Sidabro nanodalelės nugali p53 teigiamas ir p53 neigiamas osteosarkomos ląsteles, sukeldamos mitochondrijų stresą ir apoptozę | mokslinės ataskaitos

Sidabro nanodalelės nugali p53 teigiamas ir p53 neigiamas osteosarkomos ląsteles, sukeldamos mitochondrijų stresą ir apoptozę | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biomedicininės medžiagos
  • Chemoterapija
  • Naviką slopinantys baltymai

Anotacija

Dėl žmogaus vėžio dažnai stebimas naviko slopintuvo p53 funkcijos praradimas sukelia vaistų sukeltą apoptozinį vėžio ląstelių pašalinimą iš organizmo. Šis reiškinys kelia didelį susirūpinimą ir suteikia didelę impulsą dabartiniams bandymams sukurti naujos kartos priešvėžinius vaistus, galinčius išprovokuoti apoptozę nepriklausomai nuo p53. Kadangi sidabro nanodalelės (AgNP) pasižymi unikaliomis citotoksinėmis savybėmis, mes ištyrėme, ar jų aktyvumas galėtų būti panaudotas norint sunaikinti naviko slopintuvus, kurių organizme trūksta vėžio ląstelių. Todėl mes ištyrėme AgNP poveikį osteosarkomos ląstelėms, turinčioms skirtingą genetinį pagrindą p53. Kadangi dalelių skersmuo gali paveikti molekulinius mechanizmus, lemiančius AgNP sukeltą ląstelių žūtį, mes pritaikėme 5 nm ir 35 nm dydžio citratu padengtus AgNP. Mes nustatėme, kad abiejų dydžių AgNP nukreipė mitochondrijas ir sukėlė apoptozę laukinio tipo p53 turinčiuose U2O ir p53 trūkumu turinčiose Saos-2 ląstelėse. Remiantis mūsų išvadomis, AgNPs gali sunaikinti osteosarkomos ląsteles nepriklausomai nuo faktinės p53 būklės ir sukelti nuo p53 nepriklausomą vėžinių ląstelių apoptozę. Ši savybė daro AgNP patrauklius kandidatus į naujus chemoterapinius metodus.

Įvadas

Nepaisant reikšmingų navikų vystymosi ir progresavimo supratimo ląstelių ir molekuliniais lygmenimis pažangos, metastazavusių ir pasikartojančių vėžių valdymas vis dar tebėra didžiulė užduotis 1 . Per pastarąjį dešimtmetį buvo sukurtos perspektyvios alternatyvios įvairių formų vėžio gydymo strategijos, daugelis jų pagrįstos unikaliomis fizikinėmis ir cheminėmis organinių ir neorganinių nanodalelių sistemų 2, 3, 4 savybėmis.

Nustatyta, kad sidabro nanodalelės (AgNP) pasižymi stipriomis antimikrobinėmis savybėmis 5, tačiau jų vidinis citotoksinis ir priešnavikinis aktyvumas patikimai įrodytas tik prieš kelerius metus - 6, 7, 8, 9 . Naujausi tyrimai su žiurkėmis, sergančiomis Pliss limfosarkoma, Daltono ascito naviko modeliu ir krūties vėžiu ksenografu padengtomis pelėmis patvirtino, kad AgNP slopina naviko audinių augimą in vivo 10, 11, 12 . AgNP sukėlė vėžio ląstelių apoptozę, sustabdė ląstelių ciklą ir sumažino storosios žarnos vėžio ląstelių gyvybingumą in vitro 13, 14, 15, 16 . Labai elegantiškas daugelio vaistų atsparumo vėžio modelio tyrimas atskleidė sustiprėjusį priešnavikinį AgNP, veikiančio ląstelėse įsiskverbiančius peptidus 17, poveikį. Tai rodo, kad nanodalelių paviršiaus modifikavimas gali padidinti jų efektyvumą ir vėžio ląstelių specifiškumą in vivo .

Dėl šių citotoksinių savybių ir dėl plataus sidabro nanodalelių taikymo, įvairiais modeliais 18, 19, 20, 21 buvo intensyviai tiriamas AgNP sukeltų ląstelių mirties molekulinis fonas. Išsamūs toksikologiniai tyrimai parodė, kad AgNPs naikina ląsteles per Trojos arklio tipo mechanizmą, ir tai rodo, kad į ląstelę susikaupusios nanodalelės išskiria toksiškus sidabro jonus 22 . Šie jonai skatina reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) susidarymą, todėl ląstelių redokso homeostazė tampa nesubalansuota 23, 24 . Tada reaktyviosios rūšys nukreiptos į biomolekules ir ląstelių organelius, sukeliančius membranos sutrikimą, citoskeleto sutrikimą ir genotoksinius pažeidimus, kurie iš viso prisideda prie apoptozinio proceso pradžios. 25, 26, 27 . Vis dar diskutuojama, ar dalelės per se , sidabro jonų kiekis ar šių medžiagų derinys skatina AgNP toksiškumą. Visuotinai pripažįstama, kad AgNP sukeltas ląstelių žūtis pirmiausia yra oksidacinio pažeidimo rezultatas, tačiau įvairiose ataskaitose nurodoma, kad stebėtas oksidacinis stresas nepriklauso nuo sidabro jonų 28, 29 toksiškumo.

Keliuose naujausiuose leidiniuose teigiama, kad santykinis nanodalelių paviršius yra susijęs su jų sidabro jonų atpalaidavimo galimybėmis, todėl mažesnių nanodalelių citotoksinis polinkis yra didesnis ( 30, 31, 32) . Buvo pranešta, kad 5 nm AgNP buvo toksiškesni, palyginti su 20 nm ir 50 nm dalelėmis keturiose skirtingose ​​ląstelių linijose 33 . Mažesni AgNP indukuoja interleukino 8 išsiskyrimą ir ROS susidarymą didesniu laipsniu nei didesnės nanodalelės 24 . Tuo tarpu kitame tyrime buvo pastebėtas padidėjęs laktato dehidrogenazės išsiskyrimas ir mažesnis ląstelių gyvybingumas dėl 100 nm dydžio dalelių, palyginti su gydymu 10 nm ir 50 nm dydžio AgNP. Atsižvelgiant į kartais klaidinančią informaciją apie nanodalelių dydžio įtaką citotoksinėms savybėms, galima įsivaizduoti, kad mažesnės ir didesnės dalelės nukreipia ir suaktyvina įvairius ląstelių mechanizmus, lemiančius ląstelių mirtį.

