Vienos juostos į viršų vykstantys konversijos nanoprobai, skirti multipleksuoti tuo pačiu metu atliekamus vėžinių biomarkerių molekulinius žemėlapius in situ | gamtos komunikacijos

Vienos juostos į viršų vykstantys konversijos nanoprobai, skirti multipleksuoti tuo pačiu metu atliekamus vėžinių biomarkerių molekulinius žemėlapius in situ | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Krūties vėžys
  • Nanotechnologijos sergant vėžiu
  • Naviko biomarkeriai
  • Šio straipsnio „Erratum“ buvo paskelbtas 2015 m. Birželio 12 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Norint nustatyti galimus vėžiui diagnozuoti naviko onkoproteinų gausius diagnostinius žymenis ir tikslines molekules, reikalinga patogi technologija, galinti kiekybiškai išanalizuoti kelis naviko ląstelių ir audinių biomarkerius. Diagnostinė ir prognostinė žmogaus navikų klasifikacija šiuo metu grindžiama vesterno blotinimo ir vienspalviais imunohistocheminiais metodais, kurie netinka daugybiniam aptikimui. Čia pateikiamas bendras ir naujas metodas, kaip paruošti skirtingų spalvų vienos juostos aukštyn virsmo nanodaleles. Trijų biomarkerių ekspresijos lygiai krūties vėžio ląstelėse buvo nustatyti naudojant vienos juostos aukštyn virsmo nanodaleles, Western blotting ir imunohistochemines technologijas, pasižyminčias puikia koreliacija. Svarbu tai, kad pritaikius antikūnų konjuguotas vienos juostos aukštyn virsmo konversijos nanodalelių molekulinio profiliavimo technologiją galima pasiekti daugkartinį biologinių žymeklių biologinį aptikimą in situ krūties vėžio ląstelėse ir audinių mėginiuose bei gauti tikslesnius rezultatus tuo pačiu metu nustatant mažo lygio baltymus. klasikinė imunohistocheminė technologija.

Įvadas

Norint gauti genų ir baltymų profiliavimą, narkotikų patikrą, klinikinę diagnostiką ir aplinkos analizę, labai reikalingas sudėtingas, jautrus ir specifinis molekulinis aptikimas. 1, 2, 3 . Vėžio diagnozei nustatyti galimus diagnostinius biomarkerius ir tikslines molekules iš daugybės naviko onkoproteinų reikia lengvos technologijos, galinčios kiekybiškai išanalizuoti kelis biologinius žymenis naviko ląstelėse ir audiniuose 4, 5, 6, 7, 8 . Diagnostinė ir prognostinė žmogaus navikų klasifikacija šiuo metu remiasi imunofermentų metodais pagrįstais imunohistocheminiais (IHC) metodais su vienos bangos ilgio nustatymu 9, kurie yra šiek tiek pasenę ir orientuoti į patvirtintus antikūnus IHC nustatant vėžinius žymenis. Be to, IHC išlieka pusiau kiekybinis ir subjektyvus, dėl to pastebimi reikšmingi skirtumai tarp stebėtojų ir stebėtojų viduje 10 . Be to, didžiausias molekulinio profiliavimo sunkumas yra tas, kad dauguma navikų (ypač krūties ir prostatos) yra labai nevienalyčiai ir juose yra gerybinių ląstelių, piktybinių ląstelių, fibroblastų, stromos ląstelių, kraujagyslių ląstelių ir infiltruojančių uždegiminių ląstelių (tokių kaip makrofagai ir limfocitai) mišinys. 11 Dabartinės technologijos, tokios kaip atvirkštinė transkripcija - PGR, genų lustai, baltymų lustai, dviejų dimensijų gelio elektroforezė ir masių spektrometrija (pavyzdžiui, matricos pagalba atliekamas lazerio desorbcijos / jonizacijos masės spektrometrija (MALDI-MS), elektropurškimo masės spektrometrija (ES-MS). ir padidinta paviršiaus lazerio desorbcijos / jonizacijos masės spektroskopija (SELDI-MS) nėra tinkamos analizuoti šio tipo heterogeninį 12, 13, 14, 15 tipą . Kitas šių technologijų apribojimas yra tas, kad joms reikia destruktyvaus ląstelių ar audinių pavyzdžių paruošimo kaip homogeniško tirpalo, dėl kurio gali būti prarasta vertinga trijų dimensijų ląstelių ir audinių morfologinė informacija, susijusi su pradiniu naviku.

Palyginus su adsorbcija pagrįstais IHC metodais, fluorescencinis vaizdavimas optiniu mikroskopu suteikia daugybę pranašumų, tokių kaip didesnis aptikimo jautrumas, platesni signalo dinaminiai diapazonai ir linijiškesni ryšiai biomarkerio kiekybiniam įvertinimui ir terapinio atsako numatymui. Iš tiesų naujausi pasiekimai parodė, kad baltymų biomarkerių, kuriuose yra ir fluorescenciniai dažai 16, ir kvantiniai taškai (QD) 17, 18, fluorescencija pagrįsta analizė yra stipriai koreliuojama su klinikiniais rezultatais. Tačiau organinių dažų naudojimą daugiaspalviai fluorescencijai matuoti dažnai riboja fotobalinimas ir poreikis naudoti kelis šviesos šaltinius, kad būtų sužadinti skirtingi fluoroforai. QD suteikia reikšmingų pranašumų, palyginti su įprastais fluorescenciniais dažais, nes jie yra labiau fototapetiniai ir gali būti sužadinami toje pačioje spektrinėje srityje. Tačiau optinė QD trukmė biologinio audinio autofluorescenciniam fonui su tais pačiais sužadinimais mėlynoje arba ultravioletinėje srityje išlieka pagrindine problema. Norint sumažinti šiuos spektrinius trukdžius, QD dažyti bandiniai ilgą laiką turi būti apšviesti, kad prieš įrašant atvaizdus ir spektrus sumažėtų autofluorescencinis fonas (paprastai tai svyruoja nuo sekundžių iki minučių, atsižvelgiant į šviesos šaltinio intensyvumą) 19 . Be to, dėl to, kad QD ir organinių dažų emisijos spektrai sutampa, daugkartiniam vienalaikiam aptikimui in situ reikia vaizdų apdorojimo metodų, tokių kaip spektrinė dekonvoliucija 19, kurie riboja atrankos greitį ir jautrumą. Taigi tinkamų daugialypių molekulinio profiliavimo technologijų kūrimas tebėra sudėtingas uždavinys, kuris yra nepaprastai svarbus kuriant vėžio diagnozavimo technologijas, biosistemų spatioemporalinę analizę ir medicinos mokslus.

