„sirt1“ per didelis ekspresas apsaugo pelių osteoblastus nuo tnf-α sukeltos žalos in vitro, slopindamas nf-κb signalizacijos kelią | acta pharmaologica sinica

„sirt1“ per didelis ekspresas apsaugo pelių osteoblastus nuo tnf-α sukeltos žalos in vitro, slopindamas nf-κb signalizacijos kelią | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Sirtuinas 1 (Sirt1) yra III klasės histono / baltymo deacetilazė, trukdanti NF-κB signalizacijos keliui, todėl atliekanti priešuždegiminę funkciją. Šis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti, ar Sirt1 gali apsaugoti osteoblastus nuo TNF-α sukeltos žalos in vitro .

Metodai:

Naudota pelių osteoblastinių ląstelių linija MC3T3-E1. Viršutinis Sirt1 baltymo ekspresija MC3T3-E1 ląstelėse buvo atliktas transfekuojant ląsteles Sirt1 per daug ekspresuojančiu adenovirusu. MRNR ir baltymų lygiai buvo nustatyti atitinkamai naudojant qRT-PGR ir Western blot analizę. NF-κB aktyvumas buvo tiriamas naudojant NF-κB luciferazės testą. NO koncentracija buvo matuojama Griess metodu.

Rezultatai:

MC3T3-E1 ląstelių gydymas TNF-α (2, 5–10 ng / ml) slopino Sirt1 baltymo ekspresiją priklausomai nuo koncentracijos. TNF-α (5 ng / ml) padidino apoptozę ir sumažino ALP aktyvumą ląstelėse. Per didelis Sirt1 ekspresija ląstelėse žymiai susilpnino TNF-α sukeltą žalą, slopindama apoptozę, didindama ALP aktyvumą ir padidindama Runx2 ir osteokalcino mRNR raišką. Be to, per didelis Sirt1 ekspresija ląstelėse reikšmingai slopino TNF-α sukeltą NF-κB aktyvaciją, o po to sumažino iNOS ir NO susidarymą. „Sirt1“ aktyvatorius resveratrolis (10 μmol / L) mėgdžiojo ląstelių apsaugą per aukštą „Sirt1“ ekspresiją nuo TNF-α sukeltos žalos, kurią pakeitė „Sirt1“ inhibitorius EX-527 (5 μmol / L).

Išvada:

Per didelis Sirt1 ekspresija apsaugo MC3T3-E1 osteoblastus, sukeliančius TNF-α sukeltą ląstelių pažeidimą in vitro , bent iš dalies slopindamas NF-κB signalus. Sirt1 gali būti naujas terapinis taikinys gydant kaulų retėjimą, susijusį su reumatoidiniu artritu.

Įvadas

Reumatoidiniam artritui būdingas lėtinis uždegimas, dėl kurio kaulų audinyje susidaro per dideli priešuždegiminiai citokinai. 1, 2, 3, 4 . Vienas iš tokių citokinų, naviko nekrozės faktorius-α (TNF-α), yra per daug pagamintas reumatoidinio artrito pažeidimų sinovijoje ir taip prisideda prie sisteminio ir vietinio kaulų nykimo 5, 6 . Patogeninis TNF-α reikšmingumas buvo nustatytas remiantis klinikiniu veiksmingumu blokuoti TNF-α gydant aktyvų reumatoidinį artritą 7, 8 . Įrodyta, kad TNF-α sumažina osteoblastinių kaulų susidarymą slopindamas osteoblastų proliferaciją, sukeldamas osteoblastų apoptozę, slopindamas osteoblastų diferenciaciją ir slopindamas matricos baltymus, tokius kaip osteokalcinas, kurį gamina subrendę osteoblastai. 9, 10, 11 . Todėl reikalingi tolesni in vitro tyrimai, siekiant nustatyti galimus terapinius taikinius, kurie apsaugo osteoblastus nuo TNF-α sukeltos žalos, ir išsiaiškinti pagrindinius mechanizmus, tarpinančius šią apsaugą.

