Nutildyti il-23 ekspresiją mažu plaukų segtuku rna apsaugo nuo pelių astmos | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Nutildyti il-23 ekspresiją mažu plaukų segtuku rna apsaugo nuo pelių astmos | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Anonim

Anotacija

Norint nustatyti IL-23 numušimo dėl RNR intervencijos įtaką ovalbumino (OVA) sukelto astminio uždegimo išsivystymui ir sunkumui bei galimiems pelių mechanizmams, buvo nustatyta IL-23 specifinė RNRi ekspresuojanti pSRZsi-IL-23p19 plazmidė. prieš kiekvieną užkrėtimą buvo sukonstruotos ir įkvėptos pelėms, jautrioms OVA, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, apdorotomis alūnu arba budezonidu. Įkvėpus pSRZsi-IL-23p19, žymiai sumažintas OVA iššūkio sukelto IL-23 lygis plaučių audiniuose beveik 75%, nustatytas RT-PGR. Be to, sustabdžius IL-23 ekspresiją, dramatiškai sumažėjo eozinofilų ir neutrofilų skaičius BALF ir sumažėjo astmos pelių uždegimas. Be to, IL-23 ekspresija smarkiai sumažino IgE, IL-23, IL-17 ir IL-4 koncentraciją serume, bet ne IFNγ, o jo priešuždegiminis poveikis buvo panašus arba geresnis nei gydant budezonidu. esant astminėms pelėms. Mūsų duomenys patvirtina nuostatą, kad IL-23 ir susiję Th17 atsakai prisideda prie patogeninio bronchinės astmos proceso. IL-23 numušimas RNR efektyviai slopina astminį uždegimą, kuris susijęs su IL-17 ir IL-4 gamybos astmos pelėms sušvelninimu.

Įvadas

Bronchinė astma yra sunki lėtinė liga, turinti įvairius klinikinius simptomus. Dėl padidėjusios aplinkos taršos bronchinės astmos dažnis didėja visame pasaulyje (Eder ir kt., 2006). Patogeniniai tyrimai atskleidė, kad bronchinei astmai būdinga leukocitų infiltracija bronchų audiniuose, per didelis gleivių susidarymas, epitelio pažeidimas, bazinės membranos sustorėjimas ir lygiųjų raumenų hipertrofija kvėpavimo takų epiteliniuose audiniuose (Barnes, 1989; Boushey ir Fahy, 1995). Nors astma sergantiems pacientams gydyti buvo panaudota daug terpaeutinių strategijų, šių gydymo būdų veiksmingumas yra ribotas. Taigi, naujos reikšmingos ir saugios terapijos, skirtos gydyti žmogaus astmą, sukūrimas turės didelę reikšmę.

Interleukinas (IL) -23 yra IL-12 heterodimerinių citokinų šeimos narys. IL-23 sudaro p19 ir p40, IL-12 subvienetas (Oppmann ir kt., 2000). IL-23 yra priešuždegiminių Th17 ląstelių, išskiriančių IL-17, augimo faktorius ir induktorius (Aggarwal et al., 2003). Iš tikrųjų IL-23 ir Th17 ląstelės yra svarbios autoimuninių ligų, tokių kaip eksperimentinis alerginis encefalomielitas (EAE), kolageno sukeltas artritas (CIA) ir uždegiminė žarnyno liga (IBD), vystymosi proceso dalyvės (McKenzie ir kt., 2006). . Ypač didelis serumo IL-23p19 ir IL-17 kiekis nustatomas sergant įvairiomis žmogaus plaučių ligomis, įskaitant astmą ir lėtinę obstrukcinę plaučių ligą (Barczyk ir kt., 2003; McAllister ir kt., 2005). Matyt, IL-23 yra patogeninis veiksnys, dalyvaujantis patogeniniame žmogaus astmos procese. Įtariama, kad mes hipotezavome, kad žemas IL-23 ekspresijos reguliavimas gali sumažinti kvėpavimo takų uždegimą ir sušvelninti alergenų sukeltą astmą.

