Arabidopsis thaliana nac transkripcijos veiksnių anac019 ir anac055 vaidmuo reguliuojant jazmono rūgšties signalizuojamas gynybines reakcijas | ląstelių tyrimai

Arabidopsis thaliana nac transkripcijos veiksnių anac019 ir anac055 vaidmuo reguliuojant jazmono rūgšties signalizuojamas gynybines reakcijas | ląstelių tyrimai

Anonim

Anotacija

Jazmono rūgštis (JA) yra svarbus fitohormonas, reguliuojantis augalų gynybinius atsakus nuo žolėdžių atakos, patogeno infekcijos ir mechaninių žaizdų. Šioje ataskaitoje mes pateikėme biocheminius ir genetinius įrodymus, kurie parodė, kad Arabidopsis thaliana NAC šeimos baltymai ANAC019 ir ANAC055 gali veikti kaip transkripcijos aktyvatoriai, norėdami reguliuoti JA sukeltą gynybos genų ekspresiją. Dviejų NAC genų vaidmuo JA signalizacijoje buvo tiriamas naudojant anac019 anac055 dvigubą mutantą ir transgeninius augalus, kurių ekspozicija viršija ANAC019 arba ANAC055 . Dviejų mutantų „ anac019 anac055“ augalai parodė susilpnintą JA sukeltą VEGETATIVE STORAGE PROTEIN1 (VSP1) ir LIPOXYGENASE2 (LOX2) ekspresiją, tuo tarpu transgeniniai augalai, kurie per daug ekspresuoja du NAC genus, parodė sustiprintą JA sukeltą VSP1 ir LOX2 ekspresiją. Tai, kad JA sukelta dviejų NAC genų ekspresija priklauso nuo COI1 ir AtMYC2 funkcijos, kartu su išvadomis, kad per didelis ANAC019 ekspresija iš dalies išgelbėjo su JA susijusį atmyc2-2 mutanto fenotipą, leido mums kelti hipotezę, kad du NAC baltymai veikia pasroviui nuo AtMYC2, kad sureguliuotų JA signalizuotas gynybines reakcijas. Tolesni įrodymai, pagrindžiantys šią mintį, gauti iš pastebėjimo, kad dvigubo mutanto anac019 anac055 atsakas į nekrotrofinį grybelį parodė didelį panašumą į mutanto atmyc2-2 .

Įvadas

Jazmonatų oksilipinų šeima, įskaitant jazmono rūgštį (JA), metilo jazmono rūgštį (MeJA) ir kitus bioaktyvius JA darinius, yra svarbios signalinės molekulės augalų karalystėje. JA yra turbūt labiausiai žinomi dėl savo vaidmens reguliuojant gynybinius atsakus nuo biotinių stresų, tokių kaip žolėdžių užpuolimas ir nekrotrofinė patogeno infekcija 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Be biologinių stresų, JA taip pat dalyvauja kontroliuojant augalų reakcijas į įvairius abiotinius įtempius 7, 8, 9, 10, 11, 12 .

Molekuliniai genetiniai tyrimai, daugiausia atlikti su Arabidopsis thaliana modelio sistema, nustatė kelis svarbius JA signalo perdavimo būdo dalyvius. Arabidopsis koronatinui nejautrus 1 ( koi1 ) mutantas yra visiškai nejautrus JA tiek šaknų augimo slopinimui, tiek gynybinių genų ekspresijai 13 . COI1 molekulinis apibūdinimas parodė, kad šis genas koduoja F-dėžutės baltymą, o tai rodo ubiquitino tarpininkaujantį baltymų skilimo procesą JA signalo perdavimui 14 . Ši hipotezė paremta įrodymu, kad COI1 sąveikauja su Skp1 ir Cullin1, kad in vivo surinktų funkcinį SCF COI1 ubikvitino ligazės kompleksą 15, 16 . Palyginti su coi1 , jazonato atsparumu1 (jar1) 17 ir jazmonatui nejautriu1 (jin1) 18, 19 mutantų rodo gana silpną JA sukeltą šaknų augimo slopinimo fenotipą. JAR1 koduoja fermentą, kuris turi JA adenilinimo aktyvumą, kad sudarytų JA aminorūgščių konjugatus, ypač JA-izoleuciną (JA-Ile), o tai rodo, kad aktyvus hormonas 20 gali būti JA-Ile, o ne pats JA. JIN1 koduoja branduolyje lokalizuoto bazinio spiralės-kilpos-spiralės (bHLH) tipo transkripcijos faktorių, žinomą kaip AtMYC2 19 . Viso genomo transkripcijos profiliavimas parodė, kad AtMYC2 veikia ir kaip aktyvatorius, ir kaip represorius, reguliuodamas įvairius JA reakcijų aspektus 21 . Neseniai Arabidopsis baltymų šeima, pavadinta JAZ (jazonato ZIM domenas), buvo nustatyta kaip SCF COI1 ubikvitino ligazės komplekso taikinys JA signalo 22, 23 . Svarbu tai, kad JA-Ile skatina SCF COI1 ubikvitino ligazės prisijungimą prie JAZ baltymų ir vėlesnį skilimą, o tai rodo, kad SCF COI1 -JAZ kompleksas gali būti JA-Ile suvokimo vieta 23 . Be to, JAZ baltymai sąveikauja ir neigiamai reguliuoja AtMYC2, centrinį JA sukeltų genų ekspresijos reguliatorių. Todėl JAZ šeimos baltymai parodo molekulinį ryšį tarp SCF COI1 tarpininkaujamų baltymų skilimo ir jasmonato reakcijų transkripcijos aktyvavimo 22 .

Tarp identifikuotų JA signalizacijos komponentų įdomus yra JIN1 / AtMYC2 (nuo šiol vadinamas AtMYC2) vaidmuo. Kaip minėta aukščiau, AtMYC2 skirtingai reguliuoja dviejų rūšių JA signalizacijos gynybos reakcijas 19, 24, 25 . Vienas iš šių tipų, kurį teigiamai reguliuoja AtMYC2, sukelia genų, dalyvaujančių reaguojant į žaizdas, ekspresiją (mechaninius ar biotinius). Kitas tipas, kurį neigiamai reguliuoja AtMYC2, slopina patogenų, susijusių su gynyba, genų ekspresiją. Taigi, nors jin1 / atmyc2 mutantuose sumažėjo reaguojančių į žaizdą reaguojančių genų, tokių kaip VEGETATIVE STORAGE PROTEIN1 (VSP1) 18 ir LIPOXYGENASE2 (LOX2) 26, ekspresija, jie padidino patogenų gynybinių genų grupės, apimančios PDF1.2 27 ir PATHOGENESIS, raišką . SUSIJUSIAS1 (PR-1) 19, 24, 25 . Tačiau mažiau žinoma apie JA signalizacijos komponentus, kurie veikia pasroviui nuo AtMYC2.