Neseniai nustatyta, kad žinduolių tyliosios informacijos reguliatoriaus 2 narys „Sirtuin 1“ (Sirt1) yra susijęs su ligomis, susijusiomis su amžiumi, tokiomis kaip vėžys, medžiagų apykaitos ligos, širdies ir kraujagyslių ligos, neurodegeneracinės ligos ir osteoporozė. Šis dalyvavimas visų pirma yra susijęs su substratų, kurių sudėtyje yra p53, O klasės šakutės dėžutės dėžutė, peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto γ koaktyvatoriaus 1a ir branduolio faktoriaus-KB (NF-κB) 12, 13, deacetilinimu . Sirt1 aktyvinimas mezenchiminėse kamieninėse ląstelėse gali sumažinti adipocitų diferenciaciją ir padidinti osteoblastų diferenciaciją, reguliuodamas p53 ir PPARγ 12 . Be to, „Sirt1“ aktyvatorius resveratrolis gali slopinti NF-κB ligando (RANKL) sukeltos osteoklastogenezės kaulų ląstelėse 14 receptorių aktyvatorių. Neseniai buvo įrodyta, kad citokinų, įskaitant TNF-α, osteoblastų diferenciacijos ir kaulų susidarymo slopinimas yra koreliuojamas su NF-κB signalizacijos kelio 15 aktyvacija. Kadangi NF-κB yra tiesioginis Sirt1 13 taikinys, mes hipotezuojame, kad Sirt1 apsaugos osteoblastus nuo TNF-α sukelto citotoksiškumo slopindamas NF-κB aktyvumą. Norėdami patikrinti šią hipotezę, apibūdinome apsauginį „Sirt1“ ekspressijos poveikį in vitro TNF-α gydomiems osteoblastams.

Be to, iNOS, paskesnis NF-κB taikinys, vaidina svarbų vaidmenį ląstelių pažeidime, kurį sukelia TNF-α osteoblastai 16, 17 . Todėl mes taip pat išbandėme ryšį tarp Sirt1 ir iNOS ekspresijos osteoblastuose, gydomuose TNF-α.

Šiame tyrime kaip modelį mes panaudojome pelių kalvarialinių osteoblastinių ląstelių liniją (MC3T3-E1), norėdami patikrinti Sirt1 molekulinius mechanizmus, kad apsaugotume osteoblastus nuo TNF-α sukeltų ląstelių pažeidimų.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūros

Pelių osteoblastinių ląstelių linija MC3T3-E1 buvo auginama 37 ° C temperatūroje esant 5% CO 2 ir 90% drėgmei α-MEM terpėje (Invitrogen, Paisley, JK), papildyta 10% vaisiaus galvijų serumo ir 100 μg / ml gentamicino. („Invitrogen“, „Life Technologies“, Paisley, Škotija). Chemikalai, vaistai ir reagentai buvo gauti iš bendrovės „Sigma Chemical“ (Sent Luisas, MO, JAV), jei nenurodyta kitaip.

1 eksperimentas

MC3T3-E1 ląstelės buvo pasėtos į lėkšteles ir 24 valandas apdorotos TNF-α (0, 2, 5, 5, 0 ir 10, 0 ng / ml). Tada Sirt1 ekspresija buvo įvertinta naudojant Western blot analizę.

2 eksperimentas

MC3T3-E1 ląstelės buvo transfekuotos „Ad-Sirt1“ arba „Ad-lacZ“ 12 valandų. Po transfekcijos ląstelės buvo plaunamos PBS ir po to dedamos į šviežią terpę. Po 36 valandų auginimo Sirt1 ekspresija buvo įvertinta Western blot analize, o Sirt1 deacetilazės aktyvumas buvo išmatuotas naudojant fluorogeninį substratą. NF-κB aktyvumas buvo matuojamas luciferazės reporterio tyrimu, o IκB-α ekspresija buvo įvertinta naudojant Western blot analizę.

Abi ląstelių grupės (transfekuotos Ad-Sirt1 arba Ad-lacZ) 4 valandas buvo veikiamos TNF-α (50 ng / ml), po to buvo nustatytas apoptozės greitis.

