Pasirengimas sevofluranu apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo išemijos ir reperfuzijos sužalojimų, aktyvindamas kelią erk1 / 2 | acta pharmaologica sinica

Pasirengimas sevofluranu apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo išemijos ir reperfuzijos sužalojimų, aktyvindamas kelią erk1 / 2 | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti tarpląstelinių signalų reguliuojamų kinazių (ERK) vaidmenį sevoflurano sukeltoje kardioprotekcijoje in vitro .

Metodai:

Išskirtos žiurkių širdys buvo ištirtos 30 min., Po to pakartotinai buvo sufuzuota 120 min. (I / R). Po kondicionavimo sevofluranu buvo atliktas O2 praturtintų dujų mišinio su 3% sevofluranu (SEVO) vartojimas 15 min. Nuo reperfuzijos pradžios. Buvo išmatuotos širdies funkcijos, miokardo infarkto dydis, miokardo ATP ir NAD + kiekis, mitochondrijų ultrastruktūra bei antiapototinių ir antikozinių baltymų kiekis.

Rezultatai:

Po kondicionavimo sevofluranu reikšmingai pagerėjo širdies veikla, sumažėjo infarkto dydis ir mitochondrijų pažeidimai, padidėjo miokardo ATP ir NAD + kiekis I / R širdyse. Be to, sevofluranas po kondicionavimo žymiai padidino p-ERK ir p-p70S6K lygį, sumažino porimino, kaspazės-8, suskaidytos kaspazės-3 ir citozolinio citochromo c kiekį I / R širdyse. Kartu vartojant ERK1 / 2 inhibitorių PD98059 (20 μmol / L), buvo panaikintas sevoflurano sukeltas apsauginis poveikis nuo miokardo I / R.

Išvada:

Po kondicionavimo atliktas sevoflurano poveikis apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo miokardo I / R sužalojimo ir slopina ląstelių onkozę bei apoptozę aktyvuodamas ERK1 / 2 kelią.

Įvadas

Išeminių širdies ligų (IHD) paplitimas visame pasaulyje nuolat didėja 1, 2 . Pacientams, kenčiantiems nuo šių ligų, dažnai padidėja miokardo I / R sužalojimų rizika, o tai yra svarbi priežastis, dėl kurios padidėja perioperacinės komplikacijos ir mirštamumas 3 . Trumpi išemijos ir reperfuzijos epizodai sergant reperfuzija gali sumažinti miokardo infarkto dydį, žinomą kaip „išeminis post kondicionierius“ 4, 5 . Vis dėlto išeminį po kondicionavimo klinikinėje praktikoje sunku taikyti, nes gerai kontroliuojamų, trumpų miokardo išemijos epizodų atlikti beveik neįmanoma. Sevofluranas yra lakus anestetikas ir buvo plačiai naudojamas klinikinėje praktikoje. Pirmą kartą anestezinis kondicionavimas, siekiant apsaugoti miokardą nuo I / R traumų, pirmą kartą buvo paskelbtas 2006 m. 6 . Pastaraisiais metais daugelis tyrimų, įskaitant eksperimentinius tyrimus 7, 8 ir klinikinę praktiką 9, 10, 11, parodė, kad paruošimas sevofluranu apsaugo širdis nuo miokardo I / R traumų. Nors pastaraisiais metais daugelyje tyrimų buvo nagrinėjamas anestetikų kondicionavimas, pagrindiniai mechanizmai nebuvo iki galo išaiškinti.

Ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK), mitogenais aktyvuotų baltymų kinazių (MAPK) porūšių nariai, yra gerai žinomos, kad jos moduliuoja ląstelių transkripcinį aktyvumą, ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, išgyvenimą ir apoptozę 12 . Anksčiau ERK1 / 2 kelias buvo susijęs su išeminiu ir anesteziniu kondicionavimu 13, 14 ir vaidina svarbų vaidmenį miokardo apsaugoje nuo I / R traumų. ERK fosforilinimas aukštyn reguliuoja jo pasroviui p-p70S6K išraišką. Įrodyta, kad ERK1 / 2 kelias, suaktyvintas atlikus sevoflurano kondicionavimą, reguliuoja mitochondrijų pralaidumo perėjimą, slopindamas kaspazės aktyvaciją. Manoma, kad mitochondrijų pralaidumo pereinamosios poros (mPTP), kurios yra pagrindinis miokardo I / R sužalojimo galutinis efektorius, atsidaro per pirmąsias minutes po reperfuzijos. Padidėjęs mPTP atidarymas yra pagrindinė kardiomiocitų apoptozės ir onkozės priežastis po miokardo I / R sužalojimo 15, 16 .