Patrauklus alternatyvus požiūris į šią problemą apima lantanido UCNP naudojimą, kuris gali būti sužadinamas per audinį skaidriu infraraudonųjų spindulių regionu, o ne ultravioletiniu ar matomu dažniu, kad fotoliuminescencinės spinduliuotės spinduliuotė būtų matoma (anti-Stokso procesas) 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 . Tris kartus jonizuojančių lantanidų jonai šeimininkams paprastai turi 10–20 nm spinduliuotės plotį (visas plotis yra perpus mažesnis) matomoje spektro dalyje, tai yra maždaug pusė QD stebimo linijos ilgio (25–40 nm) ir daug siauresnė. nei organinių dažų (30–50 nm) linijos plotis 17, 18, 32 . Ši savybė padidina skiriamųjų spinduliuotės juostų skaičių tam tikrame spektriniame pralaidume, įgalindama daugybę multipleksuotų aptikimų.

Atliekant in situ daugkartinį molekulinį žemėlapių sudarymą, tikslus molekulinis profiliavimas gali būti pasiektas tik naudojant vienos juostos emisijos nanoprobes, pašalinant skerspjūvį tarp skirtingų ženklinimo signalų. Tačiau kiekvienas lantanido jonas turi unikalų energijos lygių rinkinį ir paprastai parodo aštrių emisijos smailių rinkinį su išskiriamais spektroskopiniais pirštų atspaudais 32, 35 . Nors kai kurios grupės pranešė, kad vienos juostos padidėjimo perskaičiavimas gali būti realizuojamas kartu dopingo būdu naudojant pereinamojo metalo jonus, tik raudonos (650–670 nm) 36 ir artimos infraraudonosios spinduliuotės (NIR; 37 800 nm) 37 vienos juostos padidėjimo perskaičiavimo emisijos buvo įgyvendintos. . Bendras metodas, leidžiantis pasiekti daugiau vienos juostos įėjimo į konversiją išmetamųjų teršalų, išlieka dideliu iššūkiu tokioms programoms, kaip multipleksuotasis tarpląstelinis aptikimas ir IHC dažymas be apribojimų, susijusių su įprastais kelių pikų UCNP.

Šiame darbe pateikiamas bendras ir paprastas metodas, kaip pasiekti, kad skirtingų dažnių juostos padidėjimas vienoje juostoje būtų padengtas skirtingomis spalvomis, padengiant konversijos nanokristalus ekrano sluoksniu, kuriame yra organiniai dažai, turintys aukštą molinės absorbcijos koeficientą, kaip nanofiltrai, kad būtų pašalintos nepageidaujamos emisijos juostos. Efektyviai reabsorbuojant organinius dažus, mėlynojoje, žaliojoje ir raudonojoje zonose gali susidaryti nepaprastai grynas vienos juostos perėjimo į aplinką išmetamųjų teršalų kiekis. Mes naudojame vienos juostos UCNP (sb-UCNP), kad kiekybiškai ir vienu metu profiliuotų in situ daugelį biomarkerių nepažeistose krūties vėžio ląstelėse ir audiniuose. Biomarkerių ekspresijos lygiai krūties vėžio ląstelių mėginiuose, nustatyti naudojant sb-UCNP, standartinį Western blotting (WB) ir IHC technologiją, rodo puikų ryšį tarp šių trijų metodų; tačiau WB ir IHC metodai gali nustatyti tik vieną biomarkerį vienu metu. Svarbu tai, kad pritaikius antikūnų konjuguotą sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją, galima pasiekti daugkartinį biologinių žymenų biologinį nustatymą in situ krūties vėžio ląstelėse ir audinių mėginiuose bei gauti tikslesnius rezultatus tuo pačiu metu nustatant žemo lygio baltymus, palyginti su IHC.

Rezultatai

Sb-UCNP gamyba

Nanokristalų, kuriuose vyrauja konversija, buvo parengta pagal ankstesnę strategiją, kurią anksčiau parengė mūsų grupė (1 papildoma lentelė) 38 . Norint gauti žaliosios emisijos sb-UCNP, pirmiausia buvo paruošti β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4 nanokristalų, spinduliuojančių ir žalią (540 nm), ir raudoną (650 nm) (1 ir 2a, c pav.). Tada nanokristallai buvo padengti grynu silicio dioksido tarpiniu sluoksniu ir aminorūgštiniais dažais, padengtais silicio dioksido sluoksniu, kad iš eilės, naudojant mikroemulsijos metodą, susidarytų selektyvus nanofiltrais aplink nanokristalus (1 pav.; 2b pav.). Organiniai dažai buvo parinkti remiantis sutapimo sugerties spektrų kriterijais tik su viena iš dvigubos emisijos juostų nanokristalų, turinčių aukštą molinės absorbcijos koeficientą skalėje nuo 10 5 M −1 cm −1 . Grynas silicio dioksido tarpinis sluoksnis buvo naudojamas siekiant užkirsti kelią fluorescencinio rezonanso energijos perdavimui (FRET) tarp filtruojamos viršutinės konversijos emisijos juostos ir fluorescencinio dažymo būdu padengto ekrano sluoksnio. Norint gauti žalią vienos juostos emisiją, nikelio (II) ftalocianino-tetrasulfonrūgšties tetranatrio druskos (NPTAT) organiniai dažai, kurių didžiausias absorbcijos bangos ilgis (λmax) yra 657 nm, buvo įpilti į tetraetilo ortosilikatą (TEOS), kad būtų sudaryti NPTAT legiruoto silicio nanofiltrai. ant β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4 @SiO 2 nanodalelių, kad būtų galima efektyviai filtruoti raudonąją emisijos juostą. Esant β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4SiO 2 @ NPTAT-skiedžiamo SiO 2 nanostruktūros, buvo pastebėtas tik siauras žaliosios emisijos centras, kurio bangos ilgis buvo 540 nm (2 pav.; Papildomas 1 pav.), Ryškiai kontrastuojant. prie dvigubos konversijos β-NaGdF 4 emisijos juostų: 20% Yb, 2% 4 (2c pav.). Norint gauti mėlynos ir raudonos emisijos sb-UCNP, β-NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% 4 ir α-NaYbF 4 : 10% 4 nanokristalų, turinčių stipriai mėlyną iki raudoną (2e pav., G) ir raudonai žalią ( 2i pav., K) pirmiausia buvo paruošti konversijos emisijos santykiai. Padengus grynus SiO 2 sluoksnius, nanofiltrai, įmirkyti NPTAT ir rodamino B izotiocianatu (2f pav., J), buvo naudojami filtruojant raudoną ir žalią emisijas, kad būtų gauti atitinkamai galutiniai mėlyni ir raudoni sb-UCNP (2 pav., L). ; 2–4 pav.) Šis bendras požiūris leidžia ne tik pašalinti nedidelius išmetamųjų teršalų smailus toliau nuo pagrindinių smailių, naudojant tinkamus nanofiltrus, bet ir alternatyviai pašalinti pagrindinius smailus, kad mažosios smailės liktų vienos juostos aukštyn virsmo konversijos metu. Pavyzdžiui, žaliosios emisijos sb-UCNP gali būti gaunami padengiant α-NaYbF 4 : 10% 4 nanokristalus NPTAT pavidalo nanofiltrais (papildomas 5 pav.).