Abi ląstelių grupės 24 valandas buvo apdorotos TNF-α (5, 0 ng / ml), o po to NOx (NO 3 - + NO 2 - ) kiekis supernatante buvo nustatytas Grieso metodu. Ląstelių iNOS ekspresija buvo nustatyta atliekant Western blot analizę.

Abi ląstelių grupės 5 dienas buvo apdorotos TNF-α (5, 0 ng / ml), po to buvo nustatytas ALP aktyvumas ir Runx2 bei osteokalcino mRNR aktyvumas.

3 eksperimentas

MC3T3-E1 ląstelės, stimuliuotos TNF-α (5, 0 ng / ml), 24 valandas buvo gydomos BAY-11-7082 (10 μmol / l, NF-κB inhibitorius) arba SP600125 (10 μmol / L, JNK inhibitorius). . Tada iNOS ekspresija buvo patikrinta atliekant Western blot analizę.

4 eksperimentas

MC3T3-E1 ląstelės buvo gydomos vien α-MEM (kontrolinė), TNF-α (5, 0 ng / ml), TNF-α su resveratroliu (10 μmol / L, „Sirt1“ aktyvatorius) arba TNF-α su resveratroliu ir EX- 527 (5 μmol / L, „Sirt1“ inhibitorius) 1 h. Tada NF-κB aktyvumas buvo analizuotas atliekant luciferazės reporterio testą.

Ląstelės 24 valandas buvo apdorojamos taip, kaip aprašyta aukščiau, o supernatanto NOx (NO 3 - + NO 2 - ) kiekis buvo nustatytas Grieso metodu.

Ląstelės buvo apdorotos taip, kaip aprašyta aukščiau 5 dienas, po to buvo nustatytas ALP aktyvumas ir Runx2 bei osteokalcino mRNR aktyvumas.

MC3T3-E1 ląstelės buvo gydomos vien α-MEM (kontrolinė), TNF-α (50 ng / ml), TNF-α su resveratroliu (10 μmol / l, „Sirt1“ aktyvatorius) arba TNF-α su resveratroliu ir EX- 527 (5 μmol / L, „Sirt1“ inhibitorius) 4 h, po to buvo išmatuotas ląstelių apoptozės greitis.

Rekombinantinių adenovirusų konstravimas

Pagal Lee ir kt . Aprašytą metodą buvo sukonstruotas Sirt1 per daug ekspresuojantis adenovirusas. Trumpai tariant, pelės Sirt1 cDNR buvo klonuotas į pENTR 2B vektoriaus (Invitrogen) Kpn I ir XhoI vietas, o tada Sirt1 cDNR intarpas buvo perkeltas į pAd / CMV / V5-DEST vektorių (Invitrogen). Plazmidės buvo linearizuotos Pac I (Promega, Madison, WI) ir perkeltos į 293A ląsteles, naudojant Lipofectamine 2000. Kaip kontrolė, pZD / CMV / V5-GW / lacZ vektorius (Invitrogen) buvo naudojamas gaminti lacZ turinčią medžiagą. adenovirusas.

Sirt1 deacetilazės aktyvumo tyrimas

Ląstelės buvo homogenizuotos 100 μL CytoBuster baltymų ekstrahavimo buferio (Invitrogen). Tada fermento aktyvumas buvo išmatuotas naudojant fluorescencinį deacetilazės aktyvumo rinkinį (Millipore, Bedford, MA, JAV).

Apoptozės tyrimas

Ląstelės buvo sėjamos į 6 šulinėlių plokštelę ir 4 valandas buvo apdorotos nurodytais reagentais. Po apdorojimo ląstelės buvo plaunamos PBS ir lizuojamos 30 minučių 4 ° C temperatūroje, naudojant lizės buferį. Suskaidytos ir bendros kaspazės-3 ekspresijos lygiai buvo nustatyti atliekant Western blot analizę. Apoptozės žymeniu buvo naudojamas suskaidytos kaspazės-3 ir visos kaspazės-3 santykis.

