Sfrp5 identifikuoja visų miokardo struktūrų, išskyrus dešinįjį skilvelį, širdies pirmtakus gamtos komunikacijos

Sfrp5 identifikuoja visų miokardo struktūrų, išskyrus dešinįjį skilvelį, širdies pirmtakus gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Diferenciacija
  • Širdies vystymasis
  • Organogenezė

Anotacija

Įgijus plaučių kraujotaką, protėvių širdis galėjo būti pertvarkyta atsitiktinai, kartu su progenitorinių ląstelių gamyba ir pertvarkymu. Tačiau palikuonių populiacijos, dėl kurių atsiranda kairysis skilvelis (LV) ir sinusinis venosus (SV), vis dar yra nevienareikšmės. Čia parodoma, kad išskiriant su peleku susietą baltymą Sfrp5 pelėje , nustatomi bendri nutekėjimo trakto (OFT), LV, prieširdžio ir SV pirmtakai, bet ne dešinysis skilvelis (RV). Sfrp5 ekspresija prasideda šoniniuose širdies pusmėnulio šonuose, išskyrus ankstyvuosius diferenciacijos regionus, ir tęsiasi veniniame poliuje, dėl kurio atsiranda SV. Linijos atsekimo analizė atskleidė, kad Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių palikuonys E7.5 prisideda ne tik prie SV, bet ir prie LV, prieširdžių bei OFT, taip pat randami nugaros splanchniniame mezodermoje, lydint antrinio širdies lauko žymens išraišką., 1 sala . Šie duomenys suteikia informacijos apie širdies pirmtakų išdėstymą sisteminei kraujotakai.

Įvadas

Žinduolių širdies vystymasis prasideda nuo širdies pusmėnulio, kurį sudaro dvišalis kardiogeninis splanchninis mezodermas, ir laipsniškas pirmtakų diferenciacija į kardiomiocitus, kad susidarytų pirminis širdies vamzdelis. Iš eilės vykstant keturkampės širdies vystymuisi, nustatomos dvi nepriklausomos plaučių ir sisteminės kraujotakos sistemos. Šiame procese progenitorinių ląstelių gamyba ir pertvarkymas gali lemti protėvių širdies rekonstravimą į šias dvi atskiras sistemas. Naujausi atradimai, susiję su kita širdies linija, vadinama antriniu širdies lauku (SHF), pakoregavo klasikinį širdies vystymosi požiūrį, kad miokardas buvo gautas iš vieno šaltinio. SHF atsiranda splanchniniame mezodermoje, kad aprūpintų ląsteles tiek arteriniame, tiek veniniame širdies vamzdelio poliuose, įskaitant dešinįjį skilvelį (RV), didžiąją dalį prieširdžių ir nutekėjimo takų (OFT) 1, 2, 3 . Tačiau progenitorių populiacija, sudaranti pirmąjį širdies lauką (FHF), sukeliantį kairįjį skilvelį (LV) ir likusius prieširdžius, bei sinuso venosus (SV), vis dar nėra dviprasmiški.

Nustatyta, kad SHF progenitorinės ląstelės, kurios laikinai ekspresuoja Islet1 ( Isl1 ), išreiškia širdies žymenis, įskaitant Fibroblast augimo faktorių 10 ( Fgf10 ), miocitus stiprinantį faktorių 2c ( Mef2c ), T-box transkripcijos faktorių 1 ( Tbx-1 ), kaip taip pat kitus žymenis, ir prisideda prie RV, OFT ir daugumos prieširdžių 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 . FHF progenitorinės ląstelės dar neturi būti apibrėžtos, nes FHF linija, kuri vėliau sukelia LV ir prieširdžių pogrupį, atpažįstama tik po diferenciacijos žymenų, tokių kaip miozino lengvoji grandinė 2a ( Mlc2a ) ir NK-2 transkripcijos, išraiškos. Su faktoriu susijęs 5 lokusas (Nkx2-5) širdies pusmėnulyje 3, 10, 11 .

SV - tai plona širdies raumens siena suformuota ertmė, išleidžianti kraują iš sisteminių venų ir koronarinio sinuso į dešinįjį prieširdį, o embriogenezės metu jungtyje esančiame sinoatrialiniame mazge atsiranda aukštesnioji kardinalinė venos. Atliekant dažymo įpurškimo eksperimentus, SV kilmė anksčiau buvo įvertinta ir pavaizduota šoniniuose viščiukų širdies laukų šonuose 12 . Neseniai nustatyta, kad ląstelių populiacija šoniniame širdies lauko krašte, kurią apibūdina mutG5 / hsp68 / LacZ raiška pelėse, prisideda prie SV 13 . Buvo pranešta, kad veninis polius yra SV pirmtakas, kurį žymi Tbx18 išraiška iš E8.25 (nuorodos 13, 14). Linijos sekimo eksperimentai su Tbx18- Cre pelėmis atskleidė, kad Tbx18 ekspresuojančios ląstelės sudaro SV ir proepikardą 15, 16 . Taigi buvo teigiama, kad SV kilmė yra pusmėnulio širdies pusmėnulio srityje, nors jo santykis su FHF ar SHF išlieka neaiškus.

