Agreguoto medino vaidmuo atliekant krūtinės ląstos aortos aneurizmos patogenezę ir išpjaustymą | laboratorinis tyrimas

Agreguoto medino vaidmuo atliekant krūtinės ląstos aortos aneurizmos patogenezę ir išpjaustymą | laboratorinis tyrimas

Anonim

Anotacija

Sporinės krūtinės ląstos aortos aneurizmos ir skrodimo patogenezė, dėl kurios gali plyšti aorta, iš esmės nežinoma. Amiloido sankaupos, susidariusios iš medino peptido, labai paplitusios krūtinės aortos terpėje. Mes ištyrėme medino kilmės amiloido atsiradimą pacientų, turinčių krūtinės ląstos aortos aneurizmą, A tipo aortos dissekcijos ir normalaus dydžio aortą, mėginiuose. Keista, bet aneurizmos ir išpjaustymo grupėse amiloido kiekis buvo žymiai mažesnis (atitinkamai 0, 63 ± 0, 13 ir 0, 36 ± 0, 24 amiloido dalelių mm2), palyginti su kontroline medžiaga (2, 37 ± 0, 58). Tačiau židinio medino imunoreaktyvumas, nesusijęs su amiloidu, buvo akivaizdžiau aptiktas dviejų sergančiųjų grupių terpėse. Naujausi amiloido tyrimai rodo, kad prefibriliniai oligomeriniai agregatai, o ne subrendę amiloido fibriliai, yra toksiški aplinkinėms ląstelėms. Stebimas neamiloidinis medino imunoreaktingumas gali atspindėti tokius toksiškus oligomerus. Tai patvirtina faktas, kad apibendrintas medinas sukėlė aortos lygiųjų raumenų ląstelių mirtį in vitro . Be to, ląstelės, inkubuotos kartu su medinu, padidino matricos metaloproteinazės-2, proteazės, kuri skaido elastiną ir kolageną bei vėliau susilpnina kraujagyslės sienelę, gamybą. Todėl mes siūlome, kad medino oligomerai būtų įtraukti į sporadinės krūtinės ląstos aortos aneurizmos degeneracijos procesą ir jos išpjaustymą.

Pagrindinis

Krūtinės ląstos aortos dissekcija ir krūtinės ląstos aortos aneurizma yra pavojingos gyvybei būklės, susijusios su degeneraciniais terpių pokyčiais. Retais atvejais sutrikimai yra susiję su Marfano sindromu, kai dėl fibrillin-1 geno klaidingų mutacijų susidaro elastingas audinys. Tačiau daugeliu atvejų šių sąlygų patogenezė yra menkai suprantama. Glikozaminoglikanų turinčios medžiagos elastinių struktūrų ir tarpląstelinių nuosėdų degeneracija, pastarosios dažnai vadinamos cistine medialine nekroze, yra tipiškos histopatologinės išvados. 1, 2 Padidėjęs tam tikrų matricinių metaloproteinazių (MMP), ypač MMP-1, MMP-2 ir MMP-9, gavimas arba buvimas rastas tiek krūtinės ląstos aortos aneurizmose, tiek skyriuose. 3, 4, 5, 6 Gauta proteolizė silpnina aortos sienelę ir, atrodo, yra tiesioginė pažeidimų priežastis. Kodėl vyksta MMP reguliavimas, nežinoma.

Maži lokalūs amiloido indėliai ypač dažni širdies ir kraujagyslių sistemoje. Bet kurioje vietoje esančiam amiloidui būdinga jo virpamosios struktūros, rentgeno spinduliuotės difrakcijos schema ir dažymo savybės Kongo raudonuoju ir tioflavinu T - charakteristikos, kurios visos yra susijusios su dideliu amiloido β turinčių lakštų kiekiu. Labiausiai paplitusi amiloidų nusėdimo vieta yra arterijų terpės, 7, 8, 9, ir nustatyta, kad šios amiloido sankaupos skiriasi biochemiškai nuo kitų širdies ir kraujagyslių amiloidų formų. 9, 10 Pagrindinis amiloido pluošto baltymas yra medinas (arba AMed), kuris yra 50 aminorūgščių liekanos baltymo pirmtako laktadherino skilimo produktas. 11 Laktadherinas yra 364 aminorūgščių baltymų liekanų baltymas, randamas daugelyje 11, 12, 13, 14 audinių ir turi daugybę siūlomų funkcijų. 13, 15, 16, 17 prie šių funkcijų pridėjome laktadherino jungimosi su elastinu gebėjimą ir mes pasiūlėme, kad laktadherinas veikia kaip jungiklis tarp lygiųjų raumenų ląstelių ir elastino per savo RGD seką N galinėje dalyje ir jo medin dalis arti C galo. 18