ALP aktyvumo matavimas

ALP indukcija yra vienareikšmis kaulų ląstelių diferenciacijos žymeklis. Norint išmatuoti ALP aktyvumą, ląstelės buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokštelę ir 5 dienas apdorotos nurodytais reagentais. Po apdorojimo kultivuoti osteoblastai buvo plaunami PBS ir po to lizuojami buferiniu tirpalu, kuriame yra 0, 9% NaCl, 0, 6% Tris, 1 mmol / L EGTA, 1% NP-40 ir 0, 25% deoksicholato, ištirpinto RIPA buferyje, esant 4 ° C, 30 min. . Tada ląstelių lizatai buvo ultragarsu apdoroti ledo vonioje, centrifuguojami 1 500 x g 5 minutes ir sumaišomi su buferiu, kuriame yra 0, 1 mol / L 2-amino-2-metil-1-propanolio, 1 mmol / L MgCl2 ir 8 mmol. / L p- nitrofenilfosfato dinatris. Po inkubacijos 20 minučių 37 ° C temperatūroje, reakcija buvo sustabdyta su 0, 1 mol / l NaOH ir absorbcija buvo rodoma esant 405 nm. Naudojant p- nitrofenolį, buvo sudaryta standartinė kreivė. Duomenys buvo normalizuoti pagal bendro baltymo koncentraciją.

RNR gryninimas ir kiekybinė RT-PGR analizė

MC3T3-E1 ląstelės buvo pasėtos 100 000 ląstelių kiekvienoje duobutėje 6 duobučių plokštelėse ir 5 dienas buvo apdorotos nurodytais reagentais. Po apdorojimo visa RNR buvo išskirta Rneasy RNR gryninimo rinkiniu (Qiagen, Solna, Stokholmas, Švedija). Iš viso 1 mg RNR buvo atvirkščiai perrašyta į cDNR naudojant „Superscript II“ (Invitrogen, Stokholmas, Švedija) pagal gamintojo protokolą. „Runx2“ (5′-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3 ′; 5′-GGTGAAACTCTTGCCTCGTC-3 ′) ir osteokalcino (5′-GCCATCACCCTGTCTCCTAA-3 ′; 5′-GCTGTACTCGGAGAAGACAGGAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAAGACAGAGAGAAGACAGAGAAGAAGACAGAAGAAGAAGACAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA ' gruntai ir SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). PGR reakcijos buvo atliktos tokiomis sąlygomis: pradinė vieno ciklo denatūracija 95 ° C temperatūroje 10 min., Po to sekanti amplifikacija 95 ° C temperatūroje 30 s, 55 ° C 30 s ir 72 ° C 30 s, iš viso 35 ciklai. Namų tvarkymo genas β-tubulinas (5′-CTGCTCATCAGCAAGATCAGAG-3 ′; 5′-GCATTATAGGGCTCCACCACAG-3 ′) buvo naudojamas kaip endogeninė kontrolė. Duomenų analizė atlikta naudojant Ct reikšmes, normalizuotas β-tubulino ekspresijai.

Western blot analizė

Osteoblastai buvo pasėti į 6 duobučių plokšteles, kurių tankis 1 x 105 ląstelių / duobutėje. Po inkubacijos su tiriamuoju reagentu, ląstelės buvo plaunamos PBS ir lizuojamos 30 minučių 4 ° C temperatūroje, naudojant lizės buferį. Baltymų suspensijos buvo pakrautos ir išskaidytos 10% SDS-PAGE, tada perkeltos į polivinilideno difluorido (PVDF) membraną (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, JAV). Sirt1, iNOS, eNOS, IκB-α, visa kaspazė-3 ir suskaidyta kaspazė-3 buvo aptikti naudojant specifinius antikūnus iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Cruz, CA; sc-74465, sc-650, sc-654, sc-1643, sc-7148 ir sc-22171). GAPDH aptikimas naudojant HRP konjuguotą monokloninį antikūną (1: 8000, Sigma) buvo įkrovos kontrolė. Reaktyvumas buvo vizualizuotas naudojant „Super Signal West Pico“ chemiliuminescencinį substratą (Pierce, Rockford, IL, JAV).