Pelių sensibilizacija ir aerozolinis poveikis ovalbuminui (OVA) buvo plačiai naudojami kaip pelių bronchinės astmos modelis (Braun ir kt., 1998; Hopfenspirger ir kt., 2001; Nakanishi ir kt., 2001). Šiame tyrime pirmiausia sukūrėme naują rekombinantinę plazmidę IL-pSRZsi-IL-23p19, kuri ekspresuoja IL-23p19 specifinę shRNR. Vėliau mes panaudojome pelių OVA bronchinės astmos modelį, norėdami patikrinti, ar gydymas IL-pSRZsi-IL-23p19 IL-23 ekspresijai in vivo sunaikinti gali modifikuoti pelių OVA sukeltą bronchų uždegimą. Mes nustatėme, kad gydymas specifine IL-23p19 shRNR sumažino pelių OVA sukeltą plaučių uždegimą. Mes aptarėme savo išvadų padarinius.

Rezultatai

IL-23 ekspresijos numušimas IL-23 specifine shRANA ekspresuojančia plazmidė in vivo

Norėdami nustatyti IL-23 slopinimo poveikį in vivo , mes sukūrėme pSRZSi-IL-23p19 plazmidę, kuri ekspresuoja IL-23 specifinę shRNR. Toliau mes išbandėme IL-23 numušimo efektyvumą pelių bronchinės astmos modelyje, jautrindami ir iššūkį BALB / c pelėms su OVA (1 paveikslas). Mes nustatėme, kad pelių, kurios buvo apdorotos pSRZSi-IL-23p19 plazmidėje Lipofectamine 2000 praėjus 48 valandoms po paskutinio gydymo, grupės parodė EGFP ekspresiją plaučių audiniuose (2A pav.). Panašūs EGFP ekspresijos modeliai buvo stebimi pelėms, kurios buvo apdorotos plazmidėmis atitinkamai praėjus 24 arba 72 valandoms po paskutinio gydymo (duomenys nepateikti). Charakterizuojant santykinį IL-23 mRNR nuorašų kiekį skirtingų pelių grupių plaučių audiniuose paaiškėjo, kad OVA sensibilizacija ir iššūkiai sukėlė žymiai aukštesnį IL-23 transkripcijos lygį plaučiuose, palyginti su atskirai gydytu alumi. kontrolinės grupės ( P <0, 01, 2B ir 2C pav.) ir gydymas budezonidu slopino IL-23 ekspresiją beveik 65% ( P <0, 01). Visų pirma, gydymas pSRZSi-IL-23p19, bet ne tuščiu vektoriu, taip pat smarkiai sumažino IL-23 mRNR nuorašų kiekį plaučiuose ir IL-23 mRNR nuorašų lygį pelių plaučiuose 48 ir 72 Po paskutinio gydymo buvo žymiai mažesnis nei pelių, gydytų budezonidu, pelių ( P <0, 01). Panašūs IL-23 baltymų modeliai buvo stebimi skirtingų pelių grupių plaučiuose (2D ir E paveikslai). Kaip parodyta 2D paveiksle, padidėjęs IL-23 imuninis dažymas (tamsiai rudas) buvo rastas bronchų epitelio ląstelėse, alveolinėse epiteelio ląstelėse ir plaučių audinių bronhopulmoninėse kapiliarinėse endotelio ląstelėse, OVA paveiktose arba tuščiose pelių grupėse, gydomose vektoriais. . IL-23 teigiamų ląstelių skaičius plaučių audiniuose sumažėjo pelėmis, gydomomis budezonidais ir IL-23. Atsižvelgiant į tai, kad IL-23 yra kritinis Th17 ląstelių vystymosi reguliatorius (Ivanov ir kt., 2007), apibūdinome IL-17 raišką ir nustatėme, kad santykinis IL-17 mRNR nuorašų lygis pelių plaučiuose gydytų budezonidu arba pSRZSi-IL-23p19, buvo žymiai sumažintas, ypač pelėms, gydytoms pSRZSi-IL-23p19 48 ir 72 valandas (2B ir 2C paveikslai). Todėl gydymas pSRZSi-IL-23p19 ne tik nutildė IL-23 raišką, bet ir sumažino IL-17 raišką pelių bronchinės astmos modelyje. Todėl mes pasirinkome 48 valandų laiko tašką po paskutinio iššūkio šiems eksperimentams.

Image

Eksperimento protokolo schema. Injekcija į pilvaplėvės ertmę.