Wnt signalizacija yra vienas iš svarbiausių stuburo kardiogenezės reguliavimo būdų 17, 18, 19, 20, 21 . Wnt antagonizmas, kurį sukelia Dkk1 arba Crescent, sukelia širdies formavimąsi stuburiniams gyvūnams 22, 23, 24, o Dkk1 reikalingas žinduolių galvos indukcijai 25 . Išskirti išsiskyrę su baltymu (Sfrp) 1 ir Sfrp2, kurie taip pat yra Wnt inhibitoriai, yra ekspresuojami širdyje ir dalyvauja širdies audinio atstatyme 26, 27, tuo tarpu kito pošeimio nario - Sfrp5 - ekspresijos būdas ir funkcija širdies vystymosi metu. yra nežinomi.

Šioje ataskaitoje mes parodome, kad Sfrp5 išraiška yra aptinkama šoniniuose ir kaukoliniuose širdies pusmėnulio regionuose, yra ekspresuojama ląstelėse, besiskiriančiose nuo tų, kuriose teigiami diferencijuotų kardiomiocitų ir SHF žymekliai, ir toliau ekspresuojama besivystančiame SV. Tačiau Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių palikuonys ypač prisideda prie kardiomiocitų visose širdies kamerose, išskyrus RV. Šie stebėjimai rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės šoniniame širdies pusmėnulio regione yra OFT, LV, kairiojo ir dešiniojo prieširdžių ir SV pirmtakinės ląstelės. Hiperplazija įtekėjimo trakte (IFT) buvo pastebėta Sfrp1 / 2/5 trigubo išmušimo (TKO) pelių embrionuose. Tai rodo, kad Sfrp5 reguliuoja širdies pirmtakų ląstelių dauginimąsi veniniame poliuje.

Rezultatai

Sfrp5 yra ekspresuojamas SV ir epikardo progenitorinėse ląstelėse

Signalizavimas Wnt reikalingas miokardo indukcijai ir yra susijęs su keliais širdies vystymosi etapais 17, 18, 19, 20, 21 . Yra žinoma, kad „ Sfrp“ porūšio genai ( Sfrp1 , 2 ir 5 ) koduoja išskiriamus „Wnt“ signalizacijos signalus 28 ir gali palaikyti suaugusiųjų širdies funkciją. Tarp trijų Sfrp genų mes nustatėme, kad Sfrp5 buvo konkrečiai ekspresuojamas tam tikroje širdies pusmėnulio dalyje, esant E7.5. Sfrp5 buvo aptiktas šoniniuose ir raiščiuose regionuose, kuriuose yra Mlc2a ir Nkx2-5 raiška, žymintis diferencijuojančius kardiomiocitus (1a, b pav.). Sfrp5 raiškos sritis aiškiai skyrėsi nuo Mlc2a ir Nkx2-5 (papildomas 1 pav.). Širdies vamzdelio kilpinimo stadijoje (E8.0 – E8.5) Sfrp5 raiška buvo nuolat stebima širdies veniniame poliuje (1c – e pav.), Kurios schema skyrėsi nuo Mlc2a ir Nkx2-5 , nurodant, kad Sfrp5 ekspresuojančioje srityje nėra diferencijuojamų kardiomiocitų. E9.5 metu Sfrp5 raiška apsiribojo veniniu veniniu poliu, kuriame, kaip žinoma, yra SV ir epikardo širdies pirmtakai, ir tai rodo, kad Sfrp5 gali būti ekspresuojamas tokiais protėviais. Norėdami ištirti šią galimybę, atlikome dvigubai fluorescencinę imunohistochemiją, naudodami atitinkamai Tbx18 ir WT1, specifinius SV ir epikardo žymenis. Norėdami stebėti Sfrp5 išraišką, mes panaudojome Sfrp5-venusYFP embrionus. E9.5 metu geltonai fluorescencinis baltymas (YFP) buvo stipriai aptiktas veninėje venoje ir silpnai nugarinėje veninio poliaus pusėje, panašiai kaip Sfrp5 išraiškos modelis (1f pav.). YFP signalas labai sutapo su dažymu Tbx18 ir vidutiniškai su dažymu WT1 (1f pav., G), kas rodo, kad Sfrp5 yra ekspresuojamas SV ir epikardo progenitorinėse ląstelėse.

Image

( a, c, d ) Dvigubai fluorescencinis viso kalno pelių embrionų ISH prie E7.5 ( a ), E8.0 ( c ) ir E8.5 ( d ), norint aptikti Sfrp5 (žalią) naudojant Mlc2a arba Nkx2-5 (raudona), kaip nurodyta kiekvienoje skydelyje. ( b, e, g ) Genų ekspresijos ( b, e ) ir baltymų pasiskirstymo ( g ) schemos. ( f ) viso sudėjimo ISH ( in situ ), YFP vaizdas sujungtas su ryškiu lauko vaizdu ( Sfrp5-YFP ), pjūvis in situ su Sfrp5 zondu ir Sfrp5-venusYFP KI embrionų vienkartiniai arba dvigubi imunohistocheminiai (IHC), naudojant anti-GFP antikūnai su anti-Tbx18 arba anti-WT1 antikūnais E9.5, kaip nurodyta kiekvienoje skydelyje. Svarstyklės = 50 μm.