Nitritų ir nitratų (NOx) koncentracijos nustatymas

Ląstelės buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokštelę ir 24 valandas apdorotos nurodytais reagentais. Po apdorojimo buvo surinkti supernatantai ir NOx, kurie yra stabilūs galutiniai NO produktai, kiekiai buvo išmatuoti naudojant viso nitrito / nitrato bandymo rinkinį (Dojindo, Kumamoto, Japonija), kuriame naudojamas Grieso metodas.

NF-κB luciferazės tyrimas

NF-κB aktyvumas buvo matuojamas naudojant NF-κB luciferazės testą. Ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių auginimo plokšteles 2 x 104 ląstelių / duobutėje. Ląstelės buvo inkubuojamos 1 valandą su plazmidėmis (85 ng nuo NF-κB priklausomos luciferazės reporterio ir 85 ng pcDNA3-β-gal), 1 μL Tfx-50 reagento (Promega) ir 200 μL serumo neturinčio RPMI- 1640 m. Po 1 valandos buvo pridėta 800 μL RPMI-1640, turinčio FBS, ir ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas. Tada ląstelės buvo apdorotos nurodytais reagentais 1 valandą. Liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant luciferazės tyrimo sistemą ir normalizuotas atsižvelgiant į β-galaktozidazės aktyvumą.

MC3T3-E1 ląstelės buvo transfekuotos „Ad-Sirt1“ arba „Ad-lacZ“ 12 valandų. Po to ląstelės buvo apdorotos taip, kaip aprašyta aukščiau, kad būtų galima nustatyti NF-KB aktyvumą po apdorojimo TNF-α (5, 0 ng / ml).

Statistinė analizė

In vitro eksperimentai buvo atlikti mažiausiai tris kartus, o kiekvienas eksperimentas buvo atliekamas su pakartojimais. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SD. Reikšmingumo lygis buvo nustatytas pagal Studento testą. Skirtumas buvo laikomas statistiškai reikšmingu, kai P <0, 05.

Rezultatai

TNF-α poveikis Sirt1 ekspresijai MC3T3-E1 ląstelėse

Norėdami ištirti Sirt1 baltymo įtaką TNF-α sukeltam citotoksiškumui osteoblastuose, mes ištyrėme Sirt1 ekspresijos lygius reaguodami į TNF-α. Western blot analizė parodė, kad inkubacija su TNF-α (0, 2, 5, 5, 0 ir 10, 0 ng / ml) sąlygojo Sirt1 baltymo ekspresijos sumažėjimą osteoblastuose (1 paveikslas).

Image

TNF-α poveikis Sirt1 ekspresijai MC3T3-E1 ląstelėse. MC3T3-E1 ląstelės buvo kultivuojamos didėjančia TNF-α koncentracija (2, 5, 5, 0 ir 10 ng / ml) 24 valandas. Buvo parodyti „Western blot“ rezultatai ir atsakingasis Sirt1 kiekybinis įvertinimas. GAPDH, glicerraldehido fosfato dehidrogenazė. Grupė be TNF-α stimuliacijos tarnavo kaip kontrolė. Kitų grupių Sirt1 ir GAPDH santykis buvo normalizuotas iki kontrolinio. b P <0, 05, palyginti su kontrole.

Visas dydis

Per didelis Sirt1 baltymo ekspresija MC3T3-E1 ląstelėse

Norint gauti įžvalgos apie Sirt1 funkciją osteoblastų srityje, Sirt1 buvo ekspresuotas, naudojant rekombinantinį adenovirusą. Osteoblastų transfekcija Ad-Sirt1 žymiai padidino Sirt1 baltymų kiekį (2A pav.). Sirt1 deacetilazės aktyvumas taip pat padidėjo naudojant Ad-Sirt1 transfekuotus osteoblastus (2B pav.).