Aukščiau paminėti tyrimai pateikė įrodymų apie priešnavikinį AgNP poveikį, vis dėlto vėžio ląstelėse yra daugybė mechanizmų, skirtų įveikti priešvėžinių agentų sukeltą ląstelių stresą. Viena iš palankiausių strategijų siekiant išvengti ląstelių mirties yra naviko slopintuvų, tokių kaip p53, inaktyvavimas. Paprastai p53 yra daugiafunkcinė platforma, skirta įveikti ląstelių sutrikimus, tokius kaip oksidacinis stresas, hipoksija, šilumos šokas ir onkogenų aktyvacija, tačiau pripažįstama, kad DNR pažeidimai yra pagrindinis nuo p53 priklausomo signalinio kelio 35 aktyvatorius. P53 aktyvinimas yra susijęs su jo kaupimu, dėl kurio padidėja p53 reaguojančių genų transkripcija, kurie tarpininkauja ląstelių ciklo sustabdymui ir, svarbiausia, inicijuoja apoptozę 36, 37, 38 . Kadangi p53 daugiausia suaktyvina branduoliniai sutrikimai, dažniausiai naudojami chemoterapiniai vaistai, tokie kaip cisplatina, doksorubicinas ir etopozidas, DNR sukelia p53 sąlygojamų ląstelių mirtį 39 . Beveik 50% visų žmonių vėžio atvejų buvo sutrikusi p53 funkcija, dėl kurios sumažėja terapinis veiksmingumas 40 . Kadangi p53 - / - vėžys dažnai pasireiškia cheminiu atsparumu priešvėžiniams vaistams, galima nustatyti tvirtą ryšį tarp p53 būklės ir terapinio rezultato 40, 41 . Vėžinės ląstelės įvairiais mechanizmais sugeba atsikratyti naviko slopinančio p53 poveikio. Pavyzdžiui, taškinės mutacijos DNR rišančiame domene gali sukelti baltymų variantus, kurie nesugeba prisijungti prie tikslinių genų 42, 43 reguliavimo sričių. Kitas galimas būdas pašalinti p53 - jo chromosomų lokuso ištrynimas iš genomo. Nors dėl p53 inaktyvavimo gana sudėtinga pašalinti vaistus nuo vėžio ląstelių, tačiau nuo p53 nepriklausomi apoptoziniai keliai gali būti naudojami kuriant ir kuriant vaistą. Pvz., Nukreipimas į mitochondrijas gali būti perspektyvi alternatyva, nes jos struktūros pažeidimas tiesiogiai sukelia apoptozinę ląstelių mirtį, nes sutrikdomas mitochondrijų membranos potencialas, išsiskiria citochromo c ir apoptosomos. Be to, ER stresas arba autofagija taip pat gali sukelti vėžinių ląstelių apoptozę nepriklausomai nuo p53. 44, 45, 46, 47 .

Kadangi p53 naviko slopintuvo geno pažeidimai yra dažniausiai aptinkami genetiniai žmogaus navikų pokyčiai 48, mūsų pagrindinis tikslas buvo ištirti, ar faktinė vėžinių ląstelių p53 būklė turės įtakos AgNP sukeltiems molekuliniams mechanizmams. Mes iškėlėme hipotezę, kad AgNP išprovokuota ląstelių mirtis gali būti realizuota tiek aktyvinant p53, tiek stimuliuojant nuo p53 nepriklausomus įvykius. Norėdami įrodyti šią hipotezę, mes panaudojome pavyzdinę sistemą, kurioje yra dvi osteosarkomos vėžio ląstelių linijos - laukinio tipo p53-ekspresuojančios U2O ir p53 - niekinių mutantų Saos-2 ląstelės - ir ištyrėme ląstelių įvykius po AgNP skyrimo. Norėdami išspręsti AgNP sukeltos ląstelių mirties nuo dalelių dydžio klausimą, abiejose ląstelių linijose pritaikėme biologiškai suderinamus 5 nm ir 35 nm dydžio citrinu dengtus AgNP. Šiame tyrime pirmą kartą parodome, kad nors gydymas AgNP aktyvina p53 p53, turinčiose osteosarkomos ląsteles, pagrindinis AgNP poveikis yra mitochondrijų streso, sukeliančio vėžio ląstelių apoptozę nepriklausomai nuo p53, sukėlimas.

Rezultatai

Citratu dengtų AgNP sintezė ir apibūdinimas

Norėdami išanalizuoti AgNP priešvėžinį aktyvumą, mes susintetinome skirtingų dydžių kvazirferinius citratu dengtus sidabro nanodaleles. Biologiškai suderinamas natrio citratas buvo naudojamas kaip redukuojanti ir dengianti medžiaga. Mūsų naudojamas metodas pasirodė tinkamas norimų dydžių stabilių AgNP tirpalų sintezei (1a pav.). Gautų koloidinių AgNP tirpalų UV-VIS spektrų charakteristika yra didžiausia, kai didžiausias maksimumas yra apie 400 nm, o tai galima priskirti paviršiaus plazmono rezonansui (S1 pav.). Paruoštų dalelių dydžio pasiskirstymas buvo įvertintas atliekant elektroninio mikroskopo (TEM) vaizdo analizę ir patikrintas naudojant dinaminį šviesos sklaidą (DLS). TEM ir DLS patvirtino sėkmingą kvazirferinių AgNPs, kurių vidutinis skersmuo yra 5 nm ir 35 nm, gamybą (1b pav., S2a, b pav., S1 lentelė). Nanodalelių mėginių, turinčių mažesnius AgNP, pasiskirstymas yra siauras (maždaug 2–15 nm), tačiau didesni AgNP rodo platų dalelių skersmens diapazoną (maždaug 10–70 nm). AgNP stabilumas buvo patikrintas DLS matavimais po 24 valandų brandinimo DMEM serume arba DMEM, pridėtame su 10% FBS. Remiantis kitais nanodalelių stabilumo tyrimais 49, AgNPs sudarė agregatus be serumo DMEM (S2c pav., D pav.), Tačiau nanodalelės, praskiestos toje pačioje terpėje su 10% FBS, pasirodė stabilios (S2e pav., F). Todėl, apdorojant AgNP, nanodalelės buvo ištirpintos pilnoje mitybinėje terpėje, kurioje buvo FBS. Zeta potencialo matavimai parodė, kad citratu padengtos nanodalelės turi neigiamą krūvį tiek vandeniniame tirpale, tiek skirtingose ​​kultūrinėse terpėse (S1 lentelė).