Visas dydis

Kardiomiocitai SV rodo unikalų genų ekspresijos profilį, tai yra, TroponinT (TnT) - ir Hcn4-teigiami, bet Nkx2-5-neigiami. Tai skiriasi nuo Nkx2-5 ir TnT teigiamų kamerinių miokardo 30 . Norėdami toliau ištirti Sfrp5-venusYFP- ekspresuojančių ląstelių raiškos profilį, atlikome žymenų ekspresijos analizę. E9.5 metu Sfrp5-venusYFP ekspresuojančios ląstelės buvo neigiamos Nkx2-5, TnT ir Hcn4 (papildomas 2a pav.), Tuo tarpu E10.5 metu šios ląstelės išreiškė TnT ir Hcn4, bet ne Nkx2-5 (papildomas pav. 2b). Šie rezultatai rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės veninio veninio poliaus ties E9, 5 yra SV pirmtakai ir kad jie diferencijuojasi į kardiomiocitus SV SV10, 5. Taigi Sfrp5 išreiškianti sritis ties E7.5 gali būti SV pirmtakas.

Sfrp5 yra išreiškiamas širdies komponentų pirmtakose, išskyrus RV

Tada mes nustatėme, ar SV palikuonys atitinka širdies pusmėnulio Sfrp5 ekspresuojančias ląsteles. Norėdami išbandyti šią galimybę, mes sukūrėme Sfrp5 - Cre liniją (papildomas 3 pav.) Ir ištyrėme Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių linijas, kirsdami šią liniją su Rosa26R arba CAG-floxed-CAT-eGFP reporterių pelėmis 31 . E8.5 metu visame širdies vamzdyje netikėtai buvo pastebėtas β-galaktozidazės (LacZ) dažymas, išskyrus labiausiai įstrižąją dalį (2a pav.). E9.5 metu LacZ dažymas buvo pastebėtas OFT, LV, prieširdyje ir veniniame poliuje, bet ne RV (2b pav.). Pažymėtos ląstelės sutapo su TnT OFT, LV ir prieširdžiuose, tai rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių palikuonys, be SV, diferencijuojasi į kamerinį miokardą (2c pav.). E13.5 metu LacZ dažytos ląstelės dažniausiai užėmė ne tik LV, bet ir buvo rastos WT1 ekspresuojančiame perikardyje (2d, e pav.) Ir diferenciacijos 31 grupėje (CD31) - arba trombocitų endotelio ląstelių adhezijos molekulėse, išreiškiančiose juos. endokardas (2f pav.). Pažymėtos ląstelės buvo rasta dalyje tarpskilvelinio pertvaros ir retai RV (2b, d pav.), O tos, kurios buvo rastos RV, buvo linkusios lokalizuotis trabekuliniame miokardyje (2f pav.). Šie stebėjimai rodo, kad Sfrp5 yra ekspresuojamas SV, perikardo, epikardo ir endokardo progenituose, taip pat visuose kameriniuose miokarduose, išskyrus RV. Atsižvelgiant į tai, kad „ Isl1“ linijos prisideda prie visų miokardo, išskyrus LV 32, 33, „ Isl1“ linijų likimas prie RV arba „ Sfrp5“ linijų prie LV gali būti išskirtinai nustatytas ankstyviausiose kardiogenezės stadijose.

Image

( a, b, d ) Sfrp5-Cre / Rosa26R embrionų dažymas ant viso pagrindo ir sekcijos LacZ E8.5 ( a ), E9.5 ( b ) ir E13.5 ( d ) vietose. HT: širdies vamzdelis; dVP: nugaros veninis polius; vVP: veninis veninis polius; epi: epikardas; peri: perikardis, IVS; tarpukario pertvara. ( c, e, f ) Sfrp5 - Cre / CAG-floxed-CAT-eGFP ( c, f ) arba Sfrp5 - Cre / Rosa26R ( e ) embrionų dviguba imunohistocheminė analizė esant E 9, 5 ( c ), E 13, 5 ( e ) ir E15 .5 ( f ), naudojant anti-GFP arba anti-β-gal (žaliuosius) antikūnus su anti-TnT, anti-Isl1, anti-WT1 arba anti-CD31 antikūnais (raudona). Stačiakampiai viršutinėse plokštėse ( f ) padidinami apatinėse plokštėse. Rodyklės rodo ląsteles, kurios kartu išreiškia YFP ir CD31 ( f ). Mastelio juostos = 50 μm.

Visas dydis

Kadangi Sfrp5 ekspresija ribojama tik su veniniu širdies poliu E8.5, kuris neapima kamerinio miokardo, spėliojome, kad ląstelėse, ekspresuojančiose Sfrp5 iki E8.5, gali būti FHF pirmtakai. Norėdami įvertinti Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių likimą konkrečiose vystymosi stadijose, sukūrėme tamoksifeno indukuojamą ( estrogeno receptorius T2 ( ERT2 )) Cre pelių liniją (papildomas 3 pav.). Po Sfrp5 - ERT2Cre pelių su reporterinėmis pelėmis Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės buvo pažymėtos E7.5 naudojant tamoksifeno injekciją ir analizuojamos E10.5. LacZ dažymas parodė, kad ląstelės, pažymėtos E7.5, buvo rastos OFT, LV, prieširdyje, SV ir veniniame poliuje, bet ne RV (3a, b pav.). Įdomu tai, kad paženklintose ląstelėse vis dar rasta prieširdžių E8.5 ir E9.5 (papildomas 4 pav.), Tai rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės prie veninio poliaus gali tiekti kardiomiocitus IFT. Šie duomenys rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės E7.5 yra SV, OFT ir visų kamerų miokardo, išskyrus RV, pirmtakai. Todėl yra didelė tikimybė, kad Sfrp5 išraiška žymi FHF palikuonis.