Apoptozė yra užprogramuotas ląstelių mirties procesas, o onkozė yra svarbus neapoptozinis būdas. ATP lygiai lemia, koks kelias pasirenkamas, apoptozė, esant normaliam intracellular ATP lygiui ar onkozė, esant intracellular ATP trūkumui 17 . Kaspazė-8 vaidina svarbų vaidmenį kaspazės aktyvavimo kaskadose, suaktyvindamos pasroviuose esančias efektorines kaspazes, tokias kaip kaspazė-3, -6 ir -7, kurios sukelia apoptozę 18 . Kita vertus, onkotinių ląstelių žūtį gali lemti poriminas, labai glikozilintas baltymas ir ląstelės membranos susijusios mucinų šeimos narys, esantis ląstelės paviršiuje 19 . Pavyzdžiui, į onkozę panašių ląstelių mirtis gali būti vykdoma įvedant porimino cDNR į Jurkato ląsteles 20 .

Mechanizmai, kuriais grindžiamas kardioprotekcinis sevoflurano kondicionavimas, išlieka neaiškūs. Čia patikriname hipotezę, kad norint sušvelninti sevofluraną, būtina suaktyvinti ERK1 / 2 kelią ir sumažinti onkozės baltymo porimino ekspresiją bei slopinti mPTP atsiskyrimą izoliuotose perfuzuotose žiurkių širdyse, patiriamose globalios išemijos.

medžiagos ir metodai

Suaugę, sveiki patinai, Sprague-Dawley žiurkės, sveriantys 280–330 g ir sveikos klasės, buvo laikomi iš Soochow universiteto medicinos mokyklos eksperimentinių gyvūnų centro. Eksperimentus su gyvūnais patvirtino Soochow universiteto Medicinos koledžo komitetas (Sudžou, Kinija; licencijos numeris: 2002–0008, II laipsnis).

Eksperimentiniai protokolai

Šimtas dvidešimt šešios izoliuotos perfuzinės žiurkės širdys buvo atsitiktinai suskirstytos į 6 grupes: kontrolinė grupė (CON), išemijos / reperfuzijos grupė (I / R), sevoflurano postkondicionavimo grupė (SEVO), DMSO grupė (DMSO), PD98059 grupė (PD) ) ir PD98059 + SEVO grupė (PD + SEVO). Išskyrus CON grupę, kiekviena žiurkė buvo paveikta 30 minučių visuotinės išemijos, po kurios sekė 2 valandos reperfuzija. Prasidėjus reperfuzijai, SEVO grupė vartojo 2, 5% ( v / v ) sevoflurano 15 min., Tada širdis reperfuzuodavo 105 min. PD grupė 15 minučių gavo ERK1 / 2 specifinį inhibitorių PD98059 (20 μmol / L) (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) 15 minučių reperfuzijos pradžioje. Eksperimentinis projektas parodytas 1 paveiksle.

Image

Eksperimento protokolo schema ( n = 18 kiekvienoje grupėje). Išskyrus CON grupę, kiekviena žiurkės šiluma buvo paveikta 30 minučių visuotinės išemijos, po kurios sekė 2 valandos reperfuzija ir buvo priskirta I / R grupei. Prasidėjus reperfuzijai SEVO grupėje, sevofluranas (3, 0%) buvo skiriamas 15 min. Prasidėjus reperfuzijai DMSO grupėje, 15 minučių buvo skiriama PD98059 nešiklio DMSO (0, 2%). Prasidėjus reperfuzijai PD grupėje, 15 min. Buvo skiriamas selektyvusis ERK1 / 2 inhibitorius PD98059 (20 μmol / L). Tiek PDMS809, tiek DMSO, tiek 3% sevoflurano buvo skiriami 15 min., Pradedant reperfuziją PD + SEVO grupėje. Lygiagrečiame širdžių rinkinyje ( n = 6) eksperimentai buvo baigti po 15 minučių pakartotinės perfuzijos, kad būtų imami NAD + matavimų mėginiai. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059; ISC, išemija.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Langendorffo izoliuotas širdies perfuzijos modelis

Krebs-Henseleit (KH) tirpalo konfigūracija (mmol / L): NaCl 118, 0, KCl 4, 8, KH2 PSO 4 1, 2, NaHCO 3 25, 0, MgSO 4 1, 2, CaCl 2 2, 5, gliukozė 11, 0 ir pH 7, 35–7, 45. Po 30 minučių išankstinio patekimo 95% O2 –5% CO 2, KH tirpalas buvo palaikomas 37 ° C temperatūroje išorine cirkuliacija (Alcott Biotechnology Co, Ltd, Šanchajus, Kinija). Žiurkės buvo anestezuotos 50 mg / kg natrio pentobarbitaliu ir heparinizuotos injekcijomis į pilvaplėvės ertmę, tada širdys buvo greitai išpjaustytos ir per aortą pritvirtintos prie Langendorff aparato, kad būtų galima perfuzuoti KH tirpalu esant pastoviam slėgiui (10 kPa) 21 . Siurblys buvo sureguliuotas taip, kad išlaikytų vainikinių kraujagyslių transudesą iki 12 ml / min.