Image

Žaliųjų, mėlynųjų ir raudonųjų sb-UCNPs ir konjugatų su antikūnais prieš krūties vėžio biomarkerius PR, ER ir HER2 daugiapakopės struktūros paviršiaus aminorūgščių modifikacijos, skirtos daugkartiniam in situ molekuliniam krūties vėžio biomarkerių žemėlapių sudarymui.

Visas dydis

Image

TEM atvaizdai ir ( a ) β-NaGdF 4 pasiskirstymas: 20% Yb, 2% 4 nanokristalų, ( b ) žaliosios emisijos sb-UCNP (β -NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4 @SiO 2 @ NPTAT- skiedžiamas SiO 2 ), ( e ) β-NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% 4 nanokristalų, ( f ) mėlynos emisijos sb-UCNP (β -NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% 4 @ SiO 2 @ NPTAT-skiedinys) SiO 2 ), ( i ) α -NaYbF 4 : 10% 4 nanokristalų ir ( j ) raudonos emisijos sb-UCNP (NaYbF 4 : 10% 4 @ SiO 2 @ rhodamine B B izotiocianato pavidalo SiO 2 ). Žaliųjų, mėlynųjų ir raudonųjų sb-UCNP ( d, h, l ) ir pradinių prieškonversijos nanokristalų, matuojamų atitinkamai vandenyje ir cikloheksane ( c, g, k ), fotoliuminescenciniai spektrai (intarpai: atitinkamos fotoliuminescencinės koloidinių tirpalų nuotraukos esant nepertraukiamai veiklai) bangos ilgio 980 nm lazerio sužadinimas). Svarstyklės, 100μm.

Visas dydis

Pagal Lamberto ir alaus įstatymą, filtruoto intensyvumą galima padidinti padidinant dažų koncentraciją ekrano sluoksnyje tam tikru bangos ilgiu 39 . Todėl padidinant dažų koncentracijas, tam tikros padidėjusios konversijos emisijos juostos intensyvumas gali būti palaipsniui mažinamas. Pavyzdžiui, norint gauti mėlynos, žalios ir raudonos spinduliuotės sb-UCNP, kai lazerinis sužadinimas yra 980 nm (10 W cm – 2 ), dažytųjų dažų ir lantanido liuminescencinių centrų (Tm arba Er) molinis santykis turėtų būti sureguliuotas iki 9: 5., 1: 5 ir 11: 100, atitinkamai (2 papildoma lentelė; papildomos 6–9 pav.). Be to, mes pastebėjome, kad dažais nusodinti nanofiltrai gali būti padengti tiesiogiai ant virsmo konversijos nanokristalų, kad būtų pasiekta vienos juostos padidėjimo konversija, kai naudojami nefluorescenciniai dažai (papildomas 10 pav.). Tačiau, jei naudojami fluorescenciniai dažais padengti nanofiltrai, negalima išvengti FRET tarp konversijos emisijos ir dažų, kurių absorbcija sutampa. Norint gauti aukšto chromatinio grynumo sb-UCNP, prieš dengiant fluorescenciniu dažais legiruoto nanofiltro sluoksnį, reikia įterpti silicio dioksido tarpiklio sluoksnį (papildomas 11a, b pav.). Kadangi FRET efektas priklauso nuo atstumo tarp donoro ir akceptoriaus 40, silicio dioksido tarpiklio sluoksnio storis turėtų būti atitinkamai sureguliuotas. Šiame darbe mes nustatėme, kad FRET efekto galima visiškai išvengti naudojant 5 nm silicio dioksido tarpiklio sluoksnį skirtingų spalvų sb-UCNP.

Sb-UCNP optinės savybės

Atliekant konversijos fotoliuminescencijos procesus matomas išvesties intensyvumas yra proporcingas n -ojo NIR sužadinimo intensyvumo galiai, tai yra, aš į viršų ∝ (I exc ) n , kur aš aukštyn ir I exc reiškia padidėjusį konversijos intensyvumą ir NIR sužadinimo intensyvumą. atitinkamai, ir n yra fotonų skaičius, reikalingas konversijos fotonui 41 sukurti . 3 paveiksle parodyta sb-UCNP ir originalių konversijos nanokristalų konversijos intensyvumo priklausomybė nuo galios. Padidinus siurblio galios tankį iki 15, 3 W cm – 2, atitinkamai padidėjo žalios, mėlynos ir raudonos vienos juostos emisijos intensyvumas, tačiau sb-UCNP vienos juostos ypatybė buvo išlaikyta didėjant sužadinimo galios tankiui (1 pav. 3b, d, f). Svarbu tai, kad sb-UCNP vienos juostos bruožas buvo išlaikytas net ir padidėjusio konversijos emisijos intensyvumo prisotinimo taške esant dideliam sužadinimo galios tankiui (82 W cm – 2 ; papildomas 12 pav.). Prieš dengiant nanofiltrais, pradiniame β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4, β-NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% 4 ir α-NaYbF 4 : 10% 4 nanokristalų spinduliavimas buvo daugiakryptis, o santykinis intensyvumas santykiai, glaudžiai susiję su siurblio galios tankiu (3a, c, e pav.).

