Signalo sekos sukeltos konfigūracijos pokyčiai signalo atpažinimo dalelėje | gamtos komunikacijos

Signalo sekos sukeltos konfigūracijos pokyčiai signalo atpažinimo dalelėje | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Tarpląsteliniai signaliniai peptidai ir baltymai
  • Molekulinė konformacija
  • Baltymų lankstymas
  • Struktūrinė biologija

Anotacija

Taikymas į ko-transliacinius baltymus yra būtinas, evoliuciškai konservuotas būdas pristatyti besiformuojančius baltymus į tinkamą ląstelės membraną. Tokiu būdu signalo atpažinimo dalelė (SRP) pirmiausia atpažįsta besiformuojančių baltymų N-galinę signalo seką ir vėliau sąveikauja su SRP receptoriais. Dėl to signalo sekos surišimas SRP54 M domene turi būti veiksmingai perduodamas SRP54 NG domenui, kuris sąveikauja su receptoriais. Čia pateikiame 2, 9 Å nesusiejamų ir signalų sekų surištų SRP formų kristalų struktūrą, kurios abi yra asimetriniame vienete. Struktūros pateikia surišto surišimo ir sulankstymo mechanizmo įrodymą, kuriame signalo sekos surišimas sukelia suderintą GM linkerio spiralės, piršto kilpos ir C-galo alfa spiralės αM6 sulankstymą. Šis mechanizmas leidžia pasiekti aukštą rišamosios vietos struktūrinį pritaikomumą ir rodo, kaip signalo sekos surišimas M domene yra susietas su NG domeno išdėstymu.

Įvadas

Signalo atpažinimo dalelė (SRP) kryžminiu būdu nukreipia baltymus į endoplazminį retikulumą eurkariotuose arba į plazmos membraną prokariotuose. Pradėdamas žingsnį, SRP jungiasi su besiformuojančių sekrecinių arba membraninių baltymų N-galine signalo seka, kai jie atsiranda iš ribosomos. Tada SRP-ribosomų besiformuojančios grandinės kompleksas (RNC) nukreipiamas į membraną per GTP priklausomą sąveiką su SRP receptoriais (SR). Signalo seka išleidžiama iš SRP ir įterpiama į translokono kanalą. Galiausiai, GTP hidrolizė sukelia SRP atsiribojimą nuo SR, ir SRP gali pradėti kitą taikymo baltymui ciklą (apžvalgą žr. Nuorodose 1, 2).

SRP sudėtis skiriasi trijose gyvenimo srityse. Tačiau evoliuciškai konservuota SRP šerdis apima tik SRP54 baltymą (bakterijose vadinamą Ffh), sujungtą su bendraašiais sudedamomis SRP RNR 5 ir 8 spiralėmis. Būtent šis SRP branduolys atlieka pagrindines signalo sekų atpažinimo ir SR sąveikos funkcijas.

SRP54 apima N-galo NG domeną ir C-galo metionino turtingą M domeną. NG domenas apima GTPazės aktyvumą ir sąveikauja su SR 3, 4 . M domenas įtvirtina SRP54 ant SRP RNR ir turi 5, 6, 7, 8 signalo seką rišančią vietą. NG ir M domenai yra sujungti ilgu ir lanksčiu GM jungikliu, kuris leidžia pertvarkyti M ir NG domenų santykines padėtis 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14 . Biocheminiai tyrimai rodo, kad signalo sekos prisijungimas prie M srities pagreitina nuo GTP nepriklausomą sąveiką tarp NG domeno ir SR ties spiralės 8 tetraloopu 15, 16 . Šiame „ankstyvajame“ komplekse vyksta nuo GTP priklausomi struktūriniai pokyčiai, kurie lemia „uždarą“ ir stabilų kompleksą. Didelio masto uždarojo komplekso pertvarkymas į spiralę 5 lemia GTPazės aktyvaciją ir signalo sekos išleidimą 11, 16, 17, 18 . Esminė SRP RNR veikia kaip pastolis tarpininkaujant pertvarkymams; jis taip pat reikalingas efektyviam GTPazės aktyvavimui 11, 17 .

Nuo SRP priklausomos N-galinio signalo sekos yra labai įvairios aminorūgščių sudėties ir ilgio, tačiau visos jos turi mažiausiai aštuonių iš eilės hidrofobinių aminorūgščių branduolį, kuris veikia kaip pagrindinis veiksnys, atpažįstantis pagal SRP 19, 20 . Be to, signalo sekos N-terminale paprastai yra teigiamai įkrautų liekanų, kurių funkcija dar nėra žinoma.

