Atskleidžiant teigiamą II tipo kinazės inhibitorių disociacijos kelią patobulintais mėginių imitavimo modeliais ir dviejų galių būsenos skaičiavimais | mokslinės ataskaitos

Atskleidžiant teigiamą II tipo kinazės inhibitorių disociacijos kelią patobulintais mėginių imitavimo modeliais ir dviejų galių būsenos skaičiavimais | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Cheminformatika
  • Kompiuterinė chemija

Anotacija

Kaip II tipo inhibitoriai jungiasi prie kinazės taikinio arba atsiriboja nuo jo, yra vis dar klaidinantis klausimas, nes maža molekulė užima tiek ATP kišenę, tiek allosterinę kinazės rišimo vietos kišenę. Čia, naudodamiesi patobulintais mėginių ėmimo modeliais (skėtinio mėginio ėmimas, JAV) ir dviejų galių būsenos energijos skaičiavimais (MM / GSBA), sistemiškai ištyrėme dviejų skirtingų mažų molekulių, išsiskiriančių iš p38 MAP kinazės rišamosios kišenės, atsiribojimo procesus. alosterinis kanalas ir ATP kanalas. Rezultatai rodo, kad nesirišimo takai palei alosterinį kanalą turi daug mažesnį PMF gylį nei tie, kurie išilgai ATP kanalo, ir tai rodo, kad alosterinis kanalas yra palankesnis dviejų inhibitorių disociacijai ir tokiu būdu patvirtina bendrą supratimą, kad didžiausias kanalo taikinys paprastai yra mažų molekulių prisijungimo / atsiribojimo įėjimo / išėjimo būdas. Įdomu tai, kad MM / GBSA metodu buvo gauti panašūs PMF profiliai, palyginti su JAV pagrįstais, daug laiko reikalaujantis metodas, rodantis, kad atliekant bendrą tyrimą, pavyzdžiui, nustatant svarbią ligando surišimo / rišimo proceso pereinamąją būseną, MM / GBSA gali būti įmanomu pasirinkimu.

Įvadas

Žmogaus baltymų kinazės reguliuoja įvairius svarbius fiziologinius procesus, įskaitant proliferaciją, invaziją, angiogenezę ir metastazes ir tt 1, 2, 3, 4, todėl jie yra svarbūs narkotikų atradimo tikslai. Visos baltymų kinazės turi struktūriškai konservuotą katalitinį domeną, susidedantį iš dviejų pagrindinių subdomenų, būtent N-galo ir C-galo skilčių 5, 6 . Abi skiltys sujungtos per lanksčią jungiamąją sritį (arba vyrių sritį). Aktyvacijos kilpa, priklausanti C-galinei skilčiai ir ribojanti su jungiamąja sritimi, reguliuoja kinazių konformacinį perėjimą tarp „įjungtos“ (aktyvios struktūros) ir „išjungtos“ (neaktyvios) būsenos. ATP surišimo vieta yra plyšyje tarp dviejų skilčių ir jungiamojo krašto. Dauguma mažų molekulių kinazių inhibitorių yra žinomi kaip I tipo inhibitoriai, nukreipti į ATP jungimosi kišenę aktyvios konformacijos metu. Pastaraisiais metais imatinibo 7, sorafenibo 8 ir BIRB796 9 kristalų struktūros atskleidė dar vienos rūšies kinazės inhibitorius, kurie užima tiek ATP surišančią kišenę, tiek gretimą hidrofobinę kišenę (dar vadinamą alosterine kišene), o vėliau buvo pavadinti II tipu. inhibitoriai 10 . II tipo inhibitoriai gali užkirsti kelią kinazės aktyvacijai, prisijungdami prie neaktyvių kinazių formacijų.

Kai I tipo inhibitorius užima ATP surišančią kišenę, aktyvacijos kilpa įgauna tokią struktūrą, kuri visiškai atidengia ATP surišančią kišenę. Tada I tipo inhibitoriaus įėjimo / išėjimo kelias į aktyvią kinazę yra apibrėžiamas kaip ATP kišenės kanalas. Kai II tipo inhibitorius nukreipia į neaktyvią kinazę, aktyvacijos kilpos ir konservatyvaus DFG (Asp-Phe-Gly) motyvo konformacinis perėjimas sutraukia ATP plyšį ir sukuria alosterinę kišenę. Taigi ATP kišenės kanalas susiaurėja ir atsiranda kitas įėjimo / išėjimo kelias, pavadintas alosterinės kišenės kanalu (1A pav.). Daugybė tyrimų buvo sutelkti į ATP kišenę I tipo inhibitorių disociacijai 11, 12, 13 . Pavyzdžiui, Capelli ir kt . ištyrėme du I tipo inhibitorius, neatsiejančius nuo AEG kanalo iš VEGFR2, naudodamiesi valdomos molekulės dinamikos (SMD) modeliavimais 12, ir mes pasinaudojome laisvojo I tipo inhibitoriaus, nukreipiančio į ALK tirozino kinazę, energijos profilio pasikeitimu, atsižvelgiant į vaistams atsparias mutacijas kartu ATP kelią naudojant adaptyviosios iškreipiamosios jėgos (ABF) modeliavimą 13 . Vis dėlto neaišku, kuris iš jų yra tikras II tipo inhibitorių judėjimo į taikinį / iš jo būdas.

Image

Ligandų surišimo afinitetai prie p38 MAP kinazės yra labai skirtingi, kaip nurodoma nuorodoje [9], kur ta pati dviejų molekulių dalis yra raudonos spalvos (B). Paviršiaus modeliai paryškino allosterinius kanalus (atitinkamai C ir E skydelius atitinkamai 1 ir BIRB796 ) ir ATP kanalus (atitinkamai D ir F plokštės 1 ir BIRB796 ) (geltonasis regionas).

Visas dydis

p38 MAP kinazė yra viena iš labiausiai ištirtų kinazių, nukreiptų į II tipo inhibitorius, taip pat yra kristalų struktūrų, esančių komplekse su II tipo inhibitoriais (PDB įrašai: 1KV1 ir 1KV2) 9 . Kita priežastis, kodėl p38 MAP kinazė gali būti naudojama kaip pavyzdinė sistema, yra ta, kad jos alosterinė kišenė buvo dažnai tiriama 14, 15, 16, 17, 18 . Pavyzdžiui, Wang ir kt . apibūdino laisvojo p38 MAP kinazės alosterinės kišenės energijos peizažą, perkeltą iš DFG į būseną į DFG išėjimo būseną, naudojant normaliojo režimo analizę kartu su skėčių ėminių ėmimu (NMA-JAV) 18 . Taigi šiame tyrime buvo naudojami patobulinti mėginių ėmimo modeliai (skėtinio mėginio ėmimas, JAV) siekiant ištirti, kaip du II tipo inhibitoriai ( 1 ir BIRB796 parodyti 1 paveiksle) atsiriboja iš aktyviosios kišenės per ATP kanalą ir alosterinį kanalą, o po to Svorinės histogramos analizės metodas (WHAM) buvo naudojamas generuoti vidutinės jėgos (PMF) potencialą rišamuosiuose keliuose. Tuo tarpu molekulinės mechanikos / generalizuoto gimimo paviršiaus ploto (MM / GBSA) metodas taip pat buvo naudojamas apskaičiuojant tirtų inhibitorių laisvojo surišimo profilius išilgai rišamųjų kelių, kad būtų galima palyginti.

Metodai

Įprastinės molekulinės dinamikos (MD) modeliavimas

Dviejų II tipo inhibitorių ( 1 ir BIRB796 ) kristalų struktūros komplekse su p38 MAP kinaze (PDB įrašai: 1KV1 ir 1KV2 9 ) buvo naudojamos kaip pradinės struktūros įprastoms MD simuliacijoms. Inhibitoriai buvo optimizuoti ir apskaičiuoti elektrostatiniai potencialai esant HF / 6-31G * teorijos lygiui, paremtam Gaussian 09. Daliniai krūviai buvo gauti, pritaikant elektrostatinius potencialus naudojant RESP metodą 19 .

Baltymams buvo naudojamas AMBER03 jėgos laukas 20, o ligandams - bendrasis AMBER jėgos laukas ( gaff ) 21 . Į abi sistemas buvo pridėta 7 Na +, kad būtų galima neutralizuoti nereikalingus grynuosius mokesčius. Kiekviena sistema buvo panardinta į stačiakampę TIP3P vandens dėžutę 22, išsikišančią 12 Å atstumu nuo bet kokių tirpių atomų. Dalelių tinklelio Evaldo (PME) 23 algoritmas buvo naudojamas elektrostatinėms nuotolinėms sąveikoms valdyti, o SHAKE 24 algoritmas buvo naudojamas kovalentinėms jungtims, susijusioms su vandenilio atomais, apriboti. Laiko žingsnis buvo nustatytas 2 fs. Mažiausia nuotolio sąveikai (van der Waals ir elektrostatinė sąveika) buvo naudojama 10 Å riba.

Prieš pradedant MD modeliavimą, siekiant optimizuoti sistemas, buvo atliktas staigiausias nusileidimo energijos minimizavimas (1000 ciklų) ir konjuguotojo gradiento energijos minimizavimas (4000 ciklų). Tada MD modeliavimo etape kiekviena sistema buvo palaipsniui kaitinama nuo 0 iki 300 K per pirmąsias 50 ps, ​​o po to sekė dar 50 ps pusiausvyros modeliavimas NPT ansamblyje ( T = 300 K ir P = 1 atm). Dviejuose MD modeliavimo etapuose sunkieji baltymo stuburo atomai buvo suvaržyti elastine konstanta - 5 kcal / mol · Å 2 . Galiausiai NPT ansamblyje buvo atliktas 10 ns gamybos bandymas be jokių suvaržymų ( T = 300 K ir P = 1 atm). Visi molekulinės mechanikos (MM) minimizavimai ir MD modeliavimas buvo atlikti naudojant šlifuoklio modulį AMBER11 25 .

Skėčio imties modeliavimas

Gerai žinoma, kad modeliuojamos sistemos lengvai patenka į vietinius minimumus, o kai kurių konformacinių pereinamųjų procesų, tokių kaip ligando atsiejimo procesas, mėginių ėmimas tampa labai sunkiu įprastu MD modeliavimu. Taigi norint ištirti mažos sistemos perėjimo procesą 26, 27, gali prireikti net milisekundžių įprastų MD modeliavimų. Laimei, patobulinti atrankos metodai, tokie kaip JAV 28, 29, 30, 31, metadinamika 32, 33 ir adaptyvioji poslinkio jėga (ABF) 34, 35, yra intelektualūs metodai, skirti išspręsti šią problemą, pridedant arba šalinimo potencialus, arba šališkumą. pajėgos, esančios tam tikroje reakcijos koordinatės (RC) vietoje, kad būtų imami regionai, kuriuose yra didelės potencialios kliūtys. Paimkite JAV kaip pavyzdį, kad visiškai ištirtumėte RC, visas RC turėtų būti padalytas į ištisinių langų seriją. Patogumui harmoninis potencialas, kaip parodyta toliau pateiktoje lygtyje, pridedamas prie pradinio potencialo (neobjektyvaus potencialo) kiekviename lange, kad sistema būtų perkelta iš vienos termodinaminės būsenos į kitą.

Image

kur u i yra pakreiptas potencialas atsižvelgiant į esamą padėtį r . r i yra pamatinė padėtis i langelyje, o k i yra tamprioji konstanta, naudojama ištrauktai šališkai molekulei iš rišamosios kišenės. Visuose JAV modeliavimo languose buvo naudojama 5 kcal / mol · Å 2 elastinė konstanta. Pridėjus šališkumo potencialą, taip pat galima visiškai imti kai kurias pereinamąsias būsenas, turinčias dideles energijos kliūtis. Norint sukonstruoti vidutinės jėgos (PMF) potencialą išilgai RC, buvo naudojamas WHAM 36, 37, kad atstatytų šalutinį tikimybės pasiskirstymą į normalųjį. Čia RCAM buvo padalintas į 2000 konteinerių WHAM apskaičiuoti po kiekvieno JAV modeliavimo ciklo (41 ns JAV bandymas buvo apibrėžtas kaip ciklas, kaip parodyta žemiau). Norint gauti konvergencines PMF kreives, iteracijos tolerancija buvo 0, 0001. Temperatūra buvo nustatyta 300 K, kad ji atitiktų modeliavimo temperatūrą.

Šiame tyrime buvo atlikti du JAV imitacijų rinkiniai, skirti imituoti dviejų II tipo inhibitorių atsiejimo procesus per ATP kanalą ir alosterinį kanalą. Modeliavimo metu atstumas tarp vieno atomo receptoriuje (O Ile80 1KV1 alosteriniame kelyje, C α Gln304 1KV1 ATP keliui, C α Gly81 1KV2 alosteriniame take ir O O Arg66 1 KV2). ATP keliui) ir kitas ligando atomas (C8 - 1 1KV1 alosterinio kelio atžvilgiu, C1 1 - 1 KV1 ATP keliui, N1 - BIRB796 1KV2 alosteriniam keliui ir C4 BIRB796 1KV2 - ATP) kelias) buvo pasirinktas kaip RC, o vektorius tarp dviejų atomų rodo kanalo kryptį (alosterinis kanalas 1C ir 1E paveiksluose ir ATP kanalas 1D ir 1F paveiksluose). Kiekviename modeliavimo rinkinyje yra 41 modeliavimo langas, kurių kiekvieno ilgis yra 0, 5 Å, o RC buvo išplėsti 20 Å nuo pradinių atstumų. Kiekvienam langui buvo paruošti 17 ns ir 10 ns modeliai JAV, atitinkamai, 1 (1KV1) ir BIRB796 (1KV2) sistemoms, kad būtų suderinta atranka. Taigi buvo sukurta maždaug 700 ns (697 ns) ir 410 ns JAV modeliavimas atitinkamai 1 ir BIRB796 sistemoms, kuriose abu yra ATP kanalo ir alosterinio kanalo modeliavimas, ir iš viso JAV buvo atlikta> 2, 2 μs modeliavimas. tyrimas. Sunkiems atomams, esantiems 18 Å atstumu nuo pradinių struktūrų ligandų, siekiant išvengti dreifuojančių sistemų, sunkiųjų atomų buvo pridėta 5 kcal / mol · Å 2 .

Absoliučiosios rišamosios laisvosios energijos apskaičiavimui buvo pasiūlyta naudoti suvaržytą schemą 38, 39, 40, tačiau šiame tyrime mes nebandėme naudoti šių metodų laisvosios rišamosios energijos skaičiavimui dėl to, kad suvaržyti modeliai gali praleisti svarbias metastabilias būsenas, kai atsieja ligandą nuo aktyviosios vietos, remiantis iš anksto nustatytu tiesiniu RC 13 . Nepaisant to, šio tyrimo tikslas yra atskleisti, kuris kelias yra palankesnis ligando atsiribojimui / įvažiavimui, ir tiesa, kad absoliučiai rišančių laisvųjų energijų skirtumas visada atsispindi atskyrimo laisvės laipsnyje41. Todėl palyginimui apskaičiuotas PMF iš tikrųjų yra PMF gylis, o ne absoliuti privalomoji laisvoji energija.

MM / GBSA privalomosios energijos skaičiavimas

Norėdami palyginti su tikimybe pagrįstu PMF, apskaičiuotu pagal JAV simuliacijas (įvertino WHAM), dviejų galių laisvos energijos skaičiavimai buvo atlikti tiesiogiai remiantis trajektorijomis, gautomis iš JAV simuliacijų. Čia buvo naudojama plačiai naudojama MM / GBSA metodika, skaičiuojant energijos iš dviejų galų būseną - 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 . Ryšio laisvoji energija (Δ G jungiasi ) tarp ligando ir receptoriaus gali būti apskaičiuota pagal šias lygtis 47 .

Image

Image

Image

kur Δ E MM yra dujų fazės sąveika tarp baltymo ir ligando, įskaitant elektrostatinę ir van der Waals energiją; Δ G GB ir Δ G SA yra atitinkamai poliniai ir nepoliniai laisvosios energijos šalinimo komponentai; - T Δ S yra konformacinės entropijos, susijusios su ligando surišimu T temperatūroje, pokytis, kuris čia nebuvo svarstomas dėl brangių skaičiavimo kaštų ir mažo numatymo tikslumo 44 . Čia elektrostatinio tirpinimo energija (Δ G GB ) buvo apskaičiuota pagal Onufrijevo sukurtą GB modelį ( igb = 2) 51, nes šis GB modelis paprastai lenkia kitus GB modelius, naudojamus AMBER 44 . Išorinė dielektrinė konstanta buvo nustatyta 80, o soličioji dielektrinė konstanta - 1. Neapoliarinė pašalinimo energijos dalis (Δ G SA ) buvo įvertinta naudojant tirpikliui prieinamą paviršiaus plotą (SASA), naudojant LCPO algoritmą: Δ G SA = 0, 0072 × ΔSASA + 0, 00 52 .

Rezultatai ir DISKUSIJA

Imituotų sistemų konvergencija

Siekiant subalansuoti sistemas, prieš JAV simuliacijas buvo atlikti įprastiniai MD modeliavimai p38 MAP kinazės kompleksams. Kaip parodyta S1 paveiksle papildomoje informacijoje, maži stuburo sunkiųjų atomų kvadratiniai nuokrypiai nuo kvadratinių verčių (vidutiniškai <1, 5 Å) kristalų struktūrų atžvilgiu rodo, kad tiriamos sistemos yra stabilios per 10 ns įprastinių MD modeliavimų., todėl tinka šioms JAV analizėms. Paskutiniai įprastų MD trajektorijų vaizdai buvo pasirinkti kaip pradinė JAV simuliacijų atitiktis.

Siekiant užtikrinti JAV imitacijų atrankos konvergenciją, kiekvienam langui buvo paruošti 17 ns ir 10 ns modeliai atitinkamai 1 ir BIRB796 sistemoms, o PMF konvergencija buvo patikrinta po kiekvienos nanosekundės modeliavimo. Kaip parodyta 2 paveiksle, atitinkamai 1 (2A – 2D paveikslai) ir BIRB796 (2E – 2H paveikslai) sistemoms buvo pavaizduotos 17 ir 10 kreivės. Galima pastebėti, kad 1 sistema suvienodėjo ​​po apytiksliai 10 ns JAV modeliavimo ir 5 ns sistemos BIRB796, kai KSF skirtumas buvo mažesnis nei 1 kcal / mol (KSF vertės buvo apskaičiuotos remiantis 15 ~ 20 Å iš RC). Įdomu tai, kad PMF kreivės, įvertintos MM / GBSA, skaičiavimo pradžioje parodė konvergenciją. Kaip parodyta 2C ~ 2F paveiksluose, visos kreivės sutampa tame pačiame regione ir panašus elgesys buvo nustatytas tarp JAV ir MM / GBSA pagrįstų PMF kreivių. Pavyzdžiui, kai BIRB796 atsiriboja nuo alosterinio kelio, JAV rezultatuose (2E paveikslas) ir MM / GBSA rezultatuose (2G paveikslas) buvo aptiktas žemos energijos barjeras, esant RC ~ 5 Å, ir tai rodo, kad MM / GBSA su daug mažesnė skaičiavimo kaina yra įmanomas metodas apskaičiuojant laisvą energiją išilgai RC 53 . Nepaisant to, atsižvelgiant į natūralias algoritmo savybes, laisvosios energijos, apskaičiuotos MM / GBSA, yra daug didesnės nei JAV (WHAM) ir eksperimentinių duomenų (1 lentelė), kurių dauguma gali būti priskirtos nežinomybei. konformacinių entropijų indėlis į rišančiąsias laisvas energijas 54 .

Image

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Suriša laisvas energijas išilgai alosterinių ir ATP kanalų

Kaip parodyta 1 paveiksle, dviem inhibitoriais ( 1 ir BIRB796 ) buvo naudojamos tos pačios šerdies struktūros (raudoni fragmentai B skydelyje) ir surišimo pozos (A grupė ). Tačiau išplėsti BIRB796 fragmentai (mėlyni fragmentai) labai padidina jo surišimo afinitetą (nuo 1160 nM iki 0, 1 nM) prie p38 MAP kinazės, kaip pranešė Pargellis et al . 9 . Kaip parodyta 1 lentelėje ir 3 paveiksle, JAV (WHAM) ir MM / GBSA numatytos laisvosios rišamosios energijos eilutės tiek alosteriniame, tiek ATP keliuose atitinka bandymų duomenis. Palyginti su JAV rezultatais, MM / GBSA prognozuojamos laisvosios energijos abiem kryptimis (alosterinis ir ATP keliai) yra nuoseklesnės, nes rišamosios laisvosios energijos skiriasi mažiau nei standartiniai nuokrypiai, tačiau yra daug didesnės ir negali pasiekti plokščioji PMF fazė po inhibitorių atsiribojimo nuo taikinio, ypač BIRB796 PMF kreivės (3B paveikslas - žalsvai mėlynos ir raudonos kreivės), kurios nuolat didėja, kai molekulė išeina iš rišamosios kišenės (5E ir E ′ paveikslai). Kaip minėta pirmiau, šį reiškinį galima paaiškinti vidiniais MM / GBSA apribojimais, kai naudojamas parametrizuotas netiesioginio tirpiklio modelis ir laisvajai energijai apskaičiuoti naudojami kai kurie savavališki parametrai (papildomo apdorojimo parametrai), pavyzdžiui, naudojant skirtingą druskos koncentraciją ir dielektriką. konstantos (tokios kaip ε tirpumas = 1 ir ε tirpiklis = 80) 54, 55, tai reiškia, kad vis dar vyksta sąveika, net ligandas juda toli nuo receptorių (20 Å). Tačiau JAV yra tikimybėmis pagrįstas metodas, o tikimybės pasiskirstymą galima išvesti tiesiogiai iš modeliavimo trajektorijos, kuri priklauso tik nuo pradinių modeliavimo nustatymų (nenaudojant kito papildomo apdorojimo metodo), pavyzdžiui, naudojant aiškų tirpiklio modelį (TIP3P vanduo ) kuri yra arčiau tikros sistemos. Todėl iš JAV išvestos PMF kreivės turėtų būti arčiau tikrovės ir eksperimentinių duomenų (1 lentelė).

Image

Palyginimui buvo naudojami paskutiniai 1 ns modeliavimo rezultatai.

Visas dydis

Image

Visas dydis

Image

Visas dydis

Kaip parodyta 1 lentelėje ir 3A paveiksle, PMF vertės, gautos atlikus JAV modeliavimą išilgai dviejų kanalų, yra labai skirtingos dviem inhibitoriams (kurių energijos skirtumas yra didesnis nei 6 kcal / mol ir daug didesnis nei standartiniai nuokrypiai). Todėl alosterinis kanalas yra akivaizdžiai palankesnis dviejų inhibitorių disociacijai. Įdomu, kad abiejuose inhibitoriuose jungimosi prieraišumas gali būti teisingai įvertintas, pavyzdžiui, –19, 03 kcal / mol, palyginti su –26, 06 kcal / mol, BIRB796, išilgai ATP kanalo, ir –12, 34 kcal / mol, palyginti su 1, - 19, 57 kcal / mol BIRB796 išilgai alosterinio kanalo. T. y., Teisingas skirtingų molekulių klasifikavimas visada gali būti pasiektas, kai buvo naudojamas tas pats atsiribojimo kelias, nors rišamosios laisvosios energijos skirtinguose keliuose gali būti gana skirtingos. Nepaisant to, dviejų molekulių ( 1 ir BIRB796 ) jungties laisvosios energijos skirtumas (ΔPMF US ), kuris yra 7, 03 arba 7, 23 kcal / mol išilgai ATP ar alosterinio kelio (S1 lentelė), gerai atitinka eksperimentinį surišimo afinitetų skirtumą. 5, 56 kcal / mol (ΔΔ G exp ), ir tai gerai patvirtina nuomonę, kad nustatant santykinį ligandų junginio afinitetą, turėtų būti naudojamas tas pats disociacijos kelias.

1 ir BIRB796 disociacijos procesai alosteriniuose ir ATP kanaluose

Norėdami nustatyti palankų dviejų inhibitorių ( 1 ir BIRB796 ), nesiejančių su taikiniu ar prie jo prisijungiantį, kelią, PMF, gauti iš paskutinių 1 ns JAV modeliavimų, buvo sujungti tarp alosterinio kelio ir ATP kelio, kaip parodyta 4G ir 5F paveiksluose. Mažiausia PMF vertė (0 kcal / mol) buvo kalibruota iki 0 Å ant RC, kad būtų pažymėtos inhibitorių surištos būsenos. RC buvo pailginti nuo 0 iki –20 Å ir nuo 0 iki 20 Å, kad būtų atitinkamai inhibitoriai 20 Å atstumu nuo ATP kanalo pusės ir alosterinio kanalo pusės rišamosios kišenės. Teoriškai PMF vertės turėtų būti lygios visur, kai dėl izotropinės masės ligandai juda toli nuo surišimo vietos (20 Å atstumu nuo surišimo kišenės). Tačiau, kaip parodyta 4G ir 5F paveiksluose, PMF vertės išilgai ATP kelio yra iš tikrųjų daug didesnės nei abiejų ligandų alosterinio kelio vertės (abiejų daugiau kaip 6 kcal / mol, kaip parodyta 1 lentelėje), rodančios, kad gali būti daug palankesnėms mažoms molekulėms, išsiskiriančioms iš alosterinio kelio, dėl daug mažesnio PMF gylio (0–20 Å RC 4G ir 5F paveiksluose) ir panašesnių laisvųjų energijų, jungiančių eksperimentinius duomenis (1 lentelė). Kaip parodyta 1C ~ 1F paveiksluose, alosterinė kišenė (C ir E plokštės) yra akivaizdžiai didesnė nei ATP kišenė (D ir F plokštės), paaiškindama, kodėl susidaro daug mažesni PMF, kai inhibitoriai atsiriboja nuo alosterinio kelio ir palaiko bendrą nuomonė, kad didžiausias kišenės kelias paprastai laikomas rišamuoju / neįrišamuoju keliu 13, 41, 56 . Priežastis, kodėl PMF išilgai ATP kelio yra daug didesnė už tas, kurios išilgai alosterinio kelio, gali būti iš dalies susijusi su kai kurių susijusių metastabilių modeliavimo būsenų sunkiu mėginių ėmimu. Kaip aptarė St-Pierre ir kt. , bus sunku sugeneruoti patikimas PMF kreives, kai pasirenkamas nepalankus kelias, netgi pasiekus mėginių konvergenciją 57 . Nepaisant to, sunkus tam tikrų kelių mėginių ėmimas gali būti efektyvus būdas rasti palankų kelią ligando įvedimui / atsiribojimui. Tačiau, kaip minėta aukščiau, iš MM / GBSA gauti PMF yra nuoseklesni, todėl sunku nustatyti, kuris būdas yra palankesnis inhibitorių surišimui / atsiejimui.

Kaip parodyta 4G ir 5F paveiksluose, abiejose molekulėse buvo stebimi skirtingi rišimosi procesai, nors jie naudojo panašias šerdies struktūras (raudoni fragmentai 1B paveiksle). Kai 1 išbėga per alosterinį kelią, PMF profilio C taške (5, 2 Å RC 4G pav.) Parodyta akivaizdi energijos kliūtis, kur metilo galvutė ( 1 pav. 1B pav.) Pamažu išeina iš rišamosios kišenės ( Fig. 4B ir 4C) prie plačiau metastabilios išorinės surišimo vietos (6, 3 Å RC 4E pav.). Kai didžioji molekulės dalis juda iš rišamosios kišenės (4D paveikslas), ligandas greitai absorbuojamas išorinėje surišimo padėtyje (4E paveikslas), smarkiai mažėdama PMF kreivė (4G paveikslo E taškas). Atsiribojęs iš išorinės rišamosios padėties, 1 visiškai atsiriboja nuo taikinio (4F pav.). Alternatyviai, nepastebėta jokio energetinio barjero, kai 1 išsiskiria iš ATP kelio (0 ~ –20 Å RC 4G pav.). Tai gali būti labai nepalanku ligando atsiribojimui per ATP kelią, nes jungimosi kanalas yra daug ilgesnis (~ 13 Å ATP kanalo, palyginti su ~ 5 Å alosterinio kanalo, 4G paveikslas) ir siauresnis (1C ir 1D paveikslai), palyginti su alosterinis kelias. Kaip parodyta 4G paveiksle, prieš pradedant 1 atsiribojimą nuo ATP kanalo, stebimi trys staigaus PMF didinimo etapai (RC A '~ B', B '~ C' ir D '~ E' regionai). taikinys, kuriame ligando konformacija per tris atsiribojimo stadijas traukiama iš išlenktos būsenos į plokščią būseną (4A pav. ~ 4F ′).

Palyginti su 1 PMF profiliu, BIRB796 PMF kreivė yra daug lygesnė, tik esant mažai energijos barjerui maždaug 5 º RC (5B paveikslas), kai ligandas nesijungia nuo alosterinio kelio, kur traukiama ligando formacija. būti beveik plokščia, o tai atitinka didelę molekulės deformacijos energiją. Tačiau sukimosi reiškinys stebimas kitame žingsnyje greičiausiai dėl didelės BIRB796 konformacinės energijos. Ligandas atveria kinazės P-kilpos sritį (mėlyna sritis 5C paveiksle), kad atpalaiduotų didelę plokščiojo ligando deformacijos energiją, kuri atitinka sistemos vietinį minimumą, kaip parodyta PMF kreivės C taške 5F paveiksle. Po to molekulė vertikaliai disocijuojasi su P-kilpos sritimi iki tūrio (5C ir 5D paveikslai). Kalbant apie ATP kanalą, kai molekulė atsiriboja nuo ATP kanalo, stebimas nuolatinis PMF augimas be jokios paprastosios būsenos (5F pav.). Nors atrodo, kad didėjantis PMF (nuolydžio) greitis (5F paveikslo taškas C ′), kai N ir O turinčios heterociklinės uodegos (1B paveikslas) išeina iš ATP kanalo (5 C paveikslas), PMF kreivė pakyla. nepertraukiamai, kol dvišakė galvutė, kurioje yra benzeno ir metilo, kurio kampas> 120 °, sujungta su dvigubu N hetero žiedu (rausvos spalvos lazdelės modelis 1A pav.), palieka siaurą kanalą (po PMF profilio D 'taško) kaip parodyta 5F pav.). Tokiu būdu, didelė dvišakė BIRB796 galvutė nėra palanki atsiriboti nuo ATP kanalo, nors panašus alosterinio (> 8 Å) ir ATP (~ 10 Å) kanalų ilgio ryšys yra stebimas PMF profilyje 5F paveiksle.

Išvada

Naudodamiesi patobulintais mėginių ėmimo modeliais ir dviejų galinių būsenų skaičiavimais, sistemiškai ištyrėme dviejų II tipo inhibitorių, kurie pabėgo iš p38 MAP kinazės, susiejimo procesus dviem būdais, būtent ATP keliu ir alosteriniu keliu. Laikydamiesi bendros minties, kad didžiausias kanalas paprastai yra ligando surišimo / atsiribojimo įėjimo / išėjimo kelias, mes nustatėme, kad abu inhibitorių alosterinio kanalo PMF gyliai yra daug mažesni nei ATP kelio, nurodant. kad inhibitoriai gali atskirti / jungtis per alosterinį kanalą. Be to, nors ATP kanalas negali būti palankus ligandų atsiribojimo būdas, taip pat buvo pastebėtas teisingas dviejų skirtingų inhibitorių rišamosios laisvosios energijos (pagal JAV pagrįstų PMF) energijų klasifikavimas, reiškiantis, kad panašus (rišantis / nesurišantis) kelias turėtų būti naudojamas jungimosi afinitetų palyginimui.

Be to, nors dėl MM / GBSA gali atsirasti daug daugiau rišamųjų energijų, palyginti su eksperimentiniais duomenimis, palyginti lengviau su daug laiko reikalaujančiais JAV modeliavimais, gauti lengviau konvergencinius PMF ir išlaikyti panašią formą tarp PMF profilių, remiantis ir JAV. Taigi, norint aptikti svarbią perėjimo būseną, MM / GBSA taip pat gali būti tinkamas pasirinkimas norint apskaičiuoti laisvojo rišimosi energiją išilgai RC.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomos medžiagos

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.