Image

a ) „LacZ“ dažytų pjūvių iš „ Sfrp5-ERT2Cre“ / „ Rosa-lacZ“ embrionų E10.5, pažymėtų tamoksifenu E7.5, nuotraukos. b ) Sfrp5 (oranžinė) išraiškos ir jo linijų (raudonos) širdies indėlio schema, kai ląstelės buvo pažymėtos E7.5 ir analizuojamos E10.5. c ) Dvigubai fluorescencinis, nesudėtingas pelių embrionų ISH prie E7.5, kad būtų galima aptikti Sfrp5 (žalią) ir Hcn4 , Tbx5 arba Isl1 (raudoną), kaip nurodyta kiekvienoje skydelyje. ( d ) Sfrp5 , Isl1 , Hcn4 ir Tbx5 genų ekspresijos scheminiai brėžiniai . ( e ) dviguba Sfrp5-venusYFP imunohistochemija E8.5, naudojant anti-GFP (žaliuosius) ir anti-HCN4 (raudonus) antikūnus. Bendra raiška su HCN4 buvo rasta VP. Silpna YFP išraiška taip pat kartu pasiskirsto su HCN4 teigiamomis ląstelėmis IFT ir dalyje primityvaus skilvelio (PV). ( f, g ) Sfrp5-venusYFP ( e ), Sfrp5-venusYFP / Isl1 - Cre / CAG- (floksuotas) -CAT-mRFP ( f ) arba Sfrp5 - Cre / CAG- (floksuotas) -CAT-eGFP ( dvigubos imunohistocheminės savybės) g ) embrionai E9.5, naudojant anti-GFP (žaliuosius) antikūnus ir anti-HCN4, anti-RFP, anti - Isl1 arba anti-Tbx1 (raudoni) antikūnus. Stačiakampiai viršutinėse plokštėse padidinami apatinėse plokštėse (v: vidurinė; d: nugaros). Aptikta bendra raiška su Isl1 (rodyklės ( f ) skydelyje ir skliausteliuose ( g )). VP prieširdžio ribos pažymėtos baltomis punktyrinėmis linijomis ( f, g ). Tbx1 signalas, bet ne GFP, buvo pastebėtas priekinėje splanchninio mezodermos dalyje ir priekiniame OFT (rodyklės galvutės skydelyje ( g )). A, prieširdyje.

Visas dydis

Sfrp5 dariniai prisideda prie FHF ir dalies SHF linijų

Norint patikrinti šią galimybę, Sfrp5 ekspresija buvo palyginta su FHF žymenų genų Hcn4 ir Tbx5 ekspresija . Hcn4 yra išreikštas būsimojoje LV ties E7.5, o išraiška keičiasi link SV 30, 34 . Tbx5 išreiškiamas FHF linijoje E6.5 – E7.5 (nuorodos 35, 36, 37). Lyginant su Sfrp5 , Hcn4 išraiška buvo stebima anteromedialiniame regione, tuo tarpu Tbx5 pažymėta sritis sutapo ir išplečiama iš priekio , palyginti su Sfrp5 (3c pav., D). Kadangi Hcn4 ekspresija buvo apribota Tbx5 ekspresijos srities priekine dalimi, padarėme išvadą, kad Hcn4 gali žymėti tik ankstyvą diferencijuotą FHF liniją. Ir atvirkščiai, Tbx5 žymi ir nediferencijuotus, ir diferencijuojančius FHF palikuonius, tarp kurių Sfrp5 raiška yra ribojama nediferencijuotais FHF progenitoriais, esančiais širdies pusmėnulio šonuose. Be to, ląstelės, silpnai ekspresuojančios YFP primityviajame skilvelyje, ir IFT, buvo paskirstytos kartu su HCN4 Sfrp5 - venusYFP pelės embrionu ties E8.5 (3e pav.), Kas rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės palikuonys prisideda prie FHF linijos.

Linijos analizė taip pat atskleidė, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės E7.5 prisidėjo prie OFT ir prieširdžių, tai rodo, kad šios ląstelės taip pat turi SHF pirmtakų. Tačiau E7.5 lygyje Sfrp5 raiškos modelis skyrėsi nuo Isl1 , SHF žymens, ekspresijos modelio, nors raida šiek tiek sutapo kaukolės srityje (3c pav., D). E9.5 metu Isl1 nuorašai ir baltymai buvo ekspresuojami splanchniniame mezodermoje, įskaitant nugaros veninį polių, tačiau retai buvo ekspresuojami ventiniame veniniame poliuje, kuriame yra Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės (papildomi 5 ir 6 pav.). Norėdami išsiaiškinti, ar Sfrp5 išraiška nesusijusi su Isl1 splanchniniame mezodermoje, atlikome linijų sekimo analizę, naudodami Isl1-Cre ir CAG-floxed-CAT-mRFP reporterį / Sfrp5-venusYFP peles. Mes nustatėme, kad YFP signalas veniniame veniniame poliuje retai sutapo su Isl1 ekspresuojančių ląstelių dariniais (3f pav.). Tačiau pelėmis Sfrp5-Cre / CAG-floxed-CAT-eGFP-reporteriais GFP pažymėtos ląstelės išreiškė Isl1 ir Fgf10 nugaros stuburo mezodermoje ir OFT dalyje (3g pav. Ir papildomas 7 pav.). Šie radiniai leidžia manyti, kad Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių dariniai taip pat prisidėjo prie SHF kilmės, todėl gali atsirasti OFT ir prieširdžiai. Pažymėtina, kad šios GFP pažymėtos ląstelės buvo retai aptinkamos priekiniame splanchniniame mezodermoje, kur pasiskirstė Tbx1, kuris, kaip žinoma, taip pat išreikštas 38, 39 SHF (3g pav.).

