Įvairių mandarinų, pumpurų ir apelsinų genomų sekos nustatymas atskleidžia sudėtingą maišymo istoriją citrusinių vaisių prijaukinimo metu | gamtos biotechnologijos

Įvairių mandarinų, pumpurų ir apelsinų genomų sekos nustatymas atskleidžia sudėtingą maišymo istoriją citrusinių vaisių prijaukinimo metu | gamtos biotechnologijos

Anonim

Dalykai

  • Biochemija
  • Peptidai
  • Sintetinė biologija
  • Vertimas

Anotacija

Auginami citrusai yra laukinių palikuonių rūšių atranka arba hibridai, kurių tapatumas ir indėlis į citrusinių vaisių prijaukinimą išlieka ginčytinas. Čia mes sekame ir lyginame citrusinių vaisių genomus - aukštos kokybės etaloninį haloidinio klementino genomą ir mandarinų, pummelo, saldžiai oranžinį ir rūgščiai oranžinį genomus - ir parodome, kad auginami tipai yra kilę iš dviejų pirmtakų rūšių. Nors kultivuojami pumpurai atspindi vienos iš palikuonių rūšių, Citrus maxima , pasirinkimą, kultivuojami mandarinai yra C. maxima įsiskverbimas į protėvių mandarinų rūšį Citrus reticulata . Plačiausiai auginami citrusiniai vaisiai, saldus apelsinas, yra anksčiau įmaišytų individų palikuonys, tačiau rūgštus apelsinas yra grynų C. maxima ir C. reticulata tėvų F1 hibridas, taigi tai reiškia, kad laukiniai mandarinai buvo ankstyvojo veisimosi daigų dalis. Kinijos laukinis „mandarinas“ iš esmės skiriasi nuo C. reticulata , taigi galima daryti išvadą apie kitų nepripažintų laukinių citrusinių rūšių galimybę. Citrusinių filogenijų supratimas atliekant genomo analizę paaiškina taksonominius ryšius ir palengvina genetinę seką.

Pagrindinis

Citrusai visame pasaulyje plačiai vartojami kaip sultys ar švieži vaisiai, teikiantys svarbius vitamino C ir kitų sveikatą stiprinančių junginių šaltinius. Pasaulinė gamyba 2012 m. Viršijo 86 milijonus tonų, o numatoma vertė sudarė 9 milijardus dolerių (//www.fas.usda.gov/psdonline/circulars/citrus.pdf). Dėl labai siauros auginamų citrusinių vaisių genetinės įvairovės jie yra labai pažeidžiami ligų protrūkiams, įskaitant citrusų žaliuojančią ligą (dar vadinamą Huanglongbing arba HLB), kuri greitai plinta visuose pagrindiniuose pasaulio citrusus auginančiuose regionuose 1 . Supratimas apie gyventojų genomiką ir citrusų prijaukinimą įgalins patobulinimo strategijas, įskaitant atsparumą žaliuojančioms ir kitoms ligoms.

Valgomųjų citrusinių vaisių prijaukinimas ir platinimas prasidėjo prieš kelis tūkstančius metų Pietryčių Azijoje ir išplito visame pasaulyje, senaisiais sausumos ir jūros keliais. Linijos, kurios sukėlė moderniausias auginamas veisles, vis dėlto buvo prarastos be dokumentų dokumentuose senovėje, o jų tapatumas tebėra ginčytinas 2, 3 . Šias kilmes sunku iššifruoti dėl kelių citrusinių vaisių biologijos ir auginimo ypatybių. Auginamos veislės paprastai dauginamos kloniniu būdu skiepijant ir auginant aseksualią sėklą (apomixis per nucellar polyembryony), siekiant išlaikyti pageidaujamus bruožų derinius (1 pav.). Taigi daugelis svarbių veislių grupių turi būdingus pagrindinius genotipus, kurie, kaip spėjama, atsirado dėl tarprūšinės hibridizacijos ir (arba) iš eilės laukinių protėvių rūšių intrigresinės hibridizacijos. Šie prijaukinimo įvykiai įvyko anksčiau nei pasaulinis citrusinių vaisių auginimo plėtimasis šimtus ar galbūt tūkstančius metų, neturint užrašų apie prijaukinimo procesą. Tokių grupių įvairovė atsiranda dėl sukauptų somatinių mutacijų, paprastai be seksualinės rekombinacijos, arba kaip galūnių sportas ant medžių, arba tarp apomiktinių sodinukų palikuonių.

Image

Pummelos (1, 2 kontūro kairėje) yra dideli medžiai, duodantys labai didelius vaisius, turintys baltą, rausvą ar raudoną minkštimą (2) ir geltonai ar rausvai žieve. Daugelis veislių turi didelius lapus su petioles su iškiliais sparnais. Apomiktinio reprodukcijos nėra, o dauguma atrankų yra nesuderinamos. Mandarinai (3–7) yra mažesni medžiai, darantys mažesnius vaisius su apelsino minkštimu (9, 11) ir žievės spalva. Mandarinai turi tiek apomiktinį, tiek zigotinį dauginimąsi, o kai kurie - savaime suderinami. Apelsinai (8, 10) paprastai būna vidutinio dydžio medžiai ir vaisiai; minkštimas (10) ir oda yra dažniausiai oranžinės spalvos, o apomiktinė reprodukcija visada būna. (Parodytas rūgštus apelsinas (12) yra nesubrendęs.)

Visas dydis

Manoma, kad dvi laukinės rūšys prisidėjo prie prijaukintų pumpurėlių, mandarinų ir apelsinų (1 papildoma pastaba). Remiantis morfologija ir genetiniais žymenimis, „Pummelos“ paprastai identifikuojamos su laukinėmis rūšimis C. maxima (Burm.) Merrill, kuri yra vietinė Pietryčių Azija. Nors „mandarinai“ panašiai plačiai identifikuojami su C. reticulata Blanco 4, 5, 6 rūšimis, laukinės C. reticulata populiacijos nebuvo tiksliai aprašytos. Įvairūs autoriai mandarinų klasifikavimui taikė skirtingą požiūrį, buvo parengtos kelios pavadinimų darymo konvencijos 7, 8 . Čia pabrėžiame, kad terminas „mandarinas“ yra komercinis arba populiarus pavadinimas, reiškiantis citrusinius vaisius su mažais, lengvai nuluptais, saldžiais vaisiais, tačiau nebūtinai taksonominis. Mes vartojame apibūdinimą „tradicinis“, kad apibūdintume mandarinus, prieš tai neįtardami, kad jie yra maišomi su kitomis protėvių rūšimis, kad galėtume atskirti juos nuo mandarinų rūšių, kurios yra žinomos ar manomos kaip naujausi hibridai. Aiškumo dėlei sisteminiame pavadinime tokius žinomus hibridus naudojame kaip × (kaip aprašyta 9 nuorodoje). Pripažindami, kad genomo sekos nustatymas ir įvairovės analizė pateikė įžvalgą apie kelių kitų augalų pasėlių prijaukinimo istoriją 10, 11, javų 12, 13 ir kitų kultūrų (apžvelgta nuoroda 14), mes sekome ir išanalizavome įvairios kultūrinių augalų kolekcijos genomus. pummelos, mandarinai ir apelsinai (1 papildoma lentelė), siekiant patikrinti pummelo-mandarinų rūšių hipotezę ir išsiaiškinti kelių svarbių citrusinių augalų veislių kilmę.

Rezultatai

Aukštos kokybės citrusinių vaisių etaloninis genomas

Norėdami pateikti citominių vaisių analizės genominę platformą, iš × 7 × Sanger didezoxy viso genomo kulkosvaidžio aprėpties aukštos kokybės etaloninį genomą sukūrėme Clementine mandarino haploidinį darinį ( C. × Clementina cv. Clemenules) 15 (2 ir 2 papildomos pastabos) . 2–4 papildomos lentelės). Naudojant haploidinę medžiagą (gautą iš vienos kiaušialąstės po indukuotos ginogenezės 15, 16 ) pašalinamos komplikacijos, atsirandančios surenkant pasenusius diploidinius genomus. Gauta 301, 4 Mb etaloninė seka yra beveik baigta, pasižyminti puikiu surinkimo nepertraukiamumu (sudedamas L50 = 119 kb) ir pastoliais (pastoliai L50 prieš pseudochromosomos konstravimą = 6, 8 Mb), palyginti su neseniai paskelbta saldžiai oranžinės grimzlės seka 17 (papildoma pastaba). 2 ir 5 lentelė). Ilgi pastoliai leido mums sukonstruoti pseudochromosomas, pagal naujausią citrusų genetinį žemėlapį 18 paskiriant 96% junginio devynių citrusinių vaisių chromosomų vietoje; palyginti, saldžiai oranžinėje grimzlėje 17 (2 papildoma pastaba) buvo priskirta tik 79%. Taip pat iš sekos duomenų mes padarėme išvadą apie dviejų diploidinių Clementine haplotipų fazę, išsiaiškinę dešimt mejozės kryžminių junginių, iš kurių susidarė haploidinis Clementine (papildomas 1 pav.), Ir vardinius centromerus pažymėjo kaip didelius mažai rekombinacijos regionus (papildomi 2–11 pav.) ). Mes taip pat savarankiškai sekvenavome ir surinkome (diploidinės) saldžiai oranžinės veislės 'Ridge Pineapple' grimzlės genomą, derindami gilų 454 seką su lengvu Sanger ėminių ėmimu (3 papildomoji pastaba ir 5–10 lentelės) ir nustatėme chromosomų fazavimą naudodami neseniai pranešta apie saldžiųjų apelsinų kilmės dihaploido grubios grimzlės genomą 17 .

Citrusinių vaisių genomas išlaiko didelę segmentinę sintezę (tai yra vietinį kolineariškumą) su kitais eudikotomis, nors chromosomų skalėje jis patyrė didelį pertvarkymą (4 papildoma pastaba). Mes siūlome konkretų modelį, pagrįstą sintezės analize, citrusų genomo kilmei iš paleoheksapoloidinio eudikoto protėvio 19 per chromosomų dalijimosi ir susiliejimo serijas (papildomi 12–14 pav.). Nepaisant citrusinių augalų genomo kompaktiškumo, 45% yra pasikartojančių, turinčių ilgą galą pakartojančius retrotransposonus ir daugybę charakterizuotų elementų, kurių kiekviena sudaro beveik pusę pasikartojančio turinio; likusią dalį sudaro DNR transposonai ir ilgi susikertantys elementai (5 papildoma pastaba ir 11 papildoma lentelė). Clementine ir saldžiuose apelsinuose nustatėme ∼ 25 000 baltymą koduojančių genų lokusų, skaičiavimo metodais derinant juos su ilgomis perskaitytomis 454 ir Sanger ekspresijos sekų žymėmis (5 papildoma pastaba ir 12 ir 13 lentelės).

Citrusinių protėvių tyrimai

Norėdami ištirti auginamų veislių kilmę, mes išskaidėme keturių mandarinų (įskaitant Clementine), dviejų pumpurų ir vieno rūgštaus apelsino, taip pat aukščiau aprašytą saldžiai oranžinio genomo genomą (1 lentelė, 1 ir 14–16 papildomos lentelės ir papildomi priedai). 1 ir 6 pastabos). (Šio tyrimo dalis nebuvo citrusmedica (trečioji tariamų laukinių rūšių rūšis), ty citrinai, kalkės ir citrinos.) Viso genomo karabinų parodymai kiekvienoje kultūroje buvo suderinti su saldžiai oranžinės spalvos chloroplastų genomu 37 ir identifikuoti aukštos kokybės vieno nukleotido variantai (SNV) (6 papildoma pastaba). Į šią analizę neįtraukėme indelių ir didesnių konstrukcinių variantų. Mes lengvai nustatėme du skirtingus chloroplastų genomų tipus (cpDNR), kurių visi mandarinai turi vieną tipą (kurį mandarinui ar C. reticulata apibūdiname kaip M), o pumpurėliai ir apelsinai dalijasi kitu tipu (apibrėžti kaip P pummelo ar C. maxima , su ribota variacija kiekviename cpDNR tipe (6 papildoma pastaba ir papildomas 15 pav.), suderinus su ankstesniais mitochondrijų žymenų tyrimais 20. Citrusinių branduolių genomai pasakoja sudėtingesnę istoriją (7–9 papildomos pastabos ir 17–19 papildomos lentelės). Suderindami viso genomo pistoletą su haploidiniu Clementine nuoroda ir identifikuodami aukštos kokybės SNV (6 papildomoji pastaba), mes nustatėme, kad nors sekvenuotos pummelės akivaizdžiai yra seksualinės C. maxima rūšies genotipai su minimaliu kitų rūšių įsiskverbimu, visos mandarino tipo citrusai, kuriuos mes sekvenavome, turi didelę sumaišymą su pummelo, todėl negali būti tiesiog atrankos iš protėvių C. reticulata populiacijos (2 ir 3 pav.). nd rūgštiniai apelsinai taip pat yra skirtingo sudėtingumo hibridai, abiem atvejais turintys pummelo tipo chloroplastų genomus.

Pilno dydžio lentelė

Image

a ) Nukleotidų heterozigotiškumo pasiskirstymas, apskaičiuotas persidengiant 100 kb langais (su 5 kb žingsnio dydžiu) per mažai rūgščių (LAP) ir Chandler (CHP) pummelo genomus ir tarp šios tėvų ir vaikų poros (LAP) neskaidytų haplotipų / CHP). Smailė, esanti he 6 heterozigotinėse vietose / kb, atliekant visus tris palyginimus poromis, rodo būdingą C. maxima rūšies nukleotidų įvairovę; smailė, esanti šalia ∼ 1 heterozigotinės vietos / kb, atspindi protėvių C. maxima populiacijos silpną vietą, nukrypus nuo C. reticulata (10 papildoma pastaba). ( b ) Nukleotidų heterozigotiškumas tradiciniam gluosnių mandarinui (WLM), pavaizduotam išilgai 6 chromosomos, apskaičiuotiems sutampančiuose 200 kb languose (su 100 kb žingsnio dydžiu). Ši chromosoma rodo aiškaus vieno nukleotido varianto heterozigotiškumo netolygumą tarp ∼ 5 / kb M / M segmente (oranžinė juosta) ir ∼ 17 / kb M / P segmente (mėlyna juosta). c ) Nukleotidų heterozigotiškumo pasiskirstymas, apskaičiuotas persidengiančiuose 500 kb languose (su 5 kb žingsnio dydžiu) Ponkan (PKM, vientisa linija) ir Willowleaf (WLM, punktyrinė linija) mandarinuose. Genominiai segmentai žymimi M / M, P / P arba P / P remiantis 1 537 264 SNP rinkiniais, kurie skiria C. reticulata (M) nuo C. maxima (P). Abiejuose mandarinuose yra sumaišytų segmentų iš C. maxima intrigos (M / P), taip pat M / M segmentų, ir šie segmentai nubraižomi ir normalizuojami atskirai, kad būtų galima lengvai palyginti. d ) Nukleotidų heterozigotiškumo pasiskirstymas, apskaičiuotas persidengiančiuose 500 kb (5 kb poslinkių) languose, siekiant saldžiųjų apelsinų (SWO) ir rūgščiųjų apelsinų (SSO). Trys skirtingi saldžiai oranžinio geno tipai (M / M, P / P ir M / P) ir rūgščiai oranžiniai genotipai M / P normalizuojami ir pažymimi atskirai.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „Excel“ šaltinio duomenis
Image

Kiekvienos iš trijų sekvenuotų citrusų grupių nukleotidų įvairovės pokyčiai (vidutiniškai apskaičiuoti per 500 kb langų, kurių žingsnio dydis yra 250 kb) per genomą parodyti vienai reprezentatyviajai veislei aukščiau genotipo žemėlapių (horizontalių juostų). Žalia, C. maxima / C. maxima ; mėlyna, C. maxima / C. tinklelis ; oranžinė, C. reticulata / C. tinklelis ; pilka, nežinoma. Devynios chromosomos yra sunumeruotos viršuje. a ) Saldžiųjų apelsinų (SWO) nukleotidų įvairovė su saldžiųjų ir rūgščiųjų apelsinų (SSO) genotipų žemėlapiais, nurodant C. maxima / C. maksimalus genotipas (žali segmentai, esantys 2 ir 8 chromosomose), saldžiai oranžinės spalvos. b ) Gluosnių mandarinų (WLM) nukleotidų įvairovė ir trijų tradicinių mandarinų (Ponkan mandarinas (PKM), Willowleaf mandarinas (WLM) ir Huanglingmiao (HLM)) ir trijų naujausių mandarinų tipai (Clementine (CLM), W. Murcott mandarinas) genotipų žemėlapiai. (WMM) ir haploidinio klementino referencija (HCR)). Dėl haploidinės klementino etaloninės sekos oranžiniai ir žali segmentai nurodo atitinkamai C. reticulata ir C. maxima haplotypes. Visi penki mandarinų tipai rodo pummelo intrigos (mėlynos arba žalios spalvos segmentai). c ) dviejų pumpurų (mažai rūgščių pummelo ir Chandler pummelo (CHP)) nukleotidų įvairovės ir genotipų įvairovė.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „Excel“ šaltinio duomenis

Pummelos protėvis

Dviejuose diploidiniuose pumpuruose, kuriuos mes sekvenavome, yra trys skirtingi haplotipai, nes mažai rūgštus (Siamo saldus) pummelo yra žinomas Chandler pummelo 21 patelė, todėl abu pumpurėliai turi po vieną haplotipą kiekviename lokuse (9 papildomoji pastaba ir papildoma fig. 16). Dviejuose sekvenciniuose pummelos ir tarp jų nesusijusių alelių (gautų iš kito Chandler tėvo, ty Siamese Pink pummelo) stebėjome nedidelį heterozigotiškumo lygį, kurio viso genomo nukleotido heterozigotumas buvo 5, 7 heterozigotinių (het) vietų / kb (pav.). .2a). Antrojo mažo heterozigotiškumo smailės (∼ 1 het vieta / kb) pasiskirstymas gali būti paaiškinamas stipriu senoviniu C. maxima populiacijos kamščiu prieš 100 000–300 000 metų (10 papildoma pastaba). Mūsų atlikta trijų Kinijos pumpurų, iš kurių anksčiau buvo pranešta 17 (įskaitant „Wusuan pummelo“, kurį mes nustatome kaip kilusius iš tos pačios somatinės kilmės kaip „Siamese Sweet pummelo“, analizė rodo, kad tiek Tailando, tiek Kinijos pummelos yra kilusios iš tos pačios laukinės populiacijos (11 papildoma pastaba). Tik vienas trumpas 1, 5 Mb segmentas 2-ojoje „Chandler“ chromosomoje rodo neįprastai aukštą heterozigotiškumą, kuris galėtų atspindėti tarpdalykinę įbrėžimą (papildomas 17 pav.). Šie stebėjimai atitinka pummelo prijaukinimą atrenkant iš laukinės seksualinės C. maxima populiacijos.

Mandarinų protėviai

Keturiuose mandarinų genomuose, kuriuos mes sekvenavome, buvo daugybė mandarinų rūšių: du tradiciniai mandarinai be išankstinio įtarimo, kad jie yra maišyti (Ponkanas - sena ir plačiai užauginta Azijos veislė, kuri, kaip manoma, buvo būdinga C. reticulata , ir Willowleaf, dažna Viduržemio jūros regiono veislė). taip pat du mandarinai, kurie, kaip manoma, yra tradicinių mandarinų su kitais citrusų hibridais (Clementine, haploidinio referencinio prisijungimo diploidinis tėvas, ir W. Murcott, manoma, kad yra veislės, dar vadinamos Nadorcott ir Afourer, sinonimu ir plačiai auginami Kalifornijoje. ir Viduržemio jūra (1 papildoma pastaba)). Priešingai nei pummelos, mandarinų priedai, kuriuos mes sekvenavome, paprastai apima didelio nukleotidų heterozigotiškumo segmentus (∼ 17 het vietų / kb, nuosekliai atsižvelgiant į tarpląstelinį kitimą), apimančius dešimtis centimorganų arba megabazių porų (2b pav. Ir papildomas 18 pav.) ). Šie labai heterozigotiniai blokai susikerta su ilgais, žymiai žemesnio lygio heterozigotiškumo segmentais (∼ 5 het vietų / kb), kurie atitinka intraspecifinį kitimą ir aiškiai skiriasi nuo aukštesniojo heterozigotiškumo blokų (2c pav.). Apatiniuose heterozigotiškumo segmentuose abu aleliai dažnai skiriasi nuo tų, kurie stebimi pummelos, ir, ko gero, kilę iš C. reticulata , kuri plačiai minima kaip tikroji rūšis, iš kurios kilo kultivuojami mandarinai 7 . Priešingai, mes nustatėme, kad aukštesnio heterozigotiškumo blokai paprastai turi vieną alelį, kuris atitinka pummelos, ir vieną nepummelo alelį, taip pat spėjama, kad C. reticulata . Spėjami C. reticulata aleliai paprastai būdingi daugybiniam mandarinų prisijungimui, taigi dar labiau patvirtina jų identifikavimą.

Mūsų nuostabi išvada yra tokia, kad tradiciniai mandarinų tipai, tokie kaip Ponkanas ir gluosnis, iš tikrųjų yra specifiniai C. maxima (pummelo) intrigos į C. reticulata (laukinis mandarinas). Be to, nors anksčiau buvo manoma, kad šie tradiciniai mandarinai yra nesusiję, aptikome platų haplotipų pasidalijimą tarp jų (10 papildoma pastaba ir papildoma 19 ir 20 pav.). Kadangi mikrosatellite pagrįstos įvairių citrusinių genotipų populiacijos struktūros analizės rodo mandarinus kaip apibrėžtą genotipų grupę 22, toks mišinys tikriausiai yra plačiai paplitęs tarp mandarinų rūšių. Neseniai surikiuoto kinų mandarino 17 reanalizė, atsižvelgiant į tai, kad atradome skirtingų rūšių mandarinų tarpsisteminį įsiskverbimą, rodo, kad tradicinis kiniškas Huanglingmiao mandarinas (anksčiau neteisingai traktuotas 16 kaip grynas C. reticulata ) taip pat turi netikėtą maišymąsi tarp C. reticulata ir C. maxima (11 papildomosios pastabos 3 pav. ir papildomos 21 pav.).

Nors nė vienas iš mūsų auginamų mandarinų genotipų neatspindi grynos C. reticulata , mes vis dėlto galime išgauti laukinių mandarinų alelių iš savo duomenų, palyginę (įmaišytus) auginamus mandarinus tarpusavyje ir su dviem grynais pumpurėliais. Atlikdami tokius viso genomo palyginimus, mes nustatėme 1 537 264 tariamus fiksuotų vieno nukleotido skirtumus tarp C. reticulata ir C. maxima (papildomas 22 pav., 1 papildomas duomenų rinkinys ir 7 papildoma pastaba). Šie diagnostiniai variantai savo ruožtu gali būti naudojami mandarinų, pummelo ir oranžinių genomų padalijimui į segmentus pagal jų rūšies protėvius (3 pav. Ir papildomas 23 pav.). C. reticulata genomo segmentų iš šiuolaikinių mandarinų apibūdinimas yra analogiškas Afrikos haplotipų ištraukimui iš Meksikos amerikiečių 23 ir Indijos vietinių haplotipų iš egzistuojančių etninių žmonių populiacijų, kurie yra sumaišyti su Amerikos, Afrikos ir Europos šaknimis 24 .

Mes galime įvertinti paprasto populiacijos genetinio modelio parametrus, skirtus C. reticulata ir C. maxima išsiskyrimui iš protėvių Pietų Azijos citrusinių augalų įkūrėjų populiacijos, naudodamiesi koalescencine schema ir mūsų fiksuotų tarpžvaigždžių skirtumų ir skirtingų rūšių skirtumų kolekcija (9 papildoma pastaba). ir papildomi 24–26 pav.). Ši analizė atitinka veiksmingą kelių šimtų tūkstančių C. maxima medžių populiaciją ir šiek tiek mažesnę C. reticulata medžių populiaciją, didesnį efektyvų populiaciją pummelos populiacijai, atsižvelgiant į didesnį jų heterozigotiškumą. Tikėtinas apomiksės pasireiškimas laukinių mandarinų populiacijose - bruožo, kurio, atrodo, nėra C. maxima , gali padėti sumažinti veiksmingą C. reticulata populiacijos dydį, palyginti su surašymo dydžiu. Jei darome prielaidą, kad mutacijos dažnis vietoje (μ) yra ∼ 1–2 × 10 –9 per metus (palyginamas su tuo, kuris stebimas tuopų medžiuose 25 ), galime įvertinti, kad C. reticulata ir C. maxima skyrėsi ∼ 1, 6–. 3.2 prieš mėnesį; tai atitinka citrusinių vaisių ir susijusios Poncirus genties skirtumus, kurie, kaip manoma, buvo prieš 4–9, 6 m. (nuoroda 26). Kaip pažymėta, mažo heterozigotiškumo segmentų perteklius pummelo atitinka didelę gyventojų susiaurėjimo problemą prieš kelis šimtus tūkstančių metų ir prieš Tailando ir Kinijos pummelo linijų atskyrimą (9 ir 11 papildomosios pastabos ir papildomos 27 pav.).

Kai kurie specifiniai citrusinių vaisių genotipai paprastai pripažįstami hibridinėmis veislėmis. Pavyzdžiui, manoma, kad Clementine mandarinas (dar žinomas kaip Alžyro mandarinas) yra atsitiktinis daigai iš Viduržemio jūros mandarino (pvz., Gluosnio), pasirinkto šiek tiek prieš šimtmetį Alžyre 27 . Nors buvo pasiūlyta įvairių vyrų tėvų, serologiniai ir molekuliniai tyrimai parodė, kad klemeninas greičiausiai buvo mandarinų ir saldžiųjų apelsinų hibridas 6, 18, 28 . Mes patvirtiname šią hipotezę sekos lygmeniu, galutinai identifikuodami gluosnio ir saldžiai oranžinį alelį kiekviename Clementine lokuse; nubrėždami rekombinacijos lūžio taškus mejozėje, kuri sukūrė haploidinę Clementine seką; ir nustatant gluosnių ir saldžiai oranžinių haplotipus, kurie prisidėjo prie diploidinio klementino atsiradimo (10 papildomoji pastaba ir papildomi 1 ir 28–31 pav.). Panašiai manoma, kad W. Murcott mandarinas yra tikri zigotiniai Murcott tangor daigai - pats spėjamas saldžiųjų apelsinų ir nežinomo mandarino F1 hibridas. Mūsų sekos analizė atitinka įtariamus senelių ir vaikaičių santykius tarp saldaus apelsino ir W. Murcott (10 papildoma pastaba). Nors kitas W. Murcott tėvas ir senelis nėra žinomi, ieškoti šių protėvių leis kiti stebimi aleliai.

Apelsinų protėviai

Saldusis apelsinas ( Citrus × sinensis L. Osbeck) yra citrusų rūšis, plačiausiai auginama vaisiams ir sultims auginti, ir manoma, kad tai tarprūšinis hibridas, tačiau jos kilmė nežinoma 4, 6 . Įvairios saldžiai oranžinės veislės turi tą pačią genominę struktūrą, nedaug keičiant seką, atsirandančios mutavus pirminį saldžiai oranžinį namiškį (kaip aprašyta, pavyzdžiui, nuorodoje 29). Naudodamiesi mūsų genomo fiksuotų C. reticulata ir C. maxima alelių katalogu, galime pavaizduoti saldžiai oranžinį genomą kaip šių dviejų tėvų rūšių segmentus arba hibridinius jų segmentus (10 papildomoji pastaba ir 2d pav.) Su aiškiomis ribomis tarp skirtingi segmentų tipai (3a pav.). Neseniai pasiūlyta (P × M) × M atvirkštinė schema, skirta saldžiam apelsinui gauti iš mandarinų ir pummelo 17, tačiau lengvai atmesta dėl aiškių P / P (ty, C. maxima / C. maxima ) segmentų. saldžiai oranžinės spalvos, kuri pareikalautų, kad abu tėvai turėtų šiek tiek pommelo protėvių. (P / P segmentas 2-ojoje chromosomoje buvo patvirtintas tiksliniu trijų genų sekos nustatymu šiame regione 30. )

Netikėtai, atlikdami analizę, mes nustatėme, kad saldieji apelsinai dalijasi aleliais su Ponkan mandarinu beveik trijuose ketvirčiuose genomo, be to, daugelis tų pačių segmentų taip pat dalijasi su Willowleaf ir Huanglingmiao (10 papildomoji pastaba ir 32 papildoma nuotrauka). Tai lemia stebėtiną išvadą, kad šie trys tradiciniai mandarinai, anksčiau laikomi nepriklausomais selekcijomis, iš tikrųjų turi didelę giminystę vieni su kitais ir su saldžiųjų apelsinų protėviu, taigi galima daryti išvadą, kad tradicinių mandarinų genetinė įvairovė yra žymiai ribota, nei buvo anksčiau. pripažinta (10 papildoma pastaba). Kito saldaus apelsino tėvo prigimtis yra sunkiau nustatoma, tačiau heterozigotinių segmentų pasiskirstymas saldiose apelsinose (papildomas 33 pav.) Ir jo pummelo tipo chloroplastų genomas būtų lengviau atskaitytas, jei moteris pati būtų su dideliu laukinio mandarino įsiskverbimu (9 papildomoji pastaba).

Galiausiai, Sevilija arba rūgštus apelsinas (dar žinomas kaip Citrus × aurantium ), kuris istoriškai buvo svarbus citrusinių vaisių poskiepis ir, plačiau žinomas, naudojamas marmelade ir kituose produktuose, yra dar viena tradicinė kultivavimo rūšis, plačiai laikoma pummelo- mandarinų hibridas. Mūsų genominė analizė rodo, kad rūgštusis apelsinas iš tiesų yra tiesioginio paprasto tarprūšinio F1 kryžminimo tarp pumpurinės ( C. maxima ) sėklos ir laukinių mandarinų ( C. reticulata ) žiedadulkių pirminis rezultatas (10 papildoma pastaba ir 34 papildomas paveikslas). . Keista, atsižvelgiant į tai, kad atradome paplitusius pumpurų mišinius tarp tradicinių mandarinų, rūgštaus apelsino motininėje motinoje C. reticulata tokio mišinio nerasta, tačiau konkretūs tėvų genotipai liko nežinomi. Rūgštus apelsinas galėjo atsirasti kaip natūralus dviejų laukinių citrusinių rūšių hibridas ir išlikti dėl jo dauginimosi apomiksės būdu ir vėliau apgalvoto žmonių auginimo ir platinimo. Pastaruoju metu neradome aptinkamo saldaus ir rūgštaus apelsino ryšio.

Kinijos mangshanas yra atskira rūšis, C. mangshanensis

Tarp veislių, kurios tradiciškai klasifikuojamos kaip mandarinai, mes atradome dar vieną staigmeną. Manoma, kad laukinio mandarino iš Mangshan, China 17 (CMS), genomo analizė rodo (i) chloroplastų genomą, kuris skiriasi nuo C. reticulata ir C. maxima (4a pav.); (ii) ribotas heterozigotumas (4b pav.), vėl tolygiai paskirstytas visame genome, be pummelo ar mandarinų protėvių segmentų, taigi, nėra jokio priemaišos; ir (iii) ∼ 2% homozigotinių skirtumų tarp C. reticulata ir C. maxima tolygiai genomui, palyginti su skirtumu tarp C. maxima ir C. reticulata (4b pav.). Nukleotidų įvairovės lygyje CMS nuo C. maxima ir C. reticulata skiriasi taip, kaip C. maxima ir C. reticulata yra vienas nuo kito (4b pav.), Ir jis yra aiškiai atskirtas nuo pummelos, apelsinų ir mandarinų. koordinačių analizė (4c pav. ir 11 papildoma pastaba). Taikydami visas šias priemones, manome, kad mangsano mandarinas nesusijęs su kitais aukščiau aptartais auginamais mandarinais (įskaitant Huanglingmiao mandariną). Todėl siūlome, kad, nepaisant morfologijos, Mangshan mandarinas yra atskira rūšis nuo C. reticulata , palaikanti C. mangshanensis nomenklatūrą 31 .

Image

a ) Citrinų chloroplastų genomų filogenetinis medis, įsišaknijęs prie kaimyno, jungiantis vidurį. b ) Porų sekų skirtumų (per 100 kb langų) dažnio pasiskirstymas tarp Mangshan mandarino (CMS) ir C. maxima (žalia), CMS ir C. reticulata (oranžinė), C. reticulata ir C. maxima (šviesiai mėlyna). ), taip pat aiškiai mažesnė CMS vidinė nukleotidų įvairovė (brūkšneliu mėlyna). Ret , C. reticulata ; max , C. maxima ; het, heterozigotinis. c ) pirmos dvi citrusinių branduolių genomų pagrindinių koordinačių analizės koordinatės, pagrįstos porų atstumais ir metrine daugialype dimensija. C. maxima - C. reticulata ašis (pagrindinė koordinatė 1, 47, 5% dispersija) skiria medetkas (žalias) nuo mandarinų (oranžines), o apelsinai (mėlyni) yra tarp jų; pagrindinė koordinatė 2 (19, 6% dispersijos) atskiria CMS (purpurinę) nuo kitų.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „Excel“ šaltinio duomenis

Diskusija

Mūsų genominė analizė paaiškina tam tikrą ankstyvą niūrias citrusinių vaisių prijaukinimo istorijas. Auginamų pumpurėlių branduoliniai ir chloroplastiniai genomai atitinka pummelos kaip vienos citrusinių rūšių, C. maxima, identifikavimą. Nepaisant mandarinų chloroplastų sekų panašumo, visuose sekvenuotų mandarinų tipo kultūrų branduoliuose yra didelis C. maxima mišinys. Taigi mūsų rezultatai rodo, kad įvairios įprastos citrusinių taksonomijos, kurios mandarinų citrusus susieja su protėvių citrusinėmis citrinos rūšimis C. reticulata, yra pernelyg supaprastintos. Ypač stebina, kad net ir tradiciniai mandarinų tipai, neturintys išankstinio įtarimo dėl panašumo ar priemaišų, tokie kaip Ponkan, Willowleaf ir Huanglingmiao mandarinai, dalijasi haplotipais ir į juos įtraukiami įbrėžti pummelo segmentai. Tariamas laukinis mandarinas iš Mangshano, Kinija, pasirodo, kad jis apibūdina atskirą taksoną, tik tolimai susijusį su C. reticulata , remiantis jo branduolinių ir chloroplastinių genomų analize. (Ankstesnėje saldžiųjų apelsinų protėvių analizėje 17 C. Manichan mandarinas Clementine ir Huanglingmiao buvo naudojami siekiant reprezentuoti C. reticulata. Mūsų atradimas, kad Clementine ir Huanglingmiao yra didelis pumpurų mišinys, ir tai, kad Mangshan mandarinas skiriasi nuo C. reticulata, dar labiau paneigia išvados, nurodytos 17 punkte)

Pažymėtina, kad net ir neturint gryno tipo C. reticulata pavyzdžio , mes galime apibūdinti šios laukinės mandarinų palikuonių rūšies genomą iš palyginto genomo palyginimo, kuriame buvo sumaišytos palikuonys 23 . Mūsų kolekcija, kurioje yra 1 537 264 SNP (1 papildomas duomenų rinkinys), išskirianti C. reticulata iš C. maxima, gali būti naudojama ieškant grynųjų C. reticulata mandarinų tipų (arba norint atpažinti kitas kriptų rūšis) iš šimtų žinomų veislių ir kitų. gemalų prisijungimas. Tikėtinomis kandidatėmis gali būti laikomi mažo vaisiaus mandarinai, kurie yra mažiau pageidautini vartoti šviežią atsižvelgiant į išvaizdą, skonį, tekstūrą ir aromatą. Sužinojus, kad C. mangshanensis yra atskira grupė, reikia apsvarstyti ir papildomų, dar neaprašytų laukinių citrusinių rūšių galimybę.

Tarp skirtingų rūšių mišinių vyraujantys auginami citrusai rodo, kad ankstyvame prijaukinimo laikotarpyje arba natūralioje hibridinėje zonoje prieš prijaukinant vaisius, C. reticulata ir C. maxima sukryžmėjo. Atsižvelgiant į tipišką hibridinių blokų dydį, prieš pasirenkant patrauklias veisles, kurios po to aseksualiai buvo dauginamos apomiktinėmis arba vegetatyvinėmis priemonėmis, galbūt pietų Kinijoje 32, pasireiškė tik kelios kartos. Mūsų atlikta saldžiųjų ir rūgščiųjų apelsinų analizė rodo, kad šie senovės ir plačiai auginami genotipai yra pummelo-mandarinų priedai, nesusiję vienas su kitu, nepaisant tam tikro fenotipinio panašumo 33 . Atradimas, kad rūgštus apelsinas yra paprastas C. maxima ir C. reticulata F1 hibridas, reiškia, kad gryni C. reticulata individai buvo veislinio daigumo dalis, kilę iš rūgštaus apelsino. Stebėtina, kad mes pastebėjome, kad išlikę Ponkan, Willowleaf ir Huanglingmiao mandarinai yra susiję vienas su kitu ir su vyru, saldžių apelsinų tėvu. Nors moteriška saldaus apelsino motina nėra žinoma, ji negalėjo būti gryna pummelo (nors ji turėjo pummelo citoplazmą, remiantis cpDNR ir mitochondrijų DNR 20 ). Jos tapatumą riboja didelis hibridinių P / M segmentų, esančių saldžiame apelsine, santykis, kurį natūraliai galima paaiškinti tuo atveju, jei moteriškoji saldaus apelsino motina būtų (P × M) × P.

Kaip ir daugelis kitų žemės ūkio įmonių, pasaulinė citrusinių vaisių pramonė didžiąja dalimi remiasi didelio masto monokultūra, todėl ypač sudėtinga patenkinti vartotojų poreikį dėl didesnės produktų įvairovės, bandant įtraukti toleranciją ir (arba) atsparumą biotiniams ir potencialiai katastrofiškiems abiotiniams stresams 34 . Pažanga citrusinių vaisių genomikos srityje 35, 36 turėtų netrukus leisti nustatyti somatines mutacijas, kurios, atsižvelgiant į jų senovės genetinius pagrindus, yra citrusinių vaisių spalvos, skonio ir aromato įvairovė šiuolaikinėse kultūrose. Mūsų analizuojami santykiai tarp auginamų citrusinių vaisių ir protėvių rūšių, iš kurių jie buvo gauti, pabrėžia ribotą protėvių daigų kiekį, kuris prisidėjo prie komerciškai svarbių veislių rūšių, tokių kaip saldusis apelsinas, ir pabrėžia naujų protėvių citrusų derinių kūrimo galimybes. types with new fruit quality traits or even the re-creation of sweet orange with improved disease resistance via sexual hybridization, beyond the current approaches based on somatic mutations and genetic engineering.

Metodai

Haploid C. × clementina 'Clemenules' sequencing and assembly.

A total of 4.6 million Sanger reads (including 469, 000 fosmid-end and 73, 000 BAC-end reads), were obtained from an induced haploid plant C. × clementina 'Clemenules', assembled with Arachne and integrated with a genetic map producing chromosome-scale pseudomolecules (nearly 97% of ESTs aligned to the genome) (Supplementary Note 2).

C. × sinensis genome sequencing and assembly.

A total of 16.5 Gb sequence (36 million 454 reads and 750, 000 Sanger PE reads) was generated from C. × sinensis 'Ridge Pineapple' and assembled with Newbler (Supplementary Note 3).

Annotation of repeats and genes in citrus genome assemblies.

Repeat analysis was performed separately in the Clementine and sweet-orange genomes. The method used RepeatModeler to find new repeats in the genome sequence, which were masked with RepeatMasker. Following this, PASA was used to align and assemble ESTs (1.6 million for Clementine; 6.5 million for sweet orange) and integrate Fgenesh+, exonerate and GenomeScan gene predictions to generate gene models (Supplementary Note 4).

Evolutionary comparisons with other plant genomes.

Evolutionary comparisons to plant genomes used ortholog assignment to generate chromosome-to-chromosome relationships within and between genomes and predict ancestral genome structures (Supplementary Note 5).

Analysis of resequencing data sets.

Illumina shotgun sequence reads from eight accessions (17 × −110 × depth; Table 1) were mapped to the haploid Clementine reference with bwa, and single-nucleotide variants were identified with SAMtools and in-house scripts (Supplementary Note 6). Heterozygosity in diploid accessions was estimated in windows of 100–500 kb by division of the number of confidently inferred heterozygous single nucleotide variant ('het') sites by the number of eligible sites in the window at which confident variant calls could be made, on the basis of depth and alignment quality (Supplementary Note 6).

Identification of two ancestral species ( C. maxima versus C. reticulata alleles) and admixture analysis.

Diagnostic alleles for the two ancestral Citrus species, C. maxima and C. reticulata, were derived from a comparative analysis of two pummelos and two traditional mandarin types and were used to study the admixture patterns in the sequenced cultivars (Supplementary Notes 7 and 8).

Population genetic analysis and simulations.

Population genetic analysis of the two citrus species and demographic inference were based on coalescent simulations conducted with MaCS (Supplementary Note 10).

Analysis of relatedness in citrus.

Parentage and relatedness analysis for Clementine and other citrus genomes made use of homozygous SNPs in each diploid genome relative to the haploid Clementine reference as well as to the inferred second haplotype of Clementine (Supplementary Notes 9 and 11). In the same way, the haploid sweet-orange assembly was used for identifying shared haplotypes with sweet orange (Supplementary Note 9). A modified identical-by-state (IBS) method was used for haplotype-sharing analysis among mandarins and other citrus pairs (Supplementary Note 9).

Prisijungimo kodai.

The reference haploid Clementine assembly and annotation has been deposited in the NCBI genome database under accession code AMZM00000000. Sanger whole-genome sequencing for Clementine has been deposited in the NCBI trace archive under SPECIES_CODE="CITRUS CLEMENTINA". This Whole-genome shotgun project has been deposited at DDBJ/EMBL/GenBank under accession code JJOQ00000000. Whole-genome sequencing data for sweet orange have been deposited in the NCBI Sequence Read Archive under BioProject PRJNA225968 (454-sequencing data) and in the NCBI trace archive under SPECIES_CODE="CITRUS SINENSIS" AND CENTER_NAME ='JGI'. Citrus resequencing data have been deposited in the NCBI Sequence Read Archive under the following accession codes: SRX372786 (sour orange), SRX372703 (sweet orange), SRX372702 (low-acid pummelo), SRX372688 (Chandler pummelo), SRX372685 (Willowleaf mandarin), SRX372687 (W. Murcott mandarin), SRX372665 (Ponkan mandarin) and SRX371962 (Clementine mandarin).

Prisijungimai

Pirminės prieigos

BioProject

  • PRJNA225968

NCBI atskaitos seka

  • JJOQ00000000

Eilių skaitymo archyvas

  • SRX371962
  • SRX372665
  • SRX372685
  • SRX372687
  • SRX372688
  • SRX372702
  • SRX372703
  • SRX372786

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas tekstas ir figūros

    Supplementary Figures 1–34, Supplementary Tables 1–19 and Supplementary Notes 1–11

Tekstiniai failai

  1. 1.

    Data Set

    Supplementary Data Set 1