Šikoninas inkstuose sukelia gliomos ląstelių nekroptozę, sukeldamas rožių perprodukciją ir skatindamas nekiltų r1 / rip3 formavimąsi | acta pharmaologica sinica

Šikoninas inkstuose sukelia gliomos ląstelių nekroptozę, sukeldamas rožių perprodukciją ir skatindamas nekiltų r1 / rip3 formavimąsi | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Nekroptozė yra užprogramuota nekrozė, kurią reguliuoja receptorių sąveikaujanti baltymų kinazė 1 (RIP1) ir RIP3. Nustatyta, kad nekroptozę sukelia per daug reaktyvių deguonies rūšių (ROS) gamyba, tačiau ROS vaidmuo reguliuojant nekroptozę išlieka sunkus. Šiame tyrime mes ištyrėme, kaip šikoninas, vėžio ląstelių nekroptozės induktorius , in vitro reguliavo signalus, sukeliančius nekroptozę glinomos ląstelėse. Gydymas shikoninu (2–10 μmol / L), priklausomai nuo dozės, sukėlė nekrozę ir sukėlė tarpląstelinės ROS perprodukciją žiurkės C6 ir žmogaus SHG-44, U87 ir U251 gliomų ląstelių linijose. Be to, nuo dozės priklausomas gydymas shikoninu padidino RIP1 ir RIP3 lygį ir sustiprino jų sąveiką gliomos ląstelėse. Išankstinis gydymas specifiniu RIP1 inhibitoriumi Nec-1 (100 μmol / L) arba specifiniu RIP3 inhibitoriumi GSK-872 (5 μmol / L) ne tik užkirto kelią šikonino sukeltai gliomos ląstelių nekrozei, bet ir žymiai sušvelnino tarpląstelinės ROS ir mitochondrijų superoksido lygį. . ROS sušvelninimas MnTBAP (40 μmol / L), kuris buvo mitochondrijų superoksido valiklis, sušvelnino šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekrozę, o padidėjęs ROS lygis rotenonu, kuris pagerino mitochondrijų superoksido generaciją, žymiai padidino šikonino sukeltą gliomos ląstelę. nekrozė. Be to, išankstinis gydymas MnTBAP užkirto kelią šikonino sukeltam RIP1 ir RIP3 ekspresijos padidėjimui ir jų sąveikai, o pradinis gydymas rotenonu sustiprino šį poveikį. Šie duomenys rodo, kad ROS yra ne tik šikonino sukeltos gliomos ląstelių nekrozės vykdytojas, bet ir RIP1 bei RIP3 ekspresijos ir nekrozomų rinkinio reguliatorius.

Įvadas

Glioma yra labiausiai paplitęs piktybinio pirminio smegenų auglio tipas. Labai sunku išgydyti piktybines gliomas, nes jos yra atsparios šiuo metu naudojamiems chemoterapiniams preparatams ir radioterapiniam režimui 1 . Vis dėlto kaupiamieji tyrimai parodė, kad nekroptozės sukėlimas yra veiksminga strategija pašalinti įvairias vėžio ląsteles, įskaitant storosios žarnos vėžio ląsteles, krūties vėžio ląsteles ir plaučių adenokarcinomos ląsteles, 2, 3, 4 . Nekroptozės indukcija yra veiksminga net šalinant vėžines ląsteles, atsparias apoptozei 5 . Taigi nekroptoze paremta terapija atskleidė naują požiūrį į gliomos gydymą.

Kaip užprogramuota nekrozė, nekroptozė ne tik prisideda prie chemoterapinių agentų sukelto vėžio ląstelių mirties 6, bet ir dalyvauja ląstelių žūtyje, kurią sukelia įvairūs patologiniai procesai, tokie kaip uždegimas ir išemija / reperfuzija 7, 8 . Nekroptozė yra morfologiškai panaši į nekrozę ir jai būdingas padidėjęs ląstelių tūris, padidėjusios organelės, plyšusi plazmos membrana ir vėlesnis tarpląstelinio turinio praradimas 9 . Biochemiškai nekroptozė atsiranda nuosekliai įjungiant signalų seriją. Receptoriais sąveikaujanti baltymų kinazė 1 (RIP1) yra nekroptozės iniciatorė, kuri sąveikauja su receptoriais sąveikaujančia baltymo kinaze 3 (RIP3) per savo RHIM domenus ir sudaro į amiloidą panašų nekrozomos kompleksą. Tada nekrosomos RIP1 suaktyvintas RIP3 įdarbina ir fosforilina savo pasroviui esantį mišrų linijinės kinazės tipo domeno baltymą (MLKL) 10, 11 . Galiausiai fosforilintas MLKL suformuoja oligomerą, kuris sukelia ląstelių membranos nutekėjimą ir ląstelių žūtį 10, 11, 12, 13 . Taigi nekrozomų susidarymas yra pagrindinis žingsnis į nekroptozę, tačiau veiksniai, turintys įtakos RIP1 ir RIP3 sąveikai, vis dar nėra aiškūs.