Image

Sirt1 baltymas buvo per daug ekspresuojamas, transfekuojant MC3T3-E1 ląsteles Ad-Sirt1 adenovirusu. MC3T3-E1 ląstelės buvo transfekuotos „Ad-Sirt1“ arba „Ad-lacZ“ 12 valandų. Sirt1 (A) ekspresija buvo tiriama atliekant Western blot analizę, o išmatuoto Sirt1 deacetilazės aktyvumas (B) buvo matuojamas naudojant fluorogeninį substratą. GAPDH, glicerraldehido fosfato dehidrogenazė. b P <0, 05 palyginti su „ Ad-lacZ“ ląstelėmis.

Visas dydis

Per didelis Sirt1 ekspresija susilpnino TNF-α sukeltą ląstelių pažeidimą MC3T3-E1 ląstelėse

Gydant TNF-α, padidėjo apoptozė ir sumažėjo ALP aktyvumas osteoblastuose. Tačiau per didelis Sirt1 ekspresija žymiai susilpnino TNF-α sukeltą ląstelių sužalojimą slopindama apoptozę (3A pav.), Padidindama ALP aktyvumą (3B paveikslas) ir padidindama Runx2 (3C paveikslas) ir osteokalcino (3D paveikslas) mRNR raišką.

Image

Sirt1 perdėtos ekspresijos įtaka TNF-α sukeltai ląstelių žalai MC3T3-E1 ląstelėse. Po sėkmingai transfekuoto Ad-Sirt1 arba Ad-lacZ, dvi ląstelių grupės buvo stimuliuotos TNF-α, apoptozė (Western blot rezultatai ir atsakas į suskaidytos kaspazės-3 ir kaspazės-3, A) kiekybinį įvertinimą, ALP aktyvumas (B). Buvo įvertinti RunR2 (C) ir osteokalcino (D) mRNR lygiai. ALP, šarminė fosfatazė; „Runx2“, su runtu susijęs transkripcijos faktorius 2. b P <0, 05 palyginti su „ Ad-lacZ“ ląstelėmis. e P <0, 05 palyginti su TNF-α-apdorotomis Ad-lacZ ląstelėmis.

Visas dydis

„Sirt1“ perdėtos ekspresijos poveikis TNF-α sukeltai NF-κB aktyvacijai

Mes ištyrėme Sirt1 perdėto ekspresijos poveikį NF-κB signalizavimui MC3T3-E1 ląstelėse. TNF-α sukeltą IκB degradaciją (5, 0 ng / ml) iš dalies blokavo padidėjusi „Sirt1“ ekspresija (4A pav.). Kaip parodė luciferazės reporterio tyrimas, TNF-α (5, 0 ng / ml) padidino NF-κB aktyvumą MC3T3-E1 ląstelėse. Šį padidėjimą iš dalies sustabdė ir „Sirt1“ per didelis ekspresas (4B pav.). Negydant TNF-α, „Sirt1“ per didelė ekspresija neturėjo reikšmingo poveikio NF-κB aktyvumui.

Image

„Sirt1“ per didelis ekspresijos poveikis TNF-α sukeltai IkBα degradacijai (A) ir NF-κB aktyvacijai (B). Kontrolinės arba Sirt1 per daug ekspresuojančios osteoblastinės ląstelės 1 valandą buvo gydomos TNF-α (5, 0 ng / ml). NF-κB aktyvumas buvo analizuojamas luciferazės reporterio tyrimu. b P <0, 05 palyginti su „ Ad-lacZ“ ląstelėmis. e P <0, 05 palyginti su TNF-α-apdorotomis Ad-lacZ ląstelėmis.