Image

a ) Atskirų dydžių citratu dengtų AgNP TEM mikrografiniai vaizdai. ( b ) Nanodalelių dydžio pasiskirstymas buvo nustatytas atliekant TEM vaizdo analizę. ( c – f ) p53 ekspresuojančių U2O ir p53 trūkumų turinčių „Saos-2“ ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu, praėjus 24 ir 48 valandoms po 5 nm arba 35 nm dydžio AgNP. Kiekvienas taškas parodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidutinę vertę su paklaida (SD). ( g ) Sumažėjęs U2Os ir Saos-2 ląstelių proliferacinis aktyvumas buvo pastebėtas po 24 val. apdorojimo AgNP, kaip nustatyta matuojant BrdU įsiskverbimą. * P ≤ 0, 01, ** P ≤ 0, 001, Dunnett'o daugybinių palyginimų testas. ( h ) gydymas cisplatina sumažino laukinio tipo p53 ekspresuojančių U2O gyvybingumą, tačiau neturėjo įtakos p53 turinčio Saos-2 gyvybingumui. ** P ≤ 0, 001, Sidako daugybinių palyginimų testas.

Visas dydis

AgNPs naikina osteosarkominio vėžio ląsteles, turinčias skirtingą p53 būseną

Laukinio tipo p53 ekspresuojančios U2Os ir p53 deficitinės Saos-2 osteosarkomos ląstelės buvo apdorotos 5 ir 35 nm dydžio AgNP įvairiomis koncentracijomis (5–100 μM) 24 arba 48 valandas, o ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu (1c pav. –F). Mažesnės nanodalelės turėjo aukštesnes citotoksines savybes nei didesnės, nei po 24 valandų ekspozicijos: 5 nm AgNP sumažino ląstelių gyvybingumą jau esant 15–20 μM koncentracijai, o reikšmingas metabolinio aktyvumo praradimas buvo pasiektas tik esant 40 μM koncentracijai, veikiant 35 nm AgNP. 48 valandų trukmės nanodalelių skyrimas sumažino ląstelių gyvybingumą, palyginti su 24 valandų gydymu, ir tai parodė nuo laiko priklausomą AgNP citotoksiškumą. IC50 vertės, atitinkančios du AgNP dydžius, tiek apdorojant 24, tiek 48 valandas buvo apskaičiuotos naudojant duomenis, gautus iš MTT tyrimų (1 lentelė). Kadangi U2O ir p53 trūkumų turinčių Saos-2 ląstelių IC50 vertės buvo aptiktos tik nedideliais skirtumais, mūsų rezultatai rodo, kad AgNP taip pat gali sukelti vėžio ląstelių mirtį nuo p53 nepriklausomu būdu.

Pilno dydžio lentelė

Siekdami ištirti, ar mažesnių ir didesnių dydžių AgNP naikina vėžio ląsteles, puolant skirtingus ar identiškus ląstelių taikinius, mes osteosarkomines ląsteles gydėme AgNP, kurių koncentracija prilygsta apskaičiuotoms IC50 reikšmėms (ty 5 nm AgNP buvo naudojami 20 μM, tuo tarpu 35 nm AgNP). esant 85 μM koncentracijai). Abiejų dydžių AgNP administracijoms buvo nustatytas sumažėjęs U2Os ir Saos-2 ląstelių proliferacinis aktyvumas. Nuo S-fazės priklausomas BrdU įtraukimas parodė antiproliferacinį nanodalelių poveikį pasirinktomis koncentracijomis (1g pav.).

Norint palyginti priešvėžinį AgNP poveikį su kliniškai naudojamu chemoterapiniu preparatu p53 ekspresuojančioms ir p53 trūkumą turinčioms osteosarkomos ląstelėms, U2Os ir Saos-2 ląstelės buvo gydomos cisplatina įvairiomis koncentracijomis, o ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas po 24 val. Taikytos koncentracijos cisplatina neturėjo įtakos p53 trūkumą turinčių Saos-2 ląstelių gyvybingumui, o laukinio tipo p53 ekspresuojančios U2Os ląstelės parodė didesnį jautrumą gydymui cisplatina. (1h pav.).

Tiek laukinio tipo p53 ekspresuojančios U2O, tiek p53 turinčios Saos-2 osteosarkomos ląstelės parodė sumažėjusį ląstelių gyvybingumą ir metabolinio aktyvumo praradimą, kai buvo gydoma 5 arba 35 nm dydžio AgNP. Stebėta vėžio ląstelių mirtis, kurią išprovokavo AgNPs, gali būti apoptozės įvykdymo rezultatas. Norėdami patvirtinti apoptozės dalyvavimą AgNP išprovokuotuose ląsteliniuose įvykiuose, pirmiausia atlikome morfologinę analizę 5 nm ir 35 nm dydžio AgNP paveiktose ląstelėse. Šis tyrimas atskleidė suskaidytas tubulino skaidulas, susitraukusius branduolius ir sumažintą citoplazmos tūrį abiejose osteosarkomos ląstelių linijose (2a pav.).

Image

( a ) Konfokusinė tubulino skaidulų ir branduolių mikroskopinė vizualizacija rodo apoptozinę U2Os ir Saos-2 ląstelių morfologiją po gydymo AgNP. AgNP paveiktose U2Os ir Saos-2 ląstelėse branduolių ir citoplazmų plotas buvo žymiai sumažintas, palyginti su neapdorotų ląstelių plotu. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, Tukey daugybinių palyginimų testas. ( b ) 5 nm ir 35 nm dydžio apdorojimas AgNP padidino ląstelių, kuriose yra suskaidytos kaspazės 3, skaičių. Ląstelių, turinčių suskaidytą kaspazę 3, skaičius buvo nustatytas po apdorojimo AgNP ir išreikštas viso ląstelių skaičiaus procentais. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, Tukey daugybinių palyginimų testas. ( c ) Padidėjęs aneksinoV ir PI teigiamų ląstelių santykis buvo pastebėtas po 24 valandų gydymo AgNP p53 trūkumu turinčiose Saos-2 ląstelėse. Duomenų srauto citometrijos duomenų taškiniai brėžiniai rodo, kad tiek 5 nm, tiek 35 nm AgNP apdorojimas sukėlė apoptozę.

Visas dydis

Apoptozės indukcija buvo patikrinta imuniniu būdu padengus U2Os ir Saos-2 ląsteles suskaidytu kaspazės 3 specifiniu antikūnu po apdorojimo 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNP 24 valandas (2b pav.). Išskaidytos kaspazės 3 teigiamos ląstelės buvo suskaičiuotos ir išreikštos bendro ląstelių skaičiaus procentine dalimi. 5 nm ir 35 nm dydžio AgNP sukėlė kaspazės 3 aktyvaciją tuo pačiu laipsniu abiejose osteosarkomos ląstelių linijose.

Galiausiai mes norėjome įrodyti, kad nuo p53 nepriklausoma kaspazės 3 aktyvacija yra išimtinai apoptozės rezultatas, o nekrotinių ląstelių žūtis neprisideda prie anksčiau stebėto citotoksiškumo. Todėl 24 valandas mes apdorojome „Saos-2“ ląsteles 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNP, o apoptozinių (Q2 + Q3) ir nekrozinių (Q1) ląstelių procentas buvo nustatytas srauto citometrijos metodu, naudojant „AnnexinV“. / PI tyrimas. Reprezentatyvūs srauto citometrijos duomenų taškiniai brėžiniai (2c pav.) Rodo, kad tiek 5 nm, tiek 35 nm AgNP apdorojimas sukėlė apoptozę Saos-2 ląstelėse.

AgNP imasi osteosarkomos ląstelės

Apdorotų U2Os ląstelių paviršiuje SEM buvo pastebėti agreguoti AgNPs, rodantys dalelių prisitvirtinimą prie ląstelės membranos (3a pav.). Mėginių cheminė sudėtis, nustatyta elektronų mikroskopu naudojant EDS detektorių, papildomai patikrino, ar nėra sidabro nanodalelių (3b pav.). Abiejų dydžių AgNP pasirodė ne tik ląstelės paviršiuje, bet ir buvo internalizuoti U2Os ir Saos-2 ląstelėse. Remiantis TEM mikrografais, AgNP lokalizavosi membranos dengtuose daugialypiuose ir daugiasluoksniuose kūnuose ir taip pat buvo išsklaidyti citoplazmoje. Branduoliuose ir mitochondrijose neaptikta nanodalelių (3c – d pav.). U2Os ląstelėse 35 nm dydžio AgNP buvo lokalizuoti tiek membranos dengtuose kūnuose, tiek išsisklaidę citoplazmoje, o 5 nm dydžio sferiniai objektai buvo identifikuoti kaip AgNP elektronų tankiose endosomose (3c pav.). „Saos-2“ ląstelėse abiejų dydžių AgNP buvo deponuoti vezikuliniuose kūnuose. Įdomu tai, kad šiose ląstelėse taip pat buvo pastebėtos membranos padengtos ląstelių organelės, galinčios parodyti su autofagija susijusių mechanizmų įtraukimą į AgNP sukeltą toksiškumą (3d pav.).

Image

a ) SEM mikrografiniuose vaizduose yra 5 nm ir 35 nm dydžio AgNP, pritvirtinti prie U2Os ląstelių membranos. ( b ) AgNP apdorotų U2Os ląstelių EDS spektrai. Au piko atsiranda dėl aukso dangos, naudojamos SEM mėginių paruošimui. AgNP apdorotų U2Os ( c ) ir Saos-2 ląstelių ( d ) TEM mikrografiniai vaizdai. Balta rodyklė rodo tankią AgNP, kurioje yra endosomų. Juodos rodyklės nurodo į ląstelių AgNP. c - citoplazma, n - branduoliai. Žvaigždutė nurodo membranomis padengtas ląstelių organeliles.

Visas dydis

AgNP stimuliuoja p53 signalizaciją

Norėdami patikrinti, ar nuo p53 priklausomas signalizacijos kelias yra suaktyvinamas pavartojus AgNP, mes ištyrėme p53 baltymų lygį ir transakcionavimo galimybes. Be to, buvo tiriama santykinė p53 taikinių genų ekspresija.

Tam mes U2Os ląsteles apdorojome 0; 10; 15; 20 μM 5 nm ir 0; 40; 60; 85 μM 35 nm dydžio AgNP ir atlikta Western blot analizė ištisų ląstelių lizatų. P53 baltymo lygis pastebimai padidėjo po 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNP gydymo, kas rodo naviko slopintuvo baltymo stabilizavimą (4a pav.). Atsižvelgiant į lūkesčius, Vakarų blotai parodė, kad „Saos-2“ ląstelėse nėra jokio p53 baltymo (4b pav.).

Image

a ) reprezentaciniai vakarų pultai 0; 10; 15; 20 μM 5 nm ir 0; 40; 60; 85 μM 35 nm dydžio AgNP apdorotos U2Os ląstelės. Abiejų dydžių AgNP apdorojimas stabilizavo p53 baltymą. ( b ) Saos-2 ląstelės neturi jokio p53 baltymo. U2Os ekstraktas buvo naudojamas kaip p53 baltymas, turintis teigiamą kontrolę. c ) AgNP gydymas sukelia p53 reaguojančio mdm2 promotoriaus aktyvumą U2Os ląstelėse. Saos-2 ląstelėse neaptikta jokio aktyvumo. pCMV-Luc buvo naudojamas kaip teigiama „Saos-2“ transfekcijų kontrolė. ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 Dunnett'o daugybinių palyginimų testas. ( d ) 5 nm ir 35 nm AgNP paveiktose U2Os ląstelėse buvo aptikti padidėję p53, p21, bax, kaspazės 3 kiekiai ir sumažėjęs survivino mRNR kiekis. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, Sidako daugybinių palyginimų testas. e) AgNP gydymas ektopiškai sunaikina p53 ekspresuojančias Saos-2 ląsteles didesniu laipsniu nei tuščias vektorius, kurio pHC624 yra kontrolinės ląstelės. Naudojant Western blot metodą, buvo patikrinta, ar sėkmingai užfiksuota negimdinė raiška. *** P ≤ 0, 001, **** P ≤ 0, 0001, Tukey daugybinių palyginimų testas.