Visas dydis

Image

IL-23 ekspresijos numušimas. BALB / c pelių grupės buvo jautrinamos OVA ir buvo apdorotos IL-pSRZsi-IL-23p19 prieš sensibilizaciją ir užkrėtimą, o transfekcijos efektyvumas plaučių audiniuose buvo tiriamas fluorescenciniu mikroskopu (A). (B) Santykinis IL-23 ir IL-17 mRNR nuorašų lygis buvo nustatytas RT-PGR. Pateikti duomenys yra reprezentatyvūs kiekvienos pelių grupės (n = 10) vaizdai iš trijų atskirų eksperimentų. M, DL2000 DNR žymeklis. (C) santykinio IL-23 ir IL-17 mRNR raštų kiekybinis įvertinimas siekiant kontroliuoti GAPDH. Duomenys išreiškiami atskirų pelių grupių vidurkiu ± SD. (D) IL-23 ekspresuojančių ląstelių plaučių audiniuose apibūdinimas imunohistochemija, naudojant anti-IL-23 antikūną. Pateikti duomenys yra reprezentatyvūs kiekvienos grupės vaizdai (× 200). IL-23 + ląstelės buvo pažymėtos rodyklėmis. (E) IL-23 ekspresuojančių ląstelių plaučių audiniuose kiekybinė analizė imunohistochemijos būdu. Duomenys išreiškiami kaip kiekvieno lauko vidutinė ± SD kiekvienoje pelių grupėje. Buvo suskaičiuota dešimt laukų iš 3 atskirų pelių skyrių. * P <0, 01, palyginti su kontroliniu aliuminiu; # P <0, 01, palyginti su OVA užkrėsta modelių grupe; ** P <0, 01, palyginti su teigiama kontrole, gauta su budezonido pespules.

Visas dydis

IL-23 numušimas sumažina OVA sukeltą plaučių uždegimą

Manoma, kad alergenams specifinis IgE ir uždegiminiai eozinofilai bei neutrofilai yra pagrindiniai mediatoriai bronchinei astmai vystytis. Toliau mes ištyrėme IL-23 nutildymo įtaką serumo OVA specifinio IgE ir eozinofilinių bei neutrofilinių infiltratų lygiams skirtingų pelių grupių BALF. Kaip ir buvo galima tikėtis, OVA sukelta reakcija sukėlė žymiai didesnį OVA specifinių IgE atsakų lygį, palyginti su kontroliniu alūno kiekiu, o gydymas budezonidu arba pSRZSi-IL-23p19, bet ne tuščiu vektoriu, dramatiškai slopino IgE atsakus ( 3A pav.). Gydymas budesonidu arba pSRZSi-IL-23p19 taip pat smarkiai slopino uždegiminių eozinofilų ir neutrofilų infiltraciją plaučiuose (3B ir 3C paveikslai). Akivaizdu, kad pelių, kurios buvo gydomos budezonidu arba pSRZSi-IL-23p19, eozinofilų ir neutrofilų skaičius BALF buvo žymiai sumažintas, o IL-23 ekspresijos slopinimas turėjo stipresnį neutrofilų įsiskverbimo slopinimą. gydymo budezonidu. Įvairių pelių grupių plaučių uždegimo apibūdinimas parodė, kad OVA sukelta leukocitų infiltracija bronchų audiniuose, per didelis gleivių susidarymas, epitelio pažeidimas, bazinės membranos sustorėjimas ir lygiųjų raumenų hipertrofija, lydima kaušelių ląstelių proliferacijos ir užgulimo (4A paveikslas). ). Gydymas budezonidu arba pSRZSi-IL-23p19, bet ne tuščiu vektoriu, dramatiškai sumažino OVA sukeliamą plaučių uždegimą (4B pav.). Bendrai mūsų duomenys parodė, kad IL-23 ekspresijos numušimas reikšmingai sušvelnino pelių OVA sukeltą plaučių uždegimą.

Image

IL-23 ekspresijos sustabdymas palengvina OVA sukeltą plaučių uždegimą astminėms pelėms. EOSinofilinių ir neutrofilinių infiltratų skaičius BALF buvo apibūdintas šviesos mikroskopu, o serumo IgE lygis buvo nustatytas ELISA metodu. (A) IgE koncentracija serume. (B) Eozinofilų skaičius BALF. (C) neutrofilų skaičius BALF. Duomenys išreiškiami kaip kiekvienos grupės vidurkis ± SD (n = 10 kiekvienoje grupėje). * P <0, 01, palyginti su kontroliniu aliuminiu; # P <0, 01, palyginti su OVA užkrėsta modelių grupe; ** P <0, 01, palyginti su teigiama kontrole, gauta su budezonido pespules.