Sfrp5-YFP ekspresuojančios ES ląstelės diferencijuojasi į širdies komponentus

Toliau mes išbandėme, ar Sfrp5 - venusYFP ekspresuojančios embriono kamieninės (ES) ląstelės galėtų diferencijuotis į širdies komponentus, tokius kaip endotelio, lygiųjų raumenų ir miokardo ląstelės. 2 dieną buvo nustatyta, kad YFP ekspresijos pikas yra didesnis nei kitų diferenciacijos žymenų (papildomas 8 pav.). 8 dieną ląstelių masėje buvo rasta CD31-, α-lygiųjų raumenų aktino ir TnT-teigiamose ląstelėse (papildomas 8 pav.), Leidžianti manyti, kad Sfrp5 taip pat galėtų tarnauti kaip širdies komponentų pirmtakų ląstelių žymeklis . in vitro diferenciacijos sistema.

Sfrps gali nedalyvauti širdies diferenciacijoje

Mūsų rezultatai rodo, kad Sfrp5 yra ekspresuojamas ir išlaikomas širdies progenitoriuose, tačiau prarandamas juos diferencijuojant, tai rodo, kad Sfrp5 praradimas gali sustiprinti šių širdies progenitorių diferenciaciją. Norėdami išbandyti šią galimybę, sukūrėme Sfrp1 / 2/5 TKO peles. Kaip pranešta anksčiau, tik TKO pelėms būdingas didelis augimo sulėtėjimas dėl Sfrp1 ir Sfrp2 kompensacinių funkcijų (nuoroda 40). Mes sutelkėme dėmesį į širdies fenotipą ir išanalizavome kelis linijos žymenis per in situ hibridizaciją (ISH) E9.5, paskutiniame etape, kuriame galima rinkti TKO embrionus. Panašiai kaip kontroliniuose, TKO embrionuose širdies vamzdyje buvo Nkx2-5, bet ne veniniame poliuje (4a pav.). Tai rodo, kad kardiomiocitų diferenciacija normaliai vyko iki šios stadijos. Tbx5 , Isl1 ir Tbx18 raiška buvo normali (4a pav.), Kas rodo, kad FHF, SHF ir SV susidarymas neturėjo įtakos. Šie pastebėjimai rodo, kad Sfrp negali paveikti diferenciacijos.

Image

a ) Kontrolės ir TKO embrionų ISH su zondais Nkx2-5 , Tbx5 , Tbx18 ir Isl1 . PV: primityvus skilvelis. ( b, c ) dviguba imunohistochemija, naudojant kontrolinius ir TKO embrionus naudojant anti-β-katenino ( b ) arba anti-Ki67 ( c ) antikūnus. Stačiakampiai iš kairiosios galinės plokštės yra padidinti dešiniajame skydelyje. Kitos padidintos nuotraukos, esančios dešiniajame apatiniame lange, rodo, kad β-kateninas kaupėsi YFP ekspresuojančiose ląstelėse veninio veninio poliaus TKO embrionuose. d ) Ki67 teigiamų (+) ląstelių procentas Sfrp5 - YFP - ekspresuojančiose (+) arba neigiamose (-) ląstelėse kontroliniuose ir TKO embrionuose ( n = 3). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd; ** P <0, 01, palyginti su kontroliniais mėginiais. Mastelio juostos = 50 μm (5 μm taškiniais stačiakampiais).

Visas dydis

Sfrps užkerta kelią proliferacijai slopindamas kanoninį Wnt signalizavimą

TKO embrionai, palyginti su OFT, turėjo padidintą IFT. Norėdami nustatyti, ar Sfrps gali reguliuoti širdies progenitorių dauginimąsi, toliau įvertinome, ar TKO embrionuose buvo paveiktas Wnt / β-catenino signalizavimas ir progenitorinių ląstelių proliferacija veniniame poliuje. Kontroliniuose embrionuose β-kateninas kaupėsi skilveliuose ir prieširdžiuose, tačiau mažiau β-katenino buvo stebėta YFP teigiamose širdies progenitorinėse ląstelėse veninio veninio poliaus srityje (4b pav.). Tačiau TKO embrionuose β-kateninas kaupėsi net YFP teigiamose širdies pirmtakų ląstelėse (4b pav.). Kontrolinėse pelėse Ki67 buvo labiau ekspresuojamas YFP neigiamose ląstelėse nei YFP teigiamose ląstelėse, kas rodo, kad Sfrp5 ekspresuojančių širdies pirmtakų proliferacija gali būti slopinama (4c pav., D). Priešingai, TKO embrionuose Ki67 teigiamų ląstelių procentas padidėjo YFP teigiamose ląstelėse, palyginti su procentine dalimi kontroliniuose mėginiuose (4c pav., D). Šie rezultatai rodo, kad Sfrps užkerta kelią širdies progenitorių dauginimuisi, slopindamas kanoninę Wnt signalizaciją.