Visas dydis

„Sirt1“ per didelis ekspresijos poveikis TNF-α sukeltai NO gamybai ir iNOS baltymo ekspresijai

Šiame tyrime osteoblastų inkubacija su TNF-α (5, 0 ng / ml) lėmė iNOS ekspresijos padidėjimą. Norėdami apibrėžti ryšį tarp TNF-α ir iNOS ekspresijos, mes ištyrėme TNF-α signalizacijos kelius, kurie pirmiausia aktyvuoja JNK ir NF-κB kelius 19, 20 . NF-κB ir JNK aktyvacijai blokuoti buvo naudojami BAY-11-7082, NF-κB inhibitorius, ir SP600125, JNK inhibitorius. Duomenys parodė, kad TNF-α sukeltą iNOS ekspresiją slopino BAY-11-7082 (10 μmol / L), o ne SP600125 (10 μmol / L) (5A pav.), Parodydami, kad TNF-α sukeltas iNOS padidėjimas raišką tarpininkavo NF-κB, o ne JNK kelias. Kadangi NF-κB aktyvacija, kurią sukėlė TNF-α, buvo slopinama dėl Sirt1 perdėtos ekspresijos, mes ištyrėme Sirt1 perdėtos ekspresijos įtaką TNF-α sukeltai iNOS raiškai. Mes nustatėme, kad per didelis Sirt1 ekspresija slopino iNOS indukciją TNF-α (5, 0 ng / ml) (5B pav.). Be to, TNF-α (5, 0 ng / ml) sukelta NO gamyba taip pat sumažėjo dėl „Sirt1“ perraiškos (5C pav.). Negydytuose osteoblastuose padidėjusi Sirt1 raiška padidino NO susidarymą. Kadangi pastoviosios būsenos iNOS yra išreikšta žemu lygiu 20, mes ištyrėme „Sirt1“ perdėtos ekspresijos poveikį eNOS raiškai bazinėmis sąlygomis ir nustatėme, kad ją taip pat sustiprina „Sirt1“ per didelė ekspresija (5D pav.).

Image

„Sirt1“ per didelis ekspresijos poveikis TNF-α sukeltai NO gamybai ir iNOS baltymo ekspresijai. Ląstelės buvo apdorotos BAY-11-7082 (10 μmol / L, NF-κB inhibitorius) arba SP600125 (10 μmol / L, JNK inhibitorius), jei nebuvo arba nebuvo TNF-α (5, 0 ng / ml) 24 valandas. h. „INOS“ išraiška buvo patikrinta atliekant Western blotting analizę (A). Kontrolinės arba Sirt1 per daug ekspresuojančios osteoblastinės ląstelės buvo kultivuojamos 24 valandas be TNF-α arba 5, 0 ng / ml. Tada iNOS ekspresija buvo patikrinta atliekant Western blot analizę (B), o NO susidarymas buvo aptiktas Griess metodu (C). Kontrolinės arba Sirt1 per daug ekspresuojančios osteoblastinės ląstelės buvo kultivuojamos ir eNOS ekspresija buvo patikrinta Western blot analize (D). NOx, nitritai ir nitratai; iNOS, indukuojama azoto oksido sintazė; eNOS, endotelio azoto oksido sintazė; GAPDH, glicerraldehido fosfato dehidrogenazė. b P <0, 05 palyginti su „ Ad-lacZ“ ląstelėmis. e P <0, 05 palyginti su TNF-α-apdorotomis Ad-lacZ ląstelėmis.

Visas dydis

Sirt1 aktyvinimas resveratroliu susilpnino TNF-α sukeltą ląstelių sužalojimą MC3T3-E1 ląstelėse

Resveratrolis (10 μmol / L), „Sirt1“ aktyvatorius, panaikino TNF-α sukeltą Sirt1 deacetilazės aktyvumo slopinimą (6A pav.) Ir NF-κB aktyvumą (6B paveikslas). Mes taip pat įvertinome apsauginį resveratrolio (10 μmol / L) poveikį nuo ląstelių pažeidimo, kurį sukelia TNF-α osteoblastai, kad papildytume rezultatus, gautus taikant perdėtos ekspresijos metodą. Gydymas resveratroliu (10 μmol / L) sumažino NO susidarymą (6C pav.), Atnaujino ALP aktyvumą (6D paveikslas), padidino tiek Runx2 (6E paveikslas), tiek osteokalcino mRNR (6F paveikslas) raišką ir slopino apoptozę (6G paveikslas). po gydymo TNF-α. Osteoblastų inkubacija su EX-527 (5 μmol / L), „Sirt1“ inhibitoriumi, atšaukė resveratrolio poveikį TNF-α sukeltai ląstelių žalai, patvirtindama Sirt1 vaidmenį TNF-α sukeltų ląstelių pažeidime.