Ne kartą buvo pranešta, kad Shikoninas, naftochinonas, išskirtas iš Lithospermum eritrohizono , yra veiksmingas vėžio ląstelių nekroptozės induktorius 3, 14, 15, 16 . Panašiai kaip kitų reagentų 17, 18 sukeltą nekroptozę, šikonino sukeltą nekroptozę lydi reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) perprodukcija 3, 14 . Be to, ROS vaidina lemiamą vaidmenį gliomos ląstelių nekrozėje, nes sušvelninta ROS išgelbėjo gliomos ląstelių nekrozę, kurią sukėlė ne tik šikoninas, bet ir kiti natūralūs chemikalai, tokie kaip pristimerinas ir deoksipodofilotoksinas 14, 19, 20 . Vis dėlto neaišku, ar ROS dalyvauja reguliuojant signalus, sukeliančius nekroptozę. Čia mes pranešame, kad RIP1 ir RIP3 reguliuoja šikonino sukeltą tarpląstelinės ROS perprodukciją pernelyg generuodami mitochondrijų superoksidą. Priešingai, ROS pagerina šikonino sukeltą ekspresinį RIP1 ir RIP3 reguliavimą ir sustiprina jų sąveiką. Šis atradimas suteikia naują įžvalgą apie molekulinį mechanizmą, pagrindžiantį gliomos ląstelių nekroptozę, ir leidžia manyti, kad šikoninas yra galimas gliomos terapinis agentas.

medžiagos ir metodai

Reagentai

Shikonin, Nec-1 (nekrostatin-1), rotenonas ir MnTBAP (metalloporfirinas Mn (III) tetrakis (4-benzoinės rūgšties) porfirinas) buvo įsigyti iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV). GSK-872 buvo įsigytas iš Calbiochem (Billerica, MA, JAV). Shikoninas buvo ištirpintas PBS, kurio laikymo koncentracija buvo 50 mmol / L. Anti-RIP1 ir anti-RIP3 antikūnai buvo įsigyti iš „Abcam“ (Kembridžas, MA, JAV). Anti-β-aktino antikūnas buvo nupirktas iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Krusas, CA, JAV). Kiti reagentai buvo įsigyti iš „Sigma“.

Ląstelių linijos ir kultūra

Žiurkių C6 ir žmogaus SHG-44, U87 ir U251 gliomų ląstelių linijos buvo gautos iš Šanchajaus ląstelių biologijos instituto, esančio Kinijos mokslų akademijoje (Šanchajus, Kinija). Šios ląstelės buvo auginamos DMEM, turinčiame 10% vaisiaus vaisiaus serumo, 2 mmol / L glutamino, 100 V / ml penicilino ir 100 μg / ml streptomicino. Ląstelės buvo palaikomos drėgnoje aplinkoje, esant 37 ° C ir 5% CO 2, o eksperimentams buvo naudojamos vidutinės loginės fazės ląstelės.

Laktato dehidrogenazės atpalaidavimo ląstelių mirties tyrimas

C6 (1 × 10 5 ląstelės / duobutėje), SHG-44 (5 × 10 4 ląstelės / duobutėje), U87 (5 × 10 4 ląstelės / duobu) ir U251 (5 × 10 4 ląstelės / duobu) šukos buvo apdorotos tiksliniai junginiai, pasodinti į 96 šulinėlių mikro plokšteles ir auginami 24 valandas. Ląstelių mirtingumas buvo tiriamas naudojant laktodehidrogenazės citotoksiškumo tyrimo rinkinį (Beyotime Biotech, Haimen, Kinija). Pagal gamintojo instrukcijas kiekvieno mėginio absorbcijos vertė buvo nuskaityta ties 490 nm. Ląstelių žūties santykis buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: ląstelių žūties santykis% = ( mėginys - A kontrolė ) / (( A max - A kontrolė ) × 100, kur A yra mėginio absorbcijos vertė; Kontrolė yra kontrolinės grupės absorbcijos vertė; ir A max yra teigiama grupės absorbcijos vertė.

Nekrozės įvertinimas naudojant srauto citometriją

Po gydymo tiksliniais junginiais SHG-44 ir U251 gliomos ląstelės, naudodamos „Annexin V-FITC“ aptikimo rinkinį (Invitrogen, Grand Island, NY, JAV), nustatė ląstelių mirties būdą. Pagal gamintojo nurodymus, ląstelės buvo surenkamos ir du kartus plaunamos PBS, po to suspenduojamos 400 μL 1x rišamojo buferio. Ląstelės (100 μL) buvo perkeltos į 5 ml auginimo mėgintuvėlį, kuriame yra 5 μl aneksino V-FITC ir 10 μL propidium jodido, tada 15 minučių inkubuojamos kambario temperatūroje tamsoje. Po to, kai į mėgintuvėlį buvo įpilta 1x rišamojo buferio, nudažytos ląstelės buvo analizuojamos srauto citometrija (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA, JAV). Ląstelių mirčių procentas buvo analizuojamas naudojant CELLquest programinę įrangą (Becton Dickinson). Duomenys buvo surinkti surinkus 20 000 ląstelių kiekviename mėgintuvėlyje ir nustatant gyvybingų ir negyvų ląstelių skaičių kiekvienoje eksperimento sąlygoje.

Matuojamos tarpląstelinės reaktyviosios deguonies rūšys ir mitochondrijų superoksidas

SHG-44, U251, U87 ir C6 gliomos ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių mikro plokšteles ir kultivuojamos 24 valandas prieš apdorojimą tiksliniais junginiais. Tarpląstelinio ROS lygiui įvertinti buvo naudojamas redoksui jautrus dažiklis DCFH-DA (Beyotime Biotech, Haimen, Kinija). Trumpai tariant, ląstelės buvo inkubuotos su 1% Triton X-100, po to, kai buvo dažytos 20 μmol / l DCFH-DA tamsoje 30 min. Tada fluorescencija buvo matuojama esant sužadinimo bangos ilgiui 485 nm ir emisijos bangos ilgiui 530 nm, naudojant fluorescencijos spektrometrą (HTS 7000, Perkin Elmer, Bostonas, MA, JAV). ROS lygis buvo išreikštas kontrolinės dalies procentais.

„MitoSOX Red“ („Invitrogen“ įmonė, Eugene, OR, JAV) buvo naudojamas mitochondrijų superoksido matavimui pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo inkubuojamos 10 minučių su 2, 0 ml 5 μmol / L MitoSOX reagento darbinio tirpalo 37 ° C temperatūroje tamsoje, po to plaunamos PBS. Raudonos fluorescencijos tankis buvo matuojamas esant sužadinimo bangos ilgiui 510 nm ir emisijos bangos ilgiui 580 nm. Jis buvo išreikštas kaip kontrolinių ląstelių fluorescencijos santykis.

Be to, SHG-44 gliomos ląstelės buvo pasėtos į 3 cm auginimo indą ir kultivuojamos 24 valandas. Po apdorojimo tiksliniais junginiais, ląstelės buvo nudažytos DCFH-DA arba MitoSox Red, kaip aprašyta aukščiau, ir stebimos fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX71, Tokijas, Japonija).

Gelio elektroforezė ir Western blotinimas

Ląstelių surinkimas ir homogenizavimas buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 20 . Tada homogenizatoriai buvo centrifuguojami 1 000 x g 10 minučių 4 ° C temperatūroje, norint gauti supernatantus, kurių baltymų kiekis buvo nustatytas naudojant Bio-Rad baltymų analizės rinkinį. Po SDS elektroforezės ir perkėlimo PVDF membranos buvo užblokuotos 3% galvijų serumo albuminu TBS 30 minučių kambario temperatūroje ir po to inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje su anti-RIP1 (1: 1000), anti-RIP3 (1: 1000). ) arba anti-β-aktino (1: 1500) antikūnai. Po inkubavimo su krienų peroksidaze konjuguotu ožkų anti-triušio IgG (1: 2000) antikūnu, blotai buvo nuplauti, o imunoreaktyvūs baltymai buvo vizualizuoti „Kodak X-omat LS“ plėvele („Eastman Kodak Company“, New Haven, CT, JAV). sustiprintas chemiliuminescencinis substratas (Amersham Biosciences, Piscataway NJ, JAV). Densitometrija buvo atlikta naudojant „Kodak ID“ vaizdų analizės programinę įrangą.

Bendras imuninis nusodinimas

Ląstelių surinkimas ir homogenizavimas buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 20 . Tada homogenizatoriai buvo centrifuguoti 15 000 x g 15 minučių 4 ° C temperatūroje, kad būtų gautas supernatantas. Po baltymų kiekio nustatymo naudojant „Bio-Rad“ baltymų tyrimo rinkinį ir baltymų koncentracijos buvo normalizuotos, 400 μg baltymų mėginių buvo iš anksto išgryninti naudojant IgG izotipo kontrolinį antikūną (Abcam) ir baltymo A / G agarozę (Millipore). Pirmiausia į baltymų mėginius buvo įtraukta 40 μL A / G baltymo agarozės, gautos inkubuojant su 10 μL pirminio antikūno 50 μL lizės buferio per naktį 4 ° C temperatūroje ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje. Po to mišinys buvo nusodinamas greitojo užšaldymo centrifugavimo būdu, esant 10 000 apsisukimų per minutę greičiu. Norėdami pašalinti nespecifiškai surištus baltymus, nuosėdos buvo tris kartus plaunamos lizės buferiu. Tada su agaroze susieti imunokompleksai buvo atpalaiduojami denatūravus tirpalą įkrovimo buferyje prieš atliekant Western blot analizę.

Imunocitocheminis, Hoechst 33342 ir PI dažymas

SHG-44 ląstelės (3x105 ląstelės / duobučio) ir U251 (4x105 ląstelės / duobučio) 24 valandas augo ant apvalkalų 6 šulinėlių kultūros plokštelėse. Ląstelės buvo apdorotos šikoninu 2 valandas 37 ° C temperatūroje, du kartus plaunamos PBS, inkubuojamos su Hoechst 33342 dažais (1 μg / ml) 5 min., Po to inkubuojamos su PI (5 μg / ml) 15 min. Kambaryje. temperatūra. Po paskutinio plovimo PBS, mėginiai buvo vizualizuojami padidinant 60 kartų, naudojant lazeriniu skenavimo konfokaliniu mikroskopu („Olympus FV1000“, Tokijas, Japonija).

Perdavimo elektronų mikroskopija

SHG-44 gliomos ląstelės buvo kultivuojamos ir apdorotos nurodytu koncentracijos šikoninu, surinktos naudojant 0, 25% tripsino, po to plaunamos PBS. Tada ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant 10 min., Esant 2000 apsisukimų per minutę, ir apdorotos taip, kaip aprašė Huang ir kt. 14 . Trumpai tariant, ląstelės buvo pritvirtintos ledo šaltyje esančiame 2, 5% gliutaraldehide PBS (pH 7, 3), nuplaunamos PBS, po to pritvirtintos 1% osmio tetrokside su 0, 1% kalio fericianidu, dehidratuotos per rūšinę etanolio grupę (30–90%). %) ir įterptas į Epon dervą („Energy Beam Sciences“, Agawam, MA, JAV). Semitino (300 nm) pjūviai buvo supjaustyti naudojant Reichart Ultracut ultra mikrotomą, dažyti 0, 5% toluidino mėlyna ir ištirti šviesos mikroskopu. Itin ploni pjūviai (65 nm) buvo nudažyti 1% uranilacetatu ir 0, 1% švino citratu ir ištirti naudojant JEM2000EX perdavimo elektronų mikroskopą (JEOL, Pleasanton, CA, JAV).

Statistinė analizė

Visi duomenys atspindi mažiausiai 4 nepriklausomus eksperimentus ir yra išreikšti kaip vidurkis ± SD. Statistiniai palyginimai buvo atlikti naudojant vienpusę ANOVA. Statistiškai reikšmingomis buvo laikomos mažesnės nei 0, 05 P vertės .

Rezultatai

Šikonino sukelta nekrozė ir ROS perprodukcija gliomos ląstelėse

Ankstesniame pranešime mes nustatėme, kad šikoninas sukėlė nekroptozę U87 ir C6 gliomos ląstelėse po 3 valandų inkubacijos, o IC50 vertės buvo atitinkamai 10, 0 μmol / L ir 6, 0 μmol / L, atitinkamai 14 . Čia mūsų tyrimas buvo išplėstas įtraukiant SHG-44 ir U251 gliomos ląsteles, o MTT tyrimas parodė, kad šikonino IC50 reikšmės SHG-44 ir U251 ląstelėms buvo atitinkamai 4, 0 μmol / L ir 10, 0 μmol / L po 3 h. inkubacija (duomenys nepateikti).

Tada mes išmatuojome šikonino toksiškumą gliomos ląstelėms, naudodamiesi LDH išsiskyrimo tyrimu, ir nustatėme, kad padidėjus šikonino koncentracijai, SHikon-44, U251, U87 ir C6 ląstelėse padidėjo šikonino sukelta gliomos ląstelių mirtis (1A pav.). Be to, srauto citometrija kartu su dvigubu aneksino V / PI dažymu parodė, kad šikoninas nepadidino akivaizdaus aneksino V + / PI - (ankstyvosios apoptozės) ląstelių procentinio padidėjimo, tačiau paskatino pastebimą PI + arba aneksino V + / padidėjimą. PI + ląstelės (1B paveikslas). Dvigubas dažymas Hoechst 33342 ir PI naudojant konokalinį mikroskopą įrodė, kad dėl gydymo shikoninu PI teigiamos ląstelės neturėjo apoptozės požymių, tokių kaip branduolio kondensacija ar suskaidymas (1C pav.). Be to, perdavimo elektronų mikroskopija parodė, kad SHikon-44 ląstelėse, apdorotose šikoninu, buvo elektronų lucentinė citoplazma, jie prarado plazmos membranos vientisumą ir nepažeistas branduolines membranas (papildomas paveikslas S1), kurios atitiko nekrozės 14 požymius. Taigi tiek PI +, tiek aneksino V + / PI + ląstelės turėjo pirminę nekrozę, bet ne antrinę vėlyvą apoptozę. Šie rezultatai rodo, kad šikoninas sukelia gliomos ląstelių nekroptozę priklausomai nuo koncentracijos.

Image

Šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse lydėjo tarpląstelinės ROS ir mitochondrijų superoksido gamyba. (A) LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad šikoninas sukėlė gliomos ląstelių mirtį priklausomai nuo koncentracijos. (B) Srauto citometrija su aneksino V / PI dvigubu dažymu įrodė, kad šikoninas nepadidino akivaizdaus aneksino V + / PI - (ankstyvosios apoptozės) ląstelių procentinio padidėjimo, bet žymiai padidino PI + arba aneksino V + / PI + ląsteles ties 3 valandos inkubacijos. (C) Konfokalinė mikroskopija naudojant Hoechst 33342 ir PI dvigubą dažymą parodė, kad shikoninas nesukėlė chromatino kondensacijos ar branduolio suskaidymo. (D) Reprezentatyvūs fazinio kontrasto ir fluorescenciniai mikroskopiniai SHG-44 gliomos ląstelių, inkubuotų su ROS zondu DCFH-DA, vaizdai per 2 valandas inkubuojant su šikoninu (20 ×). (E) Statistinė fluorescencijos tankio, aptikto DCFH-DA, analizė rodo, kad šikoninas sukelia perteklinį tarpląstelinės ROS gaminimą priklausomai nuo dozės. (F) Reprezentatyvūs fluorescenciniai mikroskopiniai SHG-44 ląstelių vaizdai, dažyti mitochondrijų superoksido zondu „Mitosox Red“ 2 valandos inkubacijos metu su šikoninu (20 ×). (G) „Mitosox Red“ aptiktas raudonos fluorescencijos tankio statistinė analizė įrodo, kad per mažas tarpląstelinio mitochondrinio superoksido susidarymas, kurį sukelia šikoninas, priklausė nuo šikonino koncentracijos. Šios vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SD ( n = 5 vienai grupei). * P <0, 01.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Atsižvelgiant į tai, kad shikonino sukeltą nekroptozę dažnai lydi ROS 3, 14 perprodukcija, mes ištyrėme ryšį tarp ROS susidarymo ir shikonino dozės. Fluorescencinė mikroskopija atskleidė, kad ląstelių ROS lygiai, nustatyti DCFH-DA po 2 h inkubacijos su shikoninu, buvo žymiai didesni 6 μmol / L grupėje nei 3 μmol / L grupėje (1D paveikslas). Statistinė fluorescencijos intensyvumo analizė parodė, kad ROS susidarymas taip pat priklauso nuo shikonino koncentracijos (1E pav.).

Atsižvelgiant į tai, kad ROS daugiausia susidaro mitochondrijose 21, mes panaudojome Mitosox Red, norėdami ištirti shikonino sukeltus mitochondrijų superoksido generacijos pokyčius. Fluorescencinė mikroskopija įrodė, kad mitosox Redo aptiktas mitochondrijų superoksido kiekis žymiai padidėjo Cikon ląstelėse, apdorotose šikoninu, o mitochondrijų superoksido lygis 6 μmol / L grupėje buvo didesnis nei 3 μmol / L grupėje (pav. 1F). Be to, statistinė raudonos fluorescencijos intensyvumo analizė parodė, kad didesnės šikonino koncentracijos padidino mitochondrijų superoksido kiekį (1G pav.). Tai rodo, kad šikoninas sukelia nenormalų tarpląstelinio ROS lygį gliomos ląstelėse nukreipdamas mitochondrijas.

RIP1 ir RIP3 reguliavo šikonino sukeltą nekrozę ir ROS perteklių

Atsižvelgiant į tai, kad RIP1 ir RIP3 yra pagrindiniai nekroptozės signalai, mes ištyrėme shikonino sukeltus RIP1 ir RIP3 pokyčius. Kaip paaiškėjo Western blotting, šikoninas sukėlė nuo koncentracijos priklausomą RIP1 ir RIP3 reguliavimą SHG-44, U251, U87 ir C6 gliomos ląstelėse (2A paveikslas ir papildoma S2A figūra). Be to, imuninis RIP1 ir RIP1 antikūno nusėdimas parodė, kad kartu iškritęs RIP3 padidėjo didėjant šikonino koncentracijai. Tai rodo, kad šikonino sukelta gliomos ląstelių nekrozė yra susijusi su RIP1 ir RIP3 (2B paveikslas ir papildoma S2B nuotrauka).

Image

RIP1 ir RIP3 reguliavo šikonino sukeltą nekrozę ir ROS perteklių. (A) Western blot analizė parodė, kad šikoninas paskatino RIP1 ir RIP3 ekspresijos padidėjimą priklausomai nuo koncentracijos. (B) Imuninis RIP1 ir RIP1 antikūno nusėdimas parodė, kad kartu iškritęs RIP3 padidėjo padidėjus šikonino koncentracijai. (C) LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad 100 μmol / L Nec-1 ir 5 μmol / L GSK-872 slopino šikonino sukeltą gliomos ląstelių mirtį. (D) Srauto citometrijos analizė atskleidė, kad 5 μmol / L GSK-872 užblokavo šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse. (F) Srauto citometrijos analizė įrodė, kad 100 μmol / L Nec-1 apsaugo nuo gikonomos ląstelių nekrozės, kurią sukėlė šikoninas. * P <0, 01, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis tik shikoninu. (F) „Western blot“ analizė atskleidė, kad Nec-1 slopino šikonino sukeltą ekspresinį RIP1 reguliavimą, o GSK-872 sušvelnino padidėjusią Šikonino sukeltą RIP3 išraišką. (G) Statistinė fluorescencinio tankio, aptikto DCFH-DA, analizė parodė, kad išankstinis gydymas 100 μmol / L Nec-1 ir 5 μmol / L GSK-872 slopino šikonino sukeltą ląstelių ROS perprodukciją. (H) Statistinė raudonos fluorescencijos tankio, aptikto „Mitosox Red“, analizė parodė, kad 100 μmol / L Nec-1 ir 5 μmol / L GSK-872 slopino per daug šikonino sukeltą mitochondrijų superoksido susidarymą. Šios vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SD ( n = 5 vienai grupei). * P <0, 01.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Tada mes užblokavome RIP1 ir RIP3 su atitinkamais specifiniais inhibitoriais Nec-1 ir GSK-872, kurie gali tiesiogiai prisijungti prie aktyvių RIP1 ir RIP3 domenų, ir ištyrėme gliomos ląstelių mirtį. Kaip parodė LDH išsiskyrimo tyrimas, 1 val. Išankstinis gydymas 100 μmol / L Nec-1 arba 5 μmol / L GSK-872 galėjo veiksmingai užkirsti kelią šikonino sukeltai gliomos ląstelių mirčiai po 3 h inkubacijos (2C paveikslas). Be to, srauto citometrijos analizė parodė, kad Nec-1 ir GSK-872 užkerta kelią šikonino sukeltai gliomos ląstelių nekrozei atitinkamai SHG-44 ir U251 ląstelėse (2D ir 2E paveikslai). Baltymų lygyje Nec-1 ir GSK-872 sušvelnino šikonino sukeltą ekspresinį atitinkamai RIP1 ir RIP3 reguliavimą (2F paveikslas ir papildoma S2C nuotrauka). Tai patvirtino, kad šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekroptozę reguliuoja RIP1 ir RIP3.

Visų pirma, mes nustatėme, kad tiek šikonino sukeltas viduląstelinio ROS padidėjimas, tiek per didelis mitochondrijų superoksido susidarymas buvo slopinami esant 100 μmol / L Nec-1 arba 5 μmol / L GSK872 (2G paveikslas ir papildomas S2D paveikslas, 2 pav.) 2H ir papildomas paveikslas S2E), rodantis, kad RIP1 ir RIP3 atspindi šikonino sukeltą ROS ir mitochondrijų superoksido perprodukciją.

ROS buvo šikonino sukeltos gliomos ląstelių nekrozės vykdytojas

Norint išsiaiškinti ROS vaidmenį šikonino sukeltoje nekroptozėje, MnTBAP (sintetinis, netoksiškas ir ląstelėms pralaidus superoksido dismutazės mimetikas) buvo naudojamas ląstelių ROS lygiui slopinti. Preliminarus gydymas MnTBAP 1 val. Reikšmingai slopino šikonino sukeltą mitochondrijų superoksido perprodukciją ir padidino tarpląstelinių ROS lygį per 2 inkubacijos valandas (3A paveikslas ir papildomas S3A paveikslas, 3B paveikslas ir papildomas paveikslas S3B). Atitinkamai, šikonino sukeltas gliomos ląstelių žūtis buvo žymiai slopinamas esant MnTBAP (3C pav.). Be to, srauto citometrija su aneksino V / PI dvigubu dažymu įrodė, kad prieš tai skiriant MnTBAP, akivaizdžiai susilpnėjo šikonino sukelta nekroptozė SHG-44 ir U251 ląstelėse (3D paveikslas). Todėl šie duomenys rodo, kad tarpląstelinė ROS yra atsakinga už šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse.

Image

ROS buvo šikonino sukeltos gliomos ląstelių nekrozės vykdytojas. (A) Išankstinis apdorojimas 40 μmol / L MnTBAP 1 val. Žymiai sumažino šikonino sukeltą mitochondrijų superoksido generaciją. (B) Esant MnTBAP, buvo aiškiai išvengta padidėjusio tarpląstelinio ROS lygio dėl gydymo shikoninu. (C) LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad 40 μmol / L MnTBAP reikšmingai slopino šikonino sukeltą ląstelių mirtį SHG-44, U251, U87 ir C6 gliomos ląstelėse. (D) Srauto citometrijos analizė įrodė, kad MnTBAP smarkiai užkirto kelią šikonino sukeltai gliomos ląstelių nekrozei SHG-44 ir U251 gliomos ląstelėse. Šios vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SD ( n = 5 vienai grupei). * P <0, 01, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

ROS buvo šikonino sukeltos gliomos ląstelių nekrozės reguliatorius

Norėdami dar labiau patikrinti ROS vaidmenį šikonino sukeltoje gliomos ląstelių nekrozėje, mes panaudojome rotenoną, kad pagerintume tarpląstelinį ROS lygį, nes rotenonas sukuria superoksidą, slopindamas mitochondrijų elektronų pernešimo grandinę. Mes nustatėme, kad rotenonas sukėlė ryškų superoksido padidėjimą SHG-44 ir U251 ląstelėse per 4 inkubacijos valandas ir paskatino gliomos ląstelių mirtį. Tačiau padidėjęs mitochondrijų superoksido ir gliomos ląstelių žūtis buvo užkirstas kelias 1 val. Iš anksto apdorojant 40 μmol / L MnTBAP (4A paveikslas ir papildomas S4A paveikslas bei 4B paveikslas). Tai rodo, kad rotenonas sukelia gliomos ląstelių mirtį dėl mitochondrijų superoksido perprodukcijos. Taigi, gliomos ląstelės 2 valandas buvo gydomos rotenonu ir po to 2 valandas inkubuojamos su šikoninu nurodytose koncentracijose. Mes nustatėme, kad pirminis gydymas rotenonu žymiai pagerino šikonino sukeltą mitochondrijų superoksido ir tarpląstelinės ROS gamybą (4C paveikslas ir papildomas S4B paveikslas, 4D paveikslas ir papildomas paveikslas S4C). Be to, LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad rotenonas pastebimai padidino šikonino sukeltą gliomos ląstelių mirtį. Be to, srauto citometrijos analizė parodė, kad rotenonas sustiprino šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekrozę (4E ir 4F paveikslai).

Image

ROS reguliavo šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse. (A) „Mitosox Red“ nustatyto fluorescencinio tankio statistinė analizė parodė, kad 4 valandas inkubuojant su rotenonu, susidarė per didelis mitochondrijų superoksido susidarymas, o tai buvo žymiai užkirstas kelias 1 valandą iš anksto apdorojant 40 μmol / L MnTBAP. (B) LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad MnTBAP slopino rotenono sukeltą ląstelių mirtį SHG-44 ir U251 gliomos ląstelėse. (C) „Mitosox Red“ nustatyto fluorescencinio tankio statistinė analizė parodė, kad išankstinis gydymas rotenonu 2 h sustiprino mitochondrijų superoksido susidarymą, kurį sukėlė 2 h inkubacija su shikoninu. (D) Statistinė fluorescencinio tankio, aptikto DCFH-DA, analizė parodė, kad išankstinis gydymas rotenonu 2 val. Pagerino padidėjusius tarpląstelinius ROS lygius, kuriuos sukėlė 2 val. Gydymas shikoninu. (E) LDH išsiskyrimo tyrimas parodė, kad rotenonas padidino šikonino sukeltą gliomos ląstelių mirtį, kurią užkirto kelią Nec-1. Tačiau Nec-1 neužkerta kelio gliomos ląstelių mirčiai, kurią sukėlė vien rotenonas. (F) Srauto citometrija su aneksino V / PI dvigubu dažymu parodė, kad rotenonas sustiprino šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse, tačiau šį sustiprinamąjį poveikį blokavo Nec-1. Šios vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SD ( n = 5 vienai grupei). * P <0, 01, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami išsiaiškinti, ar padidėjęs rotenono poveikis šikonino sukeltai gliomos ląstelių nekrozei buvo susijęs su RIP1, mes SHG-44 ir U251 ląsteles gydydavome 100 μmol / L Nec-1 1 valandą prieš nuoseklų inkubavimą su rotenonu ir šikoninu. Kaip atskleidė LDH išsiskyrimo tyrimas ir srauto citometrijos analizė, Nec-1 blokavo sustiprinamąjį rotenono poveikį šikonino sukeltai gliomos ląstelių mirčiai (4E ir 4F paveikslai). Tai rodo, kad padidėjęs rotenonas padidina shikonino sukeltą gliomos ląstelių mirtį per nekroptozės kelią.

ROS reguliavo padidėjusią RIP1 ir RIP3 raišką ir jų šikonino sukeltą sąveiką

Norėdami patikrinti ROS poveikį nekroptozės signalams RIP1 ir RIP3, atlikome Western blot analizę ir nustatėme, kad prieš tai paskyrus rotenoną, padidėjo Šikonino sukeltas RIP1 ir RIP3 reguliavimas (5A paveikslas ir papildoma S5A figūra), tačiau MnTBAP neleido pasireikšti Šikonino sukeltas RIP1 ir RIP3 reguliavimas (5B paveikslas ir papildomas S5B paveikslas). Visų pirma, bendras imunoprecipitacija parodė, kad RIP3 kartu su RIP1 nusodinant dėl ​​šikonino vartojimo pagerėjo rotenonas (5C pav. Ir papildomas S5C paveikslas), tačiau jį sušvelnino MnTBAP (5D pav. Ir papildomas S5D paveikslas). Taigi, šie duomenys rodo, kad Šikonino sukeltas RIP1 ir RIP3 reguliavimas ir nekrosomų formavimasis yra reguliuojami ROS.

Image

ROS reguliavo padidėjusią RIP1 ir RIP3 raišką ir jų sąveiką, kurią sukėlė shikoninas. (A) Western blot analizė atskleidė, kad rotenonas padidino RIP1 ir RIP3 raišką ir padidino Šikonino sukeltą RIP1 ir RIP3 padidėjimą. Tačiau šį patobulinimo efektą blokavo „Nec-1“. (B) Western blot analizė atskleidė, kad MnTBAP užkerta kelią šikonino sukeltam RIP1 ir RIP3 reguliavimui. (C) Bendras imunoprecipitacija parodė, kad žymiai didesnis RIP3 kiekis kartu su RIP1 gliomos ląstelėse, apdorotose rotenonu, prieš inkubuojant su shikoninu. (D) Bendras imunoprecipitacija įrodė, kad ląstelėse, iš anksto apdorotose MnTBAP, RIP3 buvo sumažinta mažiau nei RIP3, palyginti su gydymu vien shikoninu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Mes nustatėme, kad šikoninas sukėlė gliomos ląstelių nekroptozę ir sukėlė tarpląstelinės ROS ir mitochondrijų superoksido perprodukciją priklausomai nuo koncentracijos. Be to, šikoninas taip pat padidino RIP1 ir RIP3 lygį ir sustiprino jų sąveiką. RIP1 arba RIP3 slopinimas kartu su jų specifiniais inhibitoriais ne tik užkirto kelią šikonino sukeltai gliomos ląstelių nekroptozei, bet ir sušvelnino tarpląstelinius ROS ir mitochondrijų superoksido lygius, parodydamas, kad RIP1 ir RIP3 reguliuoja šikonino sukeltą ROS perprodukciją nukreipdami į mitochondrijas. ROS sušvelninimas naudojant MnTBAP, kuris yra mitochondrijų superoksido valiklis, susilpnintą šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekroptozę, tuo tarpu padidinant ROS su rotenonu, kuris pagerina superoksido mitochondrijų generaciją, padidėja gliomos ląstelių nekroptozė. Be to, mes nustatėme, kad MnTBAP neleido šikonino sukeltos RIP1 ir RIP3 ekspresijos ir jų sąveikos, o rotenonas sustiprino šį poveikį. Visi šie duomenys rodo, kad ROS vaidina lemiamą vaidmenį reguliuojant shikonino sukeltą gliomos ląstelių nekroptozę, nes susidaro teigiami atsiliepimai apie RIP1 ir RIP3 (6 paveikslas).

Image

ROS vaidmens shikonino sukeltos gliomos ląstelių nekroptozės schema.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Nekrozė iš pradžių buvo manoma kaip atsitiktinis įvykis, tačiau sukaupti įrodymai parodė, kad tai yra užprogramuota ląstelių mirtis, kurią reguliuoja specifiniai signalai 22 . Ląstelių mirčiai įvertinti dažnai naudojami du metodai, matuojant plazmos membranos pralaidumo pokyčius. Pirmiausia reikia ištirti DNR rišančių dažų, kurie nepraeina pro gyvų ląstelių plazminę membraną, pavyzdžiui, propidium jodido, įsisavinimą. Kitas metodas yra įvertinti tarpląstelinių molekulių, tokių kaip laktato dehidrogenazė (LDH) 23, nuotėkį. Taigi šiame tyrime mes ištyrėme gliomos ląstelių mirtį, naudodamiesi LDH išsiskyrimo tyrimu ir srauto citometrijos analize kartu su aneksino V / PI dvigubu dažymu. Mes nustatėme, kad šikoninas sukėlė nuo dozės priklausomą ląstelių mirtį visose keturiose gliomos ląstelių linijose (SHG-44, U251, U87 ir C6 ląstelės). Be to, kaip parodė fluorescencinė mikroskopija naudojant Hoechst ir PI dvigubą dažymą, šikoninu apdorotos ląstelės neturėjo jokių morfologinių apoptozės požymių, tokių kaip kondensuotas chromatinas ar suskaidyti branduoliai 14 . Be to, shikoninas nepadidino ląstelių, kurios buvo nudažytos tik aneksinu V, todėl pašalinome, kad šikonino sukelta nekrozė buvo antrinė vėlyvosios apoptozės forma. Ankstesnis mūsų pranešimas taip pat parodė, kad pan-kaspazės inhibitorius z-Vad-fmk nesutrukdė šikonino sukeltai ląstelių žūčiai gliomos ląstelėse 14 . Todėl šio tyrimo rezultatai papildomai patvirtina, kad šikoninas sukelia gliomos ląstelių nekroptozę.

Pranešama, kad RIP1 inicijuoja nekroptozę, jungdamasis su RIP3, kad susidarytų nekrozoma, kurioje RIP3 aktyvuojama RIP1 22 . Ankstesni tyrimai parodė, kad RIP1 ir RIP3 prisideda prie gliomos ląstelių nekrozės, kurią sukelia fotodinaminė terapija arba radiacijos terapija 24, 25 . Be to, kai kurie cheminiai reagentai, tokie kaip edelfozinas ir 5-benzilglicinil-amiloridas, sukelia gliomos ląstelių nekroptozę per RIP1 / RIP3 kelią 26, 27 . Dabartiniame tyrime mes nustatėme, kad RIP1 inhibitorius Nec-1 ir RIP3 inhibitorius GSK-872 ne tik susilpnino šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekroptozę, bet ir užkirto kelią shikonino sukeltai nuo dozės priklausomai RIP1 ir RIP3 reguliacijai. Taigi šie rezultatai leidžia manyti, kad šikoninas sukelia gliomos ląstelėse nuo RIP1 / RIP3 priklausomą nekroptozę.

Nustatyta, kad ROS yra nekroptozės vykdytojas 6, 28 . Jis gali pulti tarpląstelines makromolekules, įskaitant baltymus, lipidus ir nukleorūgštis 29 . Kaupiami įrodymai rodo, kad RIP1 arba RIP3 gali reguliuoti ląstelių ROS lygį skirtingais keliais. RIP1 nukreipia NADPH oksidazę 1 NOX1 ir mažąją GTPazės RAC1, kad padidintų ROS gamybą plazmos membranoje 30 . RIP3 sąveikauja su mitochondrijų baltymu GLUD1 ir jį aktyvuoja, kad padidėtų mitochondrijų superoksido ir tarpląstelinės ROS 31 lygis . Nuosekliai stebima, kad šikoninas padidina tarpląstelinį ROS lygį nukreipdamas tiek NOX1, tiek kompleksą mitochondrijų kvėpavimo grandinėje 32 . Dabartiniame tyrime šikonino sukeltos gliomos ląstelių nekrozė buvo susilpninta esant MnTBAP, kuris slopina mitochondrijų superoksido ir tarpląstelinių ROS lygius, tačiau buvo sustiprintas iš anksto apdorojant rotenonu, kuris skatina mitochondrijų superoksido ir ląstelių ROS susidarymą. Anksčiau mes taip pat pranešėme, kad ROS slopinimas antioksidantu NAC susilpnino šikonino sukeltą nekrozę gliomos ląstelėse 14 . Taigi ROS yra paskesnis RIP1 ir RIP3 signalas ir šikonino sukeltos nekroptozės vykdytojas gliomos ląstelėse.

Pabrėžėme, kad ROS slopinimas MnTBAP sumažino RIP1 ir RIP3 baltymų lygius ir sušvelnino jų sąveiką gikonomos ląstelėse, apdorotose shikoninu. Priešingai, padidėjęs ROS su rotenonu ne tik padidino RIP1 ir RIP3 raišką, bet ir palengvino RIP1 / RIP3 nekrozų formavimąsi. Nuosekliai naujausi tyrimai rodo, kad ROS vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant RIP1 ir RIP3 raišką ir jų tarpusavio ryšį. Naudodamos žmogaus FADD trūkumą turinčias Jurkat ląsteles, užkrėstas BV6 / TNFα, Schenk ir kt . Nustatė, kad RIP1 / RIP3 nekrosomą stabilizavo ROS 33 . Panašiai pranešta, kad ROS skatina RIP1 ir RIP3 sąveiką gliomos ląstelėse, kurias pabrėžia fotodinaminė terapija 34 . Be to, RIP1 ir RIP3 sąveika, sukelta gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelių hipoksijos, buvo sušvelninta, kai ROS sušvelnino BHA 35 . Tačiau nekroptozės signalų baltymų lygis taip pat turi įtakos nekrozomos surinkimui, nes RIP3 numušimas su siRNR užkirto kelią nekrozomos surinkimui žievės neuronuose, kurį sukėlė deguonies gliukozės trūkumas ir gydymas kaspazės inhibitoriumi z-VAD 36 . Todėl ROS reguliuoja shikonino sukeltą nekrozomų rinkinį daugiausia dviem būdais: padidindama RIP1 ir RIP3 baltymų lygį ir sustiprindama jų sąveiką. Tai taip pat rodo, kad shikoninas sukelia teigiamą grįžtamąjį ryšį tarp ROS ir nekroptozės signalų.

Nors mes netyrėme, kodėl ROS pagerina RIP1 ir RIP3 sąveiką, Zhang ir kt. Pranešė, kad ROS suaktyvino RIP1 autofosforilinimą 161 serino liekane (S161), o Cho ir kt. Nustatė, kad sąveika tarp RIP1 ir RIP3 stabilizavosi, kai jie buvo fosforilinti 37, 38 . Dabartiniame tyrime mes nustatėme, kad gydymas rotenonu padidino RIP1 ir RIP3 išraišką (5A pav.), Tačiau RIP1 inhibitorius Nec-1 nesutrukdė rotenono sukeltos gliomos ląstelių mirties (4E pav.). Panašiai Xu ir kt. Pranešė, kad Nec-1 neturėjo apsauginio poveikio laisvųjų radikalų sukeltai ląstelių mirčiai, kurią sukelia vandenilio peroksidas arba menadionas HT-22 ląstelėse 39 . Taigi mes manome, kad ROS savaime negali suaktyvinti RIP1 gliomos ląstelėse, o veikiau dalyvauja kituose įvykiuose, kurie reguliuoja RIP1 aktyvaciją šikonino sukeltos nekroptozės proceso metu.

Pabaigoje mes parodėme, kad RIP1 ir RIP3 reguliuoja šikonino sukeltą gliomos ląstelių nekrozę, padidindami ląstelių ROS ir mitochondrijų superoksidą, o tai pagerina šikonino sukeltą RIP1 ir RIP3 ekspresijos padidėjimą ir RIP1 / RIP3 nekrozų formavimąsi.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildoma medžiaga S1 pav

    Reprezentatyvūs šikonino sukeltų morfologinių pokyčių vaizdai, užfiksuoti perdavimo elektronų mikroskopu.

  2. 2.

    Papildoma medžiaga S2 pav

    (A) Šikonino sukeltų RIP1 ir RIP3 baltymų lygio pokyčių statistinė analizė per 2 inkubacijos valandas.

  3. 3.

    Papildoma medžiaga S3 pav

    (A ir B) SHG-44 ląstelių tipiniai fluorescenciniai mikroskopiniai vaizdai, aptikti atitinkamai mitochondrijų superoksido zonde Mitosox Red ir ROS zonde DCFH-DA (20x).

  4. 4.

    Papildoma medžiaga S4 pav

    (A) Reprezentatyvūs SHG-44 ląstelių vaizdai fluorescenciniu mikroskopu parodė, kad MnTBAP išankstinis gydymas sušvelnino rotenono sukeltą mitochondrijų superoksido (20x) gamybą.

  5. 5.

    Papildoma medžiaga S5 pav

    (A) Šikonino sukeltų RIP1 ir RIP3 padidėjusių reguliavimo ląstelėse, apdorotų rotenonu, statistinė analizė.

    Papildomą informaciją galima rasti „Acta Pharmacologica Sinica“ svetainėje.