Širdies funkcijos

Skilvelių kameros slėgis buvo paimtas ir palaikytas rankogalių slėgio keitikliu (SIA Industrial & Trade, Pekinas, Kinija). Į kairiojo skilvelio per mitralinį vožtuvą buvo įdėtas fiziologiniu tirpalu užpildytas latekso balionas, kad būtų galima stebėti širdies funkciją 14 . Manžetės tūris buvo sureguliuotas taip, kad pradinio pusiausvyros metu stabilus kairiojo skilvelio galinis diastolinis slėgis (LVEDP) būtų 5–10 mmHg. Širdies funkcijos, įskaitant kairiojo skilvelio sistolinį slėgį (LVSP), kairiojo skilvelio galinį diastolinį slėgį (LVEDP), ± d p / d t max ir širdies ritmą (HR), buvo užfiksuotos 30 min. Pusiausvyros metu (T 0 ), 30 min. T 1 ), 60 min (T 2 ), 90 min (T 3 ) ir 120 min (T 4 ) po reperfuzijos naudojant „Med Lab 6.0“ programinę įrangą. Žiurkėms su refrakteriniu skilvelių virpėjimu, dažna aritmija, LVSP <75 mmHg ar HR <180 dūžių per minutę.

Infarkto dydžio nustatymas

Miokardo infarkto dydis buvo nustatytas kaip aprašyta anksčiau 22 . Trumpai tariant, pasibaigus reperfuzijai, žiurkių širdys buvo pašalintos ir supjaustytos į 6 gabalus skerspjūvio. Širdys buvo dažytos 1% 2, 3, 5-trifeniltetrazolio chlorido triazoliu (TTC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV) pH 7, 4 buferiniame tirpale, esant 37 ° C 20 minučių, ir per naktį fiksuotos 10% formalinu. Kadangi TTC dažo gyvybingą audinį ryškiai raudona spalva, buvo manoma, kad neišdžiūvęs audinys yra infarktas. Kiekvienai pjūviui buvo apskaičiuotas infarkto dydis ir jis buvo nurodytas kaip procentas infarkto ploto, padalytas iš bendro Alpha Ease FC vaizdavimo sistemos rizikingo ploto.

Perdavimo elektronų mikroskopija

Miokardo ultrastruktūriniai pakitimai buvo aptikti atliekant perdavimo elektronų mikroskopą (TEM) 23 . Pasibaigus reperfuzijai, žiurkių širdelės buvo greitai pašalintos, o nedidelis (1 mm 3 ) audinio gabalas buvo išpjaustytas iš kairiojo skilvelio ir 4 valandas fiksuotas 2, 5% gliutaraldehide 0, 1 mol / l natrio kakodilo buferyje (pH 7, 4). Audiniai buvo pakartotinai fiksuoti 1% osmio tetroksidu 1% K 4 Fe (CN) 6, dehidratuoti per nustatytą etanolio ir propileno oksido koncentraciją, įterpti į „Epon812“ ir paskui padalinti naudojant ultraramotomą. Išilginiai pjūviai buvo dedami ant varinių grotelių, kurios buvo nudažytos uranilacetatu ir švino nitratu, ir vizualizuotos H-600 elektroniniu mikroskopu (Hitachi Limited, Tokijas, Japonija). Buvo ištirti trys laukai kiekvienam mėginiui padidinant × 8000.

Miokardo ATP kiekio matavimas

Miokardo ATP koncentracija buvo nustatyta naudojant bioliuminescencijos metodą, kaip aprašyta 24, 25 . ATP kiekiui nustatyti miokarde buvo naudojamas luminometrinis metodas, pagrįstas luciferino-luciferazės reakcija, naudojant ATP tyrimo rinkinį (Beyotime Biotechnologijos institutas, Haimenas, Kinija). Fosfokreatino koncentracija miokarde buvo nustatyta naudojant atvirkštinės fazės efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodus, aprašytus 26 . Fostokreatino standartas buvo „Sigma-Aldrich“. Glikogeno koncentracija miokarde buvo nustatyta cheminės kolorimetrijos metodu, naudojant glikogeno aptikimo rinkinį (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kinija).