Diskusija

Remdamiesi savo išvadomis, mes siūlome modelį, kaip Sfrp5 išreiškiantys širdies pirmtakai gali prisidėti prie širdies vystymosi, išskyrus RV (papildomas 9 pav.). Mes nustatėme, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės E7.5 ne tik prisidėjo prie OFT, LV ir prieširdžių, bet ir SV, atlikdamos likimo žemėlapius, naudodamos Sfrp5-Cre ir - ERT2Cre peles. Dėl šio pastebėjimo atsiranda galimybė, kad FHF linija ir SV gali turėti bendrą kilmę. Ši idėja buvo numanoma anksčiau atliekant Hcn4 ekspresijos ir linijos nustatymo eksperimentus, nes Hcn4 ekspresuojančios ląstelės iš esmės duoda didžiąją dalį LV, prieširdžių dalių ir širdies laidžiosios sistemos 30, 41, 42, 43, 44 . Mes nustatėme, kad Sfrp5 ekspresija retai sutapo su Hcn4 ekspresija , tuo tarpu ląstelės, silpnai išreiškiančios YFP PV ir IFT E8, 5, daugiausiai sutapo su Hcn4 . Sfrp5 išraiška taip pat iš esmės sutapo su Tbx5 ekspresija E7.5 , ir pranešama , kad ankstyvas Tbx5 ekspresuojančių ląstelių žymėjimas E6.5 – E7.5 žymi ląsteles, kuriose daugiausia yra LV ir prieširdžiai 36, 37, teigdamas, kad Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės turi FHF progenitorius. Be to, Sfrp5 buvo nuolat ekspresuojamas ląstelėse, sukeliančiose SV, kas rodo, kad ląstelės, kurios laikinai ekspresuoja Sfrp5, prisideda prie FHF. Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės pradeda ekspresuoti Tbx18 maždaug ties E8.0, o priverstinė Tbx18 ekspresija skatina ląstelių diferenciaciją į SV, įskaitant laidumo sistemą 45, ir reprezentuoja miokardo genų pogrupį 46 . Taigi Sfrp5 ekspresuojančios ląstelės galėtų išlaikyti ląstelių potencialą diferencijuotis tiek į SV, tiek į FHF, kol prasidės Tbx18 ekspresija.

Arba ankstyvasis Sfrp5 išreiškiantis progenitorių fondas gali būti nevienalytis įsipareigojant kiekvienai diferenciacijos programai. Kadangi Tbx5 ekspresuojančios ląstelės taške E6.5 – E7.5 neprisidėtų prie OFT (asmeninis dr. Yashiro bendravimas), tikslus Sfrp5 ir Tbx5 ekspresijos sričių ir linijų palyginimas gali diskriminuoti Sfrp5 ekspresuojančius pirmtakus, kurie prisideda prie OFT. iš tų, kurie prisideda prie kitų širdies pusmėnulio sričių. Tačiau ISH nustatytas Sfrp5 raiškos domenas gali būti labiau apribotas, nei iš tikrųjų yra ankstyvosiose stadijose, atsižvelgiant į galimybę, kad Sfrp5 ekspresuojančiuose pirmtakuose gali atsirasti Cre rekombinacija ISH neaptinkamame lygmenyje. Taigi ateityje turėtų būti atsižvelgiama į ląstelių likimo nustatymo laiką ir galimybę Sfrp5 ekspresuojančioms pirmtakoms ląstelėms diferencijuotis.

Kitas pastebėjimas buvo tas, kad dalis Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių vėliau išreiškė Isl1 ir prisidėjo prie OFT ir prieširdžių (5 pav.). Tai rodo, kad Isl1 ekspresuojanti SHF progenitorių populiacija turi bent dvi aiškias kilmes, iš kurių viena gaunama iš Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių. Mes taip pat nustatėme, kad Tbx1 yra ekspresuojamas priekiniame splanchniniame mezodermoje, kuriame nepasirodė Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių palikuonys, tai rodo, kad Tbx1 galėjo pažymėti Isl1 ekspresuojančių ląstelių subpopuliaciją SHF. Be to, Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių linijos neprisidėjo prie RV. Anksčiau buvo pranešta, kad RV formavime dalyvauja pirmosios šakinės arkos mezoderminės ląstelės ir kad Tbx1 yra ekspresuojamas pirmoje šakinėje arkoje, o Tbx1 ekspresuojančių ląstelių palikuonys prisideda prie RV 38, 39, 47, 48, 49 . Šie duomenys rodo aiškią RV kilmę, palyginti su kitų kamerų kilme. Atsižvelgiant į tai, kad išsiskyrę skilveliai evoliuciškai buvo įgyti atskirai sisteminei ir plaučių kraujotakai 50, mūsų rezultatai suteikia naują įžvalgą apie širdies pirmtakų išdėstymą prieš evoliucinį RV atsiradimą.

Image

Viršutiniai skydeliai rodo Sfrp5 (oranžinė) ir Islet1 (šviesiai žalia) išraiškos plotą ir Sfrp5 ekspresuojančių (raudona) ir Islet1 ekspresuojančių (žalių) ląstelių palikuonių pasiskirstymą E7.5 (dešinėje) ir E9.5 (kairėje) ). Apatiniame skydelyje parodyta giminės indėlis į kiekvieną širdies dalį. Mezoderminės ląstelės, kurios laikinai ekspresuoja Mesp1, gali tapti širdies pirmtako ląstelėmis, ekspresuojančiomis Islet1 (šviesiai žalią) arba Sfrp5 (oranžinę). Dalis Sfrp5 ekspresuojančių ląstelių vėliau pradeda ekspresuoti Islet1 (purpurinė). Pereinamosios Islet1 ekspresuojančios ląstelės, kurios neišreiškia Sfrp5, prisideda prie RV, OFT ir prieširdžio (žalios), o ląstelės, kurios ekspresuoja Sfrp5, prisideda prie OFT ir prieširdžio (purpurinės), bet ne prie RV. Ląstelės, kurios laikinai ekspresuoja Sfrp5, prisideda prie LV, prieširdžio ir OFT (oranžinės spalvos), o ląstelės, kurios nuolat ekspresuoja Sfrp5, sudaro SV.