Dviejų archeologinių SRP54-signalo sekų sintezės baltymų kristalų struktūros pateikė pirmuosius išsamius M srities ir signalo sekos sąveikos vaizdus. M domeną sudaro penki amfipatiniai α-spiralės (αM1-5) ir „piršto kilpa“ tarp αM1 ir αM2 (nuoroda 7). Kristalų struktūrose matomos skirtingos signalo sekos orientacijos. Sulfolobus solfataricus SRP54 komplekse su mielių dipeptidino aminopeptidazės B (DPAP-B) 5 signalo seka, signalo seka jungiasi į griovelį, kurį sudaro αM1, αM2 ir αM5; jis išdėstytas maždaug antiparaleliai αM5. Methanococcus jannaschii SRP54 ir signalo sekos, imituojančios 6, komplekso signalo seka yra statmena αM5. Ten jis surištas negiliu grioveliu, kurį sudaro αM1, αM5 ir GM linkerio spiralė (papildomas 1 pav.). Pagrindinis abiejų kristalografinių modelių trūkumas yra tas, kad SRP54 M domenas yra kompleksiškas su signalo seka iš kito SRP54 baltymo asimetriniame vienete. Dėl to nefiziologiškai SRP54 dimerizuojasi tiek tirpale, tiek kristaluose 5, 6 .

Ryšys tarp M ir NG sričių yra labai svarbus SRP funkcijai. Taikant baltymus, signalo sekos surišimas M domene turi būti veiksmingai perduodamas NG domenui, kad paspartėtų jo sąveika su SR. Šiuo metu nėra suprantamas molekulinis mechanizmas, kuriuo signalo seka stimuliuoja NG domeno ir SR komplekso jungimą. Norėdami tai išspręsti, atlikome M. jannaschii SRP ir jo sąveikos su signalų sekomis struktūrinius tyrimus. Čia pateikiame monomero SRP kristalų struktūrą, įskaitant viso ilgio (fl) M domeną komplekse su signalo seka. Ši struktūra parodo, kaip signalo sekos surišimas M domene yra tiesiogiai susijęs su NG domeno persigrupavimu per indukuotą GM jungiklio spiralės formavimąsi.

Rezultatai

Pilno ilgio SRP54 signalo sekos sintezė yra monomerinė

M-domeno aminorūgščių seka nuo C-galo iki αM5 svyruoja priklausomai nuo rūšies ilgio ir sudėties, tačiau yra visuose SRP54 baltymuose 21 . Remiantis kryžminimo 22 ir krioelektrono mikroskopijos tyrimais 14, C-galo liekanoms siūloma atlikti signalų sekos jungimąsi. Šios liekanos, kurios yra ištrintos daugumoje kristalizavimui naudojamų SRP54 konstrukcijų, yra lanksčios laisvo Pyrococcus furiosus SRP54 kristalų struktūroje (nuoroda 23). SRP54 baltymuose, esančiuose SRP54 signalo sekos suliejimo (SRP54-ss) 5, 6 kristalinėse struktūrose, taip pat nėra liekanų, esančių αM5 C-terminale. Mes iškėlėme hipotezę, kad nurodytą SRP54-ss 5, 6 dimerizaciją sukelia C-galo alifatinės sekos nebuvimas. Norėdami tai patvirtinti, mes klonavome ir išreiškėme viso ilgio (fl) SRP54 baltymą iš M. jannaschii (aa1-451), susiliejusį su stipriai hidrofobine idealizuota signalo seka, apimančia 14 leucino ir alanino liekanų 6, 24 (1a pav.). SRP54 C-galas ir signalo seka baltymo konstrukte buvo atskirti 9 aa ilgio glicino / serino jungtimi, kad signalo seka galėtų tinkamai prisijungti prie M srities. Fl-SRP54-ss baltymas buvo identiškas anksčiau praneštam SRP54-ss baltymui 6, išskyrus M. jannaschii SRP54 20 C-galo aminorūgščių įtraukimą. Dydžio išskyrimo chromatografija parodė, kad fl-SRP54-ss, bet ne SRP54-ss 6, tirpale buvo monomerinės formos (papildomas 2 pav.).

Image

( a ) C-galo aminorūgščių seka M. jannaschii fl-SRP54 ir fl-SRP54-s. Spalvų kodas yra toks: M sritis (žalia); glicino / serino jungiklis (pilkas); ir signalo seka (raudona). ( b ) SRP – SR kompleksų GTPazės normos, nustatytos atliekant daugybines apyvartos reakcijas. Parodytos SRP kreivės, kuriose yra fl-SRP54 (mėlyna) arba fl-SRP54-s (raudona), ir fl-SRP54-s, jei nėra SRP RNA-SRP19 (juoda). c ) reprezentatyvios „Biacore“ jutiklių schemos, parodančios ankstyvojo SRP – SR komplekso stabilizavimąsi signalų seka. Imobilizuota SR buvo patikrinta, ar nėra GTP, su SRP, turinčiu fl-SRP54 (1 μM, mėlyna ir 0, 5 μM, šviesiai mėlyna) arba fl-SRP54-s (1 μM, raudona ir 0, 5 μM, šviesiai raudona).

Visas dydis

Signalo sekos buvimas pagreitina SRP – SR sąveiką ir todėl daro akivaizdų stimuliuojantį poveikį SRP – SR komplekso GTPazės reakcijai 6, 16, 24, 25, 26 . Norėdami patikrinti „fl-SRP54-ss“ funkcionalumą, mes rekonstravome M. jannaschii SRP šerdies kompleksus, apimančius SRP54, SRP19 ir SRP RNR. Kaip ir tikėtasi, mes pastebėjome, kad SRP kompleksai, kuriuose yra fl-SRP54-ss, stimuliavo GTP hidrolizę ∼ 20 kartų greičiau nei SRP kompleksai, kuriuose yra SRP54-s (1b pav.). Be to, naudojant paviršiaus plazmoninį rezonansą (Biacore), mes nustatėme, kad signalo seka stabilizavo nuo GTP nepriklausomo ankstyvojo NG domeno – SR tarpinio junginio susidarymą (1c pav.), Kaip tai matyti ir E. coli SRP 16, 24 . Taigi, biocheminiai duomenys parodė, kad signalo seka, sujungta su fl-SRP54, imitavo funkcinę signalo seką ir kad jungiamoji sritis nepaveikė pagrindinių SRP54 funkcijų. Taigi „fl-SRP54-ss“ pateikė paprastą ir tinkamą modelio sistemą signalo sekų atpažinimo struktūrinei analizei.

Asimetriniame bloke yra dvi M srities konfigūracijos

Trijų fl-SRP54-ss, SRP19 ir SRP RNR M. jannaschii komplekso kristalai difrakcionuojami tik iki mažos skyros. Ankstesniuose SRP54 struktūriniuose tyrimuose buvo nustatytas vyrių regionas (LGMGD aa294-298), esantis tarp NG domeno ir GM jungiklio, kuris leidžia tam tikru laipsniu NG domenų judėjimą 10, 12 . Norėdami pagerinti kristalų kokybę, sumažindami konformacinį nevienalytiškumą, mes suklasifikavome ir išreiškėme identišką fl-SRP54-ss konstrukciją, bet be N-galo NG domeno. Dydžio išskyrimo chromatografija patvirtino, kad ši GM linkerio-M domeno signalo sekos sintezė (aa303-475), toliau vadinama SRP54M-s, tirpale buvo monomerinė.

Optimizuoti komplekso tarp SRP54M-ss, SRP19 ir 96 nukleotidų SRP RNR ( M. jannaschii SRP RNR G142 – G237) kristalų difrakcija išsiskyrė iki 2, 9 Å skyros. Šie kristalai priklausė kosmoso grupei P22 1 2 1, o asimetriniame bloke yra du kompleksai. Struktūra buvo išspręsta molekuliniu pakeitimu (1 lentelė). Sudėtingoje struktūroje SRP19 jungiasi su RNR 6 ir 8 sraigtų tetraloop regionais, o SRP54 M domenas jungiasi su simetrinėmis ir asimetrinėmis kilpomis 8 spiralėje, kaip anksčiau buvo pranešta 6, 9 . Du asimetrinio bloko kompleksai, čia vadinami A ir B kompleksais, rodo gerai apibrėžtą RNR, SRP19 ir liekanų, esančių nuo αM1 iki αM5, elektronų tankį, išskyrus piršto kilpą. Šie likučiai sudaro M domeno šerdį ir turi RNR jungimosi motyvą. Kompleksuose A ir B RNR ir SRP19 reikšmingų skirtumų nėra. M domeno šerdžių struktūros taip pat iš esmės yra vienodos. Iš tikrųjų ši M domeno dalis yra gana nelanksti, tai patvirtina palyginti žemi B faktoriai. Tačiau yra ryškus skirtumas tarp A ir B komplekso elektronų tankio žemėlapių, susijusių su GM jungtimi, piršto kilpa ir C galine seka (papildomas 3 pav.). Komplekse A šie elementai yra labai lankstūs ir negali būti modeliuojami, o komplekse B jie yra išdėstyti (2 pav.). Konformacija priklauso nuo to, ar SRP komplekse yra signalo seka, ar ne.

Pilno dydžio lentelė

Image

Du asimetrinio mazgo kompleksai yra parodyti kaip juostos atvaizdai: ( a ) nesurišta forma (kompleksas A) ir b ) signalo sekos surišta forma (kompleksas B). Spalvų kodas yra toks: GM jungiklis (mėlynas), M sritis (žalia), signalo seka (raudona), SRP19 (geltona) ir SRP RNR (oranžinė).

Visas dydis

Apribojimų ir signalo sekų ribojamos SRP konformacijos

Kai mes vadiname kompleksu A, signalo seka nėra ribojama. Tuo pačiu metu likučiai GM jungiamojoje dalyje (M303-I318), piršto kilpoje (K346-H364) ir C-galo seka (K431-G451) yra struktūriškai neapibrėžti (2a pav.). Šioje nesurištoje formoje M domeną sudaro penkios spiralės (αM1 – αM5), kurių struktūros ir erdvinis išdėstymas yra identiški B komplekse ir ankstesnėse M. jannaschii SRP struktūrose 6, 9 . Komplekso A paviršiuje yra tik seklus ir trumpas hidrofobinis griovelis, sudarytas daugiausia iš nepolinių likučių iš αM1 (L328 – M341) ir αM5 C galinės dalies (T419 – K429).

Komplekse B signalo seka sudaro keturių posūkių α-spiralės struktūrą, giliai įterptą į griovelį, kurį sudaro GM jungiklis, αM1, piršto kilpa, αM5 ir C-galinė seka (2b pav.). GM jungiklis priima α-spiralinę struktūrą (αGM, A306-M322), kuri yra orientuota signalo sekos spiralės atžvilgiu, kai skersinis kampas yra ∼ 30 ° (3 pav.). ΑGM jungiklis kartu su statmenai nukreipta αM5 C galine dalimi sudaro griovelio dugną. ΑM1 ir piršto kilpa (G342-L365) sudaro vieną griovelio pusę. Priešingą pusę sudaro M domene esančios 20 C-galinių aminorūgščių (K431-G451). Šios liekanos sudaro 3 apsisukimų α-spiralės struktūrą (αM6, P438-L446), einančią priešingai nei signalo seka. Pagalbinės αM5 ir αM6 yra sujungtos 90 ° kampu ties G430 liekana. Iš viso šie penki struktūriniai elementai - αGM, αM1, piršto kilpa, αM5 ir αM6 - sukuria maždaug 20 Å gylio ir 25 Å ilgio hidrofobinį griovelį, atidengdami ∼ 1500 Å 2 paviršiaus ploto (4 pav.). ΑM6 beveik neturi jokio kontakto su αGM, o αGM iš jo daro palyginti mažai sąveikų su αM1. Šios silpnos tarpusavio sąveikos rodo, kad signalų seką rišantis paviršius yra gana lankstus ir leidžia pasiekti aukštą struktūrinio plastiškumo laipsnį: rišamosios vietos likučių šoninės grandinės paprastai turi silpnesnį elektronų tankį ir didesnius B faktorius nei likusios. M sritis.

Image

Parodytas nesusietų ( a ) ir surištų ( b ) signalų sekų elektronų tankio žemėlapis. Kad būtų išvengta modelio paklaidų, signalo seka ir GM jungiklis buvo pašalinti iš koordinačių bylos, kuri buvo patikslinta prieš žemėlapio skaičiavimus. Šviesiai mėlynos spalvos akys yra 2mFo – DFc tankio, kontūruotos ties 0, 5 σ . Tamsiai mėlynos akys yra mFo – DFc tankis esant + 2, 5 σ (šioje srityje nėra tankio esant – 2, 5 σ ). Patikslinti C ir D grandinių modeliai pavaizduoti atitinkamai kaip žalios ir žalsvai briaunotos juostelės; signalo seka raudona juosta; ir GM jungiklis mėlyna juostele. c ) Sąveika signalų sekos rišimo vietoje komplekse B. Konservuoti GM linkerio hidrofobiniai likučiai (rodomi kaip lazdelės) yra išdėstyti vienoje spiralės pusėje, o jų šoninės grandinės nukreiptos į signalo seką. Taip pat parodyta teigiamai įkrauto lizino liekana K461 signalo sekos N gale. Ši liekana yra šalia dviejų konservuotų rūgščių liekanų GM jungtyje. ΑM6 spiralė buvo pašalinta iš b ir c paveikslų, kad būtų aiškumas.

Visas dydis

Image

Signalų sekos ( a ) ir nesurištos ( b ) M. jannaschii M srities konstantų elektrostatinis paviršiaus vaizdas. Abi struktūros parodytos tomis pačiomis kryptimis. Signalo seka rodoma kaip raudonas kirminas.

Visas dydis

Įrišimo griovelyje nepolinės liekanos sudaro ištisinį hidrofobinį paviršių. Hidrofobinis griovelio pobūdis yra išsaugotas M domenuose nuo archaea ir bakterijų, tačiau sekos tapatumas nėra (papildomas 4 pav.). Konservuoti hidrofobiniai likučiai, pamušantys griovelį, yra: T314, I318, I321 ir M322 αGM; I338 ir M341 αM1; M344, I347, L348, M350, I351 ir L362 pirštų kilpoje; T420, A423, I424 ir L427 αM5; ir L439, I442 ir M443 αM6. Iš šių liekanų 16 dalyvauja plačioje hidrofobinėje sąveikoje su signalo seka. Tiesą sakant, visos 14 aminorūgščių, esančių signalo sekoje, užmezga van der Waal kontaktus su hidrofobinių griovelių liekanomis. Iš viso rišantysis griovelis užima 65% signalo sekos paviršiaus ploto, kuris atitinka 980 Å 2 . Prie to prisideda 27% pirštų kilpos, 24% αGM, 18% αM1, 17% αM6 ir 14% αM5.

Piršto kilpos nepavyko atsekti ankstesnėje M. jannaschii SRP54-ss dimerio 6 struktūroje, tikriausiai dėl SRP54 dimerizacijos. Mūsų monomerinėje SRP54M-ss struktūroje visą pirštų kilpą galima modeliuoti pagal elektronų tankį. Trumpa spiralė αMF (P359-L365) piršto kilpos C galinėje dalyje yra gerai išdėstyta. Likę 17 pirštų kilpų likučių (G342-M358) tarp αM1 ir αMF įgauna atsekamą, bet lanksčią išplėstos kilpos struktūrą dviem trumpais spiraliniais posūkiais. Mes darome išvadą, kad šis regionas, priimdamas signalo sekas, nepriima griežtos struktūros.

Nors poliniai ir įkrauti likučiai yra beveik visiškai pašalinti iš rišamojo griovelio, ryškus neigiamai įkrautas paviršiaus pleistras yra prie hidrofobinio griovelio „išėjimo“ αGM N gale (4 pav.). Čia konservuotos rūgštinės liekanos (E307, D311) yra palankiose vietose, kad per elektrostatinę sąveiką jos sąveikautų su teigiamai įkrautomis liekanomis signalo sekų N-gale.

Diskusija

Šiame tyrime mes pateikiame SRP RNR komplekso, SRP19, kristalinę struktūrą ir M. -jannaschii susietą „fl-SRP54 M“ signalo sekos sintezę. Kristalą asimetriniame bloke turėjo dvi SRP komplekso kopijos. Įdomu tai, kad du M domenai atitinkamame SRP komplekse priėmė reikšmingai skirtingas konfigūracijas, kurios reiškė signalo seką, nesusietą (kompleksas A) ir surištas (sudėtingas B) M srities. Ši kristalų pakuotė geriausiai paaiškinama kristalų pakavimo sąveika, būdinga tik kompleksui A, kuris šioje vietoje pasirinktinai supakuoja tik nesusietas daleles į kristalų tinklelį. Tai suteikė mums unikalią galimybę tiesiogiai palyginti nesusietų ir su signalo seka susietų formų fl-SRP54 M domeno struktūras.

Nesurištoje formoje (kompleksas A) M domeną struktūriškai apibūdina tik jo pagrindiniai elementai, tai yra αM1-αM5, išskyrus piršto kilpą. M domeno šerdis yra nelanksti ir nepakitusi nuo esančių B komplekse ir anksčiau nustatytose M. jannaschii SRP struktūrose 6, 9 . Be pirštų kilpos, netvarkingas yra ir GM jungiklis bei C-galo liekanos, o tai patvirtino, kad signalo sekos rišimo vieta yra tik iš dalies suformuota 9 . Kaip matyti komplekse B, signalo sekos surišimas sukėlė suderintą GM jungiklio, piršto kilpos ir C-galo sulankstymą taip, kad jie kartu su αM1 ir αM5 sukūrė didelį U formos ištisinį hidrofobinį paviršių, kuris apima tris surišto signalo sekos puses (4 pav.). Šis sukeltas tinkamas surišimas yra biologiškai reikšmingas, nes atpažinimo elementų būdingas lankstumas kartu su indukuotu sulankstymu gali užtikrinti aukštą struktūrinio pritaikomumo laipsnį. Tai turėtų palengvinti labai skirtingų signalų sekų specifinį atpažinimą. Signalo seką rišančio griovelio plastiškumas papildomai palaikomas santykinai nedaug atpažinimo elementų sąveikos. Kadangi SRP funkcija yra evoliuciškai išsaugota, mes tikimės, kad šis atpažinimo mechanizmas bus taikomas SRP iš kitų gyvenimo sričių. Tai patvirtina biocheminiai ir struktūriniai įvairių rūšių ligandų, neturinčių ligandų, duomenys iš skirtingų rūšių, rodančių, kad GM jungtis, piršto kilpa ir C-galas yra lankstūs arba užfiksuoti kintama formacija kristaliniais kontaktais 7, 8, 10, 23 . Komplekse B GM jungiklio, piršto kilpos ir αM6 struktūros nepalaiko kristalų kontaktų.

Turimi tik riboti SRP54 C-galo struktūriniai duomenys, o jo vaidmuo jungiant signalų sekas nėra išaiškintas. Čia parodome, kad C-galas M. jannaschii įgauna α-spiralės (αM6) formą ir apsaugo signalo seką nuo tirpiklio. M. jannaschii SRP54-ss, kuriam trūksta C-galo, 6 tirpale sudaro maždaug 1: 1 santykiu monomerus ir dimerus. Surinkta į SRP kompleksus, monomerinė forma nespartina SR sąveikos ir neskatina GTP hidrolizės, parodydama, kad SRP funkcijai reikia C-galo (papildomas 5a, b pav.). Tačiau dimerinė forma rodo stipriai padidėjusį aktyvumą. Įdomu tai, kad dimerio 6 struktūroje su simetrija susijusi signalo sekos spiralė yra išdėstyta panašiai kaip C-galas SRP54M-s. Tai riboja signalo seką rišimo vietoje ir taip paaiškina jo išgelbėtą aktyvumą (papildomas 5c pav.).

SRP54-ss ir SRPM-ss struktūrų superpozicija parodo beveik identišką surišto signalo sekos orientaciją, palyginti su αGM ir M domeno šerdimi. Be to, tuos pačius kontaktus užmezga signalų seka su hidrofobinėmis liekanomis αGM ir αM1. Kai kurių iš šių liekanų svarba SRP funkcijai patvirtina mutacijų analizė 6 . Signalų sekų rišimo vieta, stebėta M. jannaschii , skiriasi nuo tų, kurios matomos S. solfataricus SRP54-ss 5 kristalų struktūroje ir E. coli SRP – RNC komplekso krioelektroninės mikroskopijos struktūrose 12, 14 . Šiose struktūrose signalo seka yra orientuota maždaug antiparalleliai αM5 (papildomas 1 pav.). Palyginus M. jannaschii ir S. solfataricus jungimosi vietas, matyti, kad kai kurie hidrofobiniai kontaktai yra išsaugoti, pavyzdžiui, I338 (L339 S. solfataricus ) αM1, o T420 (M424) ir I424 (L428) αM5. Skirtingos rišimosi vietos galėtų parodyti atskirus rišimo būdus, kurie atsiranda atpažinimo įvykio metu. Šis aiškinimas gerai sutinka su naujausiais duomenimis, įrodančiais, kad SRP jungiasi su RNC su paveiktomis signalo sekomis daugybėje tarpusavyje besikeičiančių konformacijų 27 . Padarius kompleksą B ant E. coli SRP – RNC komplekso ribosomos 12, 14, parodyta, kad jis tinkamas be sterilių susidūrimų (papildomas 6 pav.).

Paeiliui įvykius per SRP ciklą reikia pakeisti NG ir M domenų santykinę padėtį 11, 12, 14, 17, 18, 28 . Čia parodome, kad prisijungus prie signalo sekos, GM linkeris susilydo į tvarkingą α-spiralę (αGM). Šis αGM yra neatsiejama visos surišimo vietos struktūrinė dalis ir užmezga tiesioginį ryšį su signalo seka (3c pav.). ΑGM seka αGM spiralės kelią dimerio struktūroje 6 . Pastarojoje struktūroje NG sritis yra pasisukusi 180 °, palyginti su savo padėtimi laisvoje formoje, todėl GTPazės domenas yra arti spiralės 8 galo (nuorodos 6, 9). Mes darome išvadą, kad signalo sekos sukeltas αGM sulankstymas yra pagrindinis įvykis, tiesiogiai jungiantis ligando surišimą su NG domeno persigrupavimu. Mes spėjame, kad šis lankstymo įvykis įgyvendina αGM orientaciją, kuri predisponuoja NG domeną sąveikai su SR, kad susidarytų ankstyvasis NG domeno – SR kompleksas spiralės 8 tetraloopoje (1c pav. Ir 6 ref.). GTP hidrolizė ir signalo sekos išsiskyrimas įvyksta po to, kai uždaras NG domeno – SR kompleksas persikelia į 5 spiralę (nuorodos 11, 17, 18). Signalo sekos išleidimo būsenoje αGM nukreiptas toliau nuo M srities 11 . Ši αGM orientacija nesuderinama su signalo sekos rišimu, kaip matyti komplekse B. Todėl įsivaizduojama, kad NG domeno – SR persikėlimas į spiralę 5 skatina surišti griovelį ir tokiu būdu paveikti signalo seką signalo sekai išlaisvinti.

Ligando surišimo susiejimas ir atpažinimo srities sulankstymas M domene (įskaitant kritinį GM jungiklį) suteikia paprastą ir veiksmingą mechanizmą signalo sekos atpažinimui M domene perduoti NG domenui. Be to, mes siūlome, kad signalo sekos atpažinimas per daugelio struktūrinių elementų perėjimą prie tvarkos pagal eiliškumą palengvintų labai skirtingų signalų sekų specifinį atpažinimą. Būsimi struktūriniai tyrimai su skirtingos sudėties ir ilgio signalų sekomis bus reikalingi, kad būtų galima susidaryti išsamesnį vaizdą apie tai, kaip SRP ribojasi.

Metodai

Baltymų ir RNR gamyba, kompleksavimas ir kristalizavimas

M. jannaschii srp19 genas buvo klonuotas į pET-3a vektorių (Novagen) ir ekspresuotas JM109 (DE3) ląstelėse (Promega). SRP19 baltymas buvo išgrynintas termiškai apdorojant, po to atlikus nuoseklią kolonėlės chromatografiją Heparin Sepharose, Mono S ir Superdex 75 (GE Healthcare). M. jannaschii fl-SRP54, fl-SRP54-ss, SRP54-ss ir SRP54M-ss DNR seka buvo klonuota į pNZ8048 vektorių ir išreikšta Lactococcus lactis . SRP54 baltymai buvo išgryninti termiškai apdorojant ir atlikus nuoseklią kolonėlių chromatografiją Heparin Sepharose, Mono S ir Superdex 200 (GE Healthcare). M. jannaschii SRP RNR buvo transkribuota in vitro naudojant T7 RNR polimerazę ir išgryninta denatūravimo gelio elektroforeze. Prieš formavimąsi, RNR buvo atkaitinama vandenyje denatūravus 75 ° C temperatūroje, po to greitai aušinant ledu. Atkaitinta RNR buvo išgryninta Mono Q (GE Healthcare) ir dializuota prieš 10 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 5 mM MgCl2. Baltymų-RNR kompleksas buvo ištirpintas buferiniame tirpale, kuriame yra 10 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 250 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% (v / v) ß-merkaptoetanolio. Įrišimo reakcijos buvo inkubuojamos 15 minučių kambario temperatūroje, pridėjus SRP19, ir 1 valandą, esant 37 ° C, pridėjus SRP54. Po to kompleksas buvo išgrynintas Mono Q kolonėlėje ir dializuotas prieš 10 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 250 mM KCl, 5 mM MgCl2. Kompleksas (3 mg / ml) buvo kristalizuotas garų difuzijos būdu kabant lašais 18 ° C temperatūroje. Kristalai (0, 15 × 0, 15 × 0, 05 mm 3 ) išaugo per 7 dienas, kai sudėtingas tirpalas buvo sumaišytas su tokiu pat tūriu motininio tirpalo, kuriame yra 35% 2-metil-2, 4-pentandiolio, 200 mM NaCl, 80 mM MgCl2, 100. mM natrio acetatas (pH 5, 0).

Duomenų rinkimas, laipsniškas sudarymas ir patikslinimas

Kristalai buvo šaldomi tiesiogiai iš motinos skysčio, o difrakcijos duomenys buvo renkami Europos sinchroninio spinduliuotės spindulio juostoje ID23-1, naudojant rentgeno spinduliuotę, kai λ = 0, 984 Å, esant 100 K. Duomenys buvo apdoroti ir išmatuoti naudojant XDS 29 ir SCALA iš CCP4 rinkinio. 30 . Duomenų rinkinių statistika pateikta 1 lentelėje. M. jannaschii SRP54M-ss, SRP19 ir SRP RNR komplekso kristalai priklausė kosmoso grupei P22 1 2 1 ir asimetriniame vienete buvo dvi molekulės. Konstrukcija buvo išspręsta molekuliniu pakeitimu, naudojant PHASER programą iš „PHENIX suite 31“ ir paieškos modelį SRP54-ss kompleksu (pdb kodas 3NDB) 6 . Elektronų tankio žemėlapis buvo gerai apibrėžtas A ir B kompleksuose SRPRNA, SRP19 ir M domeno šerdyje. Komplekse B elektronų tankis taip pat apibrėžė signalo sekos, GM jungties, piršto kilpos ir αM6 struktūras. Skiriamasis signalo sekos ir liekanų, sudarančių jos surišimo vietą, bruožas yra silpnas jų šoninių grandinių elektronų tankis, palyginti su likusiais molekulėje. Konstrukcijos buvo pastatytos ir patobulintos naudojant programas COOT 32 ir PHENIX REFINE. Konstrukcijos buvo dedamos į COOT naudojant SSM 33 . Patikslinta struktūrų statistika pateikta 1 lentelėje. Ramachandrano grafike nėra jokių modelio briaunų, o brūkšnio rezultatas yra 1. Reprezentatyvus elektronų tankis parodytas papildomame 7 pav., Stereo. Signalo sekos rišamojo griovelio prieinamas paviršiaus plotas buvo apskaičiuotas naudojant CASTp serverį 34 . 2 ir 3c bei papildomos informacijos papildomos figūros 1, 5c ir 6 yra paruoštos naudojant PyMOL 35 ; 3a, b ir 4 pav. Ir papildoma papildoma informacija 3 pav. Buvo paruošti naudojant CCP4mg 36 .

GTPazės tyrimas

Vienas mikromolis M. jannaschii SRP RNR (nukleotidai G123 – C258, apimantys spiralės 5 sritį, reikalingą GTPazės aktyvavimui 11, 17 ), 1, 5 μM SRP19 ir 0, 5 μM SRP54 buvo surinkti į rišamąjį buferį, kuriame yra 10 mM Tris-Cl ( pH 7, 5), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2 ir 1% (v / v) ß-merkaptoetanolio, kad susidarytų 0, 5 μM M. jannaschii SRP. M. jannaschii SR (aa93-408) buvo įpiltas į SRP kompleksą iki galutinės 0, 1, 2, 5, 10 ir 25 μM koncentracijos. GTP hidrolizės reakcijos, vykdomos 25 ° C temperatūroje, buvo pradėtos pridedant 100 μM GTP su nedideliais kiekiais γ- 32 P-GTP (PerkinElmer). Skirtingais laiko momentais 0, 5 μl reakcijų alikvotinės dalys buvo pastebėtos ant polietilenimino – celiuliozės plonasluoksnės chromatografijos (PEI-TLC) plokštės (Merck). Neorganinis fosfatas (P i ) ir GTP buvo atskirti chromatografijos būdu 0, 75 M KH2P04 ir kiekybiškai įvertinti naudojant „Phosphorimager“ (Molecular Dynamics). GTP hidrolizės greičiai buvo suskaičiuoti iš trijų nepriklausomų eksperimentų ir pritaikyti prie vieno eksponentinio modelio.

Paviršiaus plazmono rezonansas

Sensorgramos buvo užrašytos naudojant „Biacore 3000“ instrumentą („GE Healthcare“). Monokloninis antikliutionato-S-transferazės (GST) antikūnas buvo imobilizuotas ant CM-5 mikroschemos („GE Healthcare“) aminų jungtimi pagal gamintojo instrukcijas. Vėliau rišamieji paviršiai buvo generuojami naudojant lygiaverčius vien tik GST kiekius arba kaip etaloninį GST žymėtą M. jannaschii SR (aa93–408). Sąveikos eksperimentai buvo atlikti tekančiame buferyje, kuriame yra 10 mM Tris-Cl (pH 7, 5), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, esant 37 ° C. Išgryninti M. jannaschii SRP kompleksai į tekančią buferinę medžiagą buvo įpurškiami esant 0, 5 ir 1 μM koncentracijai, kai nebuvo GTP, o srauto greitis buvo 5 μl min- 1 . Sensorinės programos buvo pataisytos atsižvelgiant į nespecifinę sąveiką tik su GST paviršiumi ir dvigubomis nuorodomis.

Prisijungimai

Baltymų duomenų bankas

  • 4XCO
  • 4XCO 3D vaizdas

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi 1-7 paveikslai

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.