Miokardo NAD + kiekio matavimas

Kairiojo skilvelio audiniai buvo paimti po 15 minučių reperfuzijos, kad būtų galima išmatuoti nikotinamido adenino dinukleotido (NAD + ) kiekį. NAD + buvo išgautas iš kairiojo skilvelio audinių, kuriems kyla pavojus, naudojant perchloro rūgštį 27 . Užšaldytas audinys (30 mg) buvo sumaišytas su skiediniu ir visiškai sumaišytas su 150 ml 0, 6 mol / l perchloro rūgšties. Po to mišinys homogenizuotas, neutralizuotas 3 mol / l KOH ir centrifuguojamas 10 min. Centrifuguotos nuosėdos buvo ištirpintos 0, 1 mol / l NaOH tirpale. Supernatanto mėginių skiediniai buvo pašalinti ir NAD + koncentracijos buvo nustatytos fluorometriškai, naudojant alkoholio dehidrogenazę (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), esant 460 nm bangos ilgiui, daugiafrekvenčio fazės ISS K2 spektrofluorimere (ILC Technology Inc. Sunnyvale, CA, JAV).

Mitochondrijų ir citoplazmų paruošimas ir baltymų ekstrahavimas

Kairiojo skilvelio audinys paimtas reperfuzijos pabaigoje ir homogenizuotas lediniame sacharozės buferyje, kuriame buvo 300 mmol / L sacharozės, 5 mmol / L TES, 0, 2 mmol / l EGTA. Po to, kai homogenatas buvo centrifuguotas 800x g 10 min., Supernatantas buvo toliau centrifuguojamas 10 000 x g 15 min. Gautoje granulėje buvo mitochondrijų. Supernatantas po 10 000 x g centrifugavimo buvo centrifuguojamas 100 000 x g 60 minučių, ir šis supernatantas turėjo citoplazmos frakciją.

Suminis arba mitochondrijų baltymų ekstraktas buvo gautas homogenizavus širdies audinių arba mitochondrijų granules lizės buferyje [20 mmol / L Tris-HCl (pH 7, 4), 150 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, 1 mmol / L NaVO 3, 1 mmol / L NaF, 2, 5 mmol / L Na 4 P 2 O 7, 1% NP40, 0, 1% SDS, 1 mmol / L DTT, 1 mmol / L PMSF]. Granulės buvo išplautos ir pakartotinai suspenduotos lizės buferyje ir visame proteinazės inhibitoriaus kokteilyje („Sigma“, viena tabletė 10 ml). Homogenatai buvo maišomi ultragarsu ir po to centrifuguojami 14 000 x g 10 minučių 4 ° C temperatūroje. Baltymų koncentracijai kiekvienoje frakcijoje nustatyti buvo naudojamas BCA baltymų tyrimo rinkinys (Beyotime Biotechnologijos institutas, Haimenas, Kinija), o lizatas buvo perkeltas į tą pačią koncentraciją.

Baltymų Western blot analizė

Lygiaverčiai baltymų kiekiai (kiekviename po 30 μg) iš citozolio ir mitochondrijų buvo kruopščiai sumaišomi su 2 × laemmeli buferiu ir po to 5 minutes kaitinami 97, 0 ° C temperatūroje. Vėliau denatūruoti baltymų ekstraktai elektroforezuojami ant 10% arba 15% SDS-PAGE gelių ir po to perpilami į polivinilidino fluorido (PVDF) membraną. 2 valandas užblokavus 5% neriebaus pieno, PVDF membranos buvo inkubuojamos su šiais pirminiais antikūnais 4 ° C temperatūroje per naktį: anti-ERK1 / 2 (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija, Danvers, MA, JAV), anti- p-ERK1 / 2 (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija), anti-p70S6K (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija), anti-p-p70S6K (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija), anti-porimin (1: 1000)., Sigma-Aldrich), anticitochromo c (1: 1000, Santa Krusas, Dalasas, Teksasas, JAV), anti-kaspazės-8 (1: 1000, Santa Kruso) ir anti-suskaidytos kaspazės-3 (1: 1000, Santa Krusas). Pirminis antikūnų surišimas buvo aptiktas antriniu antivirusiniu pelių arba triušiu (1: 5000) ir vizualizuotas sustiprinta chemiliuminescencija. Kaip vidinė citoplazmos ir mitochondrijų kontrolė buvo naudojami anti-glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazė (GAPDH, 1: 2000, AG019, Beyotime Biotechnologijos institutas) ir anti-draudžianti (PHB) (1: 1000) (ląstelių signalizacijos technologija). . Baltymų juostų optinio tankio pusiau kokybinė analizė atlikta naudojant „Image J“ programinę įrangą. Juostų tankis, gautas iš p-ERK1 / 2 ir p-p70S6K, buvo normalizuotas atsižvelgiant į t-ERK1 / 2 ir t-p70S6K koncentracijas tuose pačiuose mėginiuose.