Image

Nuo siurblio galios priklausantys žaliųjų, mėlynųjų ir raudonųjų sb-UCNP ( b, d, f ) ir pradinių į viršų virsmo konversijos nanokristalų ( a, c, e ), išmatuotų vandenyje ir cikloheksane, fotoliuminescenciniai emisijos spektrai. Atminkite, kad vienos juostos sb-UCNP ir nanofiltrų savybės nepriklauso nuo sužadinimo lazerio galios.

Visas dydis

Išmetamųjų teršalų intensyvumo ir NIR sužadinimo galios log-log grafikų nuolydis sb-UCNP buvo 1, 93 (žalia, 2 H 11/2, 4 S 3/2 - 4 I 15/2 perėjimas), 2, 71 (mėlyna, 1 G 4 - 3 H 6 perėjimas) ir 1, 54 (raudonas, 4 F 9/2 - 4 I 15/2 perėjimas; 4b, d, f pav.), Parodantys mažai pokyčių, palyginti su pradiniais konversijos nanokristalais (1, 88 (žalia)), 2, 60 (mėlyna) ir 1, 46 (raudona); 4a, c, e pav.). Šis rezultatas rodo, kad nanofiltro danga neturėjo įtakos lantanido elektroninėms pereinamosioms būsenoms ir kad sb-UCNP buvo išlaikytos daugia fotonų savybės. Be to, trijų vienos juostos spinduliuotių gyvavimo laikas buvo 1066 ± 17 μs (mėlyna), 89 ± 1 μs (žalia) ir 59 ± 1 μs (raudona), o tai rodo mažai skirtumų, palyginti su grynu silicio dioksidu dengtais UCNP (1045 ± 1). 14 μs (mėlyna), 88 ± 3 μs (žalia) ir 55 ± 3 μs (raudona); papildomas 13 pav.), Kuris rodo, kad sb-UCNP fosforescencinės savybės išlieka po padengimo nanofiltrais.

Image

Originalių į viršų konvertuotų nanokristalų ( a, c, e ) ir trijų vienos juostos į viršų konversijos nanoprondų ( b, d, f ), išmetamų į viršų, konvertuotų išmetamųjų teršalų galios tankio priklausomybė esant 475, 542 ir 640 nm.

Visas dydis

Norint nustatyti sb-UCNP fotostabilumą, praskiesti sb-UCNP mėginiai su skirtingomis emisijos spalvomis buvo pasklidę ant dangtelių dangtelių ir pavaizduoti atominės jėgos mikroskopijos (AFM) susietoje optinėje mikroskopijoje su sužadinimu su įtemptai sufokusuotai 980 nm bangai ( CW) lazeris (5a pav.) 31, 42 . Atvirkščiai paversti fotoliuminescenciniai mėginių vaizdai parodė vienalytes ir atsitiktinai pasiskirstančias difrakcijos ribotas dėmes, atitinkančias atskiras daleles arba agregatus (5b, d, f pav.). Be to, kaip patvirtina optinių ir AFM vaizdų santykis 1: 1 (5c pav., E, g), dalelės nuo 1 iki 3 vienareikšmiškai buvo priskirtos kaip atskiros skirtingų spalvų nanodalelės. 1–3 dalelių fotoliuminescencijos emisijos (5h pav.) Ir laiko pėdsakai (5i pav., J) buvo tiriamos nuolatos apšviečiant 980 nm ilgio CW lazeriu. Pažymėtina, kad nebuvo užfiksuotas nė vienas foto mirgėjimas, kai kiekvieno išmetamųjų teršalų intensyvumo duomenų taško laiko trukmė buvo sumažinta iki 10 ms (5i pav.). Be to, čia ištirti sb-UCNP nepasižymėjo nei fotobalinimu, nei foto pažeidimais po 15 minučių nepertraukiamo lazerio švitinimo 980 nm ilgio CW lazeriu (5j pav.).

Image

a ) Eksperimentinė sąranka. Ant apversto mikroskopo AFM leidžia tiesiogiai nustatyti dydį kartu su optiniu apibūdinimu. Į viršų konvertuoti fotoliuminescenciniai vaizdai ( b, d, f ) ir AFM vaizdai ( c, e, g ) iš mėlynos ( b, c ), žalios ( d, e ) ir raudonos ( f, g ) emisijos sb-UCNP, išsklaidyti ant poli ( L-lizinas) dengtas dangtelis. Tiek fotoliuminescencijos, tiek AFM vaizdai buvo gauti toje pačioje mėginio srityje, kaip rodo 1: 1 dalelių vietų atitikimas. ( h ) Tipiški atskirų sb-UCNP # 1, # 2 # ir 3 spektrai. Išmetimo juostos, atitinkančios perėjimus 1 G 43 H 6 (∼ 480 nm), 4 S 3/24 I 15/2 (∼ 550 nm) ir 4 F 9/24 I 15/2 (∼ Gali būti stebimas. ( i ) fotoliuminescencijos laiko pėdsakai atskiroms nanodalelėms Nr. 1, Nr. 2 ir Nr. 3, įgytoms 10 ms laiko juostose. j ) ilgalaikių fotoliuminescencijos intensyvumo pėdsakų, gautų pavienėms nanodalelėms Nr. 1, Nr. 2 ir Nr. 3, įgytoms naudojant 500 ms laiko dėžes. Visi pateikti optiniai duomenys buvo gauti su nuolatiniu bangos ilgio lazerio sužadinimu 980 nm. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

Nanofiltruose ištirpintų NPTAT ir rodamino B izotiocianatų dažų fototabilumas buvo kiekybiškai patikrintas abiejuose sb-UCNP ir NaGdF 4 arba NaYbF 4 nanodalelėse, kuriose nėra skleidžiamų lantanidų (papildomas 14 pav.). Abiejų organinių dažų optinės absorbcijos smailės 30 min. Buvo palaikomos esant 980 nm lazerio sužadinimui. Kadangi UCNP konversijos kvantinis išeiga yra mažas (<1%) 20, 40, nėra tinkama įvertinti organinių dažų, įmirkytų nanofiltrais, fotostabilumą esant matomam emisijos iš konversijos. Todėl kseno lempa (500 W) su prizmės spektroskopu buvo naudojama generuoti didesnės galios matomą apšvitą, persidengiančią su NPTAT ir rodamino B izotiocianatų dažų absorbcijos bangos ilgiu (papildomas 14 pav.). Abiejų organinių dažų optinės absorbcijos smailės buvo palaikomos ksenono lempos sužadinimo metu 30 min. Aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad homogeninis organinių dažų dopinimas silicio dioksido sluoksnyje nepakeitė organinių dažų fotostabilumo 980 nm NIR lazeriu ar matomos šviesos švitinimo.

Vėžio ląstelių ir audinių mėginių kompleksinis aptikimas

Norėdami parodyti multipleksavimo žymėjimo pagrįstumą, daugiaspalviai sb-UCNP, spinduliuojantys 480, 540 ir 650 nm bangomis, buvo tiesiogiai konjuguoti su pirminiais antikūnais (Abs) prieš tris svarbiausius krūties vėžio biomarkerius (estrogeno receptorius (ER), progesterono receptorius (PR)). ir žmogaus epitelio augimo fatoro receptorių-2 (HER2)), kurie reguliariai analizuojami chirurginės patologijos laboratorijose ir kuriais grindžiami terapiniai sprendimai (1 pav.). MCF-7 ir MDA-MB-231 krūties vėžio ląstelės, turinčios skirtingą trijų baltymų žymenų ekspresijos lygį, buvo dažytos sb-UCNP-Abs biokonjugatais (sb-UCNP-Anti-PR (žalia), sb-UCNPs-Anti -ER (mėlyna) ir sb-UCNPs-Anti-HER2 (raudona)). Taikant multispektrinę konfokalinę mikroskopiją, abiejose ląstelių linijose buvo aiškiai matoma spektriniu būdu atskirtos konversijos fluorescencija (6a pav.; Papildomas 15 pav.; Papildomas 16 pav.). Nepaprastas sb-UCNP, kurio biologinė foninė fluorescencija yra 980 nm sužadinimo metu, fototabilumas leidžia išplėsti žadinimo šviesos ekspoziciją ir todėl leidžia rekonstruoti daugiaspalvį projekciją. Kaip parodyta 6a pav., HER2 buvo ant ląstelės membranos, o tiek ER, tiek PR buvo aptikti daugiausia ląstelės branduoliuose. Šie rezultatai rodo, kad sb-UCNP-Abs biokonjugatai gali būti naudojami baltymams aptikti, neatsižvelgiant į jų ląstelių vietą. Norėdami toliau ištirti, ar fluorescencinius signalus iš pažymėtų baltymų galima tuo pačiu metu įvertinti kiekybiškai, mes atlikome vienos ląstelės spektroskopiją, naudodami spektrometrą, išskaidytą pagal bangos ilgį, kartu su konokaliniu mikroskopu. Buvo stebimi kiekvieno pažymėto baltymo, kurio smailės yra sb-UCNP emisijos maksimumų srityje (480, 540 ir 650 nm), spektrai, atspindintys sb-UCNP-Abs fotoliuminescencinę emisiją (6b pav.). Dėl siaurų padidėjusių konversijos emisijos juostų nebuvo spektrinio persidengimo tuo pačiu metu nustatant trijų baltymų žymenų sb-UCNP daugkartinį vienu metu nustatytą spektrą, o tai smarkiai įveikia QD ir organinių dažų, turinčių aiškų daugiaspalvių emisijos spektrų persidengimą, apribojimus.

Image

a ) PR, ER ir HER2 signalų išraiška MCF-7 ir MDA-MB-231 krūties vėžio ląstelėse, aptiktos fluorescencine mikroskopija (pseudo spalvos). b ) Reprezentatyvūs baltymų biomarkerių spektrai, gauti atliekant vienaląsčių spektroskopijos matavimus. c ) ER, PR ir HER2 vidutiniai ekspresijos lygiai, nustatyti spektrine 100 pavienių ląstelių analize. Duomenų taškai reiškia vidurkį + sd ( n = 100). ( d, e ) ER, PR ir HER2 ekspresija MCF-7 ir MDA-MB-231 ląstelėse, išmatuota WB. Duomenų taškai reiškia vidurkį + sd ( n = 3). f ) Sb-UCNPs-Abs biokonjugato profiliavimo duomenų ir WB rezultatų palyginamoji statistinė analizė. Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Nereguliuojant atskirų spalvų fotoliuminescencijos intensyvumų, santykinis biomarkerio fotoluminescencijos intensyvumas skirtingose ​​ląstelių linijose yra prasmingesnis nei skirtingų biomarkerių fotoliuminescencijos intensyvumų palyginimas vieno tipo ląstelėse. Šis skirtumas atsiranda dėl skirtingų spalvų sb-UCNP optinių ir struktūrinių savybių. Naudojant skirtingus fotoliuminescencijos detektorius skirtingose ​​laboratorijose taip pat gali atsirasti eksperimentų rezultatų neatitikimų. Mes pastebėjome, kad 480 nm ir 540 nm sb-UCNP buvo atitinkamai 1, 1 ir 1, 5 karto ryškesni nei 650 nm sb-UCNP tuo pačiu metu (papildomas 17 pav.). Kai atskiros spalvos buvo išspręstos naudojant anksčiau aprašytą metodą 19, 45 ir normalizuotos pagal šį „ryškumo indeksą“, smailės, esant bangos ilgiui 650 ir 480 nm, buvo padidintos 1, 5 karto ir 1, 3 karto, palyginti su jų pradinėmis vertėmis, tuo tarpu smailė ties 540 nm buvo nepakitusi. Rezultatai, gauti atliekant kiekybinę spektrometriją (6b pav.), Gerai koreliavo su biomarkerių išraiškos modeliais, gautais naudojant tradicinę WB techniką (6d, e pav.). Siekiant statistinio reikšmingumo, buvo išmatuoti 100 ląstelių fotoliuminescencijos spektrai kiekvienoje ląstelių linijoje ir įvertinti vidutiniai HER2, ER ir PR raiškos lygiai (6c pav.). Tada buvo palyginti baltymų ekspresijos rezultatai, gauti naudojant molekulinio profiliavimo technologiją sb-UCNPs-Abs ir WB, po to, kai absoliutiniai tripleto (HER2, ER ir PR) matavimai buvo paversti santykiniu mastu procentais (6f pav.). Atkreipkite dėmesį, kad biomarkerių ekspresijos lygiai, nustatyti naudojant sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją ir standartinę WB tam tikrai ląstelių linijai, yra linkę kauptis, atskleidžiant puikią koreliaciją tarp dviejų metodų.

Be to, kadangi IHC taip pat yra vienas iš plačiai naudojamų su vėžiu susijusių baltymų analizės metodų, mes palygino sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją su tradiciniu IHC metodu, naudojant tą patį krūties vėžio ląstelių linijų rinkinį (7a, b pav.). Ląstelių skaidrės buvo nufotografuotos atlikus imuninį dažymą pagal standartinius ER, PR ir HER2 patologinius protokolus (7a pav.; 3 papildoma lentelė). IHC rezultatus išanalizavo trys nepriklausomi stebėtojai ir įvertino pagal standartinę skalę nuo 0 iki 3+. Ląstelėse, kurių IHC balai buvo 3+, buvo 100% santykinė baltymų ekspresija, naudojant sb-UCNP multipleksuotą aptikimą (didžiausias kiekvieno biomarkerio ekspresijos lygis buvo nustatytas kaip vienybė). ER ir PR raiška MDA-MB-231 ląstelėse IHC buvo klasifikuojamos kaip 1+, o tai atitiko 11 ir 5%, apskaičiuotus pagal naują sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją (7b pav.; 3 papildoma lentelė), o 4 % HER2 raiškos, aptiktos sb-UCNP, buvo klasifikuojama pagal 0 IHC balą (7b pav.). Abiem atvejais baltymų ekspresija naudojant sb-UCNPs gerai koreliavo su IHC rezultatais. Tačiau konjuguotų sb-UCNP taikymas ir kiekybinė spektroskopija gali būti tikslesni nei IHC, norint kiekybiškai įvertinti baltymus, kurių yra mažai.

Image

a ) ER, PR ir HER2 išraiška krūties vėžio ląstelių linijose, įvertinta IHC, ir b ) sb-UCNP profiliavimo duomenų ir IHC rezultatų lyginamoji statistinė analizė.

Visas dydis

Padauginti ląstelių linijų aptikimo rezultatai rodo, kad naujoji sb-UCNP pagrindu sukurta molekulinio profiliavimo technologija gali atvaizduoti ir kiekybiškai įvertinti daugybinius naviko biomarkerius nepaliestuose navikų mėginiuose. Todėl mes siekėme pritaikyti šią technologiją aptikti PR, ER ir HER2 biomarkerius FFPE žmogaus krūties vėžio mėginiuose su Ab-konjuguotais sb-UCNP. Be to, remiantis Amerikos klinikinės onkologijos draugijos / Amerikos patologų kolegijos duomenimis, patvirtinti metodai šiems biomarkeriams įvertinti yra IHC 46 . Atsižvelgiant į šią naują sb-UCNP pagrįstą molekulinio profiliavimo technologiją, mūsų tikslas buvo atlikti PRC, ER ir HER2 suderinamumo tarp IHC ir sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologijos palyginimo tyrimą.

Atlikus 1 naviko biopsiją, konfokaline mikroskopija buvo stebimi tik PR ir ER signalai (8a pav.), Atitinkantys dvi spektrogramoje aptiktas fotoliuminescencinių viršūnių konversijos viršūnes (8b pav.). Atlikus biografiją ir spektroskopiškai aptikus 2 biopsiją, nustatyta PR, ER ir HER2 raiška (8a, b pav.). Kiekybinis nustatymas, analizuojant 30 atsitiktinai parinktų audinių sekcijų dėmių, naudojant sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją, parodė aiškų HER2 raiškos skirtumą tarp dviejų naviko mėginių. 1 biopsija neišreiškė HER2, priešingai nei aukšta HER2 (147 ± 10) išraiška 2 biopsijoje (8c pav.; 4 papildoma lentelė). Palyginus su IHC rezultatais, naudojant santykines skales (8d pav.; 4 papildoma lentelė), vidutinės biomarkerio išraiškos vertės, išmatuotos naudojant sb-UCNP, parodė puikią koreliaciją aukšto lygio baltymų ekspresijai (8e pav.; 4 papildomoji lentelė). Panašiai kaip ląstelių linijos aptikimas, Ab-konjuguotų sb-UCNP taikymas ir kiekybinė spektroskopija gali būti tikslesni kiekybiškai įvertinti baltymus nei IHC naviko bandiniuose. Pavyzdžiui, IHC priskyrė ER ir PR raišką 2 biopsijoje kaip 2+. Tačiau, naudojant naują sb-UCNP molekulinio profiliavimo technologiją, buvo galima tiksliau nustatyti ER (72%) ir PR (47%) raišką.

Image

( a ) Branduolio ir ląstelių membranų fluorescenciniai signalai buvo aptikti mikroskopu (pseudo spalvos), atskleidžiant ER, PR ir HER2 biomarkerių išraišką, kiekybiškai įvertintą spektroskopijos bangos ilgio atžvilgiu. b ) Emisijos spektrai išskaidomi į atskirus kanalus ir kompensuojami skirtingu skirtingų spalvų ryškumu. c ) ER, PR ir HER2 vidutiniai išraiškos lygiai, apskaičiuoti pagal spektrinės analizės rezultatus, gautus aptikant 30 atsitiktinai parinktų dėmių audinių pjūviuose. Duomenų taškai reiškia vidurkį + sd ( n = 30). d ) IHC apskaičiuota ER, PR ir HER2 išraiška krūties vėžio audinių mėginiuose ir e ) sb-UCNP profiliavimo duomenų ir IHC rezultatų lyginamoji statistinė analizė. Mastelio juosta, 20μm.