Image

Resveratrolio poveikis TNF-α sukeltam ląstelių sužalojimui MC3T3-E1 ląstelėse. Ląstelės buvo apdorotos α-MEM (kontrolinė), TNF-α (5 ng / ml), TNF-α + Resveratroliu (10 μmol / l, „Sirt1“ aktyvatorius), TNF-α + Resveratroliu + EX-527 (5 μmol / L, Sirt1 inhibitorius). Sirt1 deacetilazės aktyvumas (A), luciferazės aktyvumas (B), supernatanto NOx kiekis (C), ALP aktyvumas (D) ir Runx2 (E) bei osteokalcino (F) išraiška, apoptozė (Western blot rezultatai ir atsakas į suskaidytos kaspazės kiekybinį įvertinimą) -3 ir kaspazės-3, G). NOx, nitritai ir nitratai; ALP, šarminė fosfatazė; TNF-α, naviko nekrozės faktorius alfa; Res, Resveratrol. b P <0, 05, palyginti su kontrole. e P <0, 05 palyginti tik su TNF-α apdorotomis ląstelėmis. h P <0, 05 palyginti su TNF-α + Resveratroliu apdorotos ląstelės.

Visas dydis

Diskusija

III klasės histono / baltymo deacetilazė „Sirt1“ įsiterpia į NF-κB signalizacijos kelią ir tokiu būdu turi priešuždegiminę funkciją 21 . Dėl pagrindinio NF-κB vaidmens citokinų sukeltame osteoblastų sužalojime, mes hipotezavome, kad Sirt1 gali atlikti vaidmenį citobinų sukeltų ląstelių pažeidimų osteoblastų modeliuose. Mūsų duomenys pateikia daugybę įrodymų, kad Sirt1 turi apsauginį poveikį nuo TNF-α sukeltų ląstelių pažeidimų osteoblastinėse ląstelėse. Pirmiausia, osteoblastų ląstelių gydymas TNF-α sumažino Sirt1 baltymų kiekį. Antra, Sirt1 perdėta ekspresija sumažino TNF-α sukeltą ląstelių pažeidimą osteoblastuose. Trečia, „Sirt1“ per didelis ekspresas slopino TNF-α sukeltą NF-κB aktyvaciją, sumažino iNOS ekspresiją ir sumažino NO susidarymą osteoblastų ląstelėse. Ketvirta, „Sirt1“ aktyvatorius resveratrolis mėgdžiojo apsauginį „Sirt1“ per daug ekspresijos poveikį nuo TNF-α sukeltų ląstelių pažeidimų osteoblastuose. Šie duomenys rodo, kad Sirt1 vaidina citoprotekcinį vaidmenį prieš TNF-α osteoblastinėse ląstelėse, bent iš dalies slopindamas NF-κB aktyvumą.

Pirmiausia parodėme, kad gydant TNF-α, Sirt1 baltymo kiekis osteoblastinėse ląstelėse sumažėjo. Neseniai Takayama ir kt . Pateiktoje ataskaitoje 22 parodyta, kad Sirt1 baltymų kiekį sumažino įvairūs stresai, įskaitant mitybos stresą, katabolinį stresą ir žmogaus chondrocitų mechaninį šlyties stresą. Šie duomenys rodo, kad kartu su mūsų išvadomis Sirt1 gali būti susijęs su uždegimo ar kitų veiksnių sukeltos osteoporozės moduliavimu. Tačiau TNF-α sukėlė padidėjusią Sirt1 raišką kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse 23 . Taigi reikia ištirti pagrindinius šių prieštaringų stebėjimų skirtinguose ląstelių tipuose mechanizmus.

Keletas citokinų gali reguliuoti osteoblastