Resveratrolio analogas 3,4,4′-trihidroksi-trans-stilbenas in vitro sukelia apoptozę ir autofagiją žmogaus nesmulkialąsteliniame plaučių vėžio ląstelėje | acta pharmaologica sinica

Resveratrolio analogas 3,4,4′-trihidroksi-trans-stilbenas in vitro sukelia apoptozę ir autofagiją žmogaus nesmulkialąsteliniame plaučių vėžio ląstelėje | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti 3, 4, 4′-trihidroksi-trans-stilbeno (3, 4, 4′-THS), resveratrolio analogo, poveikį žmogaus nesmulkialąsteliniam plaučių vėžio (NSCLC) ląstelėms in vitro .

Metodai:

NSCLC A549 ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu. Ląstelių apoptozė buvo įvertinta naudojant srauto citometriją ir TUNEL analizę. Ląstelių nekrozė buvo įvertinta naudojant LDH tyrimą. Su apoptoziais arba autofagija susijusių baltymų ekspresija buvo matuojama naudojant Western blotting. Rūgštinių skyrių susidarymas buvo aptiktas naudojant AO dažymą, neutralų raudoną dažymą ir Lysotracker-Red dažymą. LC3 punkcijos buvo tiriamos fluorescencine mikroskopija.

Rezultatai:

Gydymas 3, 4, 4′-THS (10-80 μmol / L) priklausomai nuo koncentracijos slopino ląstelių gyvybingumą. Tai nesukėlė ląstelių nekrozės, bet sukėlė apoptozę, lydinčią suskaidyto PARP, kaspazės3 / 9 ir Bax padidėjusį reguliavimą, Bcl-2 žemyn reguliuojant ir išgyvenant. Tai taip pat padidino rūgščių skyrių susidarymą, LC3-II kaupimąsi ir GFP-LC3 pažymėtas autofagosomas ląstelėse. Tai slopino nuo mTOR priklausomą kelią, tačiau nepakenkė autofaginiam srautui. 3, 4, 4′-THS sukeltą ląstelių žūtį sustiprino autofagijos inhibitoriai 3-MA (5 mmol / L) arba Wortmanninas (2 μmol / L). Be to, gydymas 3, 4, 4′-THS padidino ROS lygį ląstelėse, o gydymas kartu su 3-MA dar padidino ROS lygį. 3, 4, 4′-THS sukelta apoptozė ir autofagija ląstelėse buvo susilpninta NAC (10 mmol / L)

Išvada:

3, 4, 4′-THS in vitro sukelia ir apoptozę, ir autofagiją NSCLC A549 ląstelėse. Autofagijos inhibitoriai skatina 3, 4, 4′-THS sukeltą A549 ląstelių apoptozę, todėl 3, 4, 4′-THS ir autofagijos inhibitoriaus derinys teikia daug žadančią NSCLC gydymo strategiją.

Įvadas

Plaučių vėžys yra pagrindinė mirties nuo vėžio priežastis - 2013 m. Ji sudarė maždaug 26% visų moterų ir 28% visų vyrų vėžio atvejų 1 . Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC), įskaitant plokščiąją karcinomą, adenokarcinomą ir stambiųjų ląstelių karcinomą, sukelia daugiau kaip 80% visų plaučių vėžio atvejų ir yra susijęs su prasta prognoze bei prastu vidutiniu išgyvenamumu 2 . Diagnozės nustatymo metu daugiau nei pusei šių pacientų negalima atlikti operacijos, o chemoterapija išlieka viena iš labiausiai paplitusių gydymo būdų, net jei ji susijusi su daugybe šalutinių reiškinių 3 . Stipriau veikiančių junginių, turinčių mažiau šalutinių poveikių, gydant NSCLC, atradimas ir kūrimas tapo vis aktyvesne tyrimų sritimi.

Manoma, kad natūralūs produktai (NP) yra svarbus naujų cheminių medžiagų, galinčių padėti gydyti įvairius žmonių vėžius, įskaitant NSCLC 4, šaltinis. NP naudoti kaip priešnavikinius agentus NSCLC gydymui yra patraukli idėja, nes jie yra lengvai prieinami ir neturi mažo toksiškumo 4 . Resveratrolis (3, 5, 4-trihidroksi- trans -stilbenas, RSV), fitoalexinas, randamas vynuogių, žemės riešutų, šilkmedžio, raudonojo vyno, Polygonum cuspidatum Sieb ir Zucc ir daugelio rūšių maisto odoje, yra vienas iš tokių NP ir turi buvo įrodyta, kad turi priešnavikinį ir chemoprevencinį poveikį 5 . Ankstesni tyrimai parodė, kad resveratrolis veikia ne tik kaip chemoterapinis agentas žmogaus NSCLC A549 ląstelėse, bet ir turi gydomąjį poveikį nuo esamos plaučių karcinomos 6, 7 . Nors didelės resveratrolio dozės gali slopinti A549 ląstelių dauginimąsi, sukeldamos apoptozę ir autofaginę ląstelių žūtį 8, 9, pagrindinis šio junginio naudojimo iššūkis yra tas, kad resveratrolio koncentracija, reikalinga vėžinių ląstelių mirčiai in vitro sukelti , yra per didelė, kad pasiekti in vivo klinikinėje aplinkoje 10, 11, 12 .