Visas dydis

Plačiai pranešta apie Wnt signalizacijos vaidmenį širdies vystymesi 17 . Dėl širdies pirmtakuose esančių Wnt / β-katenino signalų hiperaktyvacijos padidėja tolesnis diferenciacijos proliferacija ir slopinimas 51, 52 . Mūsų tyrime buvo pastebėtas padidėjęs TKO embrionų proliferacija, tačiau diferenciacija į primityvius kardiomiocitus nebuvo sutrikusi. Mes spėjame, kad dirbtinis Wnt / β-katenino signalizacijos aktyvinimas ir slopinimo nebuvimas gali lemti skirtingus rezultatus miokardo diferenciacijos metu, o pagrindinis Wnt / β-katenino signalizacijos vaidmuo šiame kontekste gali būti proliferacijos reguliavimas, o ne diferenciacija. Kadangi buvo pranešta, kad Sfrp1 / 2/5 reguliuoja plokščių ląstelių poliškumo kelius per nekanoninį 40 Wnt kelią, gali egzistuoti specifinės audinių ar ląstelių Sfrps funkcijos. Tolesnis širdies progenitorių diferenciacijos į įvairius kardiomiocitų tipus molekulinio pagrindo supratimas galėtų suteikti naujų terapinės įžvalgos apie regeneracinę mediciną.

Metodai

Pelės

Norint sugeneruoti Sfrp5 - Cre rekombinazę ( Cre ) ir Sfrp5 - modifikuotą ERT2, konjuguotą su „Cre knock-in“ pelių linijomis, buvo priimta strategija, panaši į tą, kuri buvo naudojama kuriant „ Sfrp5 - venusYFP“ pelių liniją 40 . Tiksliniai vektoriai buvo sukonstruoti naudojant kasetę, kurioje buvo Cre - arba ERT2Cre-rekombinazės genai su frt-PGK-neomicino (neo) -bpA-frt , kuris buvo sujungtas su KpnI-SmaI ir SpeI-XbaI fragmentais, atitinkamai, ilgomis ir trumpomis homologinėmis rankomis. . MC1-DTA neigiamo atrankos žymeklio kasetė taip pat buvo įdėta į trumpos homologinės rankos išorę, kad būtų praturtinti homologiniais rekombinatais (papildomas 3 pav.). Tikslinimo vektoriaus rekombinacijai ERT2Cre buvo naudojama CRISPR-Cas9 sistema. 5′-GGCCAGGAGTACGACTACTACGG-3 ′ seka buvo įterpta į pX330 plazmidę (Addgene), naudojant BbsI vietą, ir po to buvo kartu transfekuota su nukreipimo vektoriu. Homologinė rekombinacija buvo patvirtinta Sfrp5 - Cre linijos pietietiška hibridizacija, zondui naudojant XbaI-EcoRI fragmentus, ir PCR metodu , naudojant Sfrp5 - ERT2Cre liniją, naudojant šį pradmenų rinkinį: Neo6: 5′-CGACCACCAAGCGAAACATC-3 ′ ir SAcontRR9. : 5′-CCCAGGGAAGGGAATTGTTCTAG-3 ′. Neo trynimas kryžminant su ROSA-Flp pelių linija buvo patvirtintas PCR, naudojant šį pradmenų rinkinį: DeltaNeoF1: 5′-CCTACATGCGCCCACTAGCCGT-3 ′ ir DeltaNeoR2: 5′-CCTAGCGACCCCAAGCATCC-3 ′. TKO embrionai buvo gauti kryžminant su Sfrp1 / 2/5 ; - / -, +/−, - / - arba - / -, +/−, venus (v) / v 40 . „Isl1-Cre“ pelių linijos anksčiau buvo sukurtos naudojant taikymo genus metodus 7 . Pelių linija ROSA26R buvo Dr. Soriano 31 dovana. Šios linijos palaikytos 129 ir C57BL / 6 mišriame fone. CAG-floxed-CAT-lyn-mRFP pelių linija buvo nauja, o CAG-floxed-CAT-eGFP pelių linija anksčiau buvo nustatyta, naudojant transgeninius metodus, naudojant C3HeJ × C57BL / 6J F1 hibridines peles 53 .

Tamoksifeno injekcija

Tamoksifenas (Sigma) buvo įšvirkštas į pilvaplėvės ertmę 8–20 savaičių nėščioms patelėms 35 mg kg −1 dozėmis, esant E7.5 – E9.5. Embrionai buvo išpjaustyti ant E10.5 arba E13.5 ir dažyti lacZ.