Sergant Alzheimerio liga, II tipo cukriniu diabetu ir kai kuriais kitais sutrikimais amiloidas yra histopatologinis požymis (apžvalgą žr. Merlini ir Bellotti 19 ir Westermark 20 ). Po ilgo laiko nepastebimo, pastaruoju metu atkreipiamas dėmesys į galimą amiloido svarbą šių ligų patogenezėje. Tiksliai tai, kaip sujungti baltymai sukelia audinių sužalojimą, nėra visiškai suprantama. Nors amiloido nuosėdos užima vietą ir tokiu būdu gali sutrikdyti normalią funkciją, naujausi duomenys rodo, kad kiti mechanizmai yra svarbesni. Visiškai išsivysčiusios amiloidinės fibrilės gali būti ne pačios kenksmingiausios. Įrodyta, kad mažesni prefibrillaliniai agregatai, dažnai vadinami oligomerais ar protofibriliais, daro toksinį poveikį ląstelėms. Manoma, kad baltymų oligomerai yra svarbūs specifiniam neuronų praradimui sergant Alzheimerio liga ir β ląstelių II tipo diabetu. Oligomerai jungiasi prie ląstelių ir dėl dar mažai suprantamų mechanizmų gali sukelti ląstelių mirtį. Nenormalių porų ir patologinių jonų kanalų susidarymas, padidėjęs oksidacinis stresas ir sąveika su vietiniais receptoriais (tokiais kaip pažengusių galutinių glikatų galutinių produktų receptoriai) yra įvykiai, kurie visi turėjo įtakos tokiems baltymų agregatams. 23, 24, 25, 26 dienomis

Iš kitų amiloidozės formų yra gerai žinoma, kad arterijos gali sukelti medialinę degeneraciją ir susilpninti kraujagyslių sienelę, todėl padidėja plyšimo rizika. Tai galima pastebėti sisteminėse amiloidozėse, bet ypač intrakranijinės amiloidozės formose, įskaitant A β -amiloidą. 27, 28 A β smegenų amiloido angiopatijos pelių modelyje nustatyta, kad amiloido sankaupos yra susijusios su neorganizuotomis medialinėmis lygiųjų raumenų ląstelėmis ir esminiu šių ląstelių praradimu. 29, 30 Todėl logiška manyti, kad kartais plačiai paplitusios medino amiloido sankaupos krūtinės aortoje yra susijusios su aortos sienos silpnėjimu. Šiame tyrime mes ištyrėme medino paplitimą aortos audiniuose pacientams, kenčiantiems nuo sporadinio krūtinės ląstos aortos dissekcijos ir aneurizmos. Be to, mes ištyrėme medino poveikį lygiųjų raumenų ląstelių kultūros sistemai.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Aortos pavyzdžiai

Aortos pavyzdžiai iš 27 pacientų, kuriems buvo krūtinės aortos aneurizma (1 lentelė), ir 10 pacientų, kuriems atlikta A tipo aortos dissekcija (2 lentelė), buvo gauti iš pacientų, kuriems buvo atlikta pasirenkama ar ūminė operacija. Visi audinių mėginiai buvo iš šlaunies kylančiosios aortos. Medžiaga iš trijų asmenų, sergančių Marfano sindromu, ir dviejų asmenų, sergančių milžiniškų ląstelių aortitu, nebuvo įtraukta į analizę dėl specifinių šių ligų patogenų. Palyginimui audinių mėginiai iš to paties aortos regiono buvo paimti iš 29 pacientų, kuriems buvo atlikta vainikinių arterijų šuntavimo operacija (perforavimo biopsija) arba aortos vožtuvo pakeitimo operacija (3 lentelė). Akivaizdžių rizikos veiksnių skirtumų tarp trijų grupių nepastebėta. Kontrolinė grupė neparodė jokių medialinio silpnumo požymių, tokių kaip aortos išsiplėtimas, ty krūtinės ląstos kylančios aortos matmenys buvo normalūs. Dauguma visų grupių asmenų buvo vyrai. Vidutinis amžius kontrolinėje grupėje buvo šiek tiek didesnis nei aneurizmos grupėje (68, 0 ir 64, 2 metų). Vidutinis amžius išpjaustymo grupėje buvo 60, 8 metų. Visais atvejais pavyzdžiai buvo laikomi ant ledo, juos vežant į laboratoriją, kur jie buvo padalijami į dalį, kuri buvo pritvirtinta neutraliame buferiniame 4% formaldehido tirpale ir įterpta parafine, ir likusią dalį, kuri buvo laikoma –20 ° C temperatūroje.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Upsalos universiteto ligoninės etikos komitetas patvirtino visus tyrimus. Duomenys buvo užkoduoti pacientų apsaugai užtikrinti ir buvo gautas informuotas sutikimas. Visi matavimai buvo atlikti nežinant apie medžiagos pobūdį.

Histologiniai metodai

Skyriai buvo dažyti Kongo raudona spalva, siekiant parodyti amiloidą. 31 Kiti skyriai buvo nudažyti aldehido fuksino (elastinui), van Giesono dėmių (lygiųjų raumenų ląstelėms ir kolagenui) ir alciano mėlynojo (glikozaminoglikanams) deriniu. Kai kurie pjūviai, apdoroti pastarosiomis sujungtomis dėmėmis, taip pat 10 minučių buvo gydomi Kongo raudonojo B 32 tirpalu, kad būtų galima vienu metu parodyti įvairius audinių komponentus ir amiloidą.

Imunohistocheminiai metodai

Triušio antiserumas A179 buvo iškeltas prieš sintetinį peptidą, atitinkantį laktadherino 245–256 aminorūgštį (medino seka), kaip aprašyta. 18, 33 Western blot'uose šis antiserumas nustato laktadheriną ir mediną, tačiau atrodo, kad tai yra medinui būdingas antikūnas imunohistochemijoje. Jis ženklina amiloidą, bet ne su elastinu susietą laktadheriną aortos ir odos medžiagoje. Ši imuninė reakcija užgesinama iš anksto inkubuojant antiserumą su atitinkamu peptidu. Imunohistochemija, naudojant A179, praskiestą santykiu 1: 4000, buvo atlikta 5 μm storio deparafinizuotose atkarpose, kaip aprašyta. 18 Norėdami dvigubai dažyti Kongo raudonuoju, imuniniu ženklu pažymėti skyriai 10 minučių buvo gydomi Kongo raudonojo B tirpalu ir po to pritvirtinti. Konfokalinė mikroskopija buvo atlikta norint detaliai išanalizuoti topografinį ryšį tarp amiloido ir skirtingų audinių komponentų. Atliekant pastarąją procedūrą, parafinuotos sekcijos buvo inkubuojamos per naktį su A179 (1: 4000) ir apdorotos, kaip aprašyta. 18

Kiekybinis amiloido indėlių ir imuninės sistemos plotų įvertinimas

Kadangi amiloido sankaupos aortos terpėje išsisklaidė kaip labai maži užpildai ir kartais yra labai nepastebimai pažymėtos ir tik silpnai nusidažo Kongo raudonai, buvo naudojamas pusiau kiekybinis metodas. Buvo suskaičiuotos atskiros amiloido sankaupos sekcijose, nudažytose Kongo raudonai, ir audinio plotas buvo nustatytas naudojant „Leica Qwin Standard Y2.8“ programą („Leica Microsystems Imaging Solutions“, Kembridžas, JK). Tada amiloido kiekis buvo išreikštas nuosėdų skaičiumi mm2. Sritys, kurių imuninis žymėjimas pažymėtas antiserumu A179, taip pat buvo nustatytos naudojant „Leica Qwin Standard Y2.8“ programą, o rezultatai buvo išreikšti kaip audinio ploto, rodančio imunoreaktyvumą, procentai.

Baltymų ekstrahavimas

Medialiniai mėginiai buvo homogenizuoti ant ledo 0, 15 mol / l NaCl, turinčio 0, 05 mol / l ditiotreitolio ir proteazės inhibitorių (0, 2 mmol / l fenilmetilsulfono fluoro, 2 μmol / l leupeptino, 2 μm / l pepstatino, 1 mmol / l amin-aminokaprino). rūgštis) ir centrifuguojama (27 000 g , 30 min.). Tai buvo pakartota keturis kartus. Taikant šią procedūrą, amiloido pluoštai patenka į granulių medžiagą, o supernatantuose yra vandenyje tirpių medžiagų. Supernatantai buvo dializuojami prieš distiliuotą vandenį ir liofilizuojami. Granulių medžiaga buvo plaunama distiliuotu vandeniu, kad būtų pašalinta druska, ir liofilizuota. Tirpinant amiloidą, nuosėdų medžiaga per naktį kambario temperatūroje buvo apdorota 6 mol / l guanidino – HCl 0, 1 mol / l Tris HCl, pH 8, 0, turinčio 0, 1 mol / l ditiotreitolio ir 0, 2 mol / l etilengndiamintetraacto rūgšties. Po centrifugavimo tirpalas buvo dializuotas prieš distiliuotą vandenį ir liofilizuotas.

Ląstelių kultūros ir toksiškumo tyrimai

Pirminės aortos kilmės žmogaus lygiųjų raumenų ląstelės iš „Clonetics“ (Cambrex, Walkersville, MD, JAV) buvo auginamos 96 šulinėlių mikrotitravimo plokštelėse pagal platintojo rekomendacijas. Dieną prieš gydymą medinu serumo koncentracija mitybinėje terpėje sumažėjo nuo 5 iki 0, 5%. Sintetiniu būdu pagamintas medinas (Kecko biotechnologijų išteklių laboratorija, Naujasis Havenas, CT, JAV) buvo apdorotas, kaip aprašyta 18 punkte, kad būtų ištirpinti paruošti agregatai. Tada jis buvo ištirpintas dimetilsulfokside ir praskiedžiamas vandeniu santykiu 1:10 iki peptido koncentracijos 0, 5 mmol / l. Medino tirpalas buvo pridėtas arba iš karto į ląsteles, arba inkubuotas kambario temperatūroje įvairiais laikotarpiais prieš toksiškumo tyrimą, norint gauti skirtingas agregacijos būsenas. Medino gautos amiloido tipo fibrilės (patvirtintos lašelių dažymu pagal Kongo raudonumą ant stiklinių plokštelių) buvo matomos nuo 5 dienos. Be šviežiai ištirpinto ir iš anksto neinkubuoto medino, buvo naudojamas fibrilinis medino preparatas. Šviežiai ištirpintas medino tirpalas daugiausia susideda iš monomerų, tačiau atliekant dydžio išskyrimo chromatografiją buvo nustatyta iki oktamerų (Larsson et al. , Rankraštis rengiamas). Kadangi fibrilliniame medino preparate gali būti ne tik fibrilų, bet ir mažesnių medino agregatų, tokią medžiagą mes centrifugavome (25 000 g , 15 min.) Ir ištyrėme supernatanto poveikį. Kai fibrilinis medinas yra centrifuguojamas, susidaro nuosėdos, kuriose yra fibrilių (Kongo teigiamas), tuo tarpu mažesni agregatai patenka į supernatantą. Medino tirpalai arba lygiavertis kiekis dimetilsulfoksido buvo praskiedžiami tiesiai į terpę, kad galutinė peptido koncentracija būtų 20 μmol / l. Trečią dieną ląstelių terpė buvo pašalinta ir sumaišyta su 10% glicerolio ir laikoma -70 ° C temperatūroje želatinos zimografijai ir Western blot analizei atlikti. Ląstelės vieną kartą buvo plaunamos terpe, kurioje nėra serumo, ir 45 minutes į ląsteles buvo įpilta terpė, kurioje yra 10% Alamar Blue (Sigma, St Louis, MO, JAV). Ląstelių proliferacija buvo nustatyta esant 530 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 590 nm spinduliuotei naudojant Wallac Victor 2 1420 daugiaženklį skaitiklį (Perkin Elmer, Turku, Suomija). Alamar Blue tyrimo rezultatas buvo pagrįstas trijų nepriklausomų eksperimentų trijų šulinėlių analize ir gerai koreliavo su ląstelių skaičiumi, įvertintu ląstelių skaitikliu.

Želatinos Zimografija

Ląstelių terpė buvo atskirta ant 10% poliakrilamido gelių, turinčių 0, 1% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 0, 1% želatinos. Siekiant įsitikinti, kad kiekviename šulinyje buvo įdėtas lygiavertis baltymų kiekis, šis kiekis buvo susietas su ląstelių skaičiumi. Norėdami išlaikyti proteazės aktyvumą, mėginiai nebuvo kaitinami mėginių buferiu, o atskyrimas vyko esant vidutinei įtampai (80 V). Po elektroforezės, geliai 30 minučių maišomi Tris buferiniame druskos tirpale (TBS) (0, 05 mol / l Tris-HCl, 0, 15 mol / l NaCl, pH 7, 4), kuriame yra 5 mmol / l CaCl2, 5 μ mol / l ZnCl2 . ir 2, 5% „Triton X-100“. Geliai buvo toliau inkubuojami 40 h 37 ° C tame pačiame buferyje, kaip ir ankstesniame žingsnyje, bet su 1% Triton X-100. Šiame etape suaktyvinami gelyje esantys želatinazės ir suskaido želatiną gelyje. Geliai buvo dažomi Coomassie Blue tirpale, kol buvo pastebėtas proteolitinis aktyvumas kaip baltos juostos mėlyname fone.

SDS-PAGE ir Western blotting

Iš paciento audinių mėginių ekstrahuoti baltymai ir ląstelių terpės buvo naudojami Western blot tyrimui. Ląstelių terpė buvo sumaišyta su vienodais kiekiais mėginio buferio, kuriame yra 8% SDS ir 0, 02 mol / l ditiotreitolio, virinama ir atskiriama SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze (PAGE) naudojant 10% akrilo / bis-akrilamido gelius. 34 Iš paciento audinio mėginių išgauti baltymai (ištirpinti mėginių buferyje, kuriame yra 4% SDS) buvo išskaidyti pagal Schägger ir von Jagow 34 ant 16, 5% akrilo / bis-akrilamido gelio. Baltymai buvo išpūsti į nitroceliuliozės Hybond ™ -ECL ™ membranas (Amersham Biosciences, Upsala, Švedija). Membranos, turinčios baltymus iš ląstelių terpės, buvo inkubuotos su pelės monokloniniu MMP-2 antikūnu (IM33T, Calbiochem, San Diego, CA, JAV), praskiestu santykiu 1: 500, o membrana su paciento ekstrahuotais baltymais inkubuota su medino antiserumu. A179, praskiestas santykiu 1: 2000.

Statistiniai metodai

Statistinė analizė buvo atlikta naudojant neparametrinę (Spearman) koreliaciją ir Manno – Whitney testą. Reikšmės buvo pateiktos kaip vidurkis ± sem P <0, 05 buvo laikomas reikšmingu.

REZULTATAI

Histologiniai radiniai

Aneurizmos ir dissekcijos pavyzdžiai parodė skirtingą aortos medialinės degeneracijos laipsnį. Be elastinės juostos suskaidymo požymių, dažniausiai buvo rasta sričių, kuriose gausu alcianinės mėlynos spalvos teigiamos medžiagos (1a ir b pav.). Daugelyje mėginių kai kuriose vietose buvo akivaizdžiai prarasti lygiųjų raumenų branduoliai.

Image

Histologiniai radiniai. ( a ) ir ( b ) skyrius iš paciento, kurio krūtinės ląstos aortos aneurizma dažytas alciano mėlyna spalva, norint gauti mucoidinę medžiagą (mėlyna), ir Kongo raudona, jei yra amiloidas (rodyklių galvutės). Įprastoje šviesoje ( a ) Kongo dažytas amiloidas atrodo raudonas, o poliarizuotoje šviesoje ( b ) amiloidas įgauna tipišką žalią dvilypumą. c ) ir d ) pjūvis, gautas iš kontrolinio bandinio, kuris buvo dvigubai dažytas medinui su antiserumu A179 ir Kongo raudonuoju. Esant normaliai šviesai ( c ) antikūnų etiketės yra matomos, o poliarizuotoje šviesoje ( d ) - būdingas gelsvai žalias dvipusis trūkumas. Kaip matyti, antikūnas tolygiai paženklina amiloidą, o amiloidas randamas išilgai elastinių sluoksnių. Kontrolinėje grupėje antikūnas ir Kongo raudonoji dėmė paprastai buvo lokalizuoti ir pasirodė vienodi. e ) ir f ) Aneurizmos ir išpjaustymo pavyzdžiai paprastai turėjo medino imunoreaktyvumą tose vietose, kur nerasta amiloido. Medino imunoreaktyvumas be amiloido yra įrodytas aortos medžiagoje iš asmens, kurio aneurizma buvo dvigubai dažyta A179 ir Kongo raudonąja dėme ( e ). Nėra poliarizuotos šviesos žaliuojančio dviejų lūžių ir dėl to amiloido nematyti ( f ).

Visas dydis

Daugelio mėginių, įskaitant kontrolines medžiagas, tarpląstelinėje terpės matricoje buvo amiloidas. Indėliai turėjo medino kilmės amiloido 11, 35 savybes su mažais plačiai pasklidusiais užpildais. Amiloidas dažnai, bet ne visada, buvo stebimas kaip plonos juostos, glaudžiai sujungtos su elastingais sluoksniais (1c ir d paveikslai). Kartais amiloido sankaupos įvyko glaudžiai kartu su suskaidytais elastingų sluoksnių galais. Taip pat dažnai buvo pastebėtos mažos amiloido sankaupos, kurios, matyt, buvo lygiųjų raumenų ląstelėse (nerodytos).

Visi amiloido telkiniai vienodai paženklinti antiserumu A179 prieš mediną (1c ir d bei 2a – d paveikslai). Be to, vietose, kuriose nėra kongofilinės medžiagos, buvo pastebėtas labiau granuliuotas ir dažnai pasklidęs imuninis ženklinimas (1e ir f bei 2e – h paveikslai). Toks žymėjimas retkarčiais pasireiškė kontrolinėje medžiagoje, tačiau daug labiau pastebimas aortos mėginiuose iš aneurizmų ir pjūvių.

Image

Tipiško kontrolinio ( a - d ) ir aneurizmos ( e - h ) mėginio konfokalinė mikroskopija. Skyriai buvo dažyti Kongo raudona spalva ir pažymėti medino antiserumu A179. Elastiniai pluoštai sukelia savaiminę fluorescenciją ir yra žali ( a ir e ). Raudona spalva rodo amiloido agregatus, nudažytus Kongo raudona spalva. Tamprūs pluoštai taip pat savaime fluorescuoja tokiu bangos ilgiu. Amiloidas rodomas tik kontroliniame mėginyje ( b ), o ne aneurizmoje ( f ). Imuninis dažymas medino antiserumu (šviesiai mėlyna spalva) matomas c ir g paveiksluose. Ketvirtasis bangos ilgis buvo naudojamas aptikti Hoechst dažytus lygiųjų raumenų ląstelių (tamsiai mėlynos spalvos) branduolius, tačiau jis atskirai nerodomas. D ir h paveikslai atspindi sujungtus visų 4 bangų ilgius. Kontroliniame mėginyje antiserumas paženklina tik amiloidą ( c ir d ). Aneurizmos pavyzdyje granuliuotas imuninis žymėjimas nepastebėtas, bet amiloido ( g ir h ) nepastebėta, o tai rodo mažų medino agregatų buvimą.

Visas dydis

Medinas amiloidas trijose skirtingose ​​grupėse

Amiloido kiekis (3 paveikslas), išmatuotas kaip kongofilinių dalelių skaičius viename plote, kontrolinėje grupėje buvo žymiai didesnis (2, 37 ± 0, 58; mediana = 1, 20), palyginti su aneurizma (0, 63 ± 0, 13, P = 0, 03; mediana = 0, 42) ir išpjaustymo grupės (0, 36 ± 0, 24, P = 0, 01; mediana = 0, 02). Tarp aortos mėginių buvo vertinama kartu, atsižvelgiant į medino kilmės amiloido laipsnį ir paciento amžių, r = 0, 65 P <0, 0001 (duomenys nepateikti). Taip pat reikia pažymėti, kad mėginių, neturinčių amiloidinių nuosėdų, procentas kontrolinėje ir aneurizmos medžiagose buvo beveik vienodas (atitinkamai 21 ir 22%). Tiriamųjų pavyzdžių skaičius skyrimo grupėje buvo per mažas palyginimui.

Image

Medino amiloidas trijose skirtingose ​​grupėse. Amiloido kiekis parodytas kaip vidurkis ± sem. Amiloido laipsnis kontrolinėje grupėje (2, 37 ± 0, 58) buvo žymiai didesnis, palyginti su aneurizma (0, 63 ± 0, 13, P = 0, 03) ir dissekcija (0, 36 ± 0, 24, P = 0, 01). ) grupes.

Visas dydis

Medino imuninis reaktyvumas

Kontroliniuose mėginiuose medino imunoreaktyvumas buvo pastebėtas daugiausia dėl kongofilinių nuosėdų. Remiantis tuo, kontroliniuose mėginiuose buvo stiprus ryšys tarp amiloido kiekio ir medino imunoreaktyviojo ploto ( r = 0, 91, P <0, 0001) (4a paveikslas). Šis ryšys nerastas medžiagose iš aortos aneurizmų ar pjūvių ( r = 0, 08, NS ir r = 0, 27, NS, atitinkamai; 4b ir c paveikslai). Medino imunoreaktyviosios sritys reikšmingai nesiskyrė tarp trijų skirtingų grupių, nors aneurizmos grupėje tendencija buvo didesnė (6, 02 ± 0, 79; mediana = 4, 42), palyginti su dissekcija (4, 92 ± 0, 67; mediana = 4, 50) ir kontrolinės grupės (4, 54 ± 0, 74; mediana = 4, 37) (4d paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad aneurizmos ir skyrimo grupėse yra daugiau medino imunoreaktyvumo, nesusijusio su amiloido agregatais, ir tai gali parodyti medino oligomerų buvimą.

Image

( a - c ) Amiloido (kongofilinių nuosėdų) kiekio ir ploto, užimto ​​medino imunoreaktyvumu, santykis trijose tirtose grupėse. Tarp dviejų kontrolinės medžiagos kintamųjų yra stiprus ryšys ( r = 0, 91, P <0, 0001), bet ne tarp dviejų sergančiųjų grupių. d ) Medino imunoreaktyvusis plotas (%) krūtinės aortos terpėje trijose tirtose grupėse. Tarp grupių nėra reikšmingo skirtumo.

Visas dydis

Ekstrahuoti baltymai

Homogenizavus ir centrifugavus audinius, turinčius vandenyje netirpstančio amiloido, amiloido virputės patenka į nuosėdas. Amyloidiniai mėginiai, atskirti SDS-PAGE, dažnai sukelia būdingą tepinėlį, kuriame taip pat yra kelios skirtingo dydžio imunoreaktyviosios juostos. Šios juostos žymi amiloido peptido monomerus ir polimerus. Atliekant baltymų, ekstrahuotų iš amiloido turinčių mėginių granulių medžiagą, Western blot analizę, buvo nustatyta medino dydžio (6 kDa) imunoreaktyvioji juosta (neparodyta). Be to, buvo akivaizdžios kelios didesnio dydžio imunoreaktyviosios juostos, įskaitant juostą, kurioje juda laktadherinas, ir difuzinį tepinėlį. Taip pat vandenyje tirpūs homogenizuotų medžiagų supernatantai iš aneurizmos, išpjaustymo ir kontrolinių bandinių be amiloido buvo atskirti SDS-PAGE ir išanalizuoti naudojant Western blot (5 pav.). Rezultatai gerai koreliavo su imunohistocheminiais duomenimis. Įdomu tai, kad aneurizma ir išpjaustymo medžiaga parodė stiprią imuninę reakciją. Buvo matoma juosta apie 46 kDa, atitinkanti laktadherino dydį, taip pat tipiškas amiloido tepinėlis iki 6 kDa, kuris yra monomerinio medino dydžio. Kaip ir tikėtasi, kontrolinėje medžiagoje buvo 46 kDa laktadherino, bet nebuvo tepinėlio. Apie 26 kDa juosta taip pat buvo pastebima kontrolinėje medžiagoje ir tikriausiai reiškia apipjaustytą laktadherino formą, kurią anksčiau Cavaletto ir kt. 36 aprašė žindančioje liaukoje. Kadangi pluoštiniai amiloidiniai baltymai patenka į granulių medžiagą, šie vandenyje tirpūs medino agregatai tikriausiai reiškia mažesnius medino agregatus, taigi dar labiau palaiko oligomerų buvimą. Imunoreakcija nebuvo pastebėta, kai buvo naudojamas antiserumas, absorbuotas su nekonjuguotu peptidu.

Image

Western blot tirpalas su medino antiserumu A179 ant vandenyje tirpios homogenizuotos medžiagos (supernatantų) iš kontrolinės (kairiosios juostos), aneurizmos (vidurinė juosta) ir diskrecinio (dešinioji juosta) mėginio. Trijuose mėginiuose nebuvo amiloido. Aneurizma ir dissekcija rodo stipresnį imuninį reaktyvumą nei kontrolinis mėginys. Laktadherino imunoreaktyvumas yra tik 46 ir 26 kDa. Be to, dviejuose ligos pavyzdžiuose būdingi tipiniai amiloido tepinėliai nuo 6 kDa (monomerinis medinas) ir daugiau, turbūt atspindintys skirtingas agregacines medino būsenas ir rodantys oligomerų buvimą.

Visas dydis

Ląstelių tyrimai ir toksiškumo tyrimai

Medinas, kuris yra 50 aminorūgščių liekanų ilgas peptidas, savaime kaupiasi į amiloido tipo fibrilius, kai inkubuojamas in vitro čia naudojamomis eksperimentinėmis sąlygomis. Paprastai ši agregacija trunka 5 dienas ir prieš tai susidaro oligomeriniai mazgai. Mes ištyrėme medino poveikį in vitro , pridėdami skirtingų agregacinių būsenų peptidus į aortos lygiųjų raumenų ląsteles kultūroje. 6a paveiksle parodytas gyvybingų ląstelių procentas skirtingoms medinų kategorijoms, ištirtoms naudojant Alamar Blue testą (resazurinas). Šis tyrimas yra jautrus ir paprastas ląstelių gyvybingumo matavimo metodas. Reagentas pridedamas prie ląstelės terpės oksiduotos formos ir po to redukuojamas į fluorescencinius dažus pagal ląstelės aktyvumą. Ląstelės, apdorotos virpamuoju ir centrifuguotu medinu, neauga taip gerai, kaip kontrolinė. Gyvybingų ląstelių procentinė dalis yra tik 88 ± 2, 93%, P <0, 05 - fibriliniam medinui ir 89 ± 3, 09%, P <0, 05 - centrifuguoto medino, palyginti su kontrole. Ląstelėms, apdorotoms šviežiai ištirpintu medinu, 101 ± 2, 53%, NS, toksinio poveikio nepastebėta. Kadangi fibrilinis medinas ir fibrilinio medino supernatantas turi tą patį žalingą poveikį, subrendusios fibrilės greičiausiai nėra toksiškos rūšys. Labiau tikėtina, kad kai kurie mažesni medino agregatai (ty oligomerai) daro toksinį poveikį, stebėtą atliekant ląstelių kultūros eksperimentus.

Image

Medinas in vitro tyrimuose. a ) Aortos lygiųjų raumenų ląstelės buvo inkubuojamos kartu su fibriliniu (teigiamas su Kongo raudonuoju) medinu, šviežiai ištirpintu (daugiausia monomerais) arba centrifuguoto fibrilinio medino preparato supernatantu. Centrifuguojant fibrilinį mediną, susidaro nuosėdos, kurias daugiausia sudaro subrendusios fibrilės. Supernatante yra agreguoto medino, kuris dar nesukūrė fibrilių. Ląstelės, turinčios fibrilinį ir centrifuguotą mediną, parodė tą patį toksinį atsaką, ir atitinkamai tik 88 ir 89% ląstelių buvo gyvybingos, palyginti su kontrole. Ląstelės, apdorotos šviežiai ištirpintu medinu, neatrodė paveiktos. ( b ) Kultūrinės terpės iš ląstelių, inkubuotų su medinu, parodė padidintą želatinazės aktyvumą želatinos zimografijos tyrime. Pastebėta 66–80 kDa dydžio proteazių indukcija. c ) Matricos metaloproteinazė 2, kuri yra baltymas, skaido elastiną ir kolageną, yra viena iš protino, kurį padidina medinas. Sukeliamos tiek neaktyvios (72 kDa), tiek aktyviosios (66 kDa) MMP-2 formos.

Visas dydis

Ląstelių terpės buvo surinktos ir elektroforezuotos ant poliakrilamido gelių, turinčių želatinos. Medinomis apdorotos ląstelės parodė padidintą želatinazės aktyvumą, palyginti su ląstelėmis, paveiktomis terpėmis, kuriose trūko medino, arba terpėmis, kuriose yra kontroliniai (nesvarbūs) peptidai. Medinas ypač sureguliavo želatinazes, kurių molekulinis svoris buvo nuo 66 iki 80 kDa (6b paveikslas). Ląstelių terpėje, sutaptoje su medinu be ląstelių, nebuvo nustatyta jokios želatinazių ekspresijos, tai parodo, kad želatinazės aktyvumas tarpininkauja ląstelėms, kaip tikėtasi (duomenys nepateikti).

Naudodami antikūnus, nukreiptus prieš MMP-2 (6c paveikslas), naudodami „Western blot“, mes parodėme, kad MMP-2 iš dalies yra atsakingas už želatinazių, pastebėtų zimografijoje, padidėjimą. MMP-2 yra proteazė, ardanti tiek kolageną, tiek elastiną ir kurios neaktyvios būsenos dydis yra 72 kDa. Aktyvacijos metu pašalinamas propeptido segmentas ir lieka 66 kDa baltymas. Ir neaktyvios, ir aktyvios MMP-2 formos buvo sukeltos medinu apdorotose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. Panašūs rezultatai buvo stebimi iš gimdos kilusių lygiųjų raumenų ląstelių (duomenys nepateikti).

DISKUSIJA

Medino (AMed) amiloidas randamas daugumai asmenų, vyresnių nei 50 metų. Aortos terpėje pastebimi nedideli, bet kartais gausūs indėliai, dažniausiai artimai liečiantis su elastingais sluoksniais. 9, 38 Medin amiloido nuosėdoms nebuvo priskirta jokia specifinė liga. Tačiau, kaip įrodyta, kad kraujagyslėse esantys kitokio biocheminio pobūdžio amiloidai gali susilpninti kraujagyslės sienelę, 27, 28, 29, pagrįsta manyti, kad medinas kenkia aplinkiniams audiniams ir taip pat yra susijęs su tam tikromis sąlygomis. pavyzdžiui, šlaunies aortos dissekcijos ir aneurizmos.

Stebimas medino poveikis aortos lygiųjų raumenų ląstelių kultūroje rodo, kad medino amiloidas gali būti svarbus aortos aneurizmos ir skilimo vystymosi dviem skirtingais keliais žaidėjas. Pirmiausia, medinu paveiktos ląstelės išreiškia padidėjusį kiekį želatinazių, pavyzdžiui, MMP-2. Krūtinės ląstos aortos dissekcija ir aneurizma dažnai rodė suskaidyto elastino požymius, kurie kartais buvo apsupti medino amiloido. Gali būti, kad medinas skatina MMP-2, kuris skaido elastingus sluoksnius, gamybą. Anksčiau buvo pranešta, kad MMP geno išraiška padidėjo pacientams, kenčiantiems nuo krūtinės ląstos aortos aneurizmos ar skilimo. 3, 4, 5, 6. Manoma, kad amiloidinių fibrilių ar oligomerų poveikis ląstelėms yra bendro pobūdžio, tai yra, tariama, kad būtent agregacijos tipas, o ne biocheminis peptido pobūdis lemia ląstelių atsakas. Todėl įdomu, kad kiti tyrimai parodė, kad A β , amiloidogeninis peptidas sergant Alzheimerio liga, sukelia MMP, 39, 40, 41, kurie, kaip manoma, turi reikšmės intracerebrinio hemoragijos vystymuisi pacientams, sergantiems smegenų smegenimis. amiloidinė angiopatija.

Antra, medinas gali dalyvauti atliekant krūtinės ląstos aortos aneurizmos patogenezę ir skilimą, nes yra toksiškas aplinkinėms lygiųjų raumenų ląstelėms. Aortos lygiųjų raumenų ląstelėms sumažėjęs ląstelių gyvybingumas, kai buvo oligomerinis medinas. Monomerinis medinas nepadarė įtakos ląstelėms, o mūsų rezultatai taip pat rodo, kad subrendusios fibrilos nėra toksiškos. Vidutinį toksiškumą, kurį matėme savo eksperimente, galima paaiškinti tuo, kad toksiški oligomerai yra tarpinės rūšys, kurios yra labai trumpalaikės in vitro ir sunkiai sugaunamos eksperimento metu, nes oligomerai linkę kauptis toliau į fibriulius. Taigi, šie rezultatai atitinka kylančią teoriją, kad specifiniai agreguoti baltymai su amiloido raukšle, tikriausiai oligomerinėmis formomis, o ne kaip visiškai išsivysčiusiomis amiloidinėmis fibrilėmis, dalyvauja kelių degeneracinių sutrikimų patogenezėje. Atsižvelgiant į tai, buvo pasiūlyta, kad subrendęs amiloidas gali apsaugoti audinius nuo žalingų amiloido oligomerų. 42 Nors tikslinės ląstelės skiriasi įvairiomis ligomis, panašu, kad, nepaisant biocheminio baltymų oligomerų pobūdžio, poveikis yra panašus. Vienas amiloidinių oligomerų poveikis yra ląstelių mirtis dėl apoptozės. Kodėl apoptozė atsiranda, vis dar diskutuojama, tačiau in vitro tyrimai rodo, kad tai gali apimti ląstelių membranų porų 23 susidarymą arba laisvųjų radikalų susidarymą. 24 In vivo padidėjęs oksidacinis stresas 43 ir pažengusių gliukavimo galutinių produktų 44, 45 buvimas pastebėtas pacientų, sergančių įvairiomis amiloidozėmis, amiloidų turinčiuose audiniuose.

Abiejose tiriamųjų grupėse pastebimas žymiai mažiau amiloidų, palyginti su kontroline medžiaga, gali atrodyti stebina. Tačiau medino imunoreaktyvumo sritis nesiskyrė tarp trijų skirtingų grupių. Galima spėlioti, kad aneurizmos ir dissekcijos išsivysto, kai medino fibrillogenezė vyksta gana lėtai, dėl to išlieka toksiškesni oligomeriniai agregatai. Stiprus ryšys tarp amiloido kiekio ir medino imunoreaktyviosios srities kontrolinėje medžiagoje paaiškinamas atradimu, kad medino imunoreaktingumas beveik išimtinai pasireiškė subrendusio amiloido forma tose biopsijose. The lack of significant correlation between the amount of amyloid and immunolabeled areas in both the aneurysm and dissection specimens depends on the sometimes pronounced granular non-amyloid immunoreactivity in the media. Although not definitely proved by our studies, it is probable that such substance is prefibrillar, possibly oligomeric and more water-soluble and may be the medin immunoreactive protein found with Western blot in the water extracts of amyloid-free aortic tissue.

Aging is a major risk factor for the development of any kind of amyloidosis and thereby also diseases associated with amyloid deposits. The reasons for this association are not known but may be multiple and include the increasing inability of the cells to efficiently handle misfolded and aggregation-prone protein species. In this study, we found a strong correlation between the amount of amyloid and age in the patient material.

In conclusion, we found significantly more medin-immunoreactive material not associated with amyloid in specimens from thoracic aortic aneurysms and dissections, which we interpreted as being medin oligomers. In addition, we show that small aggregates of medin, as opposed to fibrillar and monomeric medin, are toxic to aortic smooth muscle cells in vitro . Further, we found that medin induces smooth muscle cell production of MMP-2 and other gelatinases that may degrade the elastic laminae and collagen of the aorta. Medin may thus weaken the aortic media in two ways, first by killing the smooth muscle cells and second by inducing the degradation of elastin and collagen. The toxicity mechanism of medin is still unresolved and should be explored further, both in vitro and in vivo . Other studies with the aim to identify therapeutic agents that interfere with the toxic species are of great interest. In a recent study, the last 19 amino-acid residues of the medin peptide were found to be required for amyloid formation. 46 One therapeutic approach would be to find agents that interact with this motif, thereby inhibiting the generation of medin oligomers and preventing toxicity.

DISCLOSURE/DUALITY OF INTEREST

The authors state no duality of interest.