Mtor signalo vaidmuo reguliuojant skeleto raumenų masę graužikų pasipriešinimo pratybų modelyje | mokslinės ataskaitos

Mtor signalo vaidmuo reguliuojant skeleto raumenų masę graužikų pasipriešinimo pratybų modelyje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Endokrinologija
  • Tarpląsteliniai signaliniai peptidai ir baltymai
  • Metabolizmas

Anotacija

Atsparumo mankšta (RE) suaktyvina signalizavimą pagal rapamicino (mTOR) taikinį žinduoliams, ir buvo pasiūlyta, kad rapamicinui jautrus mTOR signalizavimas kontroliuoja RE sukeltus baltymų sintezės pokyčius, ribosomų biogenezę, autofagiją ir peroksisomų proliferatoriaus gama koaktyvatoriaus išraišką. 1 alfa (PGC-1α). Tačiau trūksta tiesioginių įrodymų minėtiems santykiams pagrįsti. Todėl šiame tyrime mes ištyrėme rapamicinui jautraus mTOR reikšmę RE sukeltai raumenų baltymų sintezės aktyvacijai, ribosomų biogenezei, PGC-1α ekspresijai ir hipertrofijai. Rezultatai parodė, kad rapamicinui jautraus mTOR slopinimas galėtų užkirsti kelią ribosomų biogenezės indukcijai RE, tačiau tai tik iš dalies slopino raumenų baltymų sintezės aktyvaciją. Panašiai, rapamicinui jautraus mTOR slopinimas tik iš dalies blokavo lėtinio RE hipertrofinį poveikį. Be to, tiek ūmus, tiek lėtinis RE paskatino PGC-1α ekspresijos padidėjimą ir šie pokyčiai neturėjo įtakos rapamicinui jautraus mTOR slopinimui. Apibendrinant, šio tyrimo rezultatai ne tik patvirtina, kad rapamicinui jautrus mTOR vaidina svarbų vaidmenį reaguojant į sukeltą baltymų sintezę ir sukeliant hipertrofiją, bet ir įrodo, kad papildomi (nuo rapamicino jautrūs nuo mTOR nepriklausomi) mechanizmai prisideda prie į šiuos iš esmės svarbius įvykius.

Įvadas

Baltymų metabolizmas vaidina lemiamą vaidmenį griaučių raumenų masės reguliavime, o naujausi tyrimai parodė, kad signalizacija pagal rapamicino (mTOR) mechanistinį / žinduolių taikinį vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant baltymų sintezę ir skaidymąsi 1, 2 . Yra žinoma, kad mTOR galima rasti mažiausiai dviejuose kelių baltymų kompleksuose, vadinamuose mTORC1 ir mTORC2. Apibūdinantis mTORC1 komponentas yra baltymas, vadinamas Raptor, ir buvo parodyta, kad po mTORC1 priklausomų, bet ne nuo mTORC2 priklausomų signalizacijos įvykių pogrupis yra labai jautrus rapamicino 3, 4, 5 slopinimui. Dėl šios priežasties buvo plačiai manoma, kad mTORC1 yra atsakingas už rapamicinui jautrius ir nuo mTOR priklausomus signalinius įvykius, kurie reguliuoja baltymų metabolizmą, tačiau naujausi tyrimai parodė, kad ši prielaida gali būti ne visai teisinga 6 . Nepaisant to, akivaizdu, kad rapamicinui jautrus mTOR signalas gali reguliuoti baltymų sintezę ir autofagiją, ir šis poveikis bent iš dalies yra susijęs su paskesnių molekulių, tokių kaip p70S6K, 4E-BP1 ir ULK1, 1, 2 fosforilinimo pokyčiais.

Ankstesni tyrimai, nepaisant kritinio vaidmens reguliuojant baltymų metabolizmą, parodė, kad rapamicinui jautrus mTOR signalas yra būtinas hipertrofijai, atsirandančiai reaguojant į lėtinę mechaninę perkrovą, 7, 8 . Be to, daugybė tyrimų pranešė, kad rapamicinui jautrus mTOR yra gana stipriai aktyvinamas gana ilgą laiką (pvz., > 24 val. Po mankštos) po vienkartinio RE 9, 10, 11, 12 vartojimo . Taigi plačiai buvo teigiama, kad rapamicinui jautrus mTOR yra pagrindinis signalinis mazgas, per kurį RE sukelia hipertrofiją. Tačiau ši hipotezė nebuvo visiškai patikrinta modelyje, kuris imituoja žmogaus RE. Tai yra kritinis taškas, nes raumenų susitraukimo būdas ir pobūdis, taip pat adaptacijos, vykstančios reaguojant į lėtinę mechaninę perkrovą (per sinergistinę abliaciją, SA), eiga ir mastas yra gana skirtingi nei RE. Pavyzdžiui, SA padidina raumenų masę daugiau nei 50% per 2 savaites, o RE reikia kelių mėnesių, kad raumenų masė padidėtų 10%. Be to, neseniai atliktame tyrime, kuriame buvo naudojamas graužikų RE modelis, pranešta, kad rapamicinui jautraus mTOR signalo slopinimas tik iš dalies slopina baltymų sintezės padidėjimą, stebimą po RE 13, parodant, kad, priešingai nei SA, RE gali sukelti raumenų hipertrofiją. per rapamicinui jautrius nuo mTOR priklausomus ir nuo jų nepriklausomus mechanizmus.

Įrodyta, kad ne tik vaidmuo reguliuojant baltymų apykaitą, rapamicinui jautrus mTOR reguliuoja mitochondrijų biogenezę kontroliuodamas peroksisomų proliferatoriaus gama koaktyvatoriaus 1 alfa (PGC-1α) ekspresiją 14 . Padidėjusi PGC-1α ekspresija atsiranda atlikus ištvermės pratimus per tvirtą AMP aktyvuotą baltymų kinazės (AMPK) aktyvaciją 15, ir žinoma, kad RE padidina PGC-1α ekspresiją 16 . Be to, naujausi tyrimai pranešė, kad RE ar baltymų dietos papildymas ištvermės pratimais padidina PGC-1α ekspresiją, palyginti su vien ištvermės pratimais 17, 18 . Siūloma, kad šis poveikis bent iš dalies atsirastų dėl rapamicinui jautraus mTOR aktyvavimo; tačiau į rapamicinui jautraus mTOR vaidmenį šiame procese nebuvo tiesiogiai atsižvelgiama.

Kaip aprašyta aukščiau, buvo plačiai teigiama, kad rapamicinui jautrus mTOR signalizavimas vaidina pagrindinį vaidmenį daugelyje adaptyvių reakcijų, stebimų po RE: tačiau šių teiginių pagrįstumas nebuvo ištirtas iki galo. Todėl šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, koks yra rapamicinui jautrus mTOR vaidmuo RE sukeltame raumenų baltymų sintezės aktyvavime, ribosomų biogenezėje, PGC-1α ekspresijoje ir hipertrofijoje, naudojant graužikų atsparumo pratimų modelį.

Rezultatai

Rapamicino poveikis RE sukeltai Akt-rapamicinui jautriai mTOR signalizacijai

Akt yra žinomas kaip insulino / IGF-1 signalizacijos efektorius ir jis gali sukelti raumenų hipertrofiją per kelią, susijusį su rapamicinui jautriu mTOR 19 . Kaip parodyta 1 pav., Akt fosforilinimas Ser473 metu padidėjo 1 valandą po RE nepriklausomai nuo rapamicino vartojimo, tuo tarpu reikšmingų skirtumų nebuvo pastebėta praėjus 6 ir 24 valandoms po RE (1 pav.). Priešingai nei Akt fosforilinimo pokyčiai, rapamicinas visiškai slopino RE sukeltą p70S6K Thr389 fosforilėjimo padidėjimą visais laiko momentais. Tai svarbu, nes p70S6K Thr389 fosforilinimas yra patvirtintas rapamicinui jautraus mTOR signalizacijos 7 žymeklis, taigi, šie rezultatai patvirtina, kad gydymas rapamicinu buvo visiškai efektyvus slopinant rapamicinui jautrų mTOR signalą.

Image

RE, pasipriešinimo mankšta; RAPA, rapamicinas; PLA, placebas. Vertės grafikuose reiškia vidurkius + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme kitus dažniausiai naudojamus rapamicinui jautraus mTOR signalizacijos žymenis, įskaitant 4E-BP1 ir rpS6. 4E-BP1 fosforilinimas Thr37 / 46, kuris, kaip žinoma, yra tiesioginis rapamicinui jautraus mTOR 20 taikinys, padidėjo tik praėjus 6 valandoms po RE ir buvo jautrus rapamicinui. Aktyvus izoformos santykis 4E-BP1 (aktyvios γ formos / bendro α + β + γ), kuris yra 4E-BP1 aktyvumo žymeklis 21, 22, taip pat padidėjo praėjus 1 ir 6 valandoms po mankštos, ir šis poveikis taip pat buvo visiškai slopinamas. autorius rapamicinas. Be to, RE taip pat reikšmingai padidino rpS6 Ser240 / 244 fosforilinimą visais laiko momentais ir, remiantis kitais tyrimais 23, 24, rapamicinas šio poveikio visiškai neužblokavo. Įdomu tai, kad RE visais laikais taip pat sukėlė nedidelį, bet reikšmingą bendro rpS6 padidėjimą ir šis poveikis buvo jautrus rapamicinui.

ULK1 gali suaktyvinti autofagiją, ir buvo pranešta, kad jautrus rapamicinui mTOR slopina ULK1 fosforilinant Ser757 liekaną 25 . Kaip parodyta 2 pav., ULK fosforilinimas Ser757 padidėjo 1 valandą po RE nepriklausomai nuo rapamicino vartojimo, tuo tarpu reikšmingo RE poveikio nepastebėta praėjus 6 ir 24 valandoms po RE. Be to, po RE ir rapamicino vartojimo nepastebėta jokių LC3-I ir -II baltymų (autofagosomų žymeklis) pokyčių. Apibendrinus, šie rezultatai rodo, kad RE gali padidinti ULK1 fosforilinimą vykstant nuo rapamicinui jautraus mTOR nepriklausomo proceso, tačiau šio įvykio nepakanka norint pakeisti autofagosomų susidarymo žymenis LC3 pagrindu.

Image

RE, pasipriešinimo mankšta; RAPA, rapamicinas; PLA, placebas. Vertės grafikuose reiškia vidurkius + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje.

Visas dydis

Mes toliau tyrėme MAPK signalines molekules, ERK1 / 2 ir p38 MAPK, kad nustatytume, ar nėra rapamicino poveikio taikiniams. Kaip parodyta S2 pav., ERK1 / 2 fosforilinimas Thr202 / Tyr204 ir p38 MAPK, esant Thr180 / Tyr182, nepakito po ūmaus RE ar rapamicino vartojimo. Panašiai nei RE, nei rapamicinas nepakeitė bendro ERK1 / 2 ir p38 MAPK baltymų.

Lėtinio rapamicino skyrimo ir RE poveikis Akt-rapamicinui jautriai mTOR signalizacijai

Pranešama, kad lėtinis rapamicino vartojimas (8 mg / kg rapamicino kas antrą dieną 4 savaites) sumažina p70S6K, rpS6 ir 4E-BP1 bazinį fosforilinimą (neaktyvios α formos padidėjimas / bendras 4E-BP1) skeleto raumenyse . ir panašūs rezultatai buvo stebimi šiame tyrime (3 pav.). Be to, skirtingai nuo ūmaus rapamicino vartojimo, mes pastebėjome, kad lėtinis rapamicino vartojimas lėmė bazinio Akt Ser473 fosforilinimo (mTORC2 signalizacijos žymeklio) sumažėjimą. Akt Ser473 fosforilėjimo sumažėjimas atitinka ankstesnį tyrimą, kuriame buvo skiriama 2 mg / kg rapamicino per parą 4 savaites 27, todėl patvirtina hipotezę, kad lėtinis rapamicino vartojimas gali slopinti mTORC1 ir mTORC2 27 skeleto raumenyse . 28 .

Image

RE, pasipriešinimo mankšta; RAPA, rapamicinas; PLA, placebas. Vertės grafikuose reiškia vidurkius + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje.

Visas dydis

Priešingai nei rapamicinui jautraus mTOR signalizacijos molekulės, reguliuojančios baltymų sintezę, lėtinis rapamicino vartojimas netikėtai padidino ULK1 fosforilinimą ir bendrą kiekį (3 pav.), O fosforilinto santykis su visu ULK1 nepakito. Šie rezultatai leidžia manyti, kad bent jau skeleto raumenims rapamicinui jautrus mTOR nefosforiluoja ULK1, tačiau jis gali neigiamai kontroliuoti ULK1 raišką ir todėl ULK1 signalizacijos, sukeliančios autofagiją, pajėgumą. Panašiai, lėtinis rapamicino vartojimas žymiai padidino LC3-I, taip pat LC3-II, dar labiau (3 pav.). Yra žinoma, kad iškart po vertimo proLC3 suskaidomas į neaktyvią formą, LC3-I 29 . Autofagijos metu LC3-I yra perdirbamas į su autofagosomine membrana susijusią formą LC3-II, o LC3-II kiekis koreliuojamas su autofagosomų susidarymo laipsniu 29 . Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad lėtinis rapamicinui jautraus mTOR slopinimas kontroliuoja LC3 raišką, bet nebūtinai autofagosomų susidarymą.

Bazinis ERK1 / 2 fosforilinimas „Thr202 / Tyr204“ ir p38 MAPK „Thr180 / Tyr182“ nepakeitė po lėtinio rapamicino vartojimo (S2 pav.). Priešingai, lėtinis RE sumažino bazinį ERK1 / 2 fosforilinimą Thr202 / Tyr204, bet ne p38 MAPK, esant Thr180 / Tyr182, nepriklausomai nuo rapamicino vartojimo.

Rapamicinui jautraus mTOR signalo vaidmuo reguliuojant RE sukeltą PGC-1α ekspresiją

Rapamicinui jautrus mTOR taip pat reguliuoja PGC-1α ekspresiją, kuri yra pagrindinis mitochondrijų biogenezės 14 reguliatorius, o PGC-1α ekspresija buvo naudojama kontroliuojant skeleto raumenų masę 30, 31 . Mes nustatėme, kad RE stipriai padidino PGC-1α mRNR gausą, nepriklausomai nuo rapamicino vartojimo, praėjus 6 val. Po RE (4A pav.). Tačiau bet kuriuo metu po ūmaus RE neaptikta jokių reikšmingų PGC-1α baltymų pokyčių. Kita vertus, PGC-1α baltymų kiekis buvo ženkliai padidėjęs po lėtinio RE, tačiau rapamicinas nepakeitė šio atsako RE (4 pav. B). Visi šie rezultatai rodo, kad lėtinis RE sukelia PGC-1 padidėjimą ir kad šis poveikis pasireiškia per rapamicinui jautriu mTOR nepriklausomu mechanizmu.

Image

RE ir rapamicino vartojimo poveikis PGC-1α mRNR ( A ) ir baltymams ( B ). CON, kontrolė; RE, pasipriešinimo mankšta; PLA, placebas; RAPA, rapamicinas. Vertės grafikuose reiškia vidurkius + SE. * P <0, 05, palyginti su jokios mankštos kontrolės raumenimis toje pačioje grupėje.

Visas dydis

Rapamicinui jautraus mTOR signalo vaidmuo reguliuojant RE sukeltą ribosomų biogenezę

Žinoma, kad rapamicinui jautrus mTOR stimuliuoja ne tik transliacijos inicijavimą, bet ir ribosomų biogenezę 32, 33 . Ribosomos veikia kaip vertimo mechanizmas, todėl jų tūris atspindi ląstelių transliacinį pajėgumą. Nors didesnis transliacijos efektyvumas, daugiausia padidinant transliacijos pradžią, laikomas svarbiu raumenų baltymų sintezei gerinti, ribosomų biogenezė taip pat gali vaidinti pagrindinį vaidmenį 32 . Šiame tyrime RE nekeitė rRNR kiekio per 1 ir 6 valandas po fizinio krūvio, tačiau reikšmingas rRNR padidėjimas buvo pastebėtas praėjus 24 valandoms po ūmaus ir lėtinio RE. Šiuos pokyčius iš esmės panaikino rapamicinas (5A pav.). Taigi galima daryti išvadą, kad tiek ūminis, tiek lėtinis RE sukelia ribosomų biogenezę per rapamicinui jautrų mTOR priklausomą kelią.

Image

RE ir rapamicino vartojimo poveikis rRNR ( A ), c-myc ir UBF baltymams ( B ) ir c-myc mRNR ( C ). CON, kontrolė; RE, pasipriešinimo mankšta; PLA, placebas; RAPA, rapamicinas. Vertės grafikuose reiškia vidurkius + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje.

Visas dydis

Norėdami ištirti galimus mediatorius, pirmiausia apžvelgėme UBF, nes tai yra transkripcijos veiksnys, sukeliantis rDNR transkripciją, ir jis yra pripažintas kaip rapamicinui jautraus mTOR 34 reguliatorius pasroviui. Tačiau nei ūmus, nei lėtinis RE reikšmingai nepakeitė UBF išraiškos (5B pav.). Toliau mes pažvelgėme į c-myc, nes ribosomų biogenezę, kaip žinoma, reguliuoja c-myc, ir pranešta, kad RE skatina c-myc ekspresijos padidėjimą 16, 35, 36 . Be to, buvo pasiūlyta, kad c-myc raišką bent iš dalies gali reguliuoti rapamicinui jautrus mTOR37. Panašiai kaip ir ankstesniuose tyrimuose, mes nustatėme, kad tiek ūmus, tiek lėtinis RE padidino c-myc raišką (5B pav., C). Įdomu tai, kad rapamicinas slopino c-myc padidėjimą lėtiniu RE, bet ne ūminiu RE. Visi šie duomenys rodo, kad c-myc nėra dalis rapamicinui jautraus mTOR kelio, sukeliančio ūmius RE sukeltus ribosomų biogenezės pokyčius, tačiau c-myc gali vaidinti reikšmingą rapamicinui jautrų mTOR kelią, kuris tarpininkauja ribosomų biogenezėje. lėtinio RE metu.

Rapamicinui jautraus mTOR vaidmuo RE sukeltų baltymų sintezėje ir raumenų hipertrofijoje

Daugybė tyrimų parodė, kad RE skatina raumenų baltymų sintezės padidėjimą 38, 39, ir manoma, kad baltymų sintezės padidėjimas vaidina pagrindinį vaidmenį tuo pačiu metu vykstančiame hipertrofiniame atsake 40 . Remiantis ankstesniais tyrimais 38, 39, mes nustatėme, kad RE sukėlė raumenų baltymų sintezės padidėjimą visais analizuojamais laiko momentais (6 pav.). Įdomu, tačiau rapamicinas tik iš dalies slopino RE sukeltą baltymų sintezės padidėjimą. Mūsų pastebėjimai yra labai panašūs į tuos, kuriuos neseniai pranešė West et al . 13, todėl pateikia papildomus įrodymus, pagrindžiančius išvadą, kad tiek nuo rapamicino jautrūs, nuo mTOR priklausomi, tiek nuo jų nepriklausantys mechanizmai prisideda prie baltymų sintezės padidėjimo, kuris įvyksta po ūmaus RE sukrėtimo.

Image

CON, kontrolė; RE, pasipriešinimo mankšta; PLA, placebas; RAPA, rapamicinas. Vertės išreiškiamos lyginant su kontroline grupe be pratimų, kurioms netaikomas pratimas, ir pateikiamos kaip vidurkis + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje.

Visas dydis

Mūsų pastebėjimas, kad nuo rapamicinui jautrus mTOR nepriklausomas mechanizmas prisideda prie RE sukelto baltymų sintezės padidėjimo, leido mums kelti hipotezę, kad nuo rapamicinui jautrus mTOR nepriklausomas mechanizmas taip pat prisidės prie hipertrofijos, atsirandančios reaguojant į lėtinę RE. Taigi, mes toliau tyrėme rapamicinui jautraus mTOR vaidmenį lėtinėje RE sukeltoje raumenų hipertrofijoje. Rezultatai rodo, kad lėtinis RE padidino raumenų drėgnąjį svorį (MWW) ir skaidulų CSA tiek placebo, tiek rapamicino grupėse, nors MWW ir ląstelienos CSA padidėjimo reikšmė buvo žymiai didesnė placebo grupėje (7 pav.).

Image

Lėtinio RE ir rapamicino vartojimo poveikis raumenų šlapiajam svoriui, MWW ( A, B ) ir skaidulų skerspjūvio plotui, CSA ( C, D ). Reprezentatyvūs PLA-CON ( E ), PLA-RE ( F ), PARA-CON ( G ) ir RAPA-RE ( H ) vaizdai. CON, kontrolė; RE, pasipriešinimo mankšta; PLA, placebas; RAPA, rapamicinas. Vertės išreiškiamos lyginant su kontroline grupe be pratimų, kurioms netaikomas pratimas, ir pateikiamos kaip vidurkis + SE. * P <0, 05, palyginti su tos pačios grupės raumenų nereikalavimu; # P <0, 05 palyginti su atitinkamais raumenimis placebo grupėje; + P <0, 05 tarp grupių.

Visas dydis

Diskusija

Yra žinoma, kad RE suaktyvina rapamicinui jautrų mTOR signalizavimą, ir buvo plačiai manoma, kad rapamicinui jautraus mTOR aktyvinimas turi lemiamą reikšmę tuo pačiu metu vykstančiam hipertrofiniam atsakui 41 . Tačiau labai mažai žinoma apie tai, kaip arba jei RE sukeltas rapamicinui jautrus mTOR signalas reguliuoja paskesnius procesus, tokius kaip baltymų sintezė, ribosomų biogenezė ir mitochondrijų biogenezė. Dar svarbiau, ar rapamicinui jautrus mTOR signalizavimas yra būtinas lėtinės RE sukeltos hipertrofijos atvejais. Čia mes parodėme, kad rapamicinui jautraus mTOR signalo slopinimas per rapamicino injekciją visiškai slopino ribosomų biogenezės sukėlimą ūminiu RE, tačiau tai visiškai neužkirto kelio ūminiam RE sukelti c-myc ekspresijos ar raumenų baltymų sintezės padidėjimą. Dar svarbiau, kad mes sužinojome, kad rapamicinas tik iš dalies slopina hipertrofiją, atsirandančią reaguojant į lėtinę RE. Tai iš esmės svarbus pastebėjimas, nes jis rodo, kad nuo rapamicino jautrūs nuo mTOR nepriklausomi mechanizmai prisideda ne tik prie RE sukeltų baltymų sintezės pokyčių, bet ir dėl hipertrofijos sukėlimo.

Kiek mums yra žinoma, tik trijose studijose buvo ištirtas rapamicino poveikis ūminiams RE sukeltiems baltymų sintezės pokyčiams. Du iš šių tyrimų pranešė, kad rapamicinas visiškai slopina RE sukeltą baltymų sintezės padidėjimą 42, 43 . Tačiau vienas tyrimas, atliktas su žmonėmis, neįrodė efektyvaus p70S6K fosforilinimo 42 slopinimo; tikriausiai dėl sunkumų skiriant žmonėms rapamiciną; be to, kitame tyrime buvo naudojamas žiurkių pritūpimo modelis, kuris nesukelia raumenų hipertrofijos 44 . Dabartiniame tyrime mes panaudojome elektrinės stimuliacijos sukeltą RE modelį, kuris, kaip žinoma, skatina raumenų adaptaciją, imituojančią tuos, kurie stebimi su RE žmonėms 12, 45 . Mūsų rezultatai rodo, kad RE skatina raumenų baltymų sintezę, o rapamicinas tik iš dalies blokavo šį atsaką. Mūsų rezultatai atitinka kito neseniai atlikto tyrimo su graužikais, kurie naudojo elektrinės stimuliacijos sukeltus ekscentrinius susitraukimus, rezultatus 13 . Be to, dar vienas neseniai atliktas tyrimas pranešė apie padidėjusį raumenų baltymų sintezę po ištvermės pratimų, nesant rapamicinui jautraus mTOR signalo 46, rodantis, kad tiek rapamicinui jautrūs, nuo mTOR nepriklausomi, tiek nuo rapamicinui jautrūs mTOR priklausomi procesai reguliuoja raumenų baltymų sintezę po ūmus ištvermės pratimo ar RE smūgis.

Daugybė ankstesnių tyrimų nustatė, kad rapamicinui jautrus mTOR yra mTORC1 42, 47 . Tačiau, panašiai kaip ankstesniuose tyrimuose 27, 28, po lėtinio rapamicino vartojimo stebėjome, kad sumažėja Akt Ser473, mTORC2 signalizacijos žymeklio, fosforilinimas. Taigi, mūsų pastebėjimai atitinka ankstesnius tyrimus, kurie padarė išvadą, kad ilgalaikis rapamicino vartojimas gali sutrikdyti signalizaciją tiek mTORC1, tiek mTORC2. Todėl mTORC1 gali nevisiškai tarpininkauti rapamicinui jautriems RE sukeltos hipertrofijos komponentams. Be to, ankstesni tyrimai niekada neatmetė nežinomų rapamicinui jautrių mTOR formų. Todėl svarbu manyti, kad rapamicino poveikį gali sukelti ne tik mTORC1 slopinimas.

Manoma, kad šiuo metu ribosomų biogenezė reguliuoja raumenų baltymų sintezę ir hipertrofiją, ir ją galima reguliuoti tiek nuo rapamicino jautriais, nuo mTOR priklausomais, tiek su rapamicinui jautriais, nuo mTOR nepriklausomais mechanizmais 32 . Ankstesni tyrimai parodė, kad ūmus RE padidina ribosomų biogenezę tiek žmogaus, tiek graužikų skeleto raumenyse. 13, 36, 48 . Be to, nustatyta, kad lėtinis RE žmogaus organizme sukelia ribosomų biogenezę 49 . Šiame tyrime, suderintame su šiais tyrimais, mes nustatėme, kad ūminė RE sukėlė ribosomų biogenezę, ir, mūsų žiniomis, pirmą kartą pastebėjome, kad lėtinis RE graužikams taip pat sukelia ribosomų biogenezę, taip pat žmogaus skeleto raumenis. Be to, mes nustatėme, kad rapamicinas visiškai slopina šį poveikį. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad RE indukuoja ribosomų biogenezę per rapamicinui jautrų mTOR priklausomą mechanizmą, taip pat rodo, kad ribosomų biogenezė yra dalis rapamicinui jautrių mTOR priklausomų komponentų, per kuriuos lėtinis RE sukelia hipertrofiją.

Yra žinoma, kad c-myc reguliuoja baltymų sintezę ir šis poveikis bent iš dalies yra sąlygotas jo sugebėjimo valdyti ekspresijos genus, kurie reguliuoja ribosomų biogenezę 32, 50, 51, 52 . Ankstesnis tyrimas parodė, kad mechaninis SA perkrovimas padidino c-myc ryšį su rDNR promotoriumi 53 . Be to, naujausi tyrimai pranešė, kad c-myc sukeltą ribosomų biogenezę ir baltymų sintezę iš dalies tarpininkauja mTOR signalizuojantis 51, 52 . Ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad RE padidina c-myc raišką tiek žmogaus, tiek graužikų skeleto raumenyse. 13, 16, 35, 36, 48 . Panašiai šiame tyrime mes nustatėme, kad c-myc raiška padidėjo po ūminio RE ir šis poveikis buvo nejautrus rapamicinui, o tai taip pat atitinka kitą tyrimą 13 . Todėl įmanoma, kad RE sukeltas baltymų sintezės padidėjimas ir vėlesnė hipertrofija iš dalies yra sąlygojami nuo rapamicinui jautraus mTOR nepriklausomo c-myc ekspresijos padidėjimo. Tačiau mūsų rezultatai taip pat rodo, kad c-myc padidėjimas nėra pakankamas ribosomų biogenezei sukelti, kai slopinamas rapamicinui jautrus mTOR. Taigi, tikslus c-myc vaidmuo RE sukeltoje hipertrofijoje dar nėra apibrėžtas, ir tai greičiausiai bus vaisinga sritis ateityje.

Mechanizmai, reguliuojantys c-myc raišką skeleto raumenyse, yra palyginti nežinomi. Tačiau, panašiai kaip Akt fosforilinimas (mTORC2 signalizacijos žymeklis), c-myc baltymo ekspresija sumažėjo po lėtinio rapamicino vartojimo. Įdomu tai, kad ankstesni tyrimai parodė, kad mTORC2 gali veikti kaip c-myc 54, 55 reguliatorius prieš srovę, o tai rodo, kad mTORC2 gali reguliuoti c-myc raišką skeleto raumenyse. Palyginti su mTORC1 ar rapamicinui jautriu mTOR, mTORC2 vaidmuo skeleto raumenyse yra mažiau suprantamas. Nepaisant to, ankstesni tyrimai padarė išvadą, kad mTORC2 gali reguliuoti ląstelių augimą nuo c-myc priklausomo kelio 54, 56 . Apibendrinant, šie taškai leidžia manyti, kad nuo rapamicinui jautraus mTOR nepriklausomo baltymų sintezės padidėjimas dėl ūmaus RE ir nuo rapamicinui jautraus, nuo mTOR priklausomo hipertrofijos slopinimas lėtiniu RE gali būti susijęs su mTORC2 / c-myc signalizacijos pokyčiais.

Apibendrinant galima pasakyti, kad viena iš svarbiausių išvadų, kurias galima padaryti iš šio tyrimo, yra tai, kad nuo rapamicino jautrūs mTOR nepriklausomi signalizacijos įvykiai prisideda prie hipertrofinio RE poveikio. Šis punktas kelia klausimų dėl galimų nuo rapamicino jautrių mTOR nepriklausomų įvykių, kurie gali būti susiję su šiuo procesu. Akivaizdu, kad šie mechanizmai dar turi būti apibrėžti, tačiau jei ateities tyrimai sugeba apibrėžti šiuos mechanizmus, jie atskleis anksčiau neįvertintą ir pagrindinį komponentą kelio, kuriuo RE skatina raumenų masės padidėjimą.

Metodai

Eksperimento su gyvūnais procedūros

Visos šio tyrimo eksperimentinės procedūros buvo atliktos vadovaujantis Ritsumeikan universiteto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo rekomendacijomis ir patvirtintomis Ritsumeikan universiteto eksperimentų su gyvūnais etikos komiteto. Patinų „Sprague – Dawley“ žiurkės (~ 330 g, 11 savaičių), įsigytos iš „CLEA Japan“ (Tokijas, Japonija), 1 savaitę buvo laikomos 22–24 ° C temperatūroje palaikomoje aplinkoje 12 valandų šviesos / tamsos cikle, su maistu ir vanduo ad libitum . Po nakties greitojo anestezijos atlikus izoflurano anesteziją, gyvūno dešinisis gastrocnemius raumuo buvo izometriškai sutrauktas (dešimties 3 s stimuliacija, 7 s pertrauka su susitraukimu 5 komplektams su 3 min. Poilsio intervalais) perkutanine elektrine stimuliacija, kaip aprašyta anksčiau. 12, o kairysis gastrocnemius raumuo tarnavo kaip kontrolė. MTOR inhibitorius rapamicinas (1, 5 mg / kg, 0, 25 mg / ml PBS, kuriame yra 0, 5% DMSO) arba placebas (PBS, kuriame yra 0, 5% DMSO) buvo suleistas į pilvaplėvės ertmę 1 val. Prieš mankštą. Raumenų mėginiai buvo imami praėjus 1, 6 ir 24 valandoms po RE pakartojimo ir 48 valandas po lėtinio RE (3 kartus per savaitę 4 savaites) (n = 5 kiekviename laiko taške). Audiniai buvo greitai užšaldyti skystame azote ir iki naudojimo laikomi –80 ° C temperatūroje.

Vakarų pūtimas

Sušaldyti raumenų mėginiai buvo miltelių pavidalo, naudojant granulių smulkintuvą (μT-12, TAITEC, Saitama, Japonija), ir 20 mg miltelių mėginių buvo homogenizuoti 10 tūrio dalių homogenizacijos buferio, kuriame yra 20 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 1% NP40, 1. % natrio deoksicholato, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl ir Halt TM proteazės bei fosfatazės inhibitoriaus kokteilis („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA). Homogenatai buvo centrifuguojami 10 000 x g 10 minučių 4 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo surinktas ir kiekvieno mėginio baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant „Protein Assay Rapid“ rinkinį (WAKO, Osaka, Japonija). Mėginiai praskiedžiami 3x mėginių buferiu (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ir virinami 95 ° C temperatūroje 5 minutes. Tada, naudojant 5–20% arba 10–20% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gradiento gelius, vienodi baltymų kiekiai (20 arba 50 μg) buvo atskirti naudojant elektroforezę ir vėliau pernešti į ClearTrans ® SP polivinilideno difluorido membranas (WAKO). Po perkėlimo membranos plaunamos Tris buferiniu druskos tirpalu, kuriame yra 0, 1% Tween-20 (TBST), ir užblokuojamos RAPIDBLOCK TM SOLUTION (AMRESCO, Solon, OH) 5 minutes kambario temperatūroje. Membranos buvo plaunamos ir inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje su pirminiu antikūnu. Antikūnai prieš fosfo-Akt (Ser473, kat. Nr. 9271), total-Akt (kat. Nr. 9272), fosfo-p70S6K (Thr389, kat. Nr. 9205), suminį-p70S6K (kat. Nr. 2708), fosfo-rpS6 (Ser240 / 244, katė # 2215), total-rpS6 (katė Nr. 2217), fosfo-4E-BP1 (Thr37 / 46, kat. Nr. 9459), viso-4E-BP1 (kat. Nr. 9452), fosfo-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204, katė Nr. 9101), bendras-ERK1 / 2 (katė Nr. 9102), fosfo-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182, kat. Nr. 9211), bendras p38 MAPK (kat. Nr. 9212), fosfo-ULK1 (Ser757, kat. Nr. 14202), total-ULK1 (kat. Nr. 8054), LC3 (kat. Nr. 2775) ir c-myc (kat. Nr. 9402) buvo gauti iš „Cell Signaling Technology“ (Danvers, MA). UBF (kat. Nr. Sc-13125) ir PGC-1α (kat. Nr. 516557) antikūnai buvo gauti atitinkamai iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Kruzas, CA) ir „Millipore“ („Billerica“, MA). Tada membranos vėl buvo plaunamos TBST ir inkubuojamos 1 valandą kambario temperatūroje su atitinkamu antriniu antikūnu. Membranos buvo vizualizuotos naudojant chemiliuminescencinius reagentus, o juostos buvo aptiktos naudojant „C-DiGit Blot Scanner“ (LI-COR, Lincoln, NE). Tada membranos buvo nudažytos Coomassie mėlyna spalva, kad būtų patikrinta vienoda apkrova visose juostose. Juostos intensyvumas buvo išmatuotas naudojant „Image Studio“ (LI-COR, Lincoln, NE).

Raumenų baltymų sintezė

Raumenų baltymų sintezė buvo matuojama in vivo SUnSET 57 metodu. Anestezijos metu į pilvaplėvės ertmę buvo sušvirkšta 0, 04 μmol puromicino / g kūno svorio (Wako, Tokijas, Japonija), praskiesto 0, 02 M PBS pradiniu tirpalu, ir gastrocnemijaus raumenys buvo pašalinti tiksliai po 15 minučių po puromicino vartojimo. Po homogenizacijos, kaip aprašyta aukščiau, ir centrifuguojant 2 000 g 3 minutes 4 ° C temperatūroje, supernatantas buvo surinktas ir paruoštas Western blot tyrimui. Puromicino inkorporacijai aptikti buvo naudojamas pelių monokloninis anti-puromicino antikūnas (katė Nr. MABE343, Millipore, Billerica, MA), kuris buvo įvertintas kaip visų baltymų juostų Western blot intensyvumo suma.

Realaus laiko PGR

Visa RNR buvo išgauta iš miltelių raumenų mėginio, naudojant „ISOGEN II“ („Nippon Gene“, Tokijas, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Bendros RNR koncentracijos buvo išmatuotos naudojant „Synergy HT“ („BioTek“, „Winooski“, VT) ir 500 ng visos RNR buvo atvirkščiai perrašytos į cDNR, naudojant didelės talpos cDNR RT rinkinį („Applied Biosystems“, Foster City, CA).

Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant „TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix“ („Applied Biosystems“) ir „Mini Optiocon“ realaus laiko PGR sistemą („Bio-Rad“, Hercules, CA). PGC-1α (Rn00580241_m1), c-myc (Rn00561507_m1), β-aktino (Rn00667869_m1), GAPDH (Rn01775m3b1) Šiame tyrime naudotame graužikų atsparumo pratime modelyje GAPDH ir β2-mikrogloblinas nepakito po RE ir rapamicino vartojimo, o β-aktino reikšmingai padidėjo po RE (pav. S1). Be to, GAPDH buvo stabilesnis nei β2-mikrogloblinas. Todėl šiame tyrime kaip pamatinis genas buvo naudojamas GAPDH.

Ribosomų RNR kiekio analizė

Penki mikrolitrai bendro RNR tirpalo (25 μg raumenų / μl TE) buvo sumaišyti su 1 μl GR raudonojo įkrovimo buferio (Biocraft, Tokijas, Japonija) ir 1 μl 100% glicerolio, o po to supilti į 1% agarozės gelio TBE buferyje. 18S ir 28S ribosominės RNR (rRNR) juostos intensyvumas buvo išmatuotas naudojant ImageJ programinę įrangą (NIH, Bethesda, MD).

Myofiber CSA analizė

Viduriniai pilvo skerspjūviai (5 μm storio) buvo fiksuojami 10% neutraliu buferiniu formalinu 30 minučių kambario temperatūroje, o po to dažytos hematoksilinu ir eozinu, kad būtų galima išmatuoti miofiberio skerspjūvio plotą (CSA). Apytiksliai 300 atsitiktinai parinktų miofiberių, esančių kiekviename raumenyje, CSA išmatuotas tyrėjo aklai naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (NIH, Bethesda, MD).

Statistinė analizė

Fosforilinto baltymo, bendro baltymo, mRNR, rRNR, raumenų drėgnojo svorio ir raumenų skaidulų CSA pokyčiams įvertinti buvo naudojama dvipusė ANOVA (pratimas rapamicinas × pratimas). Post-hoc analizės buvo atliktos naudojant t- testus, koreguojant Benjamini ir Hochberg klaidingą atradimų dažnį, kad būtų galima palyginti kelis kartus, kai buvo nustatytas reikšmingas pagrindinis poveikis ar sąveika. Santykiniai pokyčiai buvo lyginami tarp grupių pagal t- testą. Reikšmingumo lygis buvo nustatytas kaip P <0, 05.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Ogasawara, R. et al . MTOR signalizacijos vaidmuo skeleto raumenų masės reguliavime graužikų pasipriešinimo pratybų modelyje. Mokslas. Atstovas 6, 31142; „doi“: 10.1038 / srep31142 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.