Viso montavimo dvigubai fluorescencinė ISH

Embrionai buvo išpjaustyti tarp E7.5 ir E9.5 ir fiksuoti 4% paraformaldehidu PBS 1 valandą iki vienos nakties. Po dehidratacijos, naudojant seriją metanolio, embrionai buvo rehidratuoti 0, 1% Tween 20 PBS (PBST), balinti 6% H 2 O 2 PBS, apdoroti Proteaze K, o paskui hibridizuoti digoksigeniinu (DIG) ir (arba) dinitrofenilu. pažymėti zondai 68 ° C temperatūroje per naktį. Po to jie buvo plaunami 5x ir 2xSSC / 50% formamidu, PBST ir blokuojančiu reagentu 1 val. Norint nustatyti DIG žymėtus zondus, embrionai buvo inkubuojami su anti-DIG antikūnais ir buvo aptikti naudojant TSA-Alexa555 aptikimo sistemą pagal gamintojo instrukcijas. Dinitrofenilo aptikimui buvo naudojamas TSA-Alexa488. Embrionai buvo analizuojami konfokaline lazerine mikroskopija (Leica LSM 5 PASCAL sistema).

Imunohistochemija ir LacZ dažymas

Embrionai po fiksavimo buvo įterpti optimalios pjovimo temperatūros junginiu ir buvo pjaustomi 10–14 μm žingsniu. Po plovimo PBS ir 1 valandą išankstinio inkubavimo su 1% BSA PBS, kad būtų galima blokuoti, sekcijos buvo inkubuotos su 500 × praskiestais pirminiais antikūnais (anti-GFP: Nakalai GF090R arba Abcam ab290; anti-Tbx1: Santa Cruz sc-17874; anti- Tbx18: Santa Cruz SC17869; anti-Wt1: Abcam ab10670; anti-Nkx2-5: Abcam ab35842; anti-TnT: Thermo MS-295-P0; anti-Hcn4: Alomone Labs APC052; anti-RFP: MBL PM005; anti- β-kateninas: Millipore 05-665; anti-Ki67: Abcam ab15580) 4 ° C temperatūroje per naktį. Tada pjūviai buvo inkubuojami su 500 x praskiestais antriniais antikūnais, konjuguotais su Alexa Fluor 488 arba 555 (Molecular Probes). Branduoliai buvo priešpriešiniai su 4, 6-diamidino-2-fenilindoliu. Norėdami dažyti LacZ, užšaldytos dalys buvo inkubuotos su X-gal tirpalu kambario temperatūroje per naktį po plovimo PBS.

ES ląstelių indukcija širdyje

ES ląstelės buvo išskirtos iš Sfrp5-venusYFP pelių blastocistų ir laikomos Leukemiją slopinančių faktorių turinčioje (1000 U ml −1 ) ES kultūrinėje terpėje (DMEM su 10% vaisiaus galvijų serumo, 1 × neesminių amino rūgščių tirpalo, 1 mM natrio). piruvato ir 10–4 M 2-merkaptoetanolio). Širdies indukcijai embrionų kūneliai, kurie 48 valandas buvo suformuoti pakabinamojo lašo kultūros metodu, buvo dedami į 2 šulinėlių kameros stiklelius arba 98 šulinėlių plokšteles (Nunc) ir 8 dienas buvo auginami ES kultūros terpėje be leukemiją slopinančio faktoriaus. .

Realaus laiko PGR

Visa RNR buvo išskirta naudojant TRIzol (Invitrogen). Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta naudojant „ReverTra Ace qPCR RT Kit“ (TOYOBO). Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc. arba Kapa Biosystems Inc.). PGR produktų intensyvumas buvo išmatuotas ir išanalizuotas naudojant Mini-Opticon (Bio-Rad). Buvo naudojami šie pradmenys: YFP : priekinė 5′-CCTGGTCGAG CTGGACGGCGAC-3 ′ ir atvirkštinė 5′-TCACGAACTCCAGCAGGACCATG-3 ′, Nkx2-5 : priekinė 5′-GCTACAAGTGCAAGCGACAG-3 ′, ir atvirkštinė 5′-GGGTG ′ -MHC : į priekį 5′-TCCACGGGAAGAGCATCCAT-3 ′ ir atvirkštinė 5′-CAGACTCTGGAGGCTCTTCACT, Hcn4: į priekį 5′-CTCAACTCAGGCGTCTTCAAC-3 ′ ir atvirkštinė 5′-CCACCGAAGTAGTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3 “ atvirkštinė 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3 ′. Amplifikacijos sąlygos buvo 5 s 95 ° C, 20 s 60 ° C ir 15 s 72 ° C 49 ciklų. G3pdh buvo sustiprintas kaip vidinė kontrolė.

Statistinė analizė

Daugiausiai buvo naudojamas parametrinis daugybinio palyginimo testas, vienpusė dispersijos analizė su Tukey – Kramer post hoc analize (jei nenurodyta kitaip), kai Bartlett'o testas ( P <0, 05) parodė dispersijų homogeniškumą su „Ekuseru – Toukei 2012“ programine įranga (Socialinis tyrimas). „Research Information Co, Ltd“). Visi duomenys išreikšti kaip vidurkis ± sd P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Duomenų prieinamumas

Autoriai pareiškia, kad visus duomenis, pagrindžiančius šio tyrimo išvadas, galima rasti dokumente ir jo papildomos informacijos rinkmenose arba turint pagrįstą atitinkamų autorių prašymą.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį: Fujii, M. et al . Sfrp5 identifikuoja visų miokardo struktūrų, išskyrus dešinįjį skilvelį, širdies pirmtakus. Nat. Bendruomenė. 8, 14664 doi: 10.1038 / ncomms14664 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi skaičiai, papildoma nuoroda

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.