Statistinė analizė

Statistiniam apdorojimui buvo naudojama „Graphpad Prism 4.00“ programinė įranga. Matavimo duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD). Duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę, po kurios sekė Tukey kartotinis palyginimas po testo, P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Rezultatai

Širdies funkcijų rezultatai

Pradinė visų grupių hemodinamika buvo panaši ( P > 0, 05). Palyginus su pusiausvyros palaikymu, be CON grupės, LVSP ir HR, akivaizdžiai sumažėjo ± d p / d t max, LVEDP reikšmingai padidėjo reperfuzijos metu tarp eksperimentinių grupių ( P <0, 05). LVSP, HR ir ± d p / d t max reikšmingai sumažėjo, o kitose grupėse LVEDP reikšmingai padidėjo, palyginti su CON grupe 30, 60, 90 ir 120 minučių reperfuzijos metu ( P <0, 05). LVSP, HR ir ± d p / d t max padidėjo, LVEDP reikšmingai sumažėjo SEVO grupėje, palyginti su I / R grupe ( P <0, 05). DMSO, PD ir PD + SEVO grupės buvo panašios į I / R grupes ( P > 0, 05) (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Miokardo infarkto dydis

Miokardo infarkto dydis SEVO grupėje (23, 44% ± 1, 98%) sumažėjo, palyginti su I / R grupe (51, 97% ± 1, 63%) ( P <0, 05); tačiau tai buvo panaikinta naudojant PD98059 PD + SEVO grupėje (49, 32% ± 1, 82%). Infarkto dydis DMSO, PD ir SEVO + PD grupėse buvo atitinkamai 49, 60% ± 1, 40%, 49, 70% ± 1, 39% ir 49, 32% ± 1, 82%, be statistinių skirtumų, palyginti su I / R grupe ( P > 0, 05 ) (2 pav.).

Image

Visų grupių miokardo infarkto dydis, išreikštas procentine infarkto dydžio dalimi, normalizuota pagal izoliuotų žiurkių širdies sričių riziką po 2 valandų reperfuzijos. Infarkto dydis buvo nustatytas dažant 1% trifeniltetrazolio chlorido tirpalu. Infarkto miokardo dydis buvo apskaičiuotas kaip ploto santykis (blyškus plotas / bendras rizikuojamo miokardo plotas). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 6. b P <0, 05, palyginti su CON. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Mitochondriono morfologija atliekant perdavimo elektronų mikroskopijos analizę

Naudodami perdavimo elektronų mikroskopiją (TEM), mes nustatėme, kad mitochondrijų tūrio tankis kiekvienoje grupėje buvo panašus. Tačiau kairiojo skilvelio miocitai, palyginti su CON grupe, turi reikšmingų morfologinių defektų ir onkozės, įskaitant pakitusį kreidos tankį ir struktūrą kitose grupėse. Daugumoje mitochondrijų buvo būdinga morfologija CON grupėje. SEVO grupė turėjo mažiau mitochondrijų pažeidimų, matricos patinimą ir raukšlių vakuolizaciją. Didinimas buvo nustatytas × 8000 (3 paveikslas).

Image

Miokardo mitochondrijų ultrastruktūra. Miokardo perdavimo elektronų mikroskopija po reperfuzijos visose eksperimentinėse grupėse. Tai yra tipiški vaizdai, paimti įtaisytų dalių širdyje. Miokardo ląstelėse yra didelis mitochondrijų patinimas ir sutrinka raukšlės I / R, DMSO, PD, PD + DMSO grupėse. SEVO grupė turėjo mažiau mitochondrijų pažeidimų. Didinimas buvo nustatytas × 8000. n = 3. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Miokardo ATP turinys

ATP kiekis CON grupėje buvo žymiai didesnis nei kitose grupėse ( P <0, 05). ATP nuostoliai buvo sumažinti SEVO grupėje, palyginti su I / R grupe ( P <0, 05). Statistinių skirtumų tarp I / R, DMSO, PD ir PD + SEVO grupių nebuvo ( P > 0, 05) (4 paveikslas).

Image

Miokardo ATP kiekis po reperfuzijos. Palyginti su CON grupe, ATP kiekis kitose grupėse žymiai sumažėjo. Palyginti su I / R grupe, ATP kiekis SEVO grupėje žymiai padidėjo. Tarp kitų grupių nebuvo akivaizdžių skirtumų. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 6. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Miokardo NAD + turinys

Kitų grupių NAD + kiekis buvo daug mažesnis nei CON grupės ( P <0, 05). Tačiau SEAD grupėje NAD + nuostoliai buvo sumažinti. Tarp kitų grupių reikšmingų skirtumų nebuvo: I / R, DMSO, PD ir PD + SEVO ( P > 0, 05) (5 paveikslas).

Image

Miokardo NAD + kiekis po 15 minučių reperfuzijos. Palyginti su CON grupe, NAD + kiekis kitose grupėse sumažėjo. Palyginti su I / R grupe, NAD + kiekis SEVO grupėje žymiai padidėjo. Tarp kitų grupių nebuvo akivaizdžių skirtumų. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 6. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059; NAD, nikotinamido adenino dinukleotidas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Vakarų dėmė

Palyginti su CON grupe, p-ERK1 / 2 ir p-p70S6K lygis reperfuzijos pabaigoje I / R grupėje buvo padidintas ( P <0, 05). Palyginti su I / R grupe, p-ERK1 / 2 / viso ir p-p70S6K / bendro santykis SEVO grupėje buvo dar padidintas ( P <0, 05); tuo tarpu p-ERK1 / 2 / viso ir p-p70S6K / bendro santykiai I / R ir DMSO grupėse buvo panašūs ( P > 0, 05) (6 paveikslas).

Image

P-ERK, t-ERK, p-p70S6K ir t-p70S6K Western blot analizė iš kairiojo skilvelio mėginių, gautų pasibaigus reperfuzijai. p-ERK / t-ERK ir p-p70S6K / t-p70S6K santykiai reikšmingai padidėjo SEVO grupėje. Po pakartotinės perfuzijos suleidus PD98059, padidėjo sevoflurano sukeltas padidėjęs p-ERK1 / 2 ir p-p70S6K lygis. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 3. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Porimino, kaspazės-8 ir suskaidytos kaspazės-3 koncentracija kitose grupėse buvo žymiai didesnė nei CON grupėje ( P <0, 05). Porimino, kaspazės-8 ir suskaidytos kaspazės-3 ekspresija SEVO grupėje buvo sumažinta, palyginti su kitomis I / R grupėmis ( P <0, 05). Tarp kitų grupių reikšmingų skirtumų nebuvo: I / R, DMSO, PD ir PD + SEVO ( P > 0, 05) (7 ir 8 paveikslai).

Image

Pasibaigus reperfuzijai, gauti kairiojo skilvelio pavyzdžių porimino Western blot duomenys. Palyginti su CON grupe, porimino raiška kitose grupėse žymiai padidėjo. Palyginti su I / R grupėmis, porimino išraiška SEVO grupėje sumažėjo. Tarp I / R, DMSO, PD, PD + SEVO grupių lygių skirtumų nebuvo. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 3. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

Iš kairiojo skilvelio mėginių suskaidytos kaspazės-3 (A) ir kaspazės-8 (B) Western blot buvo gautos reperfuzijos pabaigoje. Palyginti su CON grupe, suskaidytos kaspazės-3 ir kaspazės-8 ekspresija kitose grupėse žymiai padidėjo. Lyginant su I / R grupėmis, suskaidytos kaspazės-3 ir kaspazės-8 ekspresija SEVO grupėje sumažėjo. Tarp I / R, DMSO, PD, PD + SEVO grupių lygių skirtumų nebuvo. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 3. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Lyginant su CON grupe, Cyt c lygis citozolyje žymiai padidėjo, palyginti su kitomis grupėmis ( P <0, 05), ir dramatiškai sumažėjo mitochondrijose ( P <0, 05). Cyt c išraiška SEVO grupėje aiškiai sumažėjo citozolyje ( P <0, 05) ir reikšmingai padidėjo mitochondrijose, palyginti su kitomis I / R grupėmis ( P <0, 05). Cyt c lygis citozolyje ir mitochondrijose kitose grupėse: I / R, DMSO, PD ir PD + SEVO grupėse buvo panašūs ( P > 0, 05) (9A ir 9B paveikslai).

Image

Iš kairiojo skilvelio mėginių gauti citoto c (C) ir mitochondrijų (B) Western blot duomenys buvo gauti reperfuzijos pabaigoje. Palyginti su CON grupe, Cyt c išraiška kitose grupėse žymiai padidėjo citozolyje ir akivaizdžiai sumažėjo mitochondrijose ( P <0, 05). Palyginti su I / R grupe, Cyt c ekspresija SEVO grupėje sumažėjo citozolyje ir reikšmingai padidėjo mitochondrijose ( P <0, 05). Tarp kitų grupių nebuvo statistinių skirtumų: I / R, DMSO, PD ir PD + SEVO grupių ( P > 0, 05). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. n = 3. b P <0, 05, palyginti su CON. e P <0, 05, palyginti su I / R grupe. CON, kontrolė; I / R, išemija / reperfuzija; SEVO, sevoflurano kondicionavimas; DMSO, dimetilsulfoksidas; PD, PD98059; Cyt c , Citochrom c .

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Neseniai daugelis kitų tyrinėtojų įrodė, kad anestezijos po kondicionavimo tarpininkaujama keliais signaliniais elementais, įskaitant mitochondrijų ATP jautrius kalio kanalus (mito-KATP), mitochondrijų pralaidumo pereinamąsias poras (mPTP), fosfatidilinozitol-3-kinazę (PI3K) -ERK1. / 2 signalo kelias 14 . Šiame tyrime mes pasirinkome 3% sevoflurano, kad atliktume izoliuotų žiurkių širdžių kondicionavimą Langendorff perfuzijos sistemoje 28 . Intraceliulinės mitogenų suaktyvintos baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos kaskados vaidina pagrindinį vaidmenį širdies ir kraujagyslių ligų patogenezėje. ERK1 / 2, MAPK narys, yra susijęs su ląstelių proliferacijos, diferenciacijos, išgyvenimo ir apoptozės reguliavimu. Nors dauguma tyrėjų teigė, kad ERK1 / 2 fosforilinimas vaidino svarbų vaidmenį saugantis nuo miokardo I / R traumų, kiti parodė, kad ERK1 / 2 fosforilinimas gali apsunkinti miokardo ląstelių sužalojimą 29 . ERK fosforilinimas ne tik aukščiau reguliuoja pasroviui taikomą p-p70S6K ir žemyn reguliuoja su onkoze ir apoptoze susijusią baltymo ekspresiją, bet ir sumažina Cyt c išsiskyrimą iš mitochondrijų į citozolį ir slopina mPTP atidarymą.

Kondicionavimas sevofluranu buvo panaikintas naudojant 20 μmol / l PD98059, specifinį ERK inhibitorių. Tai rodo, kad norint sušvelninti sevoflurano miokardo apsauginį poveikį, būtina suaktyvinti ERK1 / 2 kelią. Mes nustatėme sevoflurano padidėjusį p-ERK1 / 2 ir p-p70S6K; tuo tarpu PD98059 visiškai slopino ERK1 / 2 aktyvaciją ir iš dalies slopino p70S6K aktyvaciją. p-p70S6K vaidina vaidmenį mažinant ląstelių apoptozę ir reguliuojant proapoptotinio baltymo BAD aktyvumą, siekiant apsaugoti širdis 30 .

Be savo vaidmens ląstelių energijos apykaitoje, mitochondrijos dabar yra pripažįstamos kaip pagrindinės ląstelių mirties dalyvės. Naudodamiesi TEM, nustatėme miokardo mitochondrijų pažeidimus, tokius kaip raukšlių patinimas ir vakuolizavimas I / R grupėje, labiau nei SEVO grupėje, kuri parodė, kad sevoflurano kondicionavimas sumažino miokardo onkozę. Miokardo NAD + kiekis yra atvirkščiai proporcingas mPTP atidarymui 31. Mes nustatėme, kad sevofluranas po kondicionavimo sumažino NAD + išsiskyrimą. Tai parodė, kad sevoflurano kondicionavimas apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo I / R sužalojimo slopindamas mPTP atidarymą. ATP yra pagrindinis ląstelių energijos apykaitos šaltinis, o funkcinis atsistatymas po miokardo I / R kelia papildomus energijos tiekimo reikalavimus. Kaip ir tikėtasi, ATP kiekis SEVO grupėje buvo žymiai didesnis nei kitose žalos grupėse. Taigi galime daryti išvadą, kad sevoflurano kondicionavimas apsaugo kardiomiocitus, pagerindamas miokardo energijos apykaitą po išemijos ir reperfuzijos metu, taip slopindamas apoptozę. Be to, Cyt c išsiskyrimas iš mitochondrijų į citozolį gali suaktyvinti kaspazių aktyvumą, o tai yra pagrindinis 32 apoptozės žingsnis.

Atlikdami Western blot metodą, mes nustatėme, kad sevoflurano kondicionavimas sumažino citozolinį Cyt c , o tai patvirtino, kad sevoflurano kondicionavimas gali sumažinti kaspazės kaskados reakciją. Todėl yra didelė tikimybė, kad sevoflurano kondicionavimui reikalingas ERK1 / 2 kelias ne tik slopinant apoptozės kaskadą, bet ir sumažinant onkozės signalizaciją.

Poriminas yra labai glikozilintas baltymas, kuris gali būti klasifikuojamas kaip su ląstelių membranomis susijusios mucinų šeimos narys ir tarnauja kaip naujas ląstelių paviršiaus receptorius, tarpininkaujantis onkotinėms ląstelių žūtims 20 . Poriminą suaktyvina įvairūs stresoriai, tokie kaip hipoksija, metabolinių substratų trūkumas arba greitas ATP išeikvojimas 33, 34 . Suaktyvinęs jis greitai susijungia su savo ligandu anti-porimin mAb, dėl ko pažeidžiamos membranos struktūros, pagreitindamas onkozę 20 . Onkozė yra svarbi neapoptozinė ląstelių mirties rūšis. Ląstelių onkozė sukelia nekrozę kartu su kariolize, kuriai būdingas ląstelių patinimas, membranos pūtimas ir padidėjęs membranos pralaidumas, ir priešingai nei apoptozė, sukelianti nekrozę su karioreksija ir ląstelių susitraukimu 34 . Onkozė ir apoptozė yra du skirtingi ląstelių mirties keliai, tačiau juos gali sukelti tie patys dirgikliai. Įrodyta, kad onkozė daugiausia lemia išeminę kardiomiocitų mirtį 35, 36 . Onkozė taip pat įvyksta esant miokardo I / R sužalojimams, svarbų vaidmenį vaidina poriminas. Atlikdami „Western blot“, mes nustatėme, kad I / R žala padidino porimino kiekį, tuo tarpu sevofluranas sumažino šį padidėjimą, o šį sumažėjimą panaikino PD98059. Taigi sevoflurano post-kondicionierius, veikiantis per ERK1 / 2 kelią, slopina porimino ekspresiją ir taip sumažina ląstelių onkozę bei apoptozę.

Mūsų tyrime reikia paminėti keletą apribojimų. Mes ištyrėme tik vieną įkvėptą anestetiką sevofluraną. Turi būti toliau tiriama, ar kiti nepastovūs anestetikai apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo miokardo I / R sužalojimų tuo pačiu post-kondicionieriaus mechanizmu. Nors eksperimentas tvirtai palaiko mintį, kad ERK1 / 2 kelias yra būtinas atliekant sevoflurano kondicionavimą, reikia atlikti papildomus eksperimentus, siekiant apibrėžti specifinius mechanizmus, kuriais grindžiamas jo kardioprotekcinis poveikis. Nors pasirinkome santykinai mažą ERK1 / 2 inhibitoriaus koncentraciją, negalime panaikinti galimybės, kad galėjo būti paveiktas kitas baltymų kinazės aktyvumas.

Apibendrinant, mūsų išvados parodė, kad sevoflurano kondicionavimas apsaugo izoliuotas žiurkių širdis nuo miokardo I / R traumų. ERK1 / 2 / p70S6K kelias vaidina svarbų vaidmenį atliekant sevoflurano kondicionavimą prieš miokardo I / R sužalojimą izoliuotose žiurkių širdyse, nes slopina onkozės ir apoptozės baltymų aktyvaciją, sumažina Cyt c išsiskyrimą iš mitochondrijų į citozolį, slopina mPTP atidarymą. ir pagerinti miokardo energijos apykaitą. Atrodo, kad ERK1 / 2 kelias moduliuoja ne tik antiapoptozinius, bet ir antikozozinius kelius izoliuotoje žiurkės širdies I / R modelyje. Apibendrinant, mūsų dabartiniai atradimai suteikia mechanistinį įžvalgą apie kardioprofilinį sevoflurano apsaugą po kondicionavimo ir pabrėžia jo apsaugą onkozės ir apoptozės atvejais, kai tai galėtų būti terapinės strategijos, skirtos gydyti perioperacinius išeminius įvykius, dalis.

Autoriaus indėlis

Chen WANG sukūrė tyrimą ir suteikė finansinę paramą; Hong XIE surinko ir išanalizavo duomenis, aptiko baltymų ekspresiją; Li-xin LIU ir Mario REBECCHI padėjo suprojektuoti tyrimą ir sudaryti rankraštį; Jiang ZHU pakeitė darbą ir vadovavosi moksliniais tyrimais; Jing ZHANG atliko mitochondrijų morfologijos tyrimus ir išmatavo miokardo ATP ir miokardo NAD + kiekį; Su-mei HU dalyvavo kuriant izoliuotą žiurkių širdies modelį.