Visas dydis

Norint patikrinti, ar p53 ne tik stabilizuotas, bet ir funkciškai suaktyvintas AgNP ekspozicijose, U2Os ląstelės buvo laikinai transfekuotos 1 μg pGL2-mdm2-Luc vektoriu, išreiškiančiu luciferazės reporterio geną, kontroliuojamą m5m2 reaguojančio p53 promotoriaus. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo apdorotos 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNPs, o kitą dieną buvo išmatuotas luciferazės aktyvumas. Į p53 reaguojančio promotoriaus aktyvumas žymiai padidėjo, tai rodo padidėjusį p53 operatyvinį aktyvumą vartojant AgNP (4c pav.). Norint įrodyti, kad stebimas promotoriaus aktyvumas išimtinai priklauso nuo p53, panašus eksperimentas buvo atliktas ir su p53 turinčiomis Saos-2 ląstelėmis. Kaip ir tikėtasi, Saos-2 ląstelėse nebuvo aptiktas mdm2 promotoriaus aktyvumas, o CMV promotoriaus varomas reporteris, naudojamas kaip teigiama transfekcijos kontrolė, parodė aukštą šių ląstelių aktyvumą (4c pav.). Dėl AgNP skyrimo U2Os ląstelėse RT-qPCR aptikta reikšmingai padidėjusių p53 ir p53 mRNR lygių p21 ir bax . Be to, pakito ir su apoptoze susijusių genų nuorašo lygiai, nes buvo išmatuotas sumažėjęs išgyvenivino ir padidėjęs 3 kaspazės mRNR lygis (4d pav.).

Norėdami išsiaiškinti, ar negimdinė p53 išraiška p53 trūkumu turinčiose „Saos-2“ ląstelėse turi įtakos ląstelių atsakui į AgNP ekspozicijas, mes transfekavome „Saos-2“ ląsteles FLAG pažymėtomis p53 ekspresuojančiomis pCDNA3 vektoriais. Laikinai transfekuotos ląstelės 24 valandas buvo gydomos netoksiškomis AgNP dozėmis (15 μM 5 nm ir 60 μM 35 nm), o vėliau ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas MTT tyrimu. Pažymėtina, kad nors šios AgNP koncentracijos neturėjo įtakos tuščių vektorių perkeltų Saos-2 ląstelių gyvybingumui, reikšmingas gyvybingumo praradimas buvo nustatytas p53 ekspresuojančiose ląstelėse. P53 raiška transfekuotose ląstelėse buvo patikrinta atliekant Western blot analizės biologinius eksperimentų pakartojimus. Be to, gydymas AgNP stabilizavo p53 baltymą Saos-2 ląstelėse, panašiai kaip mūsų ankstesni stebėjimai apie endogeninį p53 U2Os ląstelėse (4e pav.).

AgNPs nukreiptos į mitochondrijas

Aukščiau aprašyti rezultatai parodė, kad gydymas abiejų dydžių AgNP aktyvuoja p53 signalizaciją. Be to, apoptozinis atsakas buvo aptiktas ne tik U2Os ląstelėse, bet ir p53 niekinių mutantų „Saos-2“ ląstelėse. Tai rodo, kad AgNP sukeltos ląstelės mirties tarpininkas taip pat gali būti nuo p53 nepriklausomų įvykių rezultatas. Ištirti, ar AgNPs nukreiptos į mitochondrijas tiek U2Os, tiek Saos-2 ląstelėse, 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNP apdorotos ląstelės buvo nudažytos JC-1 ir vizualizuotos fluorescencine mikroskopija. Mikroskopiniai vaizdai parodė, kad raudonųjų JC-1 agregatų fluorescencinis intensyvumas sumažėjo, o žaliųjų JC-1 monomerų intensyvumas padidėjo apdorojant AgNP abejose ląstelių linijose, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis. Dėl to sumažėjęs raudonos ir žalios fluorescencijos santykis rodo mitochondrijų membranos potencialo praradimą (5a – c pav.). Be to, gydymas AgNP sukėlė citochromo c išsiskyrimą į citoplazmą abiejose ląstelių linijose, patvirtindamas mitochondrijų apoptozės kelio aktyvavimą (5d pav.). Kadangi mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su oksidaciniu stresu, mes ištyrėme ROS susidarymo laipsnį gydydami AgNP. Abiejose osteosarkomos ląstelių linijose 20 μM 5 nm ir 85 μM 35 nm dydžio AgNP sukėlė reikšmingą ROS susidarymą, papildomai palaikydami mitochondrijų pažeidimus (5e, f pav.).

Image

Sumažėjęs mitochondrijų membranos potencialas buvo aptiktas 5 nm ir 35 nm AgNP apdorotomis U2Os ( a ) ir Saos-2 ( b ) ląstelėmis, naudojant dažymą JC-1. c ) Raudonos ir žalios fluorescencinis santykis buvo nustatytas atliekant fluorescencinę mikroskopinę vaizdo analizę. ** P ≤ 0, 01 Dunnett'o daugybinių palyginimų testas. ( d ) Padidėjęs citoplazminio citochromo c lygis buvo nustatytas 5 nm ir 35 nm AgNP apdorotose U2Os ir Saos-2 ląstelėse, naudojant Western blot metodą. e ) Tipiniai fluorescenciniai DCFDA dažytų U2O ir Saos-2 ląstelių mikroskopiniai vaizdai rodo padidėjusį ROS lygį apdorojant AgNP. Masto juosta: 40 μm. ( f ) mikroskopinių vaizdų fluorescencinis intensyvumas buvo nustatytas atliekant vaizdų analizę. * P ≤ 0, 0001 Dunnett daugybinių palyginimų testas.

Visas dydis

Diskusija

Naviko slopintuvus inaktyvuoja beveik visų tipų žmogaus vėžys 50 . Be kita ko, naviko slopintuvas p53 skatina ląstelių ciklo sustabdymą ir inicijuoja apoptozę, kad iš organizmo pašalintų genetiškai nestabilias ląsteles ir taip užkirstų kelią vėžio transformacijai. Šių veiksnių ląstelių ciklą reguliuojančių ir ląstelių mirtį inicijuojančių funkcijų trūkumas užginčija vidinį ir vaistų terapijos sukeltą apoptozinį vėžio ląstelių pašalinimą. Dėl žadamų savybių pastaruoju metu intensyviai tiriamas galimas AgNP taikymas vėžio terapijoje. Jau buvo pranešta, kad AgNP stimuliuoja į p53 reaguojančią genų ekspresiją 51, 52, o tai rodo, kad ląstelių veikimas AgNP sukelia apoptozę stimuliuodamas p53 signalizaciją. Taigi, mes iškėlėme šiuos klausimus: i, ar AgNP gali nužudyti p53 trūkumo vėžines ląsteles, ii, jei jie tai daro, koks yra nuo p53 nepriklausomo AgNP toksiškumo mechanizmas, iii, ar šie mechanizmai priklauso nuo tikrojo taikomus AgNP. Norėdami atsakyti į šiuos klausimus, palyginome apoptotinį p53 įgudusių U2O ir p53 trūkumų turinčių Saos-2 osteosarkomos vėžio ląstelių atsaką, gydant 5 nm ir 35 nm AgNP.

Pirmiausia susintetinome mažesnių ir didesnių dydžių AgNP modifikuotu Lee-Meisel metodu ir atlikome gautų nanodalelių apibūdinimą. TEM analizė atskleidė platesnį nanodalelių populiacijos pasiskirstymą pagal dydį dėl taikomo sintezės metodo.

Norėdami ištirti nuo p53 priklausomą AgNP toksinį poveikį osteosarkomos ląstelėms, gydėme laukinio tipo p53 ekspresuojančius U2O ir p53 trūkumą turinčias Saos-2 ląsteles sintetintais 5 nm ir 35 nm dydžio AgNP. Panašiai kaip ir naujausių tyrimų, susijusių su nanodalelių 30, 31, 32 toksiškumu, rezultatais, mes nustatėme, kad mažesnės, 5 nm dydžio nanodalelės turėjo stipresnį citotoksinį poveikį, palyginti su didesniais, 35 nm dydžio, AgNP abiejose ląstelių linijose. Taip pat stebėjome nuo laiko priklausomą AgNP toksiškumą, nes po 48 valandų AgNP ekspozicijos nustatytos IC 50 vertės nukrito maždaug perpus mažesnės už tas, kurios buvo apskaičiuotos 24 valandų gydymui (1c – f pav. Ir 1 lentelė). Nors mažesnės AgNPs pasirodė labiau toksiškos nei didesnės tiriamose ląstelių linijose, mes siekėme išsiaiškinti, ar mažesnių ir didesnių AgNP sukelta vėžio ląstelių mirtis apima identiškus mechanizmus, ar skirtingo dydžio nanodalelės pasiekia savo toksiškumą suaktyvindamos skirtingus kelius. . Tam tikslui mes panaudojome 5 nm ir 35 nm AgNP koncentracijose, atitinkančiose atitinkamas IC 50 reikšmes, kad tokiu pat mastu sunaikintume vėžio ląsteles ir išbandėme pagrindinius apoptozinius požymius navikinėse ląstelėse, veikiamose skirtingo dydžio AgNP.

Ląstelių gyvybingumo eksperimentai atskleidė, kad tiek p53 ekspresuojančios U2O, tiek p53 deficitinės Saos-2 ląstelės buvo nužudytos beveik tuo pačiu laipsniu, naudojant gydymą AgNP. Nors stebėjome nedidelius AgNP toksiškumo skirtumus tarp U2Os ir Saos-2 ląstelių, AgNP reikšmingai sumažino abiejų šių osteosarkomos ląstelių linijų išgyvenamumą priklausomai nuo koncentracijos. Aptikę aneksino V ir PI dvigubai teigiamas Saos-2 ląsteles, kai ekspozicija buvo 5 ir 35 nm AgNP, todėl šios nanodalelės taip pat gali sukelti apoptozę, nesant p53. Kaspazės aktyvacijos mastas, atsispindintis prokapazės 3 skilime ir konfokalinėje ląstelių morfologijos mikroskopinėje analizėje, dar kartą patvirtino apoptozinių mechanizmų indukciją abiejose ląstelių linijose, vartojant AgNP (2 pav.). Be to, po gydymo AgNP buvo nustatytas sumažėjęs proliferacijos aktyvumas abiejų tipų osteosarkomos ląstelėse, papildomai patikrinant, ar AgNP taip pat sugeba sukelti vėžinių ląstelių augimą ir nepriklausomai nuo p53 (1g pav.).

Kadangi mitochondrijų stresas gali tiesiogiai sukelti apoptozę, nedalyvaujant p53, mes ištyrėme, ar AgNP gydomose osteosarkomos ląstelėse buvo modifikuotos mitochondrijų funkcijos. Taikant AgNP, tiek p53 turinčiuose U2O, tiek p53 trūkumu turinčiuose Saos-2 ląstelėse buvo aptiktas mitochondrijų membranos praradimas, padidėjęs citochromo c baltymo nutekėjimas į citoplazmą ir padidėjęs ROS lygis, rodantis, kad AgNP sukelia abiejų rūšių mitochondrijų stresą. ląstelių linijos (5 pav.). Kadangi ROS paprastai sukelia p53 aktyvaciją, mes ištyrėme, ar p53 funkcijos buvo aktyvuotos AgNP apdorotose U2Os ląstelėse. Dėl AgNP ekspozicijų stebėjome p53 stabilizavimąsi ir padidėjusią operatyvinę funkciją (4a, c pav.). Be to, mes nustatėme padidėjusį p53 , p21 , bax , kaspazės 3 kiekį ir sumažėjusį išgyvenivino mRNR lygį, dar kartą patvirtindami p53 signalo stimuliavimą gydydami AgNP (4d pav.). Galiausiai, pastebėtas sumažėjęs AgNP gydytų „Saos-2“ ląstelių, kurios ektopiškai ekspresuoja p53, gyvybingumas dar labiau patvirtino idėją, kad p53 prisidėjo prie AgNP sukeltos apoptozės (4 pav. 4e).

Nors p53 signalizavimas U2Os ląstelėse yra stimuliuojamas dėl gydymo AgNP, gauti duomenys apie gyvybingumą p53 neturinčiose Saos-2 ląstelėse rodo, kad AgNP sukelta apoptozė gali būti nuo p53 nepriklausomų įvykių, tokių kaip anksčiau nustatyta mitochondrijų disfunkcija, rezultatas. Kadangi ląstelių paviršiuje ir citoplazmoje mes nustatėme mažesnių ir didesnių dydžių AgNP (3 pav.), Bet mitochondrijose ir branduoliuose dalelių neaptikome, galima hipotezuoti, kad sidabro jonai, išsiskiriantys iš nanodalelių, yra atsakingi už stebimus mitochondrijų stresas tiek p53 ekspresuojančiose, tiek p53 turinčiose osteosarkomos ląstelėse. Iš viso mūsų rezultatai rodo, kad pagrindinis AgNP išprovokuotų vėžio ląstelių apoptozės induktorius yra mitochondrinis stresas, o p53 signalo perdavimo kelio aktyvavimas yra tik antrinis poveikis.

5N ir 35 nm dydžio AgNPs taikomose koncentracijose turėjo maždaug tokį patį poveikį visiems tiriamiems ląstelių įvykiams, įskaitant kaspazės 3 aktyvaciją, proliferacijos aktyvumą, p53 indukciją, mitochondrijų funkcijos praradimą ir ROS susidarymą (1c – g, 2 pav.)., 4 ir 5). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad šiame tyrime naudojami skirtingo dydžio AgNP turi bendrus ląstelių taikinius ir sukelia vienodus apoptozinius kelius ir pirmiausia veikia mitochondrijų stresą.

Išvada: šiame tyrime mes teikiame tolesnę paramą galimam AgNP taikymui vėžio terapijoje. Čia parodyta, kad tiek 5 nm, tiek 35 nm dydžio AgNP imasi osteosarkomos ląstelės ir sukelia vienodus kelius U2O ir Saos-2 ląstelėse. Mes taip pat parodome, kad skirtingo dydžio AgNP gali sunaikinti osteosarkomos ląsteles, nepriklausomai nuo to, ar yra p53. Nors gydymas AgNP aktyvuoja p53 laukinio tipo p53 turinčiose osteosarkomos ląstelėse, mūsų duomenys rodo, kad AgNP gali sukelti mitochondrijų stresą, kuris taip pat gali paskatinti vėžio ląstelių apoptozę nepriklausomai nuo p53.

Kadangi p53 funkcijos pašalinimas yra vienas iš dažniausiai pastebimų žmogaus vėžio sutrikimų, faktas, kad AgNP yra nuo p53 nepriklausomų apoptozinių mechanizmų induktoriai, padidina jų potencialą ir paverčia juos patraukliais naujais kandidatais racionaliai sukurti terapiškai naudingus priešvėžinius agentus.

Metodai

Citratu dengtų AgNP sintezė ir apibūdinimas

Citrato stabilizuotos sidabro nanodalelės buvo susintetintos modifikuotu Lee-Meisel hidroterminės redukcijos metodu pagal Wan ir kt. 53 . Gautų sidabro nanodalelių preparatų ir AgNP dalelių pasiskirstymas pagal dydį ir paviršiaus padengimas (zeta potencialas) laisvuose serumuose ir visose kultūrinėse terpėse buvo įvertinti naudojant „Zetasizer Nano Instrument“ (Marveln, Worchestershire, JK), kur AgNP dispersijos buvo ištirpintos. DMEM terpėje, kurioje yra 2 mM L-glutamino, 0, 01% streptomicino, 0, 005% ampicilino, neturinčio serumo arba papildyta 10% FBS, ir buvo analizuojami 24 valandas po paruošimo. Citratais stabilizuotų AgNP optinių absorbcijos spektrai buvo surinkti UV – VIS spektrometru (Ocean Optics DH-2000-BAL), naudojant 10, 0 mm ilgio kvarcines kiuvetes. Citratu dengtų AgNP suspensijų UV – VIS absorbcijos spektrai buvo surinkti bangų ilgių diapazone 250–900 nm.

Ląstelių kultūros ir gyvybingumo tyrimas

U2Os and Saos-2 cells were purchased from ATCC and maintained in low glucose DMEM in a 5% CO 2 atmosphere at 37 °C. Saos-2 medium was supplemented with 5% FBS, while U2Os cells were cultured in medium containing 10% FBS. Both culture media contained 2 mM L-glutamine, 0.01% streptomycin and 0.005% ampicillin.

To measure cell viability upon AgNP or cisplatin (Accord Healthcare) treatments, MTT mitochondrial activity assay was performed. Cells were seeded into 96 well plates (10 4 cells/well) and treated with AgNPs on the following day. After treatment with AgNPs cells were washed with PBS and incubated with culture medium containing 0.5 mg/ml MTT reagent (Sigma-Aldrich) for two hours at 37 °C. Formazan crystals were solubilized in DMSO and absorbance was measured at 570 nm using a SPECTROstar Nano plate reader. Absorption corresponding to the untreated control samples was considered as 100%. MTT assays were performed using four biological replicates and experiments were repeated at least three times.

BrdU cell proliferation assay

Cell proliferation was determined according to the level of the incorporated 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). 1000 cells/well were seeded into 96 well plates and AgNP treatment was performed on the following day. Cells were exposed to AgNPs for 24 h and BrdU labelling solution was added to the culture medium two hours before the end of the treatment. Cells were fixed and the level of the incorporated BrdU was determined using Cell Proliferation ELISA BrdU assay kit (Roche) following the instruction of the supplier. Proliferation activity of the untreated cells at 0 time point was considered as 100%. BrdU assays were performed using four biological replicates and experiments were repeated at least three times.

Scanning (SEM) and Transmission Electron Microscopy (TEM)

The morphology of synthetized nano-particles was characterized and their primary size was evaluated by TEM using a FEI Tecnai G2 20 x microscope at an acceleration voltage of 200 kV. Based on TEM images size distribution of AgNPs was calculated by ImageJ software.

For TEM imaging of biological samples 10 5 cells were seeded onto 0.4 μm pore polyester membrane inserts (Corning) placed in a 6 well plate. Cells were left to grow until the following day when they were treated with AgNPs for 24 hours and carefully washed and fixed in 4% glutaraldehyde in PBS for 2 hours and subsequently embedded in gelatine (2% gelatine in PBS). The obtained specimen was sliced to 1–2 mm cubes, which were further embedded in epoxy (Epon 812, EMS, PA 19440) by a routine TEM sample preparation protocol. Semi-thin sections of 1 μm were prepared to identify the cell monolayer. Blocks were trimmed, thin sections of 70 nm were obtained and stained with uranyl and lead solutions. Images were captured by a Philips CM10 electron microscope using 100 kV voltage. TEM micrographs were taken by a Megaview G2 digital camera (ITEM, Olympus Soft Imaging Solution GmbH, Münster).

For SEM analysis cells were seeded and grown onto plastic coverslips (Sarstedt) placed in 6 well plates and exposed to AgNPs on the following day. After 24 hour treatment, cells were washed and fixed overnight at 4 °C using 2.5% glutaraldehyde (dissolved in modified Sörensen buffer, pH 7.6). The samples were dehydrated by solutions containing increasing percentage of ethanol in water (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 100%, for 15 min each), followed by a series of tert-butanol:ethanol mixture (1:2, 1:2, 2:1 volume ratio) at room temperature. Then the cells were incubated with tert-butanol overnight at 4 °C and were finally lyophilised. The coverslips were mounted on specimen stubs using electrically conductive double-sided adhesive tape and the sample preparation was completed by a thin (4–5 nm) metal gold-palladium coating needed to decrease charging artefacts and radiation damage of the biological sample. SEM imaging was performed by a Hitachi S4700 electron microscope using 10 kV accelerating voltage and 10 μA emission current. EDS measurements were carried out with a Röntec QX2 EDS detector installed on SEM using 20 kV accelerating voltage and 10 μA emission current.

Apoptosis detection

For studying the cellular morphology to identify typical apoptotic features, cells were cultured on glass coverslips and treated with AgNPs. Treated cells were washed with PBS and fixed on room temperature with 4% paraformaldehyde. Following permeabilisation with 0.3% Triton-X-100 cells were blocked in 5% BSA solution. For detection of tubulin fibres slides were incubated with anti-tubulin (Sigma-Aldrich) antibody in 1:1000 dilution and with anti-mouse Alexa 647 fluorophore-conjugated secondary antibody. Cells were washed twice in PBST and stained with DAPI solution in 1:1000. Samples were visualised by an Olympus FV10i confocal microscope. The area of cell nuclei and of the cytoplasms were determined using ImageJ software.

For the visualisation of cleaved caspase 3, fixed, permeabilised and blocked cells were incubated with cleaved caspase 3 (Asp175) specific antibody (Cell Signaling) followed by incubation with Alexa 647 fluorophore conjugated secondary antibody. Nuclei were stained with DAPI and samples were examined with an OLYMPUS BX51 microscope equipped with Olympus DP70 camera. The number of cleaved caspase 3 containing cells was determined using ImageJ software.

Activation of apoptosis was also shown on the basis of AnnexinV/PI staining of cells. 3 × 10 5 cells were seeded into the wells of 6 well plates and treated with AgNPs on the following day for 24 h. Cells were washed with PBS, trypsinised, collected by centrifugation and re-suspended in AnnexinV Binding Buffer. Cells were stained with Alexa 488-conjugated AnnexinV and PI according to the guideline of the manufacturer (Life Technologies). Fluorescent intensities were determined using a FACScalibur flow cytometer by measuring 10.000 cells and FACS data were analysed by FlowJo V10 software. Experiments were repeated three times using at least two biological replicates.

Vakarų pūtimas

For western blot analysis cells were lysed in sonication buffer (50 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 50 mM NaCl, 1x PIC) and the obtained extract was used as whole cell lysate. Cell debris including mitochondria were pelleted by 13 000 rpm centrifugation from whole cell lysates and supernatants were used as cytoplasmic fractions. Whole cell lysates and cytoplasmic extracts were boiled in protein loading buffer and samples containing 20 μg protein were resolved on SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham). Membranes were blocked with 5% non-fat milk-TBST overnight and washed three times with TBST containing 0.01% Tween. p53 specific antibody (DAKO) was used in 1:2000 dilution, cytochrome c specific antibody (Abcam) was applied in 1:500, M2 anti-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) and anti-actin antibody (Sigma-Aldrich) was used in 1:2500 and in 1:5000 dilution, respectively. Following three washing steps with TBST membranes were incubated with rabbit anti-mouse or goat anti-rabbit (DAKO) horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies. Membranes were developed using ECL reagent (Millipore) following the guidelines of the manufacturer and chemiluminescent signal was detected by a C-DiGit Blot Scanner (LI-COR).

Transient transfection and Luciferase Reporter Assay

For transient transfection 3 × 10 5 cells/well were seeded into 6 well plates. 1 μg of pGL2-mdm2-promoter-Luc reporter plasmid 54 was transfected into each sample using ExGen (Fermentas) and TurboFect (Thermo Scientific) transfection reagents for U2Os and for Saos-2 cells, respectively, according to the guidelines of the suppliers. 1 μg of pCDNA3-p53-FLAG plasmid expressing a FLAG tagged p53 was transfected into Saos-2 cells cultured in 24 well plates. 24 h after transfections the medium was replaced by AgNP containing culture medium. To perform luciferase assay, AgNP-treated cells were collected by centrifugation and luciferase activity was determined from cell lysates using a Luciferase assay kit (Promega) following the manufacturer's instructions. Total protein content of the samples were determined using Bio-Rad Protein Assay reagent and bioluminescent signal was detected by an Orion L Microplate Luminometer and corrected according to the protein content of each sample. Transfections were repeated three times using three independent biological replicates.

RT-qPCR

For RT-qPCR analysis 6 × 10 5 cells were seeded into 6 cm diameter culture plates and treated with AgNPs on the following day for 24 h. By the end of the AgNP expositions total RNA was isolated using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the guideline of the manufacturer. Taqman Reverse Transcription Reagent (Applied Biosystems) was used to generate cDNA using 2 μg of RNA and relative levels of p53 , p21 , bax , survivin 55, p21 and caspase 3 transcripts were quantified by a Pico Real-Time qPCR System (Thermo Scientific) using gene specific primers (Table S2) and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Ribosomal 18S RNA level was measured to calculate relative amount of each transcript using ΔΔCt analysis. RT-qPCR measurements were carried out at least three times using cDNA obtained from three independent experiments.

JC-1 staining

To measure mitochondrial membrane potential, cells were seeded into 6 well plates at 3 × 10 5 cells/well density and treated with AgNPs on the following day. At the end of the treatment AgNP containing media were replaced by 10 μg/mL JC-1 (LifeTechnologies) containing DMEM. After 15 min incubation at 37 °C staining medium was replaced by culture medium and cells were visualised by an OLYMPUS BX51 microscope equipped with Olympus DP70 camera using the same exposition time for all samples. By ImageJ software red to green fluorescent ratio of each sample was determined. Experiments were repeated three times using at least three independent biological replicates.

ROS staining

DCFDA staining assay was performed to measure the total intracellular ROS level upon AgNP treatments. For this, cells were seeded on glass coverslips in 6 well plates (3 × 10 5 cells/well) and treated with nanoparticles on the following day. Cells were washed carefully with pre-warmed PBS and incubated with culture medium containing 10 μM DCFDA (Sigma-Aldrich) in dark for 20 min at 37 °C. Cells were washed two times with PBS and fluorescent signals were visualised by an OLYMPUS BX51 microscope equipped with Olympus DP70 camera. For capturing images the same exposition time was applied for all samples. Fluorescent intensity of the samples was analysed using ImageJ software. Measurements were repeated three times using at least three independent biological replicates.

Statistika

GraphPad Prism 6 Software was used in order to carry out statistical analysis and graphical visualization of the obtained raw data.

Papildoma informacija

How to cite this article : Kovács, D. et al . Silver nanoparticles defeat p53-positive and p53-negative osteosarcoma cells by triggering mitochondrial stress and apoptosis. Mokslas. Rep. 6, 27902; doi: 10.1038/srep27902 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.