Visas dydis

Image

Histopatologinė astmos pelių plaučių uždegimo analizė. (A) dažymas HE. B) Uždegiminiai balai. Pateikti duomenys yra tipiniai vaizdai (× 200) arba atskirų pelių grupių vidurkis ± SD. Pelės, pelės gavo alavo injekciją be OVA ir buvo naudojamos kaip kontrolė. Kitos pelių grupės buvo nurodytos paveikslo viršuje. * P <0, 01, palyginti su aliuminio kontrole, # P <0, 01, palyginti su OVA užkrėsta modelių grupe.

Visas dydis

IL-23 nutildymo poveikis sergantiems citopinais serume OVA jautrioms ir abejotinoms pelėms

Antigenams būdingi Th2, Th17 ir Th1 atsakai reguliuoja alergenų sukeltos bronchinės astmos vystymąsi. Norėdami įvertinti IL-23 nutildymo poveikį sisteminio uždegimo išsivystymui, ELISA tyrimais ištyrėme citokinų kiekį serume. Kaip parodyta 5 paveiksle, IL-23, IL-17 ir IL-4 koncentracija serume buvo žymiai padidėjusi, tačiau IFNγ lygis sumažėjo OVA jautriose ir paveiktose pelėse bei pelėse, kurios buvo gydomos tuščiomis. vektorius. Gydymas budesonidu, priešingai, reikšmingai sumažino IL-23, IL-17 ir IL-4 koncentraciją serume, tačiau padidino IFNγ kiekį serume. Be to, gydymas pSRZSi-IL-23p19 taip pat reikšmingai sumažino IL-23, IL-17 ir IL-4 koncentraciją kraujo serume, tačiau neturėjo įtakos IFNy koncentracijai serume. Be to, šių pelių IL-23 koncentracija serume buvo teigiamai koreliuojama su IL-17 lygiu (r = 0, 92, P <0, 01). Matyt, IL-23 ekspresijos sustabdymas ne tik sumažino sisteminės Th17 reakcijos, bet ir moduliavo sisteminius Th2 atsakus mūsų eksperimentinėje sistemoje, prisidėdamas prie terapinio IL-23 slopinimo OVA sukeltos bronchinės astmos pelėms.

Image

Dėl IL-23 ekspresijos sumažėja citokinų kiekis serume astma sergančiose pelėse. IL-23, IL-17, IFNy ir IL-4 koncentracija serume buvo nustatyta ELISA metodu 48 valandas po paskutinio OVA užkrėtimo. Duomenys išreiškiami atskirų pelių grupių vidurkiu ± SD. * P <0, 01, palyginti su aliuminio kontrole, # P <0, 01, palyginti su OVA užkrėsta modelių grupe.

Visas dydis

Diskusija

Dabartiniame tyrime mes panaudojome OVA pagrįstą bronchinės astmos pelės modelį, norėdami ištirti IL-23 nutildymo įtaką OVA sukeltos plaučių raidai ir nustatyti galimus mechanizmus, pagrindžiančius IL-23 numušimo poveikį uždegiminio citokinų gamybai. pelėse. Mes nustatėme, kad IL-23 ekspresijos numušimas žymiai sušvelnino OVA sukeltą plaučių uždegimą, kartu smarkiai sumažėjusį IL-17 ir IL-4 ekspresiją, tai rodo, kad IL-23 prisidėjo prie patogeniško pelių alerginio bronchų uždegimo proceso.

IL-23 yra nepaprastai svarbus kuriant Th17 atsaką (Aggarwal ir kt., 2003), ir nustatyta, kad IL-23 ir Th17 ląstelės yra patogeniški autoimuninių ligų vystymosi veiksniai (McKenzie et al., 2006). Ankstesniuose tyrimuose nustatyta aukšta IL-23 ir IL-17 koncentracija serume, sergantiems astma ir lėtinėmis obstrukcinėmis plaučių ligomis (Barczyk ir kt., 2003; McAllister ir kt., 2005). Šiame tyrime mes nustatėme, kad OVA sukeliamas iššūkis padidino IL-23 ekspresijos plaučių audiniuose 3 kartus (2B-E pav.). Mūsų duomenys atitinka ankstesnę ataskaitą [14] ir leidžia manyti, kad IL-23 gali dalyvauti astminiame šio modelio procese. Norėdami nustatyti IL-23 vaidmenį astmatiniame procese, mes specialiai nutildėme IL-23 raišką, apdorodami peles IL-23 siRNR ekspresuojančia plazmidė. Mes nustatėme, kad plazmidės įkvėpimas reikšmingai slopino IL-23 mRNR transkripciją priklausomai nuo laiko ir dramatiškai sumažino IL-23 ekspresuojančių ląstelių skaičių astminių pelių plaučių audiniuose. Šie nauji duomenys aiškiai parodė, kad plazmidės, kuri ekspresuoja IL-23-sekcifinę siRNR, inhaliacija veiksmingai mažina IL-23 ekspresiją mažiausiai tris dienas tikslinių pelių plaučių audiniuose. Esame suinteresuoti toliau tirti IL-23 ekspresijos dinamiką tiksliniuose astmos pelių audiniuose po gydymo plazmidės sukelta IL-23 siRNR.

Eozinofilinė ir neutrofilinė infiltracija bronchų audiniuose yra būdingas su bronchų astma susijusio kvėpavimo takų uždegimo požymis ir yra reguliuojama įvairių veiksnių, tokių kaip citokinai IL-4, IL-5, IL-13, kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė (VCAM-1). ir labai vėlyvas antigenas-4 (VLA4) (Koo ir kt., 2003). Neutrofilinė infiltracija yra susijusi su patogeniniu lėtinės obstrukcinės plaučių ligos (LOPL) procesu (Thompson ir kt., 1989). Iš tikrųjų neutrofilų aptinkama astma sergančių pacientų skrepliuose, ypač tų, kuriems yra ūmus paūmėjimas (Fahy et al., 1994). Ankstesnis mūsų tyrimas parodė masinę eozinofilų infiltraciją astminių IL-23R transgeninių pelių plaučiuose, kartu žymiai sumažino astmos IL-23 - / - pelių kvėpavimo takų uždegimą, kas rodo, kad IL-23 gali skatinti kvėpavimo takų uždegimą ir eozinofilų infiltraciją plaučiuose. astminių pelių (Peng ir kt., 2010). Laikydamiesi šios idėjos, BALF radome žymiai padidėjusį eozinofilinių ir neutrofilinių infiltratų skaičių, surinktą iš OVA paveiktų astminių pelių. Įdomu tai, kad nustatėme, kad IL-23 numušimas žymiai sumažino įsiskverbusių eozinofilų ir neutrofilų skaičių BALF, lydimas sumažėjusio astmos pelių plaučių uždegimo ir slopinantis IL-23 numušimo poveikį neutrofiliniams infiltratams buvo stipresnis nei gydymas budezonidas. Mūsų duomenys yra panašūs su ankstesne ataskaita, kad gydymas anti-IL-23 antikūnais sumažino antigeno sukeltą eozinofilų infiltraciją kvėpavimo takuose (Wakashin ir kt., 2008). Matyt, gydymas specifine IL-23 siRNR, kad nutildytų IL-23, gali veiksmingai slopinti astmos pelių uždegimą. Pažymėtina, kad gydymas anti-p19 tik šiek tiek sumažina neutrofilinių infiltratų skaičių astmos pelių plaučiuose (Wakashin ir kt., 2008). Skirtingas IL-23 slopinimo poveikis gali kilti dėl kintančių eksperimentinių protokolų ir mėginių dydžių. Kaip alternatyva, reikšmingas IL-23 siRNR slopinamas neutrofilinis uždegimas greičiausiai siejamas su Th17 atsako slopinimu mūsų modelyje, nes Th17 ląstelės yra lemiamos reikšmės neutrofiliniam uždegimui astminėse pelėse (Wakashin et al., 2008). Atsižvelgiant į tai, kad slopinantis IL-23 slopinimas neutrofilinei ir eozinofilinei infiltracijai ir kvėpavimo takų uždegimui yra panašus ar geresnis nei gydant budesonidu, IL-23 slopinimas gali pasiūlyti naują bronchinės astmos kontrolės strategiją. Mes suinteresuoti toliau ištirti, ar astmos modelio gydymas abiem gali sinergiškai slopinti plaučių uždegimą.

IL-23 yra kritinis Th17 atsakų vystymosi reguliatorius ir gali sustiprinti Th2 poliarizaciją bei alerginį kvėpavimo takų uždegimą (Peng ir kt., 2010). Kita vertus, IFNγ, svarbus Th1 citokinas, gali žemyn sureguliuoti Th17 atsako vystymąsi ir antagonizuoti Th2 ląstelių funkciją. Norėdami suprasti galimus IL-23 slopinimo terapinio poveikio mechanizmus, išanalizavome citokinų kiekį kraujo serume ir nustatėme, kad aukštą serumo IL-17 ir IL-4 lydi sumažėjęs IFNγ lygis serume OVA paveiktoms pelėms. . Priešingai, gydymas IL-23 specifinės siRNR ekspresijos plazmidėmis ne tik reikšmingai sumažino IL-23 koncentraciją serume, bet ir sumažino IL-17 astmos pelėse, o IL-23 koncentracija serume buvo teigiamai koreliuojama su IL-17 lygis. Tačiau IL-23 numušimas reikšmingai nepakeitė šių pelių serumo IFNγ lygio. Visų pirma, buvo pasiūlyta, kad IL-17 skatina uždegiminę infiltraciją (Wakashin ir kt., 2008). Gali būti, kad IL-23, aukščiau reguliuodamas Th17 ir Th2 reakcijų vystymąsi bei IL-17 ir IL-4 gamybą, skatina uždegiminių ląstelių infiltraciją astmos pelių plaučiuose. Manoma, kad tikėtina, kad IL-17 ir IL-4 gamybos slopinimas prisideda prie terapinio IL-23 slopinimo poveikio pelių astmos uždegimui.

Alergenams būdingas IgE atsakas yra svarbus alerginės astmos biomarkeris. IgE gali suaktyvinti kaulas, kad išsiskirtų astmos mediatoriai, tokie kaip citokinai, histaminas, cisteinil-leukotrienai, prostaglandinas D 2 ir triptazė, sukeldami plaučių uždegimą (Peachell, 2005). Ghilardi ir kolegos pranešė, kad pelėms, kurių organizme trūksta IL-23, pasireiškė sutrikusi IgE reakcija po alerginio iššūkio (Ghilardi ir kt., 2004). Remdamiesi jų stebėjimais, mes nustatėme, kad IL-23 ekspresijos numušimas žymiai sumažino serumo IgE kiekį astminėse pelėse. Atsižvelgiant į tai, kad IL-4 yra labai svarbus diferencijuojant alergenus suaktyvinančias IgE gaminančias B ląsteles, o IL-23 gali sustiprinti Th2 poliarizaciją, IL-23 ekspresijos numušimas, slopindamas IL-4 ekspresiją, gali slopinti IgE atsaką astminėms pelėms. .

Visų pirma, budesonidas ir kiti kortikosteroidai buvo naudojami astmai kontroliuoti klinikoje. Mes nustatėme, kad gydymas budezonidu ne tik slopino eozinofilinę ir neutrofilinę infiltraciją ir kvėpavimo takų uždegimą, bet ir reikšmingai sumažino IFNγ ir IL-4 koncentraciją serume astma sergančioms pelėms. Įdomiau, kad gydymas budesonidu sumažino IL-23 ekspresijos lygį tiksliniuose plaučių audiniuose ir sumažino IL-23 ir IL-17 kiekį sergantiems astma. Šie nauji duomenys suteikia naujų įžvalgų, kaip suprasti farmakologinį kortikosteroidų poveikį kontroliuojant bronchų uždegimą ir astmą klinikoje.

Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad IL-23 prisideda prie patogeniško baroninės astmos proceso, skatindamas IL-17 sekreciją ir Th2 poliarizaciją. Todėl nutildžius IL-23 ekspresiją specifinėmis RNR gali būti veiksminga bronchinės astmos terapija.

Metodai

Reagentai

Restrikcijos fermentai BamH I ir EcoR I , E. coli DH5α kompetentingos ląstelės, DNR ligavimo rinkiniai buvo įsigyti iš „TaKaRa Biotechnology“. LipofectamineTM 2000 buvo gautas iš Invitrogen, JAV. Monokloniniai antikūnai prieš pelių IL-23 ir biotinilinti triušių anti-pelių IgG antikūnai buvo gauti iš „Santa Cruz Biotechnology“. FITC konjuguotas pelių anti-triušio IgG buvo gautas iš Pekino Boisynthesis Biotechnology. Streptavidin-perosidazės ir diaminobenzidino (DAB) reagentai buvo įsigyti iš „Fuzhou Maxim Company“. Pelių IL-23 ir IL-17 ELISA rinkiniai buvo įsigyti atitinkamai iš „SunBio“, „Pekinas“ ir „Tianjin Genomapping Technology“. IFN-γ ir IL-4 ELISA rinkinius pateikė „Jingmei BioTech“, Šendženas. Serumo IgE aptikimo rinkinys buvo gautas iš BioKey, JAV.

Plazmidės konstrukcija

Buvo sukurti oligonukleotidai, koduojantys siRNR, nukreiptus į pelės IL-23p19 („GenBank“ prieigos Nr. NM031252). Priekiniai ir atvirkštiniai oligonukleotidiniai pradmenys buvo atkaitinti ir sujungti į linearizuotą retrovirusinį vektorių RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen (Clontech, BD Biosciences). Rekombinantinė pSRZSi-IL-23p19 plazmidė buvo dvigubai suskaidyta BamH I ir EcoR I restrikcijos fermentais ir apibūdinta 2% agarozės gelio elektroforeze. Rekombinantinė plazmidė pSRZsi-IL-23p19 dar buvo patvirtinta sekos nustatymu (Applied Biosystem). Po to identifikuota plazmidė buvo transformuota į E. coli ir išgryninta naudojant TaKaRa MiNiBEST plazmidžių gryninimo rinkinį pagal gamintojo nurodymus (TaKaRa Biotechnology).

Pelės ir astmos indukcija

Eksperimento protokolą patvirtino mūsų universiteto Etikos komitetas. Moterys BALB / c pelės, kurių amžius 6-8 savaitės, sveriančios 18–22 g, buvo gautos iš Jilino universiteto Pagrindinių medicinos mokslų universiteto Laboratorinių gyvūnų centro ir buvo laikomos specialiame patogene neužkrėstoje įstaigoje esant pastoviai drėgmei ir temperatūra esant 12 h / 12 h šviesos / tamsos ciklui, laisvai pasiekiant maistą ir vandenį. Norėdami sukelti bronchinę astmą, pelės buvo atsitiktinės atrankos būdu suskirstytos į jautrinimą ir įjautrinamos į pilvaplėvės ertmę 10, 0 ovalbumino (OVA, V laipsnio, Sigma) ir 0, 2 mg aliuminio hidroksido (alumo) 100 µl PBS 0, 6 ir 13 dienomis. pirmąją imunizaciją pelės buvo paveiktos aerozoliniu 1% OVA 30 minučių kas antrą dieną 5 kartus per 9 dienas. Paslėptoms pelių grupėms buvo įšvirkšta į pilvaplėvės ertmę 0, 2 mg aliuminio 100 µl PBS 0, 3 ir 6 dienomis, ir jie buvo impulsuojami 1% OVA 30 minučių kas antrą dieną 5 kartus. Kita pelių grupė buvo įkvėpta 2 ml 50% (1 mg) budezonido pespules (AstraZeneca) 30 min. 1 val. Prieš 1% OVA sukeliamą poveikį ir buvo naudojama kaip teigiama terapinė kontrolė. Eksperimentinės ir tuščios pelių vektorių grupės kasdien buvo įkvepiamos 100 µl 4 µg plazmidės arba vektoriaus DNR ir 8 µl Lipofectamine 2000 mišinio 492 µl DMEM mišinyje tris dienas iš eilės prieš kiekvieną jautrinimą OVA / Alum. Pelės buvo gydomos nosies pagalba tokiu pat kiekiu plazmidės transfekcijos komplekso vieną dieną prieš 1% OVA užkrėtimą. Eksperimentinis protokolas ir manipuliacijų grafikas skirtingoms pelių grupėms (n = 10 vienai grupei) yra pavaizduoti 1 paveiksle. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po paskutinio užkrėtimo, atskirų pelių kraujo mėginiai buvo nustatyti citokinų ir pelių serume. buvo aukojamos. Jų kairieji plaučiai buvo surinkti ir fiksuoti 10% formalino histologiniam tyrimui. Dešinieji atskirų pelių plaučiai buvo užšaldyti -80 ℃ temperatūroje, kad būtų galima nustatyti santykinius citokinų mRNR nuorašų lygius. Transfekcijos efektyvumas buvo nustatytas vizualizuojant žalią fluorescenciją kristalų plaučių skyriuose po konokaliniu mikroskopu (Olympus, Japonija).

RT-PGR

Santykinis IL-23 ir IL-17 mRNR nuorašų kiekis plaučių audiniuose buvo ištirtas RT-PGR metodu, naudojant specifinius pradmenis (Papildomų duomenų lentelė S1) ant termociklerio PTC-100TM (MJ. Tyrimai). Bendra RNR buvo išgaunama iš atskirų plaučių audinių įprasta technologija, atvirkščiai perrašyta į cDNR ir naudojama kaip šablonai. PGR reakcijos buvo daromos dviem egzemplioriais, esant 94 ℃ 3 min., Ir veikiamos 30 ciklų, kuriuose 94 ℃ buvo 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, po to 72 ℃ 5 minutes. GAPDH buvo naudojamas kaip vidinis valdymas su 94 ℃ programa 5 minutes, 30 ciklų po 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s ir 72 ℃ 5 minutes. Padaugintiems produktams buvo būdinga 1, 5% agarozės gelio elektroforezė ir jie buvo pavaizduoti naudojant gelio vaizdo sistemą („Kodak Digotal Science ID“).

Imunohistologinė ir imunohistochemistrinė analizė

Formaline fiksuoti ir parafinu įterpti kairi plaučių audiniai buvo suskirstyti į 5 µM ir imuniniai gauti po deparafinavimo ir rehidratacijos. Audinių sekcijos buvo tiriamos antigenu ir apdorotos endogeninės peroksidazės blokavimo tirpalu. Vėliau audinio pjūviai buvo užblokuoti ožkos serumu ir zonduojami anti-IL-23 monokloniniu antikūnu arba IgG izotipu (4 μg / ml) per naktį, esant 4 ℃. Po plovimo sekcijos buvo inkubuojamos su biotiniluotu triušio anti-pelės IgG kambario temperatūroje 20 min., O surišti antikūnai buvo aptikti peroksidaze konjuguotu streptavidinu, po to vizualizuojant DAB. Atskiros ląstelės su geltonai ruda dažymo membrana ir (arba) citoplazma buvo pripažintos teigiamomis imuninę spalvą turinčiomis ląstelėmis. Iš 5 vienos pelės dalių mikroskopu atsitiktinai parinkta 10 laukų ir apskaičiuotas vidutinis IL-23 teigiamų ląstelių skaičius atskirose pelėse.

Be to, kai kurie plaučių audinio skyriai buvo dažyti hematoksilinu ir eozinu (HE), kad apibūdintų uždegiminius infiltratus. Uždegimo balai buvo suskirstyti pagal 0–4 laipsnių balų sistemą (0: nėra uždegimo; 1: lengvas uždegimas; 2: vidutinio stiprumo uždegimas; 3: stiprus uždegimas ir 4: stiprus uždegimas), kaip aprašyta anksčiau (Henderson et al., 2002).

Plaučių morfologijos ir leukocitų apibūdinimas kraujyje, audiniuose ir bronchoalveoliniame plovimo skystyje (BALF)

BALF buvo surinktas iš atskirų pelių plaučių tris kartus plaunant plaučius 0, 8 ml Ca 2+ ir Mg 2+ nesukeliančio šalto PBS, papildyto 0, 1% BSA ir 0, 05 mM EDTA. Po to BALF buvo centrifuguotas, o esančios ląstelės buvo nudažytos Wright-Giemsa. Eozinofilų dažnis atskiruose BALF mėginiuose buvo suskaičiuotas hemocitometru. Neutrofilų dažnis buvo nustatytas HE dažytose atkarpose. Eozinofilų ir neutrofilų skaičius buvo išreikštas per 1000 ląstelių kiekviename lauke, o duomenų analizei atlikti buvo užregistruoti mažiausiai keturi laukai fazinio kontrasto mikroskopu.

ELISA

Atskiri serumai buvo paruošti centrifuguojant, o IL-23, IL-17, IL-4, IFN-γ ir IgE koncentracija serume buvo nustatyta ELISA metodu, naudojant specialius rinkinius, pagal gamintojo instrukcijas.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. Skirtumas tarp skirtingų grupių buvo nustatytas ANOVA, o tarp dviejų grupių - F-testas arba q-testas. Statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS 16.0 statistikos programinę įrangą (SPSS Inc., Čikaga, IL). Statistiškai reikšminga buvo P vertė <0, 01.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

Alum

aliuminio hidroksidas

BALFAS

bronchų alveolių plovimas

LOPL

lėtinė obstrukcinė plaučių liga

CŽV

kolageno sukeltas artritas

DAB

diaminobenzidinas

EAE

encefalomielitas

JIS

hematoksilinas ir eozinas

IBD

uždegiminė žarnų liga

OVA

ovalbuminas

RT-PGR

atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija

RNR

RNR trukdžiai

„VCAM-1“

kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė

VLA4

labai vėlyvas antigenas-4

Papildoma informacija pridedama prie eksperimento ir molekulinės medicinos tinklalapyje esančio dokumento