Struktūrinis NP modifikavimas yra efektyvus būdas padidinti jų aktyvumą ir sumažinti šalutinį poveikį. Pastaraisiais metais buvo sukurta daugybė sintetinių resveratrolio analogų, taip pat aptikta keletas pagerinto aktyvumo hidroksistitilbenų. Pavyzdžiui, 3, 4, 5-trihidroksi-trans-stilbenas (3, 4, 5-THS) parodė stiprų citotoksinį poveikį žmogaus leukemijos Jurkat ląstelėms, sukeldamas ekstensyvią ląstelių apoptozę esant mažesnei koncentracijai nei resveratrolis 13 . Įrodyta, kad 4, 4′-dihidroksitrans -stilbeno (4, 4′-DHS) antiproliferacinis poveikis ir citotoksiškumas, kurie buvo priskirti DNR polimerazės delta aktyvumo slopinimui ir DNR replikacijai, yra efektyvesni nei resveratrolio 14, 15 . Pakeitus 5-hidroksi grupę resveratrolyje į 4-hidroksi (3, 4, 4′-trihidroksi- trans -stilbeną, 3, 4, 4′-THS; 1 paveikslas), smarkiai padidėja resveratrolio analogų apsauginis poveikis nuo laisvųjų radikalų. - sukelia lipidų peroksidaciją, fotojautrintą DNR oksidacinį pažeidimą ir laisvųjų radikalų sukeltą žmogaus raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę 16 . Be to, pranešama, kad 3, 4, 4′-THS yra veiksmingesnis antiproliferacinis agentas nei resveratrolis žmogaus leukemijos HL-60 ląstelėse16. Tačiau mechanizmas, kuriuo 3, 4, 4′-THS žudo vėžio ląsteles, išlieka neaiškus. Mūsų išankstiniai tyrimai parodė, kad 3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė didelę ląstelių žūtį ir citoplazmos vakuolizaciją. Šios išvados paskatino mūsų susidomėjimą ištirti 3, 4, 4′-THS poveikį A549 ląstelėms, taip pat mechanizmus, palengvinančius šį poveikį.

Image

3, 4, 4′-THS cheminė struktūra. Šio junginio molekulinė formulė yra C14H12O3, o jo molekulinė masė yra 228, 2433 g / mol.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir apdorojimas 3, 4, 4′-THS

3, 4, 4′-THS (grynumas buvo ne mažesnis kaip 99% pagal HPLC analizę) pateikė prof Bo ZHOU (Valstybinė pagrindinė taikomosios organinės chemijos laboratorija, Lanzhou universitetas). 3, 4, 4′-THS buvo ištirpintas DMSO (0, 1 mol / L), kad būtų gautas pradinis tirpalas. A549 ląstelės buvo kultivuojamos RPMI-1640 terpėje (Gibco, Carlsbad, CA, JAV, 11875–093), turinčioje 10% karštyje inaktyvuoto galvijo vaisiaus serumo (FBS, HyClone, Logan, UT, JAV, SV30087.02), penicilino (100 U / ml) ir streptomicino (100 mg / ml) drėkintame inkubatoriuje, esant 37 ° C, 5% CO 2 . Ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS koncentracijomis nuo 10 iki 80 μmol / L, pridedant 5% FBS 3, 6 arba 12 valandų.

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

A549 ląstelės buvo pasodintos į 96 duobučių ląstelių kultūros plokšteles. 3-metiladeninas (3-MA, Sigma-Aldrich, M9281) ir N-acetilcisteinas (NAC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV, A7250) buvo ištirpinti steriliame vandenyje. Wortmanninas (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV, W1628) buvo ištirpintas DMSO. Kai ląstelės pasiekė 80% susiliejimą, jos vieną kartą buvo plaunamos bazine RPMI-1640 terpe (Gibco, Carlsbad, CA, JAV, 31800022). Tada ląstelės buvo apdorotos įvairiais junginiais, kaip nurodyta paveikslų legendose. Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu, kaip aprašyta anksčiau 17 . Gyvybingumas (%) buvo išreikštas kaip = (apdorotos grupės optinis tankis [ OD ] / kontrolinės grupės OD ] × 100%. Kontrolinės grupės gyvybingumas buvo nustatytas 100%.

Laktato dehidrogenazės (LDH) tyrimas

Ląstelių kultūros terpė buvo surinkta po to, kai A549 ląstelės buvo apdorotos DMSO arba 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / l) 12 val. Pagal gamintojo protokolą buvo atliktas LDH tyrimas naudojant LDH rinkinį (Nanjing Jiancheng Co, Nanjing, Kinija).

Dvigubo dažymo aneksinu V / propidium jodidu (PI) srauto citometrija

A549 ląstelės 12 valandų buvo apdorotos įvairiomis 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / l) koncentracijomis, po to plaunamos PBS. Apoptozinių ląstelių skaičius buvo išmatuotas naudojant aneksino V-FITC / PI apoptozės aptikimo rinkinį (DOJINDO Biotechnology, Šanchajus, Kinija, AD10) pagal gamintojo protokolą. Duomenys buvo gauti ir išanalizuoti naudojant srauto citometriją (BD FACSCalibur) ir „Cell Quest“ programinę įrangą.

Western blot analizė

Po apdorojimo ląstelės lizuojamos lizės buferiu, kuriame yra 25 mmol / l Tris-HCl (pH 6, 8), 2% SDS, 6% glicerolio, 1% 2-merkaptoetanolio, 2 mmol / L PMSF, 0, 02% bromfenolio mėlynojo ir proteazės. inhibitoriaus kokteilis (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV, P8340) 10 min. kambario temperatūroje ir virinamas dar 10 min. Visi endotelio baltymų ekstraktai (30 μg) buvo atskirti 12% arba 15% SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze ir perkelti į polivinilideno difluorido (PVDF) membraną (Millipore, Billerica, MA, JAV, ISEQ09120). Membrana užblokuota 5% ( m / t ) sauso pieno be riebalų PBS-Tween 20 (PBST; 0, 05%) 1 valandą ir po to inkubuojama su pirminiais antikūnais (1:10 000 PBST) 4 ° C temperatūroje per naktį. Po 3 plovimų PBST, PVDF membrana buvo inkubuota su atitinkamais HRP konjuguotais antriniais antikūnais (1:20 000) 1 valandą kambario temperatūroje. Imunoreaktyvios juostos buvo sukurtos naudojant Pierce ECL („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV, 32106) Western blotting sistemą. Santykinis baltymų kiekis buvo analizuotas naudojant „Quantity One“ programinę įrangą (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Pirminiai antikūnai prieš PARP (sc-56197), Bcl-2 (sc-492), Bax (sc-20067) ir Survivin (sc-10811) buvo įsigyti iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Dalasas, TX, JAV). Pirminiai antikūnai prieš LC3B (L7543) ir β-aktiną (A1978) buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV). Pirminis antikūnas prieš p62 (610833) buvo pirktas iš „BD Transduction Laboratories“ (San Diegas, CA, JAV). Pirminiai antikūnai prieš p-p70S6K (9206), p70S6K (9202), p-4EBP1 (9456), 4EBP1 (9452), suskaidytą kaspazę-3 (9661) ir suskaidytą kaspazę-9 (9509) buvo įsigyti iš „Cell Signaling Technology“. (Beverlis, MA, JAV). Antriniai HRP konjuguoti anti-triušio IgG (sc-2004) ir anti-pelių IgG (sc-2371) antikūnai buvo įsigyti iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Dalasas, TX, JAV).

Akridinio oranžinio (AO) dažymas

AO laisvai juda per biologines membranas ir sukelia raudoną fluorescenciją rūgštiniuose skyriuose ir žalią fluorescenciją citozoliniame ir branduoliniame skyriuose. Po apdorojimo ląstelės buvo dažytos AO (5 μg / ml, Sigma, Sent Luisas, MO, JAV, A6014) 37 ° C temperatūroje 1 minutę ir stebimos fluorescencine mikroskopija (Nikon, Tokijas, Japonija).

Neutralaus raudonojo įsisavinimo tyrimas

Po apdorojimo ląstelės buvo nudažytos neutralia raudona spalva (0, 05% be fenolio raudonojo RPMI-1640 / BSA 0, 1%), membraną praleidžiančiu dažikliu, kuris kaupiasi rūgštiniuose skyriuose, 37 ° C temperatūroje 5 minutes. Tada ląstelės buvo plaunamos ir stebimos apverstos fazės kontrasto mikroskopu (Nikon, Tokijas, Japonija).

Dvigubas dažymas naudojant „Lysotracker-Red“ ir „Hoechst 33258“

Po apdorojimo ląstelės buvo dvigubai nudažytos 1 mmol / l Lysotracker-Red DND (Invitrogen, L7528) ir 10 μmol / L Hoechst 33258 (Sigma, 14530) 37 ° C temperatūroje 20 minučių. Tada ląstelės buvo plaunamos ir stebimos fluorescencine mikroskopija (Nikon, Tokijas, Japonija). Apoptozinės ląstelės buvo nudažytos ryškiai mėlyna spalva dėl chromatino kondensacijos. Remiantis atvaizdais, buvo apskaičiuota fluorescenciškai dažytų ląstelių procentinė dalis.

LC3B punkto analizė

A549 ląstelės buvo pasodintos į 48 šulinėlių auginimo indus ir 24 valandas transdukuotos „Premo Autophagy Sensor LC3B-GFP“ (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV, P36235). Tada ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) koncentracijomis atitinkamai 3, 6 arba 12 valandų. A549 ląstelės buvo stebimos fluorescencine mikroskopija (Nikon, Japonija).

Terminalaus deoksinukleotidilo transferazės tarpininkaujamo dUTP slapyvardžio pabaigos žymėjimo (TUNEL) tyrimas

Po to, kai A549 ląstelės buvo apdorotos įvairiais junginiais, kaip nurodyta paveikslų legendose, apoptozinių ląstelių skaičius buvo išmatuotas TUNEL (Promega, Madison, WI, JAV, G3250) tyrimu pagal gamintojo protokolą. Ląstelės buvo įvertintos fluorescenciniu mikroskopu. Apoptozinė norma buvo įvertinta kiekybiškai pagal teigiamą TUNEL normą.

Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) matavimas

DCFH-DA, nefluorescencinis zondas, gali prasiskverbti į ląstelių membranas ir yra suskaidomas esterazės būdu, kad būtų gautas ne fluorescencinis DCFH. DCFH oksiduojamas esant ROS, kad susidarytų labai fluorescencinis DCF. Po apdorojimo įvairiais junginiais, kaip parodyta paveikslų legendose, A549 ląstelės buvo inkubuotos su 10 μmol / l DCFH-DA (Sigma, St Louis, MO, JAV, D6883) 30 minučių 37 ° C temperatūroje, o fluorescencinis intensyvumas DCF kiekis buvo matuojamas naudojant Epoch spektrofotometrą. Fono fluorescencijai nustatyti buvo naudojama sąlyga be ląstelių, o santykinis fluorescencijos intensyvumas kontrolinėje grupėje buvo nustatytas 1.

Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo atlikti dviem egzemplioriais ir pakartoti bent tris kartus. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± vidurkio standartinė paklaida (SEM). Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami atliekant vienpusę dispersinę analizę (ANOVA), o dviejų grupių vidurkiai buvo lyginami naudojant Studento t- testą su SPSS versija 17.0 (SPSS Inc, Čikaga, IL, JAV). Statistiškai reikšmingi buvo skirtumai, kai P <0, 05.

Rezultatai

THS galimai sukėlė apoptozę A549 ląstelėse

Norint ištirti 3, 4, 4′-THS citotoksinį poveikį A549 ląstelėms, buvo naudojama fazinio kontrasto mikroskopija, skirta įvertinti A549 ląstelių, apdorotų skirtingomis 3, 4, 4′- koncentracijomis, morfologijos pokyčius. THS (10–80 μmol / L) įvairiam laikui (3, 6 arba 12 h). Kaip parodyta 2A paveiksle, 3, 4, 4′-THS padidino susitraukiančių ląstelių, kurias ląstelės atitraukė nuo auginimo indo dugno, skaičių. MTT tyrimas parodė, kad 3, 4, 4′-THS slopina ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo dozės ir laiko (2B paveikslas). Šie duomenys rodo, kad 3, 4, 4′-THS sukėlė A549 ląstelių mirtį. Visų pirma, A549 ląstelėse padidėjo didelių vakuolių skaičius ir dydis, reaguojant į 10–40 μmol / L 3, 4, 4′-THS prieš 6 val. Laiką.

Image

3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė apoptozę. (A) A549 ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 3, 6 arba 12 valandų. Mikroskopinės nuotraukos (400 ×) darytos apverstos fazės kontrasto mikroskopu. (B) Ląstelių gyvybingumas nustatomas MTT tyrimu. (C) A549 ląstelių, apdorotų 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / l) 12 valandų, santykinis LDH aktyvumas. (D) Po apdorojimo 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 12 val., A549 ląstelės buvo nudažytos aneksino V-FITC / PI ir po to analizuojamos srauto citometrija. Buvo manoma, kad aneksino V teigiamos ląstelės yra ankstyvoje apoptozės stadijoje, tuo tarpu aneksinas V ir PI teigiamos ląstelės yra vėlyvoje apoptozės stadijoje. (E) Apoptozę sukeliančių baltymų Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 12 val. (F) Histograma parodo santykinį baltymų kiekį. Duomenys išreiškiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SEM). b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami nustatyti 3, 4, 4′-THS sukeltų ląstelių žūties mechanizmą, nustatėme, ar 3, 4, 4′-THS sukėlė nekrozę ar apoptozę A549 ląstelėse. LDH tyrimo rezultatai parodė, kad LDH aktyvumas reikšmingai nesiskyrė tarp kontrolinės grupės ir tų, kurie 12 h buvo gydyti 3, 4, 4′-THS (2C paveikslas). Tačiau A549 ląstelių apdorojimas 3, 4, 4′-THS 12 valandų žymiai padidino aneksino V-FITC teigiamų ląstelių procentą (2D paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad 3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė apoptozę, bet nekrozę.

Norint toliau parodyti, kad ląstelių mirtis įvyko dėl apoptozės, buvo nustatytas 3, 4, 4′-THS poveikis su apoptozė susijusiems baltymams. Western blot analizė parodė, kad PARP, kaspazės 3/9 ir Bax skilimas padidėjo 3, 4, 4′-THS apdorotose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, tuo tarpu antiapoptozinių baltymų, tokių kaip Bcl-2 ir išgyvenamino, sumažėjęs (2E ir 2F paveikslai). Šie duomenys parodė, kad 3, 4, 4′-THS sukėlė ląstelių mirtį A549 ląstelėse, sukeldama apoptozę, kuri buvo susijusi su proapoptozinių baltymų padidėjusiu reguliavimu ir antiapoptozinių baltymų sumažėjusiu reguliavimu.

3, 4, 4′-THS padidino rūgščių skyrių susidarymą

Norėdami suprasti vakuolių, stebėtų fazės kontrasto mikroskopu, pobūdį, pirmiausia dažėme ląsteles AO. A549 ląstelės, apdorotos 10–40 μmol / L 3, 4, 4′-THS 3 val., Citoplazmoje rodė daug fluorescuojančių raudonų taškų, atspindinčių rūgščius skyrius (tokius kaip lizosomos ir autofagolizosomos). Didžiausia 3, 4, 4′-THS koncentracija (80 μmol / L) sukėlė stiprius morfologinius pokyčius, susijusius su apoptoze, įskaitant chromatino kondensaciją ir branduolio suskaidymą (3A paveikslas); todėl fluorescencinių raudonų taškų nepavyko aptikti. Branduolinis kondensatas ir suskaidymas buvo akivaizdūs ilgesnį gydymo periodą (6 arba 12 h), net esant 40 μmol / L dozei. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant neutralų raudoną dažymą (3B paveikslas). Norint patvirtinti 3, 4, 4′-THS poveikį rūgščių skyrių indukcijai A549 ląstelėse, buvo atliktas dvigubas dažymas „Lysotracker-Red“ (organolelektyvusis fluorescencinis zondas, žymintis ir stebintis rūgščius organelius) ir „Hoechst 33258“. Gydymas 3, 4, 4′-THS padidino LysoTracker raudonai dažytų pūslelių intensyvumą A549 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (3C paveikslas). Padidėjus koncentracijai ar apdorojimo laikui, atsirado branduolio skilimas ir chromatino kondensacija (3C ir 3D paveikslai), kurie patvirtino, kad 3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė apoptozę.

Image

3, 4, 4′-THS padidino rūgščių skyrius A549 ląstelėse. (A) Imunofluorescencinės nuotraukos (100 ×) rodo A549 ląstelių AO dažymą, apdorotas 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 3, 6 arba 12 valandų. (B) Mikroskopinės nuotraukos (200 ×) rodo A549 ląstelių, apdorotų 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 3, 6 arba 12 valandų, neutralų raudoną dažymą. (C) Imuninės fluorescencinės nuotraukos (400 ×) rodo A549 ląstelių, apdorotų 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 3, 6 arba 12 valandų, dažymą „Lysotracker-red“ ir „Hoechst 33258“. (D) Histograma parodo apoptozinių A549 ląstelių santykį. Duomenys išreiškiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SEM). b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė autofagiją

Pirmiau minėti atradimai paskatino mus išnagrinėti galimybę, kad rūgštieji skyriai iš tikrųjų buvo autofagolizosomos ir kad 3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė autofaginį, taip pat apoptozinį atsaką. Pirmiausia mes ištyrėme 3, 4, 4′-THS poveikį LC3 perdirbimui ir LC3-II kaupimuisi, naudodami Western blot analizę. LC3 perdirbimas, LC3-II / β-aktino santykis, pastebimai padidėjo A549 ląstelėse, apdorotose 3, 4, 4′-THS (10–40 μmol / L) 3 arba 6 valandas (4A ir 4B paveikslai). Be to, 10–40 μmol / L 3, 4, 4′-THS padidino GFP-LC3 pažymėtų autofagosomų skaičių A549 ląstelėse (4C ir 4D paveikslai). Esant 80 μmol / L, 3, 4, 4′-THS stipriai sukėlė A549 ląstelių apoptozę, todėl padidėjusio LC3 kaupimosi ir GFP-LC3 pažymėtų autofagosomų nebuvo galima aptikti.

Image

3, 4, 4′-THS A549 ląstelėse sukėlė autofagiją. (A) LC3-II ir p62 Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose 3, 4, 4′-THS (10–80 μmol / L) 3 arba 6 valandas. (B) Histograma parodo santykinį LC3-II lygį. (C) Imunofluorescencinės nuotraukos (200 ×) rodo endogeninį LC3 skyrybos tašką A549 ląstelėse. Branduoliai buvo nudažyti Hoechst 33258. (D) Histograma parodo endogeninių LC3 skyrybos vienoje ląstelėje skaičių. (E) LC3-II Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) 3 valandas. 3-MA (5 mmol / L) arba bafilomicinas A1 (100 nmol / L) buvo pridėtas prie ląstelių 1 val. Prieš apdorojant 3, 4, 4′-THS. (F) Histograma parodo santykinį LC3-II lygį. (G) p-p70S6K ir p-4EBP1 Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose be 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) arba 3 h. (H) Histograma parodo santykinį p-p70S6K ir p-4EBP1 lygį. Duomenys išreiškiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SEM). b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole. e P <0, 05 palyginti su 3, 4, 4′-THS, h P <0, 05 palyginti su Baf.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

LC3-II lygio padidėjimas ir autofagosomų kaupimasis, kurį sukelia 3, 4, 4′-THS, gali būti susiję arba su padidėjusiu autofagosomų susidarymu dėl padidėjusio autofaginio aktyvumo, arba su sumažėjusiu autofagosomų skilimu dėl sutrikusio autofaginio srauto 18 . Norėdami atskirti šias dvi galimybes, pirmiausia įvertinome p62 lygį, kuris yra susijęs su autofagosomų formavimu ir yra konstitutyviai skaidomas autofaginiu keliu, specifiškai jungiantis prie LC3 19 . Todėl sumažėjęs p62 lygis atspindi nesuvaržytą autofaginį srautą. Mūsų rezultatai parodė, kad 3, 4, 4′-THS sumažino p62 lygį (4A pav.), Tai rodo, kad šis junginys nepakenkia autofaginiam srautui. Be to, III klasės PtdIns3K inhibitorius 3-MA, ankstyvosios stadijos autofagijos inhibitorius, slopino 3, 43′-THS sukeltą LC3-II kaupimąsi (4E ir 4F paveikslai). Jei 3, 4, 4′-THS sukelia autofagiją, gydymas kartu su vėlyvosios stadijos autofagijos inhibitoriumi turėtų dar labiau padidinti LC3-II lygį. Taigi autofaginiam srautui slopinti panaudojome bafilomiciną A1 (Baf), vakuolinės H + -ATPazės inhibitorių. Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas 3, 4, 4′-THS (40 μmol / l) ir Baf padidino LC3-II kaupimąsi, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis vien 3, 4, 4′-THS (4E ir 4F paveikslai). ).

Ir nuo mTOR priklausomi, ir nepriklausomi keliai gali sukelti autofagiją vėžio ląstelėse 20, 21 . Norėdami nustatyti, ar mTOR signalizacija yra susijusi su 3, 4, 4′-THS sukelta autofagija, ištyrėme p70S6K ir 4EBP1, dviejų mTOR taikinių, fosforilinimo būklę po gydymo 3, 4, 4′-THS. Kaip parodyta 4G ir 4H paveiksluose, 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) susilpnino p70S6K ir 4EBP1 fosforilinimą.

Autofagijos slopinimas paskatino 3, 4, 4′-THS sukeltą apoptozę A549 ląstelėse

Kadangi autofagija gali lemti ląstelių išgyvenimą ir mirtį, mes toliau tyrėme 3, 4, 4′-THS sukeltos autofagijos citotoksinio poveikio A549 ląstelėms mechanizmą. Fazinio kontrasto mikroskopija buvo naudojama įvertinti A549 ląstelių, apdorotų 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) ir autofagijos inhibitoriais, morfologijos pokyčius įvairiais laikotarpiais (3, 6 arba 12 h). Bendras gydymas 3, 4, 4′-THS ir 3-MA arba wortmanninu padidino susitraukiančių ląstelių, išsiskiriančių iš auginimo lėkštelės, skaičių, palyginti su A549 ląstelėmis, paveiktomis tik 3, 4, 4′-THS (5A paveikslas). . Lygiagretūs MTT ir TUNEL tyrimai taip pat parodė, kad gydymas 3, 4, 4′-THS ir autofagijos inhibitoriais žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą ir sukėlė ląstelių apoptozę, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis tik 3, 4, 4′-THS (5B paveikslas ir 5 pav. 5C). Be to, autofagijos slopinimas 3-MA arba wortmanninu padidino PARP-1 skilimą (5D – 5G paveikslas), parodydamas, kad 3, 4, 4′-THS sukėlė citoprotekcinę autofagiją, kuri sušvelnino A549 ląstelių apoptozę.

Image

Autofagijos slopinimas padidino 3, 4, 4′-THS toksiškumą A549 ląstelėse. (A) A549 ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L), 3-MA (5 mmol / L), wortmanninu (2 μmol / L) arba kombinuotu apdorojimu 3, 4, 4 ′ -THS ir 3-MA arba wortmanninas 3, 6 arba 12 h. Mikroskopinės nuotraukos (400 ×) darytos apverstos fazės kontrasto mikroskopu. (B) Ląstelių gyvybingumas nustatomas MTT tyrimu. (C) Histograma rodo TUNEL teigiamų ląstelių santykį. (D) Suskaidytos PARP Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose be 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) arba 3 valandas. 3-MA buvo pridėtas prie ląstelių 1 valandą prieš apdorojimą 3, 4, 4′-THS. (E) Histograma parodo suskaidyto PARP santykinį lygį. (F) Suskaidytos PARP Western blot analizė A549 ląstelėse, apdorotose be 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L) arba 3 valandas. Wortmanninas buvo pridėtas prie ląstelių 1 val. Prieš apdorojant 3, 4, 4′-THS. (G) Histograma parodo santykinį suskaidyto PARP lygį. Duomenys išreiškiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SEM). b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su 3, 4, 4′-THS.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

ROS dalyvavo 3, 4, 4′-THS sukeltoje autofagijoje ir apoptozėje A549 ląstelėse

Norėdami patikrinti, ar ROS dalyvavo 3, 4, 4′-THS sukeltoje autofagijoje ir apoptozėje, A549 ląstelės 12 valandų buvo veikiamos 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L), o po to dažytos specifine oksidacija. -jautrūs fluorescenciniai dažai, DCFH-DA. Gydymas 3, 4, 4′-THS žymiai padidino santykinį DCF fluorescencinį intensyvumą, atitinkantį padidėjusį ROS lygį, tuo tarpu NAC, ROS šaliklis, efektyviai slopino aukštą ROS lygį (6A pav.). Pjaunamas ROS su NAC blokavo aukštą LC3-II lygį, sukeltą 3, 4, 4′-THS (6B ir 6C paveikslai). Be to, NAC panaikino 3, 4, 4′-THS sukeltą ląstelių gyvybingumo sumažėjimą, didelį TUNEL teigiamų ląstelių santykį ir aukštą suskaidytų PARP kiekį (6D – 6G paveikslas). Visi šie rezultatai parodė, kad ROS dalyvavo 3, 4, 4′-THS sukeltoje autofagijoje ir apoptozėje. Be to, mes nustatėme, kad autofagijos slopinimas 3-MA arba wortmanninu reikšmingai padidino ROS lygį 3, 4, 4′-THS apdorotose ląstelėse, palyginti su gydymu vien 3, 4, 4′-THS (6H pav.).

Image

ROS dalyvavo 3, 4, 4′-THS sukeltoje autofagijoje ir apoptozėje A549 ląstelėse. A549 ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L), NAC (10 mmol / L) arba kombinuotu 3, 4, 4′-THS ir NAC apdorojimu 12 val. (A) santykinis DCF fluorescencijos intensyvumas, kuris atitinka ROS susidarymo lygį, išmatuotą mikroplokštės spektrofotometru. (B) LC3-II Western blot analizė. (C) Histograma parodo santykinį LC3-II lygį. (D) MTT tyrimu nustatytas ląstelių gyvybingumas. (E) Histograma rodo TUNEL teigiamų ląstelių santykį. (F) suskaldyto PARP Western blot analizė. (G) Histograma parodo santykinį suskaidyto PARP lygį. (H) A549 ląstelės buvo apdorotos 3, 4, 4′-THS (40 μmol / L), 3-MA (5 mmol / L), wortmanninu (2 μmol / L) arba kombinuotu apdorojimu 3, 4, 4 ′ -THS ir 3-MA arba Wortmannin 12 val. Histograma parodo santykinį DCF fluorescencinį intensyvumą. Duomenys išreiškiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SEM). b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su 3, 4, 4′-THS.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Ankstesnis tyrimas parodė, kad 3, 4, 4′-THS (1 paveikslas), resveratrolio analogas, yra veiksmingesnis už resveratrolį, užkertant kelią žmogaus leukemijos HL-60 ląstelių dauginimuisi 16 . Tačiau informacijos apie 3, 4, 4′-THS priešnavikinį aktyvumą yra mažai. Šiame tyrime mes nustatėme, kad 3, 4, 4′-THS, kurio IC50 yra maždaug 18 μmol / L po 12 h inkubacijos, buvo žymiai stipresnis nei resveratrolis, slopindamas A549 ląstelių gyvybingumą (2 paveikslas ir papildomas paveikslas). 1). Mūsų duomenys taip pat rodo, kad 3, 4, 4′-THS citotoksinis poveikis A549 ląstelėms visų pirma atsirado dėl apoptozės, o ne nekrozės, indukcijos (2 paveikslas).

Vienas įdomiausių ankstyvosios stadijos po gydymo 3, 4, 4′-THS įvykių buvo citoplazminė vakuuliacija. AO dažymas, neutralus raudonas dažymas ir Lysotracker-Red dažymas atpažino šias vakuumas kaip rūgščius skyrius (3 paveikslas). Be to, 3, 4, 4′-THS apdorotose ląstelėse padidėjo LC3 kaupimasis ir GFP-LC3 žymėtos autofagosomos. Remdamiesi šiais rezultatais, mes spėliojo, kad be apoptozės indukcijos, 3, 4, 4′-THS gali sukelti autofagiją A549 ląstelėse. Tačiau, užuot sukėlęs autofagiją, LC3-II kaupimasis gali padidėti dėl autofagosomų suliejimo su lizosomomis ir LC3-II skilimo 3, 4, 4′-THS. Norėdami nustatyti 3, 4, 4′-THS veikimo mechanizmą, įvertinome autofaginį srautą A549 ląstelėse. Mūsų rezultatai parodė, kad p62 nesikaupia 3, 4, 4′-THS apdorotose ląstelėse (4A paveikslas). Be to, 3-MA blokavo 3, 4, 4′-THS sukeltą LC3-II kaupimąsi (4E ir 4F paveikslai). Bendras gydymas 3, 4, 4′-THS ir bafilomicinu A1 padidino LC3-II kaupimąsi, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis vien 3, 4, 4′-THS (4E ir 4F paveikslai). Bendrai šie duomenys parodė, kad 3, 4, 4′-THS sukėlė aukštą LC3-II lygį stiprindama autofaginį aktyvumą, o ne blokuodama autofagijos antplūdį A549 ląstelėse.

Vienas iš klasikinių būdų, kontroliuojančių autofaginę veiklą, yra mTOR signalizacija 22 . mTOR aktyvacija pagerina baltymų transliaciją fosforilinant savo tikslus p70S6K ir 4EBP1 ir slopindama autofagijos indukciją 23 . Mūsų rezultatai parodė, kad 3, 4, 4′-THS slopino p70S6K ir 4EBP1 fosforilinimą, tai rodo, kad mTOR signalizacija gali dalyvauti 3, 4, 4′-THS sukeltoje autofagijoje. MTOR / p70S6K yra ne tik centrinis kontrolinis taškas, kuris neigiamai reguliuoja autofagiją, bet ir svarbus tarpląstelinis signalizacijos kelias, reguliuojantis ląstelių išgyvenimą ir apoptozę 24 . Mes spėliojo, kad 3, 4, 4′-THS gali sukelti ankstyvą autofagiją ir vėlyvą apoptozę, slopindami mTOR signalizacijos kelią A549 ląstelėse. Tačiau norint patikrinti šią hipotezę, reikia atlikti papildomus tyrimus.

Apoptozė ir autofagija yra labai konservuoti procesai, palaikantys atitinkamai organizmo ir ląstelių homeostazę. Nors apoptozė atlieka šį vaidmenį pašalindama pažeistas ar nepageidaujamas ląsteles, autofagija palaiko ląstelių homeostazę perdirbdama selektyvius tarpląstelinius organelius ir baltymus, todėl laikoma svarbiu vėžio ląstelių apsauginiu mechanizmu reaguojant į chemoterapiją 25 . Tačiau autofagija tam tikromis sąlygomis gali sukelti apoptozę arba sukelti nepoptozinę užprogramuotos ląstelių mirties (PCD) formą, vadinamą autofagine ląstelių mirtimi arba su autofagija susijusią ląstelių mirtį (II tipo PCD) 26 . Taigi skirtingais atvejais reikia nustatyti autofagijos, kaip ląstelių žūties ar ląstelių išgyvenimo, funkciją. Mūsų tyrime autofagijos slopinimas 3-MA arba wortmanninu reikšmingai sumažino 3, 4, 4′-gydytų A549 ląstelių gyvybingumą ir sustiprino 3, 4, 4′-THS sukeltą apoptozę (5 paveikslas), nurodydamas, kad autofagija sukeltas 3, 4, 4′-THS, buvo apsauginis atsakas A549 ląstelėse. Pranešama, kad resveratrolis galėjo sukelti ir apoptozę, ir autofaginę ląstelių mirtį A549 ląstelėse 9, 27 . Šie stebėjimai kartu su šiais atradimais parodė, kad 3, 4, 4′-THS daro priešnavikinį poveikį kitokiu nei resveratrolio mechanizmu.

Citotoksinės ROS koncentracija vėžio ląstelėse dažnai padidėja iškart po chemoterapinių agentų poveikio 28 . Taip pat gerai nustatyta, kad ROS vaidina pagrindinį vaidmenį sukeliant ląstelių autofagiją ir apoptozę 29 . Šiame tyrime 3, 4, 4′-THS padidino ROS lygį A549 ląstelėse. Kai ROS išpjaustė NAC, buvo slopinama ir 3, 4, 4′-THS sukelta autofagija, ir apoptozė (6 paveikslas), kuri parodė, kad padidėjęs ROS lygis, kurį sukelia 3, 4, 4′-THS, yra atsakingas už indukciją autofagijos ir apoptozės. Dar svarbiau, kad autofagijos slopinimas žymiai padidino ROS lygį 3, 4, 4′-THS apdorotose A549 ląstelėse. Pranešama, kad autofagija gali pašalinti pažeistas mitochondrijas, kad apribotų ROS amplifikaciją 30 . Mitochondrijų kelias yra pagrindinis signalo perdavimo būdas apoptozės indukcijai (vidinės ląstelės mirties kelias). Ankstesni tyrimai parodė, kad ROS veikia prieš mitochondrijų inicijuotą apoptozę, skatindama Bax translokaciją į mitochondrijas, leidžiančią suaktyvinti kaspazę-9/3, o tai lemia PARP skilimą 31 . Remdamiesi dabartinėmis išvadomis ir ankstesnėmis ataskaitomis, mes spėliojome, kad 3, 4, 4′-THS gali sukelti vidinės ląstelės ROS tarpininkavimo apoptozės kelią; be to, autofagija gali palengvinti 3, 4, 4′-THS sukeltą apoptozę A549 ląstelėse, sumažindama per didelį ROS lygį. Tačiau šią hipotezę reikia išsamiau išnagrinėti mūsų būsimame tyrime.

In conclusion, this work is the first report to reveal that 3, 4, 4′-THS induced excessive cell death in human NSCLC A549 cells by inducing apoptosis. The anti-tumor effect of 3, 4, 4′-THS was associated with the up-regulation of pro-apoptotic proteins and down-regulation of anti-apoptotic proteins. 3, 4, 4′-THS could also induce autophagy in A549 cells. mTOR signaling may be involved in this process. Co-treatment with 3, 4, 4′-THS and autophagy inhibitors enhanced cell death in A549 cells. The high level of ROS induced by 3, 4, 4′-THS was essential for the induction of autophagy and apoptosis. Autophagy might delay 3, 4, 4′-THS-induced apoptosis in A549 cells by suppressing the ROS level. In addition, we found that up to 12 h of treatment with 10–80 μmol/L 3, 4, 4′-THS was not cytotoxic to normal cultured human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs, Supplementary Figure 2). These data suggested that 3, 4, 4′-THS, together with an autophagy inhibitor might provide a potent strategy for NSCLC treatment. However, several questions remain to be answered. For example, what is the direct target for 3, 4, 4′-THS on A549 cells? What is the molecular switch between apoptosis and autophagy in response to 3, 4, 4′-THS? These questions will need to be addressed in more detail in our future studies.

Autoriaus indėlis

Lu ZHANG and Yu-qi GUO designed the research; Lu ZHANG, Fang DAI, Pan-long SHENG, Zhi-qiang CHEN, and Qi-ping XU performed the research; Lu ZHANG, Fang DAI, Pan-long SHENG, Zhi-qiang CHEN, and Qi-ping XU analyzed the data; Lu ZHANG wrote the paper.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

    The effect of resveratrol on the cell viability of A549 cells.

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

    The effect of 3, 4, 4′-THS on the cell viability of normal cultured human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs).

    Supplementary figures are available at the Acta Pharmacologica Sinica website.