Terapija sildenafilu normalizuoja nukrypstantį metabolominį profilį preeklampsijos / vaisiaus augimo ribojimo pelės ir / arba pelės modelyje | mokslinės ataskaitos

Terapija sildenafilu normalizuoja nukrypstantį metabolominį profilį preeklampsijos / vaisiaus augimo ribojimo pelės ir / arba pelės modelyje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ligos modelis
  • Metabolomika
  • Nuspėjami žymekliai

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Preeklampsija (PE) ir vaisiaus augimo ribojimas (FGR) yra sunkios nėštumo komplikacijos, susijusios su labai padidėjusia motinos ir perinatalinio sergamumo ir mirštamumo rizika. Šias komplikacijas sunku diagnozuoti, o gydomojo gydymo nėra. Mes iškėlėme hipotezę, kad dviejų ligos modelių, katechol-O-metiltransferazės (COMT - / - ) ir endotelio azoto oksido sintazės (Nos3 - / - ) nokautuotų pelių, metabolinis parašas žymiai skirsis nuo kontrolinių C57BL / 6J pelių. Be to, mes hipotezavome, kad bet kokie COMT - / - pelių skirtumai bus pašalinti po gydymo Sildenafil, kuris gelbsti vaisiaus augimą. Tikslus, kiekybinis nėščių Nos3 - / -, COMT - / - ir C57BL / 6J pelių metabolizmo profilių palyginimas buvo atliktas naudojant rinkinį iš BIOCRATES. Tarp Nos3 - / - ir C57BL / 6J pelių (p <0, 05) ir 18 metabolitų tarp C57BL / 6J ir COMT - / - pelių (p <0, 05) buvo pastebėti reikšmingi 4 metabolitų skirtumai. Po gydymo Sildenafiliu tik 5 iš 18 anksčiau nustatytų metabolitų skirtumų (p <0, 05) liko COMT - / - pelėse. Metabolominis pelių modeliavimas yra įmanomas, gaunant parašus, kurie aiškiai skiriasi nuo kontrolinių gyvūnų. Galimas naujas gydymas Sildenafilis gali normalizuoti abejotiną metabolitinį profilį COMT - / - pelėms; kadangi šis gydymas pereina į klinikinius tyrimus, ši informacija gali padėti įvertinti galimus veikimo mechanizmus.

Įvadas

Preeklampsija (PE) ir vaisiaus augimo ribojimas (FGR) yra nėštumo komplikacijos, kurios kartu paveikia apie 10% viso pasaulio nėštumų 1, 2 . PE būdinga hipertenzijos ir proteinurijos atsiradimui po 20 -osios nėštumo savaitės, tuo tarpu FGR (kuri gali būti susijusi ar nesusijusi su PE) apibūdinama kaip vaisius, kuris nepasiekia genetinio augimo potencialo. Kartu šios komplikacijos yra pagrindinė motinos ir perinatalinio sergamumo ir mirštamumo priežastis 3, 4, 5 . Be to, mažesnis gimimo svoris yra susijęs su padidėjusia vėlesnio gyvenimo ligų, įskaitant širdies ir medžiagų apykaitos, rizika 6, 7 . Nepaisant didelių šių ligų sveikatos ir visuomenės kaštų, PE ir FGR gydymo galimybės yra ribotos ir dažnai susijusios su priešlaikiniu vaisiaus gimdymu, kuris pats kelia didelę riziką motinai ir vaikui.

Naujų terapinių agentų, skirtų šioms nėštumo komplikacijoms, kūrimą labai sutrikdė tiek ribotos galimybės diagnozuoti PE / FGR, tiek ir tinkamų gyvūnų modelių, kuriais būtų galima išbandyti naujus gydymo būdus, trūkumas. Šių ligų etiologija yra sudėtinga ir greičiausiai daugiafaktorinė, nors abiem atvejais paprastai stebimas padidėjęs gimdos arterijos atsparumas 8 . Naujausias įdomus įvykis buvo genetiškai modifikuotų pelių, turinčių PE / FGR savybes, identifikavimas. Du iš šių modelių kelia ypatingą susidomėjimą, būtent pelė endotelio azoto oksido sintazės išmušimui (Nos3 - / - ) ir katechol-O-metiltransferazės nokauta (COMT - / - ) pelė. Pastebėta, kad azoto oksidas (NO) vaidina svarbų vaidmenį nėštumo metu, ypač tarpininkaujant tam tikroms motinos kardiovaskulinėms adaptacijoms, kurių reikia norint užtikrinti tinkamą placentos perfuziją 9, 10 ir palaikyti normalų motinos kraujospūdį 11 . Todėl nenuostabu, kad Nos3 - / - pelės nėštumo metu tyrimas parodė reikšmingą anomaliją, palyginti su laukinio tipo partneriais. Pagrindiniai stebėjimai, atspindintys kai kuriuos klinikinius ligos požymius, yra nenormalūs gimdos arterijų rekonstrukcijos 12 ir gimdos arterijų disfunkcijos 13, padidėjusi placentos hipoksija 14, 15 ir FGR 13, 15 .