Visas dydis

Diskusija

Jei vėžį būtų galima patikimai nustatyti kuo ankstesnėje ląstelių perėjimo stadijoje, tada nauji vaistai galėtų būti sukurti siekiant sustabdyti piktybinio virsmo procesą. Agresyvų elgesį ar fenotipus galima suprasti ir numatyti nustatant biologinių žymenų rinkinį. Kritiškai apibrėžus šių biomarkerių tarpusavio ryšius, būtų galima diagnozuoti vėžį ir prognozuoti prognozę remiantis paciento molekuliniu profiliu, o tai lemia personalizuotą ir prognozuojamą onkologiją. Tai yra, unikalus molekulinis profilis gali būti naudojamas numatant naviko invazinį ir metastazinį potencialą, jo sugebėjimą išgyventi ir augti esant androgenų trūkumui, hipoksinio ir metabolinio streso sąlygoms bei tam tikrų vėžio ląstelių galimybes išvengti šeimininkų imuninės priežiūros. Dabartinė diagnostinė ir prognostinė žmogaus navikų klasifikacija daugiausia grindžiama IHC metodu, nustatančiu vienos bangos ilgį, o tai nesuderinama su multipleksuotu molekuliniu profiliavimu 47 . Naujausi pasiekimai parodė, kad baltymų biomarkerių analizė, pagrįsta fluorescencija, yra stipriai koreliuojama su klinikiniais rezultatais. Palyginti su įprastomis biologinėmis etiketėmis, tokiomis kaip organiniai dažai, QD ir įprastos lantanido etiketės su ultravioletiniu sužadinimu, UCNP turi daug pranašumų, įskaitant beveik nulinį savaiminio fluorescencijos foną, kuris pagerina signalo ir triukšmo santykį, didelius anti-Stokes poslinkius, kurie palengvina fotoliuminescencijos atskyrimą nuo sužadinimo bangos ilgio, siaurą spinduliuotės pralaidumą, palengvinantį daugialypį vaizdavimą, ir didelį atsparumą fotobalinimui, kad būtų suderinamas su ilgalaikiu kartotiniu vaizdavimu. Be to, UCNP nemirksi, pasižymi mažesniu šviesos išsklaidymu ir leidžia giliai įsiskverbti į audinį, nes jų sužadinimas yra NIR srityje optinio skaidrumo lange 48 .

Šioje ataskaitoje mes sukūrėme bendrą ir paprastą metodą, skirtą vienos juostos aukštyn virsmo konversijai, gaunamai naudojant įvairias spalvas ir aukštą chromatinį grynumą, padengiant konversijos nanokristalus organiniais dažais, padengtais nanofiltrais 48 . Efektyviai reabsorbuojant organinius dažus, pasižyminčius dideliu molinės absorbcijos koeficientu, mėlynos (480 nm), žalios (550 nm) ir raudonos (650 nm) regionuose gali susidaryti nepaprastai grynos vienos juostos padidėjusios konversijos emisijos. Be to, lantanido jonai yra spektroskopiškai turtingos rūšys, o dauguma retųjų žemių (RE) jonų gali parodyti konversiją, įskaitant Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Er ir Tm. Koreguojant skirtingus dopingo jonų ir pagrindinių medžiagų derinius 20, 38, 40, konversijos emisijos bangos ilgį (nuo ultravioletinių spindulių matomą NIR) ir santykinį emisijos smailių intensyvumą galima efektyviai kontroliuoti, kad būtų galima moduliuoti lantanido turinčių nanokristalų emisijos spalvas. Todėl šį metodą galima išplėsti, norint gauti papildomų sb-UCNP kartu su vienu ar daugiau tinkamų filtrų dažų tipų.

Pažymėtina, kad šiame darbe mes pademonstravome sb-UCNP naudojimą trijų auglių biomarkerių daugkartiniam aptikimui abiejų kultūringų žmogaus krūties vėžio ląstelių ir parafino įterptų klinikinių audinių skyriuose. Tuo pačiu metu nustatytas ER, PR ir HER2 receptorių ekspresijos lygis krūties vėžio ląstelių mėginiuose glaudžiai koreliavo su tradicinio WB metodo rezultatais. Be to, konjuguotų sb-UCNP taikymas ir kiekybinė spektroskopija gali būti tikslesni nei IHC tuo pačiu metu kiekybiškai įvertinti baltymus, kurių vėžinėse ląstelėse ir audinių mėginiuose yra nedaug. Taigi, sb-UCNP pagrįsta technologija gali būti gerai pritaikyta navikinių biomarkerių molekuliniam profiliavimui in vitro ir gali reikšti klinikinį transversinių nanomedžiagų pritaikymą vėžio prognozei. Galimybė aptikti daugybę tikslinių baltymų mažuose vėžio audinių mėginiuose galėtų padėti priimti efektyvesnius terapinius sprendimus, kai jie naudojami kartu su įprastais IHC metodais. Kitas žingsnis - atlikti didelio masto klinikinius tyrimus, siekiant nustatyti sb-UCNP pagrįstos molekulinės patologijos protokolus ir praktiką.

Be to, fluorescenciniai spalvų kodai, naudojami daugelyje sričių, buvo vieni iš svarbiausių multipleksavimo metodų, kaip parodyta šiame darbe. Nors naudojant UCNP galima pasiekti daug siauresnes emisijos viršūnes, perkrautas spektrinis domenas vis tiek riboja aptikimo skaičių. Sukūrus papildomus atskiriamus kodavimo matmenis, turėtų būti patobulintos aptiktos galimybės. Neseniai Jin ir kt . 49, 50 pademonstravo, kad derinamas liuminescencinis gyvenimo laikas mikrosekundės srityje gali būti naudojamas koduoti individualius konversijos nanokristalus (τ-taškus), kurie nepriklauso nei nuo spalvos, nei nuo intensyvumo, ir praplečia optinio multipleksavimo galimybes pridedant laiko matmenis prie fotoluminescencinių signalų. Kalbant apie liuminescencijos intensyvumu pagrįstą multipleksavimą, sb-UCNP yra pranašesni, todėl tikimasi, kad derinant vienos juostos padidėjimą ir laikinąją liuminescencijos signalų dimensiją dar labiau padidės optinės multipleksavimo galimybės naujos kartos taikymams gyvybės moksluose.

Metodai

Lantanido konversijos nanokristalų sintezė

Aukštyn virsmo konversijos nanokristalai, įskaitant šešiakampės fazės β-NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% Tm, β-NaGdF 4 : 20% Yb, 0, 2% 4, β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% Er, β-NaGdF 4 : 20% Yb, 2% 4, kubinės fazės α-NaYbF 4 : 10% Er ir α-NaYbF 4 : 10% 4 nanokristalų, buvo paruošti paeiliui atliekant sluoksnių po sluoksnio strategiją (žr. Papildomus metodus).

Sb-UCNP sintezė

Sb-UCNP buvo susintetinti atvirkštinės fazės mikroemulsijos metodu. Įprastoje atskirų raudonos emisijos sb-UCNP sintezėje maišomas 0, 5 ml paviršiaus aktyviosios medžiagos CO-520 (įsigytas iš „Sigma Aldrich“), 16 ml cikloheksano (įsigyto iš „Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd“) ir 1 ml 0, 1 tirpalo. Mmol α-NaYbF4: 10% 4 tirpalas cikloheksane buvo intensyviai maišomas 15 min. Po to į tirpalą buvo pridėta 2, 1 ml CO-520 ir 0, 2 ml NH 3 · 2O (30 masės%, įsigyta iš „Beijing Chemical Reagents Co. Ltd“), indas buvo uždarytas ir ultragarsu apdorotas 15 min. susidarė atvirkštinės fazės mikroemulsija. Tada į tirpalą buvo pridėta 0, 1 ml TEOS (įsigytos iš Sigma Aldrich). Intensyviai maišant 2 valandas, buvo pridėta 0, 1 ml (3-aminopropil) trietoksisilano (APTES) (įsigyto iš „Sigma Aldrich“) modifikuoto rodino B izotiocianato (įsigyto iš „Sigma Aldrich“) tirpalo (5 mg ml –1 ). Nuolat maišant kambario temperatūroje esant 750 aps./min. 2 dienas, produktai buvo nusodinami pridedant etanolio. Surinktos nuosėdos du kartus plaunamos etanoliu ir disperguojamos etanolyje tolimesniam naudojimui. Mėlynos ir žalios emisijos sb-UCNP buvo susintetinti panašiu būdu, naudojant nikelio (II) ftalocianino-tetrasulfoninės rūgšties tetranatrio (5 mg ml −1, įsigyto iš Sigma Aldrich) dopingo dažus.

Plataus lauko liuminescencija ir AFM vaizdavimas pavieniais sb-UCNP

Norint paruošti UCNP mėginį vienetinių dalelių matavimams, švarus dangtelio dangtelis pirmiausia buvo padengtas poli (L-lizinu; 0, 1% m / v H2O), o sb-UCNP tirpalas buvo pasklidintas jame matavimui. Sb-UCNP vaizdavome naudodamiesi vidinio plataus lauko fluorescencinio vaizdo nustatymo schema, pagrįsta apverstu mikroskopu (X71, „Olympus“), NIR sužadinimo šaltiniu (980 nm ilgio CW lazeriu) ir labai jautriu ARC-SP 2360 spektrometru. su „Pro EMCCD“ kamera („Pro EM“: 1 600 × 200 B / l „eXcelon“ EMCCD fotoaparatų sistema, „Princeton Instruments, Inc.“). 980 nm lazerio (SDL-980LM-500T, 500 mW, „Shanghai Dream Lasers Technology“) išėjimas buvo erdviniu būdu filtruojamas naudojant 100 mm smeigę ir kolimizuotas taip, kad prieš įeinant į mikroskopą pluošto skersmuo būtų ∼ 10 mm. Spindulys atsispindėjo trumpo pralaidumo optiniu filtru (750SP iš „Chroma Corp“) mikroskopo viduje ir nukreiptas į mikroskopo objektyvą (skaitinė diafragma 1, 40, panardinimas į aliejų, „Olympus“). Praėjus pro dichroinio pluošto skirstytuvą, emisija buvo filtruojama trumpojo pralaidumo emisijos filtru (750SP iš „Chroma Corp“), kurio pralaidumo diapazonas yra 400–700 nm, kuris apima mėlyną, žalią ir raudoną sb-UCNP emisijos juostas. „Sb-UCNP“ mėginio vaizdas buvo dar labiau padidintas naudojant achromatinių lęšių rinkinį, esantį už mikroskopo, ir galiausiai jį aptiko „Pro EMCCD“ kamera. Norėdami nustatyti, ar ryškios dėmės tokiuose optiniuose vaizduose atitiko pavienius sb-UCNP ar jų junginius, AFM (Catalyst, Bruker) pavaizdavome tą patį regioną ir išanalizavome dalelių morfologiją.

Padaugintas krūties vėžio ląstelių ženklinimas

Krūties vėžio ląstelių linijos (MCF-7, MDA-MB-231) buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV). Pakartotiniam sb-UCNPs-Abs dažymui ląstelės (1 × 104) buvo inkubuojamos konokalinėse lėkštelėse (35 x 10 mm) 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO 2, 24 valandas. Ląstelės buvo deparafinuotos, inkubuojant su formaldehidu (4%), po to 30 min. Inkubuojant drėkintoje kameroje 37 ° C temperatūroje su 2% Triton X-100. Po blokavimo 5% galvijų serumu, praskiestu fosfatu buferiniame druskos tirpale, 30 min., Ląstelės buvo nudažytos konjugatų mišiniu, nukreiptu į ER, PR ir HER2 (kiekvienas po 40 nM), 1 valandą ir penkis kartus plaunamos PBS.

Kiekybinė spektrometrija su konfokaline mikroskopija

Vienos ląstelės spektroskopija buvo atlikta naudojant skenuojamąjį konokalinio fluorescencinio mikroskopo žemėlapius. Biomarkerio ekspresijai kultivuotose ląstelėse išmatuoti, erdvėje atskirtos atskiros ląstelės rankiniu būdu buvo dedamos į „karštąją vietą“, kurią apibrėžė smeigės padėtis ir dydis. Biomarkerio išraiškai audinių mėginiuose nustatyti buvo išmatuoti sb-UCNP spektrai iš 30 atsitiktinai parinktų sričių. Spektroskopinių matavimų duomenys buvo konvertuoti į ASCII formatą tolimesniam kiekybiniam įvertinimui ir statistinei analizei.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi 1-17 pav., 1-4 papildomos lentelės, papildomi metodai ir papildomos nuorodos

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.