NAC (NAM / ATAF1, 2 / CUC2) baltymai yra augalų specifinių transkripcijos veiksnių, turinčių įvairias biologines funkcijas, šeima 28 . Kaupiami įrodymai rodo, kad NAC šeimos baltymai vaidina svarbų vaidmenį įvairiais augalų vystymosi aspektais 29, 30, 31, 32 . Be to, manoma, kad keli NAC baltymai Arabidopsis yra svarbūs augalų reakcijose į abiotinius stresus. Pavyzdžiui, buvo parodyta, kad trys dehidratacijos sukeliami NAC genai ( ANAC019, ANAC055 ir ANAC072 ) buvo susiję su tolerancija sausrai 33 ir kad AtNAC2 / ANAC092 buvo siejami su druskos ir streso reakcijomis 34 . Neseniai NAC baltymų vaidmuo reaguojant į biologinį stresą buvo įrodytas, kad Arabidopsis NAC baltymas ATAF2 29 veikia kaip su patogeneze susijusių genų represorius 35 . Tačiau daugumos NAC šeimos transkripcijos veiksnių narių biologinės funkcijos dar turi būti nustatytos 28 .

ANAC019 ir ANAC055 yra artimai susiję NAC šeimos baltymai Arabidopsis 33, 36 . Šioje ataskaitoje mes pateikėme įrodymų, kad ANAC019 ir ANAC055 gali veikti kaip transkripcijos aktyvatoriai, norėdami reguliuoti JA sukeltą gynybos genų ekspresiją. Dviejų NAC genų vaidmuo JA signalizacijoje buvo ištirtas naudojant anac019 anac055 dvigubus mutantus ir transgeninius augalus, kurie ekspresuoja ANAC019 arba ANAC055 . Mūsų duomenys patvirtina hipotezę, kad du NAC baltymai veikia pasroviui nuo AtMYC2, norėdami reguliuoti JA signalizuojamas gynybines reakcijas.

Rezultatai

ANAC019 ir ANAC055 yra JA sukeliami genai, koduojantys NAC šeimos baltymus

Atlikome At1g52890 ir At3g15500, kaip JA indukuojamų genų, analizę mikrotraumuose, naudodami viso Arabidopsis genomo lustą (Affymetrix) 37 . Tiek At1g52890, tiek At3g15500 koduoja 317 aminorūgščių baltymus, o jų N-gale esančios sritys turi NAC domeną, labai panašų į visus augalui būdingus NAC šeimos baltymus 36 . Todėl At1g52890 ir At3g15500 buvo pervadinti atitinkamai ANAC019 ir ANAC055 pagal nomenklatūrą, kuri buvo sukurta Arabidopsis NAC baltymų šeimai 36 . Aminorūgščių lygyje ANAC019 parodė 72% sekos panašumą į ANAC055, o homologijos sritys buvo stebimos ne tik NAC srityje, bet ir C-gale 33, o tai rodo, kad abu nariai gali turėti panašias arba sutampančias biologines funkcijas. .

ANAC019 ir ANAC055 raišką indukuoja MeJA priklausomai nuo COI1 ir AtMYC2

MeJA sukelta ANAC019 ir ANAC055 ekspresija buvo patikrinta naudojant RNR gelio blot analizę. Kaip parodyta 1A paveiksle, dviejų NAC genų nuorašų nebuvo galima aptikti nesant MeJA, bet jie buvo suaktyvinti gydant MeJA. ANAC019 ir ANAC055 nuorašų skaičiaus padidėjimas buvo nustatytas jau po 15 minučių po MeJA taikymo, o šis nuorašų skaičiaus padidėjimas išliko iki 6 val. Po gydymo.

Image

MeJA sukelta ANAC019 ir ANAC055 ekspresija . (A) MeJA sukelta dviejų NAC genų išraiška laukinio tipo augaluose. (B) MeJA sukelta dviejų NAC genų raiška skirtinguose mutantų sluoksniuose. Dviejų savaičių augalai buvo gydomi 50 μM MeJA ir nurodytu laiku buvo surinkti audiniai RNR ekstrakcijai. Iš viso į juostą buvo įdėta 30 μg visos RNR, o dėmė buvo hibridizuota su nurodytais zondais. Kartotinis gelis, dažytas EtBr, buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė.

Visas dydis

Buvo palyginta dviejų NAC genų sukelta MeJA ekspresija tarp laukinio tipo ir dviejų su JA susijusių mutantų, coi1-1 14 ir atmyc2-2 25 . Kaip parodyta 1B paveiksle, MeJA sukeltų ANAC019 ir ANAC055 ekspresijos lygiai reikšmingai sumažėjo coi1-1 ir atmyc2-2 . Šie rezultatai rodo, kad MeJA sukeltas ANAC019 ir ANAC055 ekspresijos aktyvavimas reikalauja COI1 ir AtMYC2 baltymų, dviejų iš žinomų JA signalizacijos signalų komponentų Arabidopsis, funkcijos .

ANAC019 transkripcijos faktorius tiesiogiai jungiasi su VSP1 promotoriumi

Tran et al. 33 parodė, kad ANAC019 ir ANAC055 veikia kaip transkripcijos veiksniai suaktyvinti sausros sukeltų genų ekspresiją. Be to, jie nustatė visą DNR surišančią seką, kurią atpažįsta du NAC baltymai, tarp kurių yra vadinamoji NAC atpažinimo seka (NACRS) CATGT ir šerdį rišanti vieta CACG. Kaip parodyta papildomoje informacijoje, S1 paveiksle, mūsų sekos tyrimas atskleidė du CATGT motyvus ir šešis CACG motyvus VSP1 promotoriaus regione - gerai atpažintame žymeklio gene JA sukeltoms reakcijoms Arabidopsis 18 . Norėdami patikrinti, ar ANAC019 gali surišti VSP1 promotorių, mes ištyrėme ANAC019 surišimo aktyvumą su 10 bazių DNR segmentu (CATGTCCACG), esančiose nuo –369 iki –360, palyginti su numatomu VSP1 38 transliacijos pradžios kodonu. 10 bp cis elemento CATGTCCACG turi NACRS ir šerdį rišančią vietą, kurios yra išdėstytos kaip tandeminis matricas, išdėstytas C atstumu (2A paveikslas ir papildoma informacija, S1 pav.). Išgrynintas His-ANAC019 sulietas baltymas buvo inkubuotas su pažymėtu DNR zondu, turinčiu keturis tandeminius 10-bp cis elemento pakartojimus (pavadintus vsp , 2A pav.), Ir inkubaciniai mišiniai buvo analizuojami naudojant gelio mobilumo poslinkio testą. Didelio afiniteto DNR-baltymo kompleksas buvo aptiktas kartu su laisvu zondu (2B paveikslas, 2 juosta), o DNR surišimo aktyvumas buvo sumažintas pridedant nepaženklintą vsp oligonukleotido zondą (2B paveikslas, 6–8 juostos). ). Norėdami apibrėžti DNR rišančiojo aktyvumo sekos specifiškumą, išanalizavome ANAC019 sulieto baltymo jungimosi aktyvumą su trimis mutantinėmis vsp zondo versijomis (atitinkamai pažymėtomis kaip m1 , m2 ir m3 , 2A pav.). Kai buvo tiriami DNR zondai, kurių mutacijos buvo tik CATGT (pakeistos AAAAA) arba CACG (pakeistos AAAA), akivaizdus surišimo aktyvumo sumažėjimas nepastebėtas (2B paveikslas, 3 ir 4 juostos). Priešingai, kai mutavo ir CATGT, ir CACG, ANAC019 prarado savo surišimo aktyvumą (2B paveikslas, 5 juosta). Be to, nepaženklintas mutantinis zondas, kuriame buvo pakeisti CATGT ir CACG, prarado gebėjimą konkuruoti su laukinio tipo vsp zondu dėl sąveikos su ANAC019 sulietu baltymu (2B paveikslas, 9 juosta). Šie rezultatai rodo, kad ANAC019 gali tiesiogiai sąveikauti su VSP1 promotoriumi. Atsižvelgiant į didelį ANAC055 sekos panašumą į ANAC019, yra pagrįsta numatyti, kad ANAC055 taip pat gali jungtis tiesiogiai prie VSP1 promotoriaus.

Image

In vitro His-ANAC019 jungiasi su CATGT ir CACG motyvais Arabidopsis VSP1 geno promotoriuje. (A) Oligonukleotidai, naudojami gelio mobilumo poslinkio tyrime. „ Vsp“ zonde yra keturi tandemo cis elemento pakartojimai, kuriuose yra NAC atpažinimo vieta CATGT (pabraukta) ir šerdį rišanti vieta CACG (dvigubai pabraukta), esančių VSP1 promotoriaus regione. Norėdami parodyti ANAC019 prisijungimo prie VSP1 promotoriaus specifiškumą , buvo naudojamos trys vsp zondo mutantinės versijos: m1 , CATGT buvo pakeistas AAAAA; m2 , CACG buvo pakeista AAAA; m3 , mutavo ir CATGT, ir CACG. (B) Gelio mobilumo poslinkio tyrimas, siekiant ištirti His-ANAC019 prisijungimą prie CATGT ir CACG motyvų VSP1 geno promotoriuje. Baltymų-DNR kompleksai buvo aptikti, kai His-ANAC019 sintezės buvo inkubuojamos su vsp (2 juosta), m1 (3 juosta), m2 (4 juosta), bet ne su m3 (5 juosta). m3 prarado sugebėjimą konkuruoti dėl His-ANAC019 prisijungimo prie vsp (9 juosta). Įrišimo reakcijose buvo maždaug 300 ng His-ANAC019 sulieto baltymo ir 0, 05 pmol / μL pažymėto zondo. 1 juostoje nebuvo pridėta baltymų. Trikampis rodo, kad pridedami 10 × (6 juostos), 50 × (7 juostos) ir 100 × (8 juostos) moliniai pertekliniai kiekiai nepaženklintų konkurentų prieš konkurentus (komp.). Rodyklė nurodo baltymų-DNR kompleksą. FP, nemokamas zondas.

Visas dydis

Branduolinė ANAC019 ir ANAC055 lokalizacija

Norėdami ištirti dviejų NAC baltymų subkilulinę lokalizaciją, mes sukūrėme transgeninius augalus, turinčius viso ilgio ANAC019 arba ANAC055 cDNR, sulietus su žalio fluorescencinio baltymo (GFP) cDNR, kontroliuojamu 35S promotoriaus. Homozigotiniai 35S: ANAC019-GFP ir 35S: ANAC055-GFP augalai parodė padidintą MeJA sukeltą VSP1 ekspresiją, palyginti su 35S: GFP augalais (duomenys nepateikti), o tai rodo, kad ANAC019-GFP ir ANAC055-GFP sintezės yra funkcinės. Ištirti transgeninių sodinukų šakniastiebiai, siekiant nustatyti GFP fluorescenciją. Nustatyta, kad transgeninių augalų, turinčių 35S: GFP vektoriaus kontrolę, šaknies patarimai rodo platų GFP fluorescencijos pasiskirstymą ląstelėse (3 paveikslas, viršutinė plokštė). Atvirkščiai, buvo nustatyta, kad sulieti baltymai ANAC019-GFP (3 paveikslas, vidurinė plokštė) ir ANAC055-GFP (3 paveikslas, apatinė plokštė) yra nukreipti į branduolius. Šie rezultatai rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 gali būti lokalizuoti branduolyje.

Image

NAC-GFP sulietų baltymų lokalinė ląstelė po ląstelių. Stebimi transgeninių augalų, turinčių 35S: GFP (viršutinis skydelis), 35S: ANAC019-GFP (vidurinis skydas) ir 35S: ANAC055-GFP (apatinis skydas) suliejimo genai, šaknys , ir fotografuota naudojant lazeriu skenuojantį konokalinį mikroskopą (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Vokietija).

Visas dydis

ANAC019 ir ANAC055 C-galiniai domenai turi transaktyvinį aktyvumą

Iki šiol paprastai buvo manoma, kad NAC šeimos baltymų C-galinis domenas turėjo 32, 33, 34, 35, 36 transaktyvacinį aktyvumą. Čia mes išbandėme, ar nėra transaktyvacijos domenų ANAC019 ir ANAC055, naudojant mieles kaip analizės sistemą. Mielių tyrimai buvo atlikti naudojant anksčiau aprašytą mielių štamą HF7c, kuriame yra du reporterio genai His3 ir LacZ 32 . ANAC019 ir ANAC055 C-galiniai domenai (148-317 aminorūgštys) buvo sujungti atitinkamai su GAL4 DNR surišančiu domenu, kad būtų galima ištirti jų sugebėjimą suaktyvinti transkripciją iš GAL4 priešakinio aktyvavimo sekos (UAS) ir taip skatinti mielių augimą. Mielių ląstelės, turinčios pBD-ANAC019C, pBD-ANAC055C ir kontrolinę plazmidę pBD, visos gerai augo YPDA terpėje (4B paveikslas), tuo tarpu SD terpėje be histidino ir triptofano galėjo augti tik mielių ląstelės, turinčios pBD-ANAC019C arba pBD-ANAC055C (4C paveikslas). ), kuris rodo, kad ANAC019C ir ANAC055C turi aktyvavimo transkripciją ir todėl galėtų skatinti mielių augimą be histidino ir triptofano. Atliekant β-gal aktyvumo testą, mielių ląstelės, turinčios pBD-ANAC019C arba pBD-ANAC055C, taip pat pasidarė mėlynos, rodančios kito reporterio geno LacZ aktyvaciją (4D paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 C-galiniai domenai turi transaktyvacinį aktyvumą mielėse.

Image

Mielių tyrimai rodo ANAC019 ir ANAC055 transkripcinį aktyvumą ir dimerizaciją. (AD) ANAC019 ir ANAC055 C-galiniai domenai parodė transkripcijos aktyvavimo aktyvumą. Mielių ląstelės buvo transformuotos nurodytomis plazmidėmis (A) . Transformantai buvo dryžuoti ant YPDA (B) ir SD / Trp - His - terpės, kad būtų galima ištirti augimą (C), ir buvo nustatytas β-galaktozidazės aktyvumas replikos filtruose (D) . (EH) ANAC019 ir ANAC055 dimerizacijos analizė atlikta naudojant mielių dviejų hibridų tyrimus. Mielių ląstelės buvo ko-transformuotos su nurodytomis plazmidėmis (E) . Transformantai buvo dryžuoti ant YPDA (F) ir SD / Trp - Leu - His - terpės augimui (G) ištirti ir tirti β-galaktozidazės aktyvumui replikos filtruose (H) .

Visas dydis

ANAC019 ir ANAC055 dimerizacijos

Norint patikrinti ANAC019 ir ANAC055 sugebėjimą dimerizuoti, naudojant mielių dviejų hibridų analizę, mielių ląstelės buvo ko-transformuotos skirtingais konstruktų deriniais (4E pav.). Rezultatai rodo, kad nors visos mielių linijos augo gerai YPDA terpėje (4F pav.), Tik mielių linijos, turinčios konstrukcinius pAD-ANAC019 + pBD-ANAC019 ir pAD-ANAC055 + pBD-ANAC055 derinius, galėjo gerai augti SD / Jo - terpė plius 10 mM amino-1, 2, 4-triazolo (3-AT) ir pasidarė mėlyna atliekant β-gal aktyvumo tyrimą (4G – 4H paveikslas). Tai rodo, kad ANAC019 arba ANAC055 sąveikauja su savimi mielėse. Tačiau mielių linijos, turinčios pAD-ANAC019 + pBD-ANAC055 ir pAD-ANAC055 + pBD-ANAC019 konstrukcijų derinius, priešingai, galėtų augti mažiau klonų SD / His terpėje plius 10 mM 3-AT (4G paveikslas)., ir šie klonai neparodė β-gal aktyvumo (4H pav.). Tai rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 negali sąveikauti su mielėmis. Kaip kontrolė, mielių linijos, kuriose yra pAD + pBD-ANAC019 arba pAD + pBD-ANAC055 konstruktas, negalėjo augti (4G – 4H paveikslas). Mielių analizės rezultatai rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 atveju homodimeriniai kompleksai yra sudaryti geriau nei heterodimeriniai kompleksai. Šis dimerizacijos tyrimas gali padėti paaiškinti, kodėl anac019 anac055 dvigubas mutantas rodo stipresnius su JA susijusius fenotipus nei atskiri mutantai (žr. Žemiau).

„Anac019 anac055“ dvigubas mutantas rodo sumažintą MeJA sukeltos VSP1 ir LOX2 ekspresiją

Siekdami ištirti dviejų NAC genų fiziologines funkcijas signalizuojant JA, mes nustatėme ir išanalizavome Arabidopsis T-DNR įterpimo linijas anac019 ir anac055 (žr. Medžiagos ir metodai). „ Anac019“ alelyje (SALK_096295) yra T-DNR intarpas į trečiąjį ANAC019 egzoną (5A pav.). Anac055 alelyje (SALK_014331) yra T-DNR intarpas į trečiąjį ANAC055 egzoną (5A pav.). Tačiau, palyginti su laukiniu tipu, nei anac019, nei anac055 neparodė pakitusių JA sukeltų atsakų nei šaknies augime, nei gynybinių genų ekspresijoje (duomenys nepateikti). Todėl anac019 ir anac055 buvo perbrauktos ir gauta F2 populiacija, kuri buvo atskirtos pagal du T-DNR intarpus. Atlikdami PGR metodu 266 asmenų iš šios F2 populiacijos genotipą, gavome 15 (beveik 1/16) anac019 anac055 dvigubų mutantų augalų. Šie rezultatai rodo, kad kiekviena iš T-DNR atsiskyrė kaip vienas lokusas ir kad anac019 ir anac055 yra vieno lokuso T-DNR įterpimo mutantai. RNR gelio blot analizė parodė, kad dvigubi mutantai tuo pat metu sutrikdė ANAC019 ir ANAC055 raišką (5B paveikslas).

Image

Sumažinta VSP1 ir LOX2 raiška , reaguojant į MeJA dvigubame mutante anac019 anac055 . (A) ANAC019 ir ANAC055 diagramos, parodančios T-DNR intarpus. (B) RNR gelio blot analizė, rodanti sutrikusią NAC genų ekspresiją dviguboje mutantėje anac019 anac055 . Dviejų savaičių augalai buvo gydomi 50 μM MeJA ir nurodytu laiku buvo surinkti audiniai RNR ekstrakcijai. Iš viso į juostą buvo įkelta 30 μg visos RNR. Kartotinis gelis, dažytas EtBr, buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. (C) nurodytų genotipų daigų šaknų ilgio palyginimas esant skirtingoms MeJA koncentracijoms. Kiekvienas duomenų taškas parodo 20 augalų genotipo vidurkį ± SD. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai ir gauti panašūs rezultatai. (D) MeJA sukeltos VSP1 ir LOX2 ekspresijos palyginimas dvigubu anac019 anac055 mutantu ir laukiniu tipu. Dviejų savaičių daigai buvo gydomi 50 μM MeJA ir nurodytu laiku buvo surinkti audiniai RNR ekstrakcijai. Iš viso į juostą buvo įkelta 10 μg visos RNR. Kartotinis gelis, dažytas EtBr, buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė.

Visas dydis

Pirmiausia buvo tiriamas anac019 anac055 dvigubo mutanto MeJA sukeltas atsakas, naudojant šaknies augimo slopinimo testą. Kaip parodyta 5C paveiksle, nesant ar nebuvo įvairių MeJA koncentracijų, dvigubo mutanto anac019 anac055 šaknies ilgis buvo panašus į laukinio tipo. Norėdami toliau tirti anac019 anac055 dvigubo mutanto poveikį JA reguliuojamai genų ekspresijai, išanalizavome VSP1 ir LOX2 , kurie yra du JA reguliuojamų gynybinių reakcijų žymenų genai Arabidopsis, raiškos lygius. RNR gelio blot analizė parodė, kad nesant MeJA indukcijos, dviejų genų nuorašai buvo sunkiai aptinkami (5D pav.). Gydymas MeJA paskatino dviejų genų ekspresiją tiek laukinio tipo, tiek anac019 anac055 dvigubuose mutantuose , ir nustatyta, kad VSP1 ir LOX2 transkripcijos kaupimosi lygiai dvigubuose mutantuose yra mažesni nei laukinio tipo (5 pav. D). Šie rezultatai rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 ekspresijos sutrikimas sąlygoja MeJA sukeltos VSP1 ir LOX2 ekspresijos susilpnėjimą ir rodo, kad tarp ANAC019 ir ANAC055 yra reikšmingas funkcinis dubliavimas.

Per didelis ANAC019 ir ANAC055 ekspresija sustiprina MeJA sukeltą VSP1 ir LOX2 ekspresiją

NAC genų poveikis JA signalizacijai taip pat buvo tiriamas transgeniniuose Arabidopsis augaluose, kurie, eksploatuojant 35S promotorių, perregistravo viso ilgio ANAC019 arba ANAC055 cDNR (žr. Medžiagos ir metodai). Homozigotinės transgeninės linijos buvo ištirtos atlikus RNR gelio blot analizę, norint nustatyti padidėjusią ANAC019 (6A paveikslas) arba ANAC055 (6C paveikslas) transkriptų išraišką . Reprezentatyvios eilutės, pavadintos atitinkamai 35S: ANAC019-1 # ir 35S: ANAC055-4 # , buvo pasirinktos palyginti jų reakcijas į MeJA su laukinio tipo reakcijomis.

Image

Padidėjusi VSP1 ir LOX2 raiška , reaguojant į MeJA, dėl per didelio dviejų NAC genų ekspresijos. (A) RNR gelio blot analizė, rodanti sustiprintą ANAC019 ekspresiją skirtingose ANAC019 -reprezentuojančiose linijose. RNR ekstrakcijai buvo naudojami 2 savaičių daigų (neapdorotų) audiniai ir į vieną juostą buvo įdėta 10 μg RNR. (B) MeJA sukeltos VSP1 ir LOX2 ekspresijos palyginimas tarp 35S: ANAC019-1 # ir laukinio tipo augalų. (C) RNR gelio blot analizė, rodanti sustiprintą ANAC055 ekspresiją skirtingose ANAC055 -referos ekspresijos linijose. RNR ekstrakcijai buvo naudojami 2 savaičių daigų (neapdorotų) audiniai ir į vieną juostą buvo įdėta 10 μg RNR. (D) MeJA sukeltos VSP1 ir LOX2 ekspresijos palyginimas tarp 35S: ANAC055-4 # ir laukinio tipo augalų. Dėl (B ir D) dviejų savaičių augalai buvo gydomi 50 μM MeJA ir nurodytu laiku buvo surinkti audiniai RNR ekstrahuoti. Iš viso į juostą buvo įkelta 10 μg visos RNR. Dubliuoti geliai, dažyti EtBr, buvo naudojami kaip pakrovimo kontrolė.

Visas dydis

Nesant ar nebuvo įvairių MeJA, 35S: ANAC019-1 # ir 35S: ANAC055-4 # sodinukų, šakniavaisių fenotipo, kuris nesiskyrė nuo laukinio tipo augalų (5C paveikslas). Tada dvi transgeninės linijos buvo palygintos su laukinio tipo MeJA sukeltos gynybos geno ekspresijai. Kaip parodyta 6B ir 6D paveikslėliuose, RNR gelio blot analizė rodo, kad per didelis ANAC019 arba ANAC055 ekspresija nesukelia esminio VSP1 ir LOX2 ekspresijos . Tačiau buvo nustatyta, kad šių transkriptų MeJA sukeltos ekspresijos lygis yra žymiai didesnis transgeninėse linijose nei laukinio tipo augaluose. Visi šie rezultatai kartu parodo, kad per didelis ANAC019 arba ANAC055 ekspresija sustiprina augalų reakcijas į MeJA, išreikšdamas gynybinę geną.

Per didelis ANAC019 ekspresija iš dalies gelbsti MeJA sukeltos gynybos geno ekspresijos pakitimus atmyc2-2 mutante.

Norint ištirti dviejų NAC genų, veikiančių JA signalizaciją, veikimo vietas , ANAC019 buvo per daug išreikštas JA-nejautraus mutanto atmyc2-2 genetiniame fone (7A pav.). Anksčiau buvo įrodyta, kad AtMYC2 skirtingai reguliuoja dvi JA sukeltų gynybinių genų atšakas , todėl atmyc2-2 mutantas pasižymi sumažinta JA sukeltos VSP1 ekspresija, palyginti su padidėjusia JA sukeltos PDF1.2 19, 25 raiška . Sutikdami su tuo, mūsų rezultatai rodo, kad per didelis ANAC019 ekspresija atmyc2-2 fone nesukelia nuolatinės VSP1 ar PDF1.2 išraiškos , jei nėra MeJA; tai tik bent iš dalies gelbsti MeJA sukeltų VSP1 ir PDF1.2 ekspresijos pokyčiai atmyc2-2 mutante (7B pav.). Šie rezultatai leidžia manyti, kad konstitucinė ANAC019 išraiška apeina AtMYC2, kad galėtų sukelti JA sukeltą gynybos geną, ir patvirtina mintį, kad ANAC019 tikriausiai veikia pasroviui nuo AtMYC2 JA signalizacijoje. Kiti įrodymai, pagrindžiantys šią idėją, buvo gauti iš išvados, kad MeJA sukeltos VSP1 ekspresijos sumažėjimas anac019 anac055 nebuvo toks stiprus kaip atmyc2-2 (7 pav. C).

Image

Per didelis ANAC019 ekspresija koi1-1 ir atmyc2-2 mutantų fone. (A) ANNR019 ekspresijos RNR geliu blot analizė įvairiuose fonuose, kaip nurodyta. Iš viso į juostą buvo įdėta 10 μg visos RNR iš 2 savaičių neapdorotų augalų. Kartotinis gelis, dažytas EtBr, buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. (B) RJA gelio blot analizė MeJA sukeltos VSP1 ir PDF1.2 ekspresijai skirtinguose genotipuose. (C) RJA gelio blot analizė MeJA sukeltos VSP1 ekspresijos nurodytuose genotipuose. (D) RJA gelio blot analizė, atlikta MeJA sukeltos VSP1 ekspresijos metu laukinio tipo, coi1-1 ir coi1-1 / 35S: ANAC019 transgeniniuose augaluose. B - D, 2 savaičių augalai 6 valandas buvo gydomi 50 μM MeJA ir audiniai buvo surinkti RNR ekstrakcijai. Iš viso į juostą buvo įkelta 10 μg visos RNR. Kartotinis gelis, dažytas EtBr, buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė.

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad elegantiški tyrimai parodė, kad AtMYC2 veikia paskui COI1 ir reguliuoja JA sukeltos gynybinės genų ekspresiją 19, 25, pagrįstai galima numatyti, kad ANAC019 veikimo vieta lokalizuojasi pasroviui nuo COI1 ir AtMYC2. Norėdami tai išbandyti, sukryžiavome aukščiau aprašytą 35S: ANAC019-1 # su coi1-1 ir nustatėme augalus, kurių ANi01019 buvo ekspresuota per daug, ir coi1-1 genetiniame fone (7A pav.). Tačiau per didelis ANAC019 ekspresija neišgelbėjo KoJA-1 mutanto MeJA sukeltos VSP1 ekspresijos (7D pav.), Kas rodo, kad COI1 funkcija vis dar reikalinga MeJA sukeltai VSP1 ekspresijai net transgeniniuose augaluose, kurie iš esmės ekspresuoja ANAC019 . Šis rezultatas atitinka tai, kad norint nustatyti augalų jautrumą JA, reikalinga COI1. Patvirtinantys šios idėjos įrodymai buvo gauti iš neseniai pateiktos išvados, kad SCF COI1 -JAZ kompleksas gali būti JA-Ile suvokimo vieta 22, 23 .

Dviejų NAC genų išstūmimas arba per didelis ekspresija turi įtakos augalų reakcijai į patogeno ataką

Atsižvelgiant į nustatytą JA vaidmenį reguliuojant augalų gynybines reakcijas prieš patogenus, ypač nekrotrofinius patogenus 3, 39, mes norėjome sužinoti, ar šiuose procesuose dalyvauja du NAC genai. Iš tikrųjų mūsų RNR gelio blot analizė parodė, kad ANAC019 ir ANAC055 ekspresija buvo sukelta sukėlėjo inokuliacijos (8A pav.). Tada mes ištyrėme anac019 anac055 , 35S: ANAC019-1 # ir 35S: ANAC055-4 # efektyvumą nekrotrofiniam grybeliui Botrytis cinerea . Į šiuos eksperimentus taip pat buvo įtraukti laukinio tipo augalai ir mutantas atmyc2-2 . Keturių savaičių amžiaus augalai buvo užkrėsti B. cinerea ir buvo įvertinti infekcijos simptomai. Remiantis ankstesniais tyrimais, atmyc2-2 parodė padidėjusį atsparumą šiam patogenui. Kaip ir atmyc2-2 , dvigubas mutantas anac019 anac055 taip pat parodė padidėjusį atsparumą B. cinerea, palyginti su laukiniu tipu, kaip rodo mažiau infekcijos simptomų užkrėstuose augaluose (8B pav.). Priešingai, transgeninės linijos, per daug ekspresuojančios ANAC019 arba ANAC055, parodė sumažėjusį atsparumą šiam patogenui (8B pav.).

Image

ANAC019 ir ANAC055 išnaikinimas arba per didelis ekspresija turi įtakos augalų reakcijai į B. cinerea . (A) B. cinerea infekcija sukėlė ANAC019 ir ANAC055 ekspresiją laukinio tipo augaluose. Laukinio tipo augalai buvo pasėti 5x105 sporomis ml −1 B. cinerea . Lapai buvo surinkti RNR ekstrahuoti praėjus 2 dienoms po inokuliacijos. Iš viso į juostą buvo įkelta 30 μg visos RNR. (B) Grafinis ligos simptomų vaizdavimas praėjus 5 dienoms po lapų, užkrėstų 5 × 105 sporomis, ml − 1 B. cinerea užkrėtimo. Pateikti rezultatai atspindi tris nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų duomenys rodo, kad ANAC019 ir ANAC055 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant JA signalizuotas gynybos reakcijas. Pirmiausia, dviejų NAC genų ekspresija buvo indukuota MeJA priklausomai nuo COI1 ir AtMYC2 (1 paveikslas). Antra, baltymų ir DNR jungimosi in vitro tyrimas parodė, kad ANAC019 sąveikauja su cis elementu (CATGTCCACG) VSP1 promotoriaus srityje (2 paveikslas). Trečia, anac019 anac055 dvigubų mutantų augalai parodė susilpnintą MeJA sukeltą VSP1 ir LOX2 ekspresiją (5D pav.), Tuo tarpu transgeniniai augalai, kurių ekspresija viršija ANAC019 ar ANAC055, parodė sustiprintą MeJA sukeltą VSP1 ir LOX2 ekspresiją (6B – 6D pav.). Ketvirta, per didelis ANAC019 ekspresija iš dalies išgelbėjo su JA susijusį atmyc2-2 fenotipą (7B pav.), Kuris sutrikdė bHLH transkripcijos faktoriaus AtMYC2, neseniai nustatyto žaidėjo, dalyvaujančio JA signalizacijoje, Arabidopsis 19, 25, funkciją. Penkta, anac019 anac055 dvigubo mutanto jautrumas nekrotrofiniam grybeliui parodė didelį panašumą į atmyc2-2 mutantą (8 paveikslas). Visi šie duomenys leido mums kelti hipotezę, kad du NAC baltymai gali veikti pasroviui nuo AtMYC2 norėdami reguliuoti JA tarpininkaujamus gynybos atsakus.

Įdomus dviejų NAC transkripcijos veiksnių vaidmuo JA signalizacijoje susijęs su anac019 anac055 dvigubo mutanto fenotipais, kurie parodė sumažėjusią MeJA sukeltų VSP1 ir LOX2 ekspresiją (5 pav. D), tačiau padidino atsparumą nekrotrofiniam patogenui B. cinerea (8 paveikslas). Šis stebėjimas sutampa su mutantų, kurių AtMYC2 funkcija yra sutrikusi, stebėjimais. Ankstesni tyrimai parodė, kad reaguodamas į JA gydymą, AtMYC2 skatina žaizdų, susijusių su žaizdomis, genų ekspresiją, tuo tarpu jis slopina patogenų, susijusių su gynyba, genų ekspresiją. Nuoseklios AtMYC2 mutacijos parodė sumažintą VSP1 ir LOX2 ekspresiją, palyginti su padidėjusia patogeno gynybinių PDF1.2 ir PR-1 raiška, ir dėl to žymiai padidėjo jų atsparumas nekrotrofiniam patogenui B. cinerea. 19, 25 . Mutantų fenotipo panašumas, kaip ir mūsų išvados, kad per didelis ANAC019 ekspresija ( atmyc2-2 genetiniame fone) gelbsti pokyčius, kuriuos sukelia MeJA sukeltas VSP1 ir PDF1.2 ekspresija atmyc2-2 mutante (7B pav.), Palaiko įrodymai, kad ANAC019 ir ANAC055 veikia pasroviui nuo AtMYC2 JA signalizacijos srityje.

Kiti įrodymai, pagrindžiantys mintį, kad ANAC019 veikia pasroviui nuo AtMYC2, buvo gauti palyginus MeJA sukeltus VSP1 raiškos lygius tarp 35S: ANAC019-1 # , anac019 anac055 ir atmyc2-2 . Kaip parodyta 7C paveiksle, priešingai nei 35S: ANAC019-1 # , kuris parodė aukštesnius VSP1 ekspresijos lygius, palyginti su laukiniu tipu, tiek anac019 anac055 , tiek atmyc2-2 parodė sumažintą VSP1 ekspresijos lygį, palyginti su laukiniu tipu. Tačiau MeJA sukeltos VSP1 ekspresijos sumažėjimas anac019 anac055 nebuvo toks stiprus kaip atmyc2-2 .

Priešingai nei pranešta apie atmyc2 mutanto alelius, kurie yra mažiau jautrūs nei laukinis tipas JA slopinimo poveikiui šaknies augimui 19, 25, mūsų šaknų augimo tyrimas rodo, kad dvigubas mutantas anac019 anac055 nerodo akivaizdžių šaknų. fenotipas esant MeJA (5C pav.). Tai galima paaiškinti kitų su ANAC susijusių baltymų egzistavimu; pavyzdžiui, ANAC072 (At4g27410) rodo didelį sekų panašumą į ANAC019 ir ANAC055. Kitos galimybės priklauso nuo nežinomų komponentų (šakų), kurie gali veikti lygiagrečiai su ANAC baltymais, norėdami reguliuoti JA tarpininkaujantį šaknų augimą.

Medžiagos ir metodai

Augalinės medžiagos ir augimo sąlygos

Visos naudojamos A. thaliana linijos buvo Kolumbijos (Col-0) fone. Anac019 (SALK_096295) ir anac055 (SALK_014331) mutantai buvo gauti iš Arabidopsis biologinių išteklių centro. JA atsakymo mutantai coi1-1 14 ir atmyc2-2 buvo aprašyti anksčiau.

Arabidopsis sėklos buvo paviršiaus sterilizuojamos 30% balikliu ir 0, 001% Triton X-100 10 minučių ir tris kartus plaunamos steriliu vandeniu. Tada sterilizuotos sėklos buvo suspenduotos 0, 2% agarozės ir pasodintos ant Murashige ir Skoog terpės. Augalai vernalizuojami tamsoje 3 dienas 4 ° C temperatūroje ir po to perkeliami į fitotroną, nustatytą 22 ° C temperatūroje, naudojant 16 valandų šviesos / 8 valandų tamsos ciklą. Po 2–3 savaičių daigai taip pat buvo sudedami į dirvą ir dedami į auginimo kambarį 22 ° C temperatūroje su 16 valandų šviesos / 8 valandų tamsiuoju ciklu.

T-DNR įterpimo linijų identifikavimas ir dvigubo mutanto anac019 anac055 generavimas

Spėjamos anac019 (SALK_096295) ir anac055 (SALK_014331) mutantinės linijos buvo identifikuotos iš SALK T-DNR intarpų bibliotekos duomenų bazės (//signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress). Sėklos buvo gautos iš Arabidopsis biologinių išteklių centro (ABRC) (Ohajo valstijos universitetas), o sodinukai buvo analizuojami atskirai, naudojant PGR amplifikaciją, siekiant patvirtinti T-DNR buvimą, naudojant LBa1 pradmenį (esantį T-DNR) ir specifinį geną. gruntai (papildoma informacija, S1 lentelė). SALK_096295 augalas, kuris buvo homozigotinis T-DNR įterpimui, buvo toliau kryžminamas su laukiniu tipu, o gauti F2 palikuonys sudygo kanamicino turinčioje terpėje. Buvo įvertinta F2 populiacija, susidedanti iš 251 individo, ir nustatyta, kad atsparių kanamicinui ir kanamicinui jautrių sodinukų segregacijos santykis yra 192: 59 (kuris yra artimas 3: 1). Šie rezultatai rodo, kad homozigotiniame SALK_096295 augale buvo vienas T-DNR intarpas. Kanamicinui atsparūs F2 daigai buvo dar kartą tirti PGR, siekiant nustatyti augalus, kurie buvo homozigotiniai T-DNR įterpimui. Tada identifikuotų SALK_096295 augalų, kurie buvo homozigotiniai T-DNR įterpimui, F3 palikuonys buvo tiriami RNR gelio blot'u , ar nėra ANAC019 ekspresijos, esant arba neturint MeJA. Remdamiesi šiomis analizėmis, mes nustatėme homozigotinę T-DNR įterpimo liniją su sutrikdyta ANAC019 (žymimos kaip anac019 ) ekspresija . Taikydami panašią procedūrą, mes taip pat nustatėme homozigotinę T-DNR įterpimo liniją su sutrikdyta ANAC055 (žymimos kaip anac055 ) ekspresija .

anac019 ir anac055 buvo sukryžiuoti, o PCR analizės būdu iš gautos F2 populiacijos buvo nustatyta anac019 anac055 dvigubų mutantų linija. Ryšio analizė parodė, kad su JA susijęs dvigubo mutanto fenotipas buvo atskirtas su dvigubais T-DNR intarpais (duomenys nepateikti).

Transgeninis manipuliavimas ANAC019 arba ANAC055 ekspresija laukinio tipo (Col-0), atmyc2-2 ir coi1-1 fonuose

ANAC019 ir ANAC055 koduojančios sekos buvo amplifikuotos RT-PCR ir klonuotos dvejetainio vektoriaus pBI121 Bam HI ir Sac I vietose kontroliuojant žiedinių kopūstų mozaikos viruso 35S promotoriui. Naudoti pradmenys yra išvardyti Papildomos informacijos S1 lentelėje. Gautos 35S: ANAC019 ir 35S: ANAC055 konstrukcijos buvo įvestos į laukinio tipo Arabidopsis augalus, naudojant Agrobacterium tumefaciens medijuotą transformaciją 40 . Kiekvieno iš pasirinktų transgeninių augalų T2 sėklos buvo pasodintos ant daiginimo terpės, kurioje kaip atrankos antibiotikai buvo kanamicinas, ir buvo atrinktos homozigotinės linijos. Po to buvo tiriami homozigotiniai T3 palikuonys, nustatant taikinių genų ekspresijos lygius, naudojant RNR gelinio bloto analizę. Iš viso buvo identifikuota 12 homozigotinių linijų, turinčių padidintą ANAC019 ekspresiją, ir 7 linijos, turinčios padidintą ANAC055 ekspresiją. Tolimesnei analizei buvo naudojamos reprezentatyvios linijos, peržengiančios ANAC019 (6A paveikslas) arba ANAC055 (6C paveikslas). ANAC019-1 # ir ANAC055-4 # rezultatai pateikiami šioje ataskaitoje.

Norint gauti ANAC019 -represuojančius augalus atmyc2-2 fone, aukščiau minėta ANAC019 koduojanti seka buvo klonuota į pCAMBIA1300-221-HA vektoriaus Bam HI ir Sac I vietas ir gauta plazmidė buvo įvesta į atmyc2-2 augalus. Teigiamų transformantų atranka buvo atlikta daiginimo terpėje, turinčioje higromiciną kaip antibiotikų selekcijos žymeklį. T3 transgeninių linijų, kurios buvo homozigotinės ANAC019 transgenui, palikuonims buvo atlikta RNR gelio blot analizė, kad būtų padidėjęs ANAC019 ekspresijos lygis (7A pav.), Ir PGR analizė, siekiant nustatyti atmyc2-2 alelį 25 .

Norėdami gauti ANAC019 -represuojančius augalus coi1-1 fone, 35S: ANAC019-1 # , kuris parodė padidėjusią ANAC019 ekspresiją (6A pav.), Buvo kryžminamas su coi1-1 mutantu, o gauti F1 augalai buvo nufilmuoti. Kanamicinui atsparūs F2 daigai buvo analizuojami atskirai su suskaidyta amplifikuota polimorfine seka (CAPS) 14 žymekliu, kad būtų patvirtinta coi1-1 mutacija. Identifikuoti augalai buvo toliau tiriami naudojant Northern blot metodus, siekiant patikrinti ANAC019 per didelę ekspresiją (7A pav.).

Fiziologiniai tyrimai

Šaknies augimo slopinimo tyrimui Arabidopsis sėklos buvo sudygusios MS terpėje, kurioje buvo specifinės MeJA koncentracijos (Sigma, St Louis, MO), ir šaknies ilgis buvo įvertintas po 7 dienų augimo vertikaliose plokštelėse. Kad būtų atliktas JA sukeltas gynybinio geno ekspresijos tyrimas, 2 savaičių daigai, užauginti MS terpėje, buvo tolygiai purškiami tirpalais, kuriuose buvo specifinės MeJA koncentracijos, ir po to inkubuojami augimo kameroje nuolatos veikiant. Audiniai buvo imami tam tikrais laiko tarpais RNR ekstrakcijai.

Augalų užkrėtimas patogenais

Remiantis paskelbtais metodais 25, su nedidelėmis modifikacijomis patogenui inokuliuoti buvo naudojami keturių savaičių Arabidopsis augalai. Inokuliacijai su B. cinerea grybelio progresavimas ir infekcijos simptomai buvo stebimi 10 dienų, o užkrėstiems augalams buvo priskirta 0 - 3 infekcija (0, neužsikrėtė infekcija / nekrozė; 1, lapai nekrozė; 2, lapai rodo sunki nekrozė; 3, negyvi / sugedę lapai), remiantis anksčiau aprašytu metodu 25 . Kiekvieno eksperimento metu buvo pasėjama mažiausiai 15 augalų kiekvienam genotipui ir buvo įvertinti 4 kiekvieno augalo lapai simptomų vystymuisi. Eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus su panašiais rezultatais.

RNR gelio blot analizė

Bendras RNR ekstrahavimas ir Northern blot analizė buvo atlikti paskelbtu metodu37 . RNR gelio blotai buvo tiriami naudojant PGR amplifikuotus DNR fragmentus, naudojant genui specifinius pradmenis (papildoma informacija, S1 lentelė).

ANAC019 ir ANAC055 lokaliniai tarpląsteliniai

ANAC019 cDNR buvo amplifikuota PGR, suardyta Sal I ir Spe I ir sujungta rėme su GFP į pBA-GFP vektorių, kuriame yra 35S promotorius. ANAC055 PCR amplifikuota cDNR buvo suskaidyta Spe I ir sujungta su GFP į rėmelį pBA-GFP vektoriui. Po sekvenavimo patvirtinimo, 35S: ANAC019-GFP ir 35S: ANAC055-GFP konstrukcijos, taip pat 35S: GFP vektoriaus kontrolė buvo įvesta į laukinio tipo augalus, kaip aprašyta aukščiau, ir buvo gauti homozigotiniai T3 transgeniniai augalai, remiantis selekcija antibiotikais. 7 dienų senumo transgeninių sodinukų šaknys buvo vizualizuotos konokaliniu mikroskopu lazeriu (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Vokietija).

Mielių tyrimai

Mielių tyrimai buvo atlikti naudojant anksčiau aprašytą mielių štamą HF7c, kuriame yra du reporterio genai His3 ir LacZ 32 . Norint ištirti dviejų NAC baltymų dimerizaciją, iš PGR gautos ANAC019 ir ANAC055 viso ilgio kodavimo sekos buvo klonuojamos į pGBKT7 vektorių, kuriame yra GAL4 DNR jungiantis domenas (pBD), ir į pGADT7 vektorių, kuriame yra GAL4 aktyvavimo domenas ( pAD). Gautos plazmidės buvo panaudotos mielių dviejų hibridų tyrime 32 . Norint ištirti ANAC019 ir ANAC055 transkripcijos aktyvavimo aktyvumą, jų C-galo fragmentai (aminorūgštys 148-317), atitinkamai pavadinti ANAC019C ir ANAC055C, buvo klonuoti į pGBKT7 vektorių (pBD) ir paversti mielėmis. Kiekvieno baltymo transkripcijos aktyvavimo aktyvumas buvo įvertintas remiantis paskelbtu protokolu 32 . Panaudoti pradmenys nurodyti papildomos informacijos S1 lentelėje.

His-ANAC019 sulietų baltymų gamyba ir in vitro DNR jungimosi tyrimas

PET28a vektorius (Novagen) buvo naudojamas konstruoti plazmidę, išreiškiančią His-tag pažymėtus ANAC019 susiliejimus. Panaudoti pradmenys nurodyti papildomos informacijos S1 lentelėje. His-tag sulietas baltymas buvo gaminamas ir gryninamas pagal gamintojo instrukcijas. Naudoti laukinio tipo ir mutantiniai oligonukleotidiniai vsp zondai (žr. 2 paveikslo legendą) buvo suprojektuoti pagal 10 bp elementą „CATGTCCACG“, kuris yra VSP1 promotoriaus regione. Oligonukleotidų zondai buvo pažymėti [γ- 32 P] ATP, naudojant T4 polinukleotidų kinazę (Pharmacia). DNR surišimo testai buvo atlikti nesant ar be radioaktyviosiomis medžiagomis pažymėto konkurento kambario temperatūroje, 20 μL galutiniame tūryje, naudojant rišamąjį buferį, kuriame yra 15 mM Hepes, pH 7, 5, 35 mM KCl, 1 mM EDTA, 6%. glicerolio, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 ir 2 μg poli (dI-dC). Mėginiai buvo inkubuojami kambario temperatūroje 30 min., Po to atskirti 2, 0% agarozės geliu. Po džiovinimo geliai buvo autoradiografuojami.

(Papildoma informacija yra susieta su internetine straipsnio versija ląstelių tyrimų svetainėje.)

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija S1 pav

  2. 2.

    Papildoma informacija S2 lentelė

    Šiame tyrime naudoti oligonukleotidų pradmenys