Katechol-O-metiltransferazė (COMT) yra vienas iš fermentų, dalyvaujančių 17β-estradiolio metabolizme į 2- ir 4-metoksiestradiolį 16 . COMT - / - pelės nėštumo metu atlikti tyrimai parodė motinos hipertenziją ir padidėjusią proteinuriją vėlyvojo nėštumo metu 17, taip pat abejotinas bambos arterijos Doplerio bangos formas ir FGR 18 ; dar kartą parodydamas genetiškai modifikuoto pelės modelio sugebėjimą pakartoti keletą pagrindinių klinikinių ligos požymių.

Atsižvelgiant į daugiafaktorinę PE ir FGR etiologiją, yra privalumų tiriant įvairius gyvūnų modelius su skirtingais patofiziologiniais mechanizmais. Čia aprašyto tyrimo tikslas buvo išanalizuoti dviejų PE / FGR pelių modelių (COMT - / - ir Nos3 - / - pelių), taip pat kontrolinių pelių C57BL / 6J, metabolinį parašą. Mes atlikome hipotezę, kad COMT - / - ir Nos3 - / - pelių metabolominių profilių skirtumai, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, bus įrodyti.

Tinkamų gyvūnų modelių sukūrimas leido išbandyti galimus naujus gydymo būdus. Vienas iš galimų terapinės naudos turinčių gydymo būdų yra sildenafilio citratas; hipotezuojama, kad, atsižvelgiant į vazodilatacinį poveikį, gydymas sildenafilio citratu sumažins gimdos arterijų atsparumą ir sustiprins gimdos kaklelio perfuziją. Mažas tyrimas su moterimis, kurioms nustatytas sunkus ankstyvas FGR, buvo gydomos Sildenafilio citratu; šis tyrimas parodė padidėjusį vaisiaus pilvo apimties augimą, palyginti su negydytais kontroliniais preparatais19. Taip pat pastebėta, kad gydymas sildenafilio citratu normalizuoja virkštelės arterijos Doplerio bangos formas ir pagerina vaisiaus augimą COMT - / - pelės modelyje 18 . Nors buvo įrodytas teigiamas gydymo sildenafilio citratu poveikis, svarbu išsamiai suprasti jo veikimo mechanizmus, siekiant užtikrinti, kad jis būtų naudojamas saugiai ir naudingai. Atsižvelgiant į teigiamą jo biologinį poveikį COMT - / - pelės modelyje, mes taip pat hipotezavome, kad COMT - / - pelių metabolominio profilio skirtumai bent iš dalies išnyks po gydymo sildenafilio citratu; buvo įvertinti COMT - / - ir kontrolinių pelių, gydomų Sildenafilio citratu, metaboliniai profiliai.

Tokių analizių rezultatai gali suteikti papildomos informacijos apie šių modelių patofiziologinius mechanizmus ir padėti suprasti galimo gydymo būdus.

Rezultatai

Visose tirtose pelių grupėse iš viso buvo nustatyti 149 metabolitai iki MSI 1 lygio ir kiekybiškai įvertinti (išsamų identifikuotų metabolitų sąrašą žr. S1 papildomoje lentelėje internete). Nustatyti metabolitai priklausė daugybei skirtingų klasių, įskaitant acilkarnitinus, glicerofosfolipidus, sfingolipidus, aminorūgštis ir biogeninius aminus, tokius kaip kreatininas ir kyneureninas.

Visuotiniai metabolominio parašo pokyčiai

Iš pradžių kontrolinių C57BL / 6J pelių metabolominis parašas buvo lyginamas su Nos3 - / - ir COMT - / - pelių. 4 metabolitai reikšmingai pakito Nos3 - / - serume, palyginti su C57BL / 6J pelėmis (žr. Papildomą paveikslą S1 internete); Karnitino (p <0, 05), lizofosfatidilcholino acilo C26: 0 (p <0, 01), karnozino (p <0, 05) ir kreatinino (p <0, 05) koncentracijos serume buvo reikšmingai padidėjusios, palyginti su C57BL / 6J pelėmis. Palyginimui, iš viso 18 metabolitų reikšmingai pakito COMT - / - lyginant su C57BL / 6J pelėmis (p <0, 05; 1 pav., 1 lentelė); Pelių COMT - / - pelėse padidėjo daugybė glicerofosfolipidų ir sfingolipidų, o kyneurenino ir acilkarnitinų koncentracija sumažėjo.

Image

Šilumos žemėlapis, vaizduojantis statistinius skirtumus, įvertintus Kruskal-Wallis bandymu, metabolitų koncentracijose serume COMT - / - palyginti su kontrolinėmis C57BL / 6 J pelėmis arba COMT - / - pelėmis, apdorotomis Sildenafil citrate (Sc), palyginti su kontroline C57BL /. 6 J pelės. Legenda parodo spalvotus statistinius nurodytų metabolitų koncentracijų skirtumus.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Tada buvo atlikta metabolitų, kurie parodė reikšmingus serumo koncentracijos skirtumus, kanoninė variacijų analizė (CVA). Pirmojo ir antrojo kanoninių kintamųjų išskaidymo schema (2 pav.) Nusako aiškius reikšmingus daugiamatžius vidutinius skirtumus tarp skirtingų negydytų pelių modelių.

Image

Kanoninė kintamųjų analizė (CVA) buvo atlikta naudojant tuos metabolitus, kurių koncentracija serume buvo reikšmingai pakitusi (nurodyta S1 paveiksle, p <0, 05). Duomenys pateikiami kaip CV1, palyginti su Nos3 - / -, COMT - / -, C57BL / 6J pelių CV2, palyginti su CV2, kur Sc nurodo tas peles, kurios buvo apdorotos sildenafilio citratu. Analizė parodė reikšmingus metabolominio skirtumo skirtumus tarp Nos3 - / - ir COMT - / - pelių, taip pat tarp kontrolinių pelių. Tarp pelių, gydytų Sildenafilio citratu, COMT - / - ir C57BL / 6 J pelių profilių reikšmingo skirtumo nebuvo. Kietieji apskritimai = 95% pasikliovimo intervalai kiekvienos grupės populiacijai; punktyriniai apskritimai = 95% pasikliovimo intervalai kiekvienos grupės vidurkiams; juodas kryžius = kiekvienos grupės vidurkis.

Visas dydis

Gydymo Sildenafil citratu poveikis metabolomumui

Iš pradžių metabolizuotas COMT - / - pelių, gydytų Sildenafilio citratu, metabolizmas buvo lyginamas su negydytų C57BL / 6J kontrolinių pelių. Išlieka skirtumai tik 5 iš 18 reikšmingai pakitusių metabolitų (1 pav., 1 lentelė).

CVA analizė taip pat rodo, kad tiek C57BL / 6J, tiek COMT - / - pelės, gydomos Sildenafiliu, reikšmingai nesiskyrė; be to, COMT - / - pelės, apdorotos Sildenafiliu, pastebimai pasikeitė į negydytų / neapdorotų C57BL / 6J pelių grupių (2 pav.).

Kai buvo ištirti konkretūs atskirų metabolitų pokyčiai, buvo pastebėta, kad acetilkarnitino (3A pav.), Valerilkarnitino (3B pav.) Ir kinurenino (3D pav.) Koncentracijos reikšmingai sumažėjo pelėms COMT - / - lyginant su kontrolinėmis (p. <0, 05). Palyginimui, fosfatidilcholino diacilo C34: 2 (3 pav. C; p <0, 01) koncentracija reikšmingai padidėjo pelėse COMT - / -, palyginti su C57BL / 6J pelėmis. Tarp C57BL / 6J pelių ir COMT - / - pelių, gydytų Sildenafilio citratu, šių metabolitų koncentracijos serume skirtumų nebuvo (3A – D pav.; P> 0, 05).

Image

Palyginus C57BL / 6 J ir COMT - / - pelių mėginius, reikšmingas metabolitų, priklausančių daugeliui klasių, koncentracija serume. Metabolitai, kuriuos žymiai pakeitė, buvo tokie acilkarnitinai, kaip ( A) C2 (acetilkarnitinas) ir ( B) C5 (valerilkarnitinas), glicerofosfolipidai, tokie kaip ( C) PCaa C34: 2 (fosfatidilcholino diacilo C34: 2) ir ( D) . bioamino kinureninas. Šie skirtumai nebuvo reikšmingi daugumai metabolitų, kai buvo lyginami C57BL / 6 J pelių ir COMT - / - pelių, gydomų Sildenafilio citratu, mėginiai. n = 10–23, Kruskal-Wallis testas; * p <0, 05, ** p <0, 01. 'Sc' rodo, kad pelės buvo gydomos sildenafilio citratu.

Visas dydis

Diskusija

Tiek PE, tiek FGR etiologija yra sudėtinga ir greičiausiai daugialypė. Tai atspindi tiek šių abiejų ligų rizikos veiksnių skirtumai, tiek sunkumai diagnozuojant sąlygas arba kuriant galimą naują gydymą. Norėdami ištirti galimus susijusius patofiziologinius mechanizmus ir išbandyti galimus naujus gydymo būdus, mes panaudojome du pelių modelius su skirtingomis genetinėmis modifikacijomis, apie kuriuos anksčiau buvo pranešta, kad jie turi skirtingus abiejų sąlygų požymius. Pagrindinė hipotezė, siejanti du čia aprašytus modelius, yra gimdos plastinės perfuzijos sumažėjimas, atspindinti pagrindinį klinikinį ligos rodiklį 8, 20 . Čia aprašyti pelių modelių metabolominiai parašai rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontrolinėmis pelėmis.

Didelė kliūtis kuriant naujus gydymo būdus buvo tinkamų modelių, kuriais būtų galima patikrinti jų veiksmingumą, trūkumas. Gyvūnai savaime nesivysto PE, nors dabar egzistuoja daugybė modelių, kurie rodo skirtingus būklės požymius. Pavyzdžiui, sumažėjęs gimdos perfuzijos slėgio (RUPP) modelis žiurkėms rodo padidėjusį kraujo spaudimą ir proteinuriją bei sisteminę motinos endotelio disfunkciją, kurios visos būdingos PE 21, 22, 23 . Tačiau dėl nuolatinio mechaninio kraujagyslių okliuzijos sunku įvertinti gydymo veiksmingumą šiame modelyje, ypač jei šis gydymas yra skirtas pagerinti gimdos ir placentos perfuziją. Panašių sunkumų buvo patirta bandant tinkamai modeliuoti FGR. Pavyzdžiui, daugybė tyrėjų pasinaudojo motinos nepakankamos mitybos metodu 24, 25 . Tai iš tikrųjų lemia FGR, bet nenagrinėja svarbiausios klinikinės priežasties, būtent placentos nepakankamumo. Du modeliai, naudojami šiame tyrime, buvo pasirinkti, nes buvo įrodyta, kad jie turi PE ir (arba) FGR požymių, ir pagrindiniai klinikiniai požymiai, susiję su sumažėjusia gimdos ląstelių perfuzija.

Pelėje Nos3 - / - nenustatyta fermento endotelio azoto oksido sintazės (Nos3) 26 geno mutacija. „Nos3“ yra viena iš 3 izoformų, kurios katalizuoja arginino virsmą citrulinu, susidarant azoto oksidui (NO) kaip šalutiniam produktui. Neišnešiotiems gyvūnams, Nos3 - / - pelėms būdingas nenormalus širdies ir kraujagyslių fenotipas, įskaitant lengvą hipertenziją 27 ir endotelio disfunkciją 28 . Nėštumo metu NO vaidina lemiamą vaidmenį tarpininkaujant svarbioms širdies ir kraujagyslių adaptacijoms, būtinoms sėkmingam nėštumui. Todėl nenuostabu, kad Nos3 - / - pelės pademonstravo daugybę jos adaptacijos nėštumui pokyčių, palyginti su C57BL / 6J kontrolinėmis pelėmis. Pvz., Nėščiosioms motinoms yra hipertenzija tiek prieš nėštumą, tiek nėštumo metu26, ir jų širdies veikla yra žymiai sumažėjusi 29 . Gimdos arterijos tinkamai nesigilina, todėl sumažėja gimdos arterijos skersmuo 12 . Tai daro didelę įtaką gimdos kaklelio kraujotakai, o placentos hipoksijos žymenys jungiamojoje zonoje yra padidėję vėlyvojo nėštumo metu 30 . Taip pat pastebėtas reikšmingas placentos maistinių medžiagų transportavimo sutrikimas 13, kartu su nuolatiniu augimo ribojimo fenotipu 13, 14, 15, 31 . Nepaisant reikšmingų ir įvairių Nos3 - / - pelių motinos fiziologijos ir placentos funkcijos pokyčių, stebėtinai tik nedidelis metabolitų skaičius buvo žymiai pakitęs, kai metabolizmo serumo serume palyginimas su C57BL / 6J kontrolinės pelės profiliu (papildomas paveikslas S1 prisijungęs). Yra žinoma, kad du metabolitai, kurių koncentracija serume buvo žymiai padidėję, karnitinas ir karnozinas, pasižymi antioksidaciniu aktyvumu 32, 33 . Todėl jų gamyba gali padidėti, atsižvelgiant į padidėjusį oksidacinio streso lygį nėščioms Nos3 - / - pelėms 15 . Vis dėlto buvo įdomu pastebėti, kad serumo arginino koncentracijai įtakos neturėjo No3 geno moduliacija. Tai gali reikšti, kad ne visi metaboliniai pakitimai, susiję su nėštumo sutrikimais, atsispindi motinos serume. Kai kurie fiziologiniai pokyčiai gali atsirasti tik konkrečiame audinyje, o kraujo mėginyje nematyti metabolinių biomarkerių. Todėl, jei įmanoma, ieškant ligos mechanizmų ir biologinių rodiklių, reikėtų atsižvelgti į skirtingas biologinių medžiagų rūšis.

Antrasis modelis, naudojamas šiame tyrime, buvo pelė COMT - / . Katechol-O-metiltransferazė (COMT), be kitų substratų, 17β-estradiolį paverčia 2-metoksiestradioliu (2-ME). Šį modelį pirmiausia sukūrė „Gogos“ ir jo kolegos, jis buvo plačiai naudojamas kaip psichinių sutrikimų modelis 34, jo naudojimas nėštumo metu buvo palyginti nesenas. Žmonių tyrimai pasiūlė galimą COMT ir 2-ME vaidmenį PE; pastebėta, kad tiek COMT, tiek 2-ME lygis yra padidėjęs per trečiąjį normalaus žmogaus nėštumo trimestrą 35, tačiau yra žymiai mažesnis toms moterims, kurioms nustatytas sunkus PE 17 . Vėliau daugybėje tyrimų buvo pastebėta tiek PE, tiek FGR požymių COMT - / - pelės modelyje. Tai apima vėlyvą gestacinę hipertenziją, proteinuriją ir glomerulinę endoteliozę 17, taip pat nenormalias bambos arterijos Doplerio bangos formas ir FGR 18 . Nepaisant fenotipinių dviejų čia naudojamų modelių, ty hipertenzijos ir FGR, panašumų, patofiziologiniai mechanizmai, kuriais grindžiami šie stebėjimai, skiriasi. Pavyzdžiui, COMT - / - pelėms nebuvo nustatyta jokių gimdos arterijos Doplerio bangos formų ar funkcijos pokyčių 18 . Tačiau yra įrodymų apie padidėjusį placentos atsparumą 18 ir angiogeninių veiksnių disbalansą COMT - / - pelėje 17, kas rodo, kad sumažėjusi placentos angiogenezė gali būti pagrindinis šio modelio mechanizmas. Todėl nenuostabu, kad COMT - / - pelės metabolizmo parašas serume buvo kitoks, palyginti su pele Nos3 - / -, taip pat su C57BL / 6J kontroline pele (2 pav.).

Nemažai metabolitų paveikė COMT geno pašalinimas (1 pav.). Dažniausiai nukentėjo acilkarnitino ir lipidų klasės. Acilkarnitinai yra tarpiniai metabolitai, susidarantys riebalų rūgščių oksidacijos metu; Tai yra pagrindinis energijos šaltinis daugelyje skirtingų audinių, įskaitant lygiuosius kraujagyslių raumenis 36 . Riebalų rūgšties oksidacija vyksta mitochondrijose, o reikšmingas acilkarnitinų koncentracijos pokytis gali rodyti pasikeitusią mitochondrijų funkciją. Paprastai tokiose ligos būsenose, kaip diabetas / atsparumas insulinui, pastebėta padidėjusi acilkarnitinų koncentracija37. Tai rodo padidėjusį lipidų kiekį arba nepilną riebalų rūgščių oksidaciją 38, 39 . Tačiau šiame tyrime, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, pastebėtas reikšmingas acilkarnitino koncentracijos sumažėjimas COMT - / - . Šis reikšmingas sumažėjimas buvo pastebimas trumpųjų (C2), vidutinės grandinės (C6) ir amino rūgščių (C3, C4 ir C5) acilkarnitinų sumažėjime. Kadangi acilkarnitino koncentracijos tiesiogiai atspindi riebalų rūgščių ir aminorūgščių oksidacijos greitį, tai gali parodyti sumažėjusį aktyvumą šiuose energijos gaminimo keliuose.

Placenta yra ypač metaboliškai aktyvus audinys, o bet kokie energijos gamybos pokyčiai gali turėti reikšmingą poveikį jo raidai ar funkcijai. Atsižvelgiant į tai, kad placentos disfunkcija yra svarbiausia tarpininkaujant fenotipu, stebėtu COMT - / - pelėms 17, 18, įdomu pastebėti, kad mitochondrijų disfunkcija vaidina svarbų vaidmenį FGR patofiziologijoje. Pavyzdžiui, atlikus viso genomo raiškos analizę, Madaleneau ir kt . (2015) nustatė reikšmingą kelių genų ekspresijos sumažėjimą placentos audinyje, gautus iš FGR atvejų, palyginti su įprastu nėštumu 40 . Genai, kuriems pasireiškė sumažėjusi ekspresija, paveikė tris iš penkių mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų ir todėl greičiausiai turėjo didelę įtaką metabolizmui ir energijos gamybai. Be to, kituose graužikų FGR modeliuose buvo pastebėti placentos audinio mitochondrijų anomalijos 41 . Pažymėtina, kad kiti tyrėjai pastebėjo padidėjusį placentos mitochondrijų DNR kiekį placentoje nuo FGR 42 atvejų; Nors iš šių tyrimų yra įrodymų apie sutrikusią mitochondrijų funkciją, akivaizdu, kad mitochondrijų biogenezės ir aktyvumo pokyčiai ir jų vaidmuo placentos nepakankamumo patogenezėje greičiausiai yra sudėtingas. Mažai žinoma apie acilkarnitinų išpylimo į tarpląstelinius skyrius tikslus, tačiau čia pastebėtos sumažėjusios koncentracijos gali rodyti sumažėjusią mitochondrijų biogenezę ar aktyvumą placentos audinyje.

Anksčiau mes pastebėjome, kad COMT - / - pelių gydymas Sildenafilio citratu normalizavo virkštelės arterijos Doplerio bangos formas ir padidino vaisiaus augimą 18 . COMT - / - pelių gydymas sildenafilio citratu taip pat normalizavo visų, išskyrus vieną, acilkarnitinų, koncentraciją. Yra daugybė tyrimų, kurie įrodė gydymo Sildenafilu gebėjimą padidinti mitochondrijų biogenezę ir aktyvumą ląstelių linijose 43 ir įvairiuose gyvūnų modeliuose 44, 45 . Iki šiol galimas Sildenafilio poveikis placentos mitochondrijų biogenezei / funkcijai nebuvo ištirtas, tačiau čia pateikti duomenys rodo, kad tai gali būti vienas iš mechanizmų, kuriais Sildenafilis gali pagerinti placentos nepakankamumą ir pateisina tolesnį tyrimą.

Taip pat pastebėta, kad, palyginti su C57BL / 6J pelėmis, kinenino reikšmingai sumažėjo mėginiuose iš COMT - / - . Kinureinas yra aminorūgšties triptofano metabolitas ir naudojamas gaminant niaciną. Įdomu tai, kad niacinas daugelį metų buvo siejamas su širdies ir kraujagyslių sveikata. Nors buvo manoma, kad pradinė niacino nauda susijusi su pagerėjusiais lipidų profiliais 46, naujausi tyrimai taip pat parodė pagerėjusią endotelio funkciją, susijusią su padidėjusiu niacino vartojimu per maistą 47 . Šiame tyrime pastebėtas COMT - / - pelių stebėtas kinurenino sumažėjimas gali atsispindėti niacino gamybos sumažėjime, o tai savo ruožtu gali prisidėti prie pakitusių plazmos lipidų profilių ir (arba) sutrikusios endotelio funkcijos. COMT - / - pelėms nustatytas reikšmingas placentos atsparumo padidėjimas, kuris sumažėja po gydymo Sildenafiliu. Padidėjęs placentos atsparumas gali būti susijęs su padidėjusiu kraujagyslių susiaurėjimu gimdos kaklelio kraujotakoje, kurį vėliau pagerina Sildenafilis. Nežinoma, ar niacinas yra vazoaktyvus gimdos kaklelio kraujotakoje ir todėl prisideda prie šių placentos atsparumo pokyčių; turėtų būti atlikti in vitro tyrimai, siekiant ištirti šio junginio svarbą šioje kraujagyslių lovoje.

Galiausiai pastebimas reikšmingas sfingolipidų ir glicerofosfolipidų koncentracijos padidėjimas COMT - / - pelėse; šie junginiai yra pagrindiniai plazmos lipoproteinų ir biologinių membranų 48 struktūriniai komponentai, turintys svarbų vaidmenį reguliuojant membranų baltymų judėjimą ir ląstelių signalizaciją bei funkciją. Šiame tyrime pastebėta pakitusi šių lipidų koncentracija gali atsirasti dėl ląstelių membranų pažeidimo ir vėlesnio išsiskyrimo, susijusio su sutrikusia placentos augimu, vystymusi ir funkcija. Patobulinta gimdos ląstelių perfuzija po gydymo Sildenafil gali sumažinti ląstelių pažeidimus, todėl sumažėja fosfolipidų išsiskyrimas. Tačiau sildenafilis taip pat gali turėti daugiau tiesioginių veiksmų. Pavyzdžiui, dėl sfingolipidų apykaitos susidaro keramidai, kurie yra pagrindiniai apoptozės tarpininkai. Pastebėta, kad PE sergančioms moterims, kurioms būdinga padidėjusi placentos apoptozė, padidėja įvairių keramidų koncentracija serume 49 . Atsižvelgiant į padidėjusią sfingolipidų koncentraciją COMT - / - pelėse, palyginti su kontrolinėmis, atrodo, kad lipidų metabolizmo keliuose gali būti reikšmingų pokyčių, dėl kurių gali padidėti keramidų gamyba. Įdomu tai, kad azoto oksidas gali išvengti ceramido sukeliamos apoptozės priklausomai nuo cGMP 50 . Atsižvelgiant į ryšį tarp padidėjusios placentos apoptozės ir padidėjusios PE 51 / FGR 52 rizikos bei sumažėjusių sfingolipidų pelėms, gydomoms Sildenafiliu, tai parodo dar vieną intriguojantį potencialų mechanizmą, pagal kurį Sildenafilis gali perduoti jo teigiamą poveikį.

Įdomu tai, kad metabolitai, kurie, kaip nustatyta, pakito šiame modelyje, yra iš panašių klasių, kaip ir tie, kurie pastebėti pakitę plazmos ir placentos mėginiuose, paimtuose iš moterų, kurioms atsirado FGR 53 ar PE 54 . Pavyzdžiui, atliekant moterų kraujo plazmos tyrimus, paimtus ankstyvuoju nėštumo laikotarpiu iki FGR atsiradimo, acilkarnitinai, fosfolipidai ir sfingolipidai buvo tarp metabolitų, išskiriamų pagal diskriminacinį metabolizmo požymį 53 . Vėliau šie pokyčiai buvo patvirtinti tiek plazmos mėginiuose, paimtuose ligos metu (venų virkštelės plazma, paimta iš gimimo), tiek žiurkių modelyje FGR 53 . Atradimų ir įteisintų atvejų kontrolės tyrimai taip pat nustatė pakitusį metabolominį požymį ankstyvuoju nėštumo periodu, kuris susijęs su vėlesniu PE 54 vystymu. Pažymėtina, kad šis pakitęs parašas apėmė acilkarnitinų ir fosfolipidų koncentracijos pokyčius, vėlgi, kaip pažymėta čia aprašytame tyrime.

Be to, neseniai atlikta placentos genų ekspresijos profilių analizė pastebėjo, kad vienas iš ženkliai pakitusių PE būdų yra lipidų metabolizmas 55 . PE ir FGR yra dvi sąlygos, turinčios sudėtingą daugiafaktorinę etiologiją. Įprastų būdų ir (arba) mechanizmų, kurie yra keičiami tiek žmogaus mėginiuose, tiek ir skirtinguose gyvūnų modeliuose, nustatymas yra svarbus žingsnis, siekiant toliau suprasti mūsų ligos patofiziologiją, taip pat kurti ir optimizuoti terapines strategijas.

Šis tyrimas yra pirmasis metabolizmo taikymas pelių preeklampsijos ir vaisiaus augimo ribojimo modeliuose. Tai parodė, kad metabolinis PE ir FGR pelių modelių profiliavimas gali ne tik sukelti fenotipinį ženklą, kuris aiškiai skiriasi nuo kontrolinės, bet ir būdingas pagrindiniams patofiziologiniams mechanizmams. Be to, Sildenafilio citrato gebėjimas padidinti vaisiaus augimą atsispindėjo keičiantis metabolomui.

Pastebėta, kad pakitęs metabolizmo profilis ligos modeliuose panašus į pakitusį profilį, kurį stebėjo moterys, kurioms vėliau pasireiškė preeklampsija ar vaisiaus augimo apribojimas. Šie panašumai padeda toliau patvirtinti šiuos modelius - ne tik toliau tirti galimus ligos mechanizmus, bet ir naudoti galimų naujų gydymo būdų išbandymui. Kadangi tinkamų gyvūnų modelių silpnumas buvo vienas iš veiksnių kuriant gydomąjį gydymą, tai yra nepaprastai svarbus poslinkis ir pabrėžiamas galimas metabolominio profiliavimo vaidmuo kuriant naujas terapines strategijas. Be to, atliekant papildomus metabolitų, kurie, kaip nustatyta, pasikeitė šiuose modeliuose, tyrimus, gali būti gaunama informacijos apie patofiziologinius ir galimus terapinių strategijų veikimo mechanizmus.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnai ir jų gydymas

Visus protokolus patvirtino Albertos universiteto Sveikatos mokslų politikos ir gyvūnų gerovės komitetas, vadovaudamasis Kanados gyvūnų globos taryba, ir jie atitiko Laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą (autorių teisės 1996, Nacionalinė mokslo akademija).

Šiame tyrime buvo naudojamos nėščios pelės; Buvo naudojamos 8–12 savaičių patelės COMT - / -, Nos3 - / - ir C57BL / 6J (C57BL / 5J pelės yra abiejų modelių fono padermė). Jie buvo poruojami naktį su atitinkamo genotipo patinais. Rytas, aptiktas makšties kamštis, buvo pažymėtas kaip 0, 5 nėštumo diena (GD). Pogrupis COMT - / - ir C57BL / 6J pelių buvo gydomos sildenafilio citratu; Iš GD12.5 buvo skiriamas sildenafilio citratas (0, 2 mg / ml geriamajame vandenyje; ekvivalentiškas 300 mg per parą 70 kg žmogaus, pakoreguotas pagal pakitusią farmakokinetiką pelėse 56 ) arba normalus geriamasis vanduo. Vandens suvartojimas tarp apdorotų ir negydytų grupių buvo lyginamas ir statistiškai nesiskyrė. Vaisto vartojimo laikas buvo pasirinktas taip, kad placentos vystymasis a) atitiktų pirmojo trimestro pabaigą žmoguje b) gimdos kaklelio cirkuliacija yra atvira ir yra pagrindinis vaisiaus augimo veiksnys 57 . Gydymas tęsėsi iki 18, 5 GD (terminas yra 19, 5 GD). Iš visų pelių grupių buvo paimtas galutinis kraujo mėginys, atliekant širdies punkciją, esant GD18.5. Kraujui buvo leista krešėti ant ledo, tada serumas buvo paruoštas centrifuguojant (mėginiai buvo sukami 5 minutes, esant 5000 aps./min., Esant 4 ° C temperatūrai). Serumo mėginiai buvo padalijami į alikvotą dalį, užšaldyti skystame azote ir laikomi –80 ° C temperatūroje, kol prireiks. Iš viso buvo tiriami 23 C57BL / 6J, 13 COMT - / - ir 13 Nos3 - / - pelių mėginiai. Be to, buvo tiriami 10 C57BL / 6J ir 14 COMT - / - pelių, apdorotų Sildenafilio citratu, mėginiai.

Metabolitų atskyrimas ir aptikimas

Serumo mėginiams analizuoti buvo naudojamas tikslinis kiekybinės metabolomikos metodas, naudojant komerciškai prieinamą tiesioginio srauto injekciją ir LC-MS / MS rinkinį iš „BIOCRATES Life Sciences AG“ (Austrija). Šis rinkinys kartu su ABI 4000 Q-Trap (Applied Biosystems / MDS Sciex) masių spektrometru gali būti naudojamas tiksliniam identifikavimui ir kiekybiškai įvertinti iki 180 skirtingų endogeninių metabolitų, įskaitant aminorūgštis, acilkarnitinus, biogeninius aminus, glicerofosfolipidus, sfingolipidus. ir cukrų. Taikytas metodas sujungia analitų derivatavimą ir ekstrahavimą, jų atskyrimą atvirkštinės fazės PLC ir selektyvųjį masės spektrometrinį aptikimą naudojant daugialypės reakcijos stebėjimo (MRM) poras. Izotopais pažymėti vidiniai standartai ir kiti vidiniai standartai buvo integruoti į rinkinio plokštelės filtrą metabolitų kiekybiniam įvertinimui. Į „Absolute IDQ“ rinkinį įeina 96 gilių šulinėlių plokštelė su filtro plokštele, pritvirtinta sandarinimo juosta, ir reagentai bei tirpikliai, naudojami plokštelės tyrimui paruošti. Pirmieji 14 rinkinio šulinių buvo naudojami kalibravimui ir kokybės kontrolei (vienas tuščias; trys nulio mėginiai, septyni standartai ir trys kokybės kontrolės mėginiai, pateikti su kiekvienu rinkiniu). Visi serumo mėginiai buvo analizuojami naudojant protokolą, aprašytą AbsoluteIDQ vartotojo vadove. Trumpai tariant, sergančių pelių, paimtų iš nėščių pelių nėštumo pabaigoje, pavyzdžiai buvo atšildyti ant ledo, pamaišyti sūkuryje ir po to centrifuguoti 13 000x g. 10 μL kiekvieno serumo mėginio buvo įpilta į filtro centrą viršutinėje 96 šulinėlių rinkinio plokštelėje ir išdžiovinta azoto sraute. Vėliau, kad būtų galima derivatizuoti, buvo pridėta 20 μL 5% fenilizotiocianato tirpalo. Po inkubacijos filtro dėmės vėl buvo džiovinamos garintuvu. Tada metabolitai buvo ekstrahuojami pridedant 300 μL metanolio, kuriame yra 5 mM amonio acetato. Ekstraktai buvo gauti centrifuguojant į apatinę 96 gilių šulinėlių plokštelę, po to praskiedžiant komplektu MS tekančiu tirpikliu. Masės spektrometrinė analizė buvo atlikta naudojant API4000 Qtrap® tandeminės masės spektrometrijos instrumentą (Applied Biosystems / MDS Analytical Technologies, Foster City, CA), aprūpintą tirpiklių tiekimo sistema. Mėginiai buvo pristatyti į masės spektrometrą, naudojant atvirkštinės fazės HPLC kolonėlę (aminorūgščių ir biogeninių aminų analizei), o po to atliktas tiesioginio srauto injekcijos (DI) tyrimas (acilkarnitinų ir lipidų analizė). Programa „Biocrates MetIQ“ buvo naudojama valdyti visą tyrimo darbo eigą, pradedant mėginio registravimu ir baigiant automatizuotu metabolitų koncentracijos apskaičiavimu, baigiant duomenų eksportavimu į kitas duomenų analizės programas. Tikslinė profiliavimo schema buvo naudojama norint kiekybiškai ištirti žinomus mažų molekulių metabolitus, naudojant daugkartinį reakcijos stebėjimą, neutralių nuostolių ir pirmtakų jonų nuskaitymą.

Statistinė analizė

As the raw data for each measured metabolite from each of the groups (COMT −/−, Nos3 −/− and C57BL/6J mice, and then COMT −/− and C57BL/6J mice following Sildenafil citrate treatment) were not normally distributed, the differences in metabolic profile distributions were evaluated, per metabolite, using the nonparametric Kruskal-Wallis one-way analysis of variance by ranks test, and for significant metabolites, pairwise group comparisons were performed using the Wilcoxon rank-sum test. Comparisons were considered statistically significant if p-values lower than 0.05 were obtained. Canonical Variate Analysis (CVA) 58 was then performed using all metabolites whose serum concentrations were significantly changed (p < 0.05) in order to visualise the correlated multivariate discrimination between all 5 data groups. For the CVA analysis, data were log transformed, mean centred, and scaled to unit variance 59 . Missing values were imputed using the k-nearest neighbour method 60 . All of the statistical analyses were carried out using the Matlab scripting language (//www.mathworks.com/). Initially, results from COMT −/− and Nos3 −/− mice were compared with C57BL/6J mice, to determine what, if any, differences were present in the metabolomic signature of different models compared with that of their background strain. A comparison between the two models, COMT −/− and Nos3 −/−, was also made to determine if the differing pathophysiological mechanisms were reflected in changes in the altered metabolomic signature. COMT −/− mice treated with Sildenafil were compared with untreated C57BL/6J mice to determine the ability of Sildenafil to normalize the metabolomic signature in comparison with 'normal' control mice; treated C57BL/6J mice were also included in the event that Sildenafil treatment may alter metabolite concentration in normal mice.

Papildoma informacija

How to cite this article : Stanley, JL et al. Sildenafil Therapy Normalizes the Aberrant Metabolomic Profile in the Comt -/- Mouse Model of Preeclampsia / Fetal Growth Restriction. Mokslas. Rep. 5, 18241; doi: 10.1038/srep18241 (2015).

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.