Sunkus bendras imunodeficitas frizų vandens šunims, kurį sukelia rag1 mutacija | genai ir imunitetas

Sunkus bendras imunodeficitas frizų vandens šunims, kurį sukelia rag1 mutacija | genai ir imunitetas

Anonim

Dalykai

  • Mutacija
  • Sunkus kombinuotas imunodeficitas
  • VDJ rekombinacija

Anotacija

Frizų vandens šunys dažnai stebėdavo 8–12 savaičių amžiaus šuniukų mirtingumą. Buvo stebimi naujagimių kraujo rodikliai ir klinikiniai požymiai iš trijų patelių. Trims mažyliams iš dviejų vadų buvo labai sumažėjęs imunoglobulinų ir limfocitų kiekis. Šie šunys buvo išnaikinti pirmą kartą pasireiškus ligai. Kartu nustatyti klinikiniai ir patologiniai požymiai atitiko sunkaus kombinuoto imunodeficito (SCID) diagnozę. Neteisinga V (D) J rekombinacija yra viena iš SCID priežasčių žmonėms ir gyvūnams. Aštuoni genai, įtraukti į V (D) J rekombinaciją, buvo ištirti artimai esančių mikrosatellito žymenų segregacijos analize ir DNR sekos analize. Iš atvejų, kai DNR buvo identifikuota nesąmonė V (D) J rekombinacijos faktoriaus RAG1 koduojančio geno mutacija, toje pačioje vietoje kaip ir nesąmonių mutacijų, rastų žmogaus SCID, vietoje. Buvo padaryta išvada, kad SCID dėl RAG1 mutacijos lėmė didelį mirtingumą.

Įvadas

Per pastaruosius du dešimtmečius nepaaiškinamas šuniukų mirtingumas buvo stebimas maždaug 10% visų Fryzijos vandens šunų vadų (FWD, Fédération Cynologique International veislė Nr. 221, Wetterhoun olandų kalba). Pastebėti klinikiniai požymiai, tokie kaip viduriavimas, epilepsijos priepuolių ir vestibulinės ataksijos išsivystymas, taip pat tokie patologiniai požymiai, kaip multifokalinis lėtinis encefalitas, daugiažidininiai pyrogranulomatous pažeidimai skirtinguose organuose ir limfoidinių audinių išeikvojimas, kaip pagrindą mirties priežastį nurodė imunodeficitą. Pastebėta, kad žmogaus, arklio, pelės, katės ir šuns imunodeficitai yra neįmanomi, o įvairių genų defektai yra koreliuojami su specifiniais fenotipais ir klinikiniais simptomais, ligos sunkumu ar mirtingumu. Sunkus kombinuotas imunodeficitas (SCID) reiškia genetinių sutrikimų grupę, kuriai paprastai būdingi T ir B limfocitų disfunkcija, sukelianti nefunkcinę adaptuotą imuninę sistemą ir mirtį kūdikystėje. 1 Disfunkcija gali atsirasti dėl sugedusios V (D) J rekombinacijos mašinos, atsakingos už genų, koduojančių labai polimorfinius antigeno atpažinimo regionus T-ląstelių receptoriuose ir imunoglobulinuose, pertvarkymą. Buvo aprašytos PRKDC , RAG1 , RAG2 , DCLRE1C ir LIG4 mutacijos, sukeliančios tokį defektą. 2, 3, 4, 5 žinomos tik autosominės recesyvinės ir su X susijusios paveldimos ligos formos. Šunims iki šiol buvo pranešta apie PRKDC geno mutaciją, atsakingą už autosominę SCID formą Džeko Raselio terjeruose, ir IL2RG mutaciją, sukeliančią X-sujungtą SCID basetų skalikuose ir Cardigan Welsh Corgi. 6, 7, 8

Šioje ataskaitoje aprašomas paveiktų FWD jauniklių imunodeficito fenotipas ir molekulinė genetinė analizė, rodanti jo ryšį su specifine RAG1 geno mutacija.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Klinikiniai požymiai

Nepaaiškinamas 8–12 savaičių FWD šuniukų mirtingumas įvyko 24 iš 212 patelių, gimusių nuo 1991 iki 2008 m.. Paaugliai, sergantys 7–8 savaičių viduriavimu, nukentėjo nuo viduriavimo, kuris gerai reagavo į gydymą antibiotikais. Vėliau išsivystė neurologiniai požymiai, tokie kaip epileptiformos priepuoliai, aklumas ir vestibulinė ataksija, dėl kurių įvyko savaiminė mirtis ar eutanazija. Neseniai trys naujagimių vados buvo atidžiau stebimos. Būdami 6 savaičių, visi 18 šuniukų buvo sveiki. Tačiau diferencinis baltųjų kraujo kūnelių skaičius pagal kraujo tepinėlį ( n = 2) arba automatinis ląstelių skaičiavimas ( n = 1) parodė, kad sumažėjo limfocitų skaičius trijuose šuniukuose iš dviejų patelių. Kraujo tepinėlių procentinė dalis buvo <1%, o automatinio skaičiavimo - 8, 8%, tuo tarpu FWD jauniklių normalus diapazonas buvo 15, 9–50, 8% (1 paveikslas). Imunoelektroforezė serumu parodė, kad tie patys trys šuniukai, priešingai nei kiti šuniukai, neturėjo aptinkamo imunoglobulino M (IgM) lygio. Kadangi IgM nėra antikūnų, gautų iš motinos maždaug gimus, fonde, jo buvimas rodo sveikų naujagimių produkciją, o jo nebuvimas rodo įgimtą trūkumą. IgG1, IgG2 ir IgA lygis nebuvo aptinkamas arba buvo labai žemas visų šuniukų tarpe, tai tikriausiai buvo motinos imunoglobulinų liekanos. Trijų motinų IgG1, IgG2, IgA ir IgM lygis buvo normalus.

Image

Naujagimių Fryzijos vandens šunų hematologija. Nustatyta, kad sveiko šuniuko C ir a pakratų diferencinė leukocitų analizė nustatyta, kad juos paveikė sunkus kombinuotas imunodeficitas ( b ). Rodyklė nurodo limfocitų padėtį. Metodai: A pakratų šuniukų ir jų motinų kraujo ląstelių skaičiavimas atliktas mikroskopu tiriant EDTA kraujo mėginių tepinėlius. Kraujo ląstelėms suskaičiuoti, surinktų ląstelių tūriui įvertinti ir leukocitų kiekiui ADVIA 120 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, JAV) paimti buvo naudojami EDTA kraujo mėginiai iš B ir C vadinamų šuniukų ir jų motinų. A – C vadų jauniklių ir jų motinų kraujyje imunoglobulino A, imunoglobulino M, imunoglobulino G1 ir imunoglobulino G2 koncentracija buvo nustatyta imuninės elektroforezės būdu. Imuninė elektroforezė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau. 14 EDTA kraujo srautocitometrinės analizės mėginiai buvo praskiesti santykiu GIBCO RPMI-1640 (Life Technologies, Bleiswijk, Nyderlandai), turinčio heparino. Atskiesti periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės, turinčios limfocitus, buvo praskiedžiamos mėginių mėginiuose (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV). Gradientai buvo centrifuguoti 800 g greičiu 20 minučių 20 ° C temperatūroje. Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės buvo surinktos ir paženklintos CD21 ir CD8 specifiniais monokloniniais antikūnais, kurie abu buvo konjuguoti su fikoeritrinu, ir CD4 specifinis antikūnas, pažymėtas Alexa647 (AbD Serotec, Diuseldorfas, Vokietija) pagal įprastas procedūras. Pažymėtos ląstelių suspensijos buvo analizuojamos naudojant FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Breda, Nyderlandai).

Visas dydis

Baltųjų kraujo kūnelių flowcitometrinė analizė parodė, kad sveikų šuniukų pasklidimo / šoninio pasklidimo grafikuose galima nustatyti visų tipų ląsteles, įskaitant limfocitus, nors ir mažiau diskretiškai nei suaugusio šuns. Analizuojant paveikto FWD šuniuko limfocitų kraują, jie nebuvo aptinkami, pažymėtuose monokloniniuose antikūnuose prieš CD21, CD4 ir CD8 nebuvo rasta teigiamų ląstelių (duomenys nepateikti).

Pablogėjus klinikinei būklei ir klinikiniams požymiams, tokiems kaip epilepsijos priepuoliai ir vestibulinė ataksija, šuniukai buvo išnaikinti. Du šuniukai buvo ištirti po skerdimo. Limfmazgių žievė ir užkrūčio liauka buvo hipoplastinė, o Hasso kūnų nebuvo. Baltoje minkštimo blužnyje atsirado aplazija. Be to, abu šuniukai turėjo daugiažidinį poūmį į lėtinį histiocitinį miokarditą ir hepatitą.

Įvertinus imunologinius parametrus ir autopsijos išvadas, padaryta išvada, kad FDW šuniukai serga SCID.

Genetinė analizė

Paveldėjimo būdo klausimui spręsti buvo sujungtos dviejų patelių su paveiktais mažyliais kilmės duomenys su Olandijos Staby ir Wetterhounen asociacijos informacija apie įtariamus atvejus (2 pav.). Remiantis kilmės informacija buvo pasiūlyta, kad paveldėjimo būdas yra autosominis recesyvinis. Šią mintį sustiprino segregacijos analizė, kuri parodė, kad rizikuojamiems broliai ir seserys turi įtakos 0, 23 tikimybei. Grynaveislių šunų recesyvus paveldėjimas reiškia, kad pavienė DNR mutacija veislėje atsiskyrė ir visi atvejai bus homozigotiniai dėl vienos priežastinės mutacijos. 9

Image

Fryzijos vandens šunų šeimos, atskiriančios šuniukų mirtingumą, kilmė. Iš dalies užpildyti simboliai rodo šunis, kurie išaugino palikuonis su imunodeficito požymiais. Užpildyti simboliai rodo patvirtintus sunkaus kombinuoto imunodeficito atvejus. Metodai: kilmė buvo sudaryta remiantis Olandijos Stabio ir Wetterhouneno asociacijos pateikta informacija. Šiame tyrime dalyvavo naujagimiai A1 – A5 ir C1 – C6 šunys. Taip pat buvo prieinama motinų DNR. Šunys buvo privati ​​nuosavybė ir buvo įtraukti su jų savininkų informuotu sutikimu. Septyni B pakratų šunys nebuvo paveikti ir nėra pavaizduoti kilmės schemoje. Šunys A3, A4 ir C5 buvo eutanazuoti, o A3 ir A4 buvo tiriami po skerdimo. Kaip aprašyta, atlikta segregacijos analizė viengubo metodo pagalba. Ši analizė buvo pagrįsta 19 vadų su 38 įtariamais atvejais ir 89 sveikais šunimis sudėtimi. Buvo 11 vadų su vienu įtariamu atveju. DNR buvo išskirta iš EDTA kraujo mėginių, kaip aprašyta. 16

Visas dydis

Neseniai buvo nustatyta, kad SCID Džeko Raselio terjeruose sukelia nesąmonė PRKDC mutacija, koduojanti DNR aktyvuotos baltymo kinazės katalizinį subvienetą. 1 Neretai viena patogeniška DNR mutacija išplito skirtingose ​​veislėse. 10 Taigi buvo tiriama paveiktų FWD jauniklių DNR, siekiant nustatyti PRKDC mutaciją, tačiau paaiškėjo, kad jos nėra.

Vėliau buvo ištirtas galimas aštuonių genų, koduojančių faktorius, susijusius su V (D) J rekombinacija, dalyvavimas. Trims paveiktiems šunims, šešiems broliams ir seserims bei dviem motinoms buvo atliktas mikrosatellito žymeklių, esančių arti RAG1 ir RAG2 , PRKDC , DCLRE1C , LIG4 , XRCC4 , XRCC5 ir XRCC6, genotipas (1 papildoma lentelė). Vienam ar daugiau paveiktų šuniukų buvo heterozigotiniai žymenų, rodančių PRKDC , DCLRE1C , LIG4 , XRCC4 , XRCC5 ir XRCC6 , žymenys , todėl šie genai nebuvo įtraukti į tolesnius tyrimus. Buvo išbandyti aštuoni RAG1 - RAG2 genų porų žymekliai, tačiau nė vienas iš jų nebuvo informatyvus FWD vadose su SCID atvejais. Todėl nusprendėme išanalizuoti šių genų koduojančias DNR sekas. RAG1 buvo rasta taškinė mutacija c.2893G> T, pakeisdama GAG kodoną glutamatu į TAG sustabdymo kodoną (p.Glu965X, 3 pav.). Mes prognozuojame, kad mutacija lemia apipjaustytą baltymą, kuriam trūksta C-galo 79 aminorūgšties liekanų. Sustabdykite kodono mutacijas panašiose RAG1 aminorūgščių 938 ir 959 padėtyse žmonėms su SCID. 3, 11 Trys paveikti šunys mutacijai buvo homozigotiniai, dvi motinos buvo heterozigotinės, o broliai ir seserys buvo heterozigotiniai arba homozigotiškai aiškūs.

Image

RAG1 mutacija, susijusi su sunkiu kombinuotu imunodeficitu Fryzijos vandens šunims. Rodykle nurodyta G> T mutacija įveda stop kodoną ( * ) baltymo sekos 965 padėtyje. Trys paveikti šunys buvo homozigotiniai dėl mutacijos, visi turimi įrodyti ir įtariami nešiotojai buvo heterozigotiniai. Metodai: Oligonukleotidai PGR ir RAG1 bei RAG2 koduojančių regionų DNR sekos analizei buvo pasirinkti iš „Dogset“ (//www.vgl.ucdavis.edu/dogset/) ir išvardyti 2 papildomoje lentelėje. PGR reakcijos genomo DNR amplifikacijai buvo atlikti standartinėmis procedūromis. Reakcijos produktai buvo praskiedžiami 10 kartų ir 1 μl buvo inkubuotas su 3 pmol bet kurio PGR pradmens, 1 μl BigDye mišinio ir 1, 75 μl 5x sekvencinio buferio (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) 10 μl tūrio. 25 ciklai: 96 ° C 30 s, 50 ° C 15 s ir 60 ° C 2 min. Produktai buvo išgryninti centrifuguojant į sefadekso kolonėles, naudojant daugiaekranę 96 filtravimo plokštelę, ir analizuoti naudojant ABI Prism 3130xl genetinį analizatorių. DNR sekos buvo išanalizuotos ir palygintos naudojant „SeqmanII“ programinę įrangą (DNAstar, Madison, WI, JAV). Kaip aprašyta, buvo tiriamas galimas PRKDC geno mutacija, nustatyta Jacko Raselio terjeruose, turintiems imunodeficitą. 1 Pradmenys 5′-GGCAAAAAACCCTGTTAATAAAAAA-3 ′ ir 5′-ACCTGAATAAACCTCCTTCTG-3 ′ buvo naudojami atitinkamo PRKDC geno fragmento amplifikacijai iš paveiktų Fryzijos vandens šunų DNR, po to atlikta DNR sekos analizė, kaip aprašyta aukščiau.

Visas dydis

Be aukščiau aprašytų vadų su paveiktais šunimis, buvo patikrinta 138 Fryzijos vandens šunų mutacija, nustatyta 41 nešiotojų, nerasta jokių homozigotinių šunų. Nešėjų grupėje buvo visi penki galimi vienišų tėvų tėvai, kurių mirtingumas nepaaiškinamas.

RAG1 965 padėtyje esantis glutamatas atitinka daugelio kitų rūšių glutamatą 962 padėtyje. Likutis yra įterptas į domeną, kuriame yra pokyčių be pakitimų visuose stuburiniuose gyvūnuose, kuriame buvo analizuotas genas. Įrodyta, kad gliutamato liekana yra viena iš nedaugelio rūgščių liekanų, būtinų RAG1 kataliziniam aktyvumui, dalyvaujančiam V (D) J rekombinacijos procese. Taigi buvo padaryta išvada, kad nesąmonė mutacija sukelia SCID veisiant FWD veislę, atsakingą už šuniukų mirtingumą. Kadangi dabar naudojant paprastą PGR metodiką bus galima nustatyti nešiotojus, selektyviai veisiant veislę galima išlaisvinti iš trūkumo ir pagrindinio geno. Maždaug 50% T ir B ląstelių neigiamų SCID atvejų žmonėms yra daugiau kaip 30 skirtingų RAG1 mutacijų rezultatas. Žmonėms liga pasireiškia mažiausiai 1: 100 000 gimimų. Liga, pasireiškianti spontaniškai FWD veislei, suteikia natūralų stambiųjų gyvūnų modelį, skirtą SCID terapijai (genų), kurią sukelia RAG1 mutacijos, įvertinti.

Papildoma informacija

„Excel“ failai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    2 papildoma lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Genų ir imuniteto“ svetainėje (//www.nature.com/gene)