cultured ovaries from newborn mice were collected and fixed in 10% buffered formalin for 12 h, embedded in paraffin, serially sectioned at a thickness of 5 μ m, and then stained with hematoxylin and eosin. To evaluate follicular development in operated mice, all follicles were counted at every fifth section using the fractionator and nucleator principles. 16 Follicles were only counted when the dark-staining nucleolus was seen within the nucleus of the oocytes to prevent recounting the same follicle. To evaluate the activation of primordial follicles, two serial sections from the largest cross-section through the center of each ovary were chosen for p-rpS6 staining. The average of p-rpS6-positive primordial follicles/total primordial follicles was used as the percentage of activated primordial follicles in each section. We used the same standards to count follicles in in vitro cultured newborn mouse ovaries. All sections were counted by two independent individuals for comparison.

Imunohistochemija

Paired ovaries were collected at 6 h after ovarian resection to detect the expression of p-rpS6, Foxo3a and NGF. Briefly, 5 μ m sections were deparaffinized, rehydrated and endogenous peroxidase activity was blocked by incubation in 3% hydrogen peroxide in methanol for 20 min. Antigen retrieval pretreatment was carried out by boiling the sections in 0.01 M citrate buffer, pH 6.0 for 10 min. Immunohistochemical analyses were performed using a Histostain Kit (856743, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with antibodies against p-rpS6 (S235/236) (4858, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Foxo3a (ab53287, Abcam, Cambridge, MA, USA) and NGF (ab6199, Abcam) overnight at 4 °C. For some sections, primary antibodies were replaced with non-immune rabbit IgG as negative controls.

Immunoblotting analyses

Proteins were extracted by RIPA lysis buffer (P0013B, Beyotime Institute of Biotechnology, Beijing, China) with protease inhibitor cocktails (M221, Amresco, Solon, OH, USA). Proteins were separated by electrophoresis and after electronic transfer, the membranes were blocked and incubated with specific antibodies overnight at 4 °C. Antibodies against S6K1 (2708), p-S6K1 (T389) (9234), rpS6 (2217), p-rpS6 (S235/6), p-Erk1/2 (9101), p-MEK (9121), p-Akt (S473) (9271), Akt (9272) and β -tubulin (2128) were all rabbit antibodies and purchased from Cell Signaling Technology. Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (SC2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) were then used to detect proteins through enhanced chemiluminescence (RPN2232, Amersham, Washington, NY, USA).

Real-time PCR analyses

cDNAs were synthesized from total RNAs or polysome-associated RNAs by using a FastQuant RT Kit (TIANGEN Biotech, Beijing, China). SYBR-based qPCR was then performed using Bestar qPCR Mastermix (DBI-2225, DBI Bioscience, Ludwigshafen, Germany) on an ABI StepOnePlus platform (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Quantification of various mRNAs was performed by using the actin amplification signal as the internal control. Primer sequences used in the qPCR are listed in Supplementary Tables S4 and S5. The specificity of the PCR products was assessed by melting curve analyses and amplicon size was determined by electrophoresis in 2% agarose gels.

In vitro ovarian organ culture

Ovaries from the P3 female pups were harvested and cultured on inserts (PICM01250, Millipore, Billerica, MA, USA) with 0.4 ml culture medium added to the bottom of each well. Each insert held 4–5 ovaries and a drop of medium was added to the top of each tissue fragment to prevent drying. 17 The culture medium was MEMalpha supplemented with 0.23 mM pyruvic acid, 50 mg/l streptomycin sulfate, 75 mg/l penicillin G and 3 mg/ml BSA. Ovaries were randomly distributed to the control and the treated groups. In the treated groups, the ovaries were incubated with 250 nM rapamycin (Sigma), 100 nM recombinant mouse beta-NGF (1156-NG/CF, R&D, Minneapolis, MN, USA) or rapamycin together with NGF for 24 h. After washing out the chemicals, the culture continued in control medium for 96 h (24+96 h) and ovaries were collected at 24 and 96 h, respectively.

Polysome profiling

Control non-operated and operated ovaries were collected at 6 h after surgery. Approximately 20 ovaries were lysed with lysis buffer (100 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 50 mM HEPES, pH 7.4, 2 mM MgCl 2, 10% glycerol, 1 mM DTT, 100 mg/ml cycloheximide, 20 U/ml RNase inhibitor (3335402001, Roche), plus protease inhibitor cocktail (04693116001, Roche, Basel, Switzerland)). Lysates were centrifuged at 12 000 g for 10 min at 4 °C. Supernatants were divided into two parts, one part for total RNA preparation, whereas the other part was loaded onto a 10 ml 20–50% (W/V) linear sucrose gradient made by Gradient Master (BioComp, Fredericton, NB, Canada) and centrifuged in a SW-41 Ti rotor (Beckman, Brea, CA, USA) for 150 min at 38 000 rpm at 4 °C. Polysome profiles were collected with a fraction collector (Gilson, Middleton, WI, USA) and determined by monitoring RNA absorbance (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) at 254 nm. Twenty-five fractions (with each fraction containing 0.45 ml gradients) were collected from the top of the gradients into cold microfuge tubes and immediately placed on dry ice. Fractions 1–11 were designated as non-translated with fractions and fractions 12–25 were designated as polysomes. Gradient fractions were supplemented with Cas9 mRNA to control for the efficiency of RNA recovery. 48 Total RNA and polysome-associated RNA were precipitated with ethanol overnight and purified with RNeasy Plus Micro kit (74034, Qiagen, Germantown, MD, USA).

RNR-seq

Total mRNA or polysome-associated mRNA ( μ g) was subjected to construction of cDNA libraries by using NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (E7645-S, NEB, Ipswich, MA, USA). Finished libraries were sequenced by Illumina HiSeq 2000 for 100-bp paired-end sequencing. The RNA-seq reads were analyzed by TopHat, 49 Cufflinks 50 and DESeq. 51 Genes mapped with at least 10 reads were considered as the threshold of quantifiable genes in the RNA-seq data. Multiple testing corrections were used according to the Benjamin Hochberg FDR method. To identify DEGs, stably expressed protein-coding genes were filtered according to statistical significance (FDR<0.05) and greater than twofold changes were considered to be significant. A gene enrichment analysis was performed with DAVID. 52

Statistinė analizė

The chi-square test, or one-way ANOVA and Mann–Whitney U -test were used to evaluate differences between groups. Data are means±SEM A value of P <0.05 was considered to be statistically significant.

Duomenų prieinamumas

Transcriptome and translatome sequence reads have been deposited in the NCBI.SRA database with the accession number PRJNA357978. Raw supporting data are provided in the additional files (Supplementary Tables S1).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Supplementary Figures, Figure Legends and Tables

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma S1 lentelė

  2. 2.

    Papildoma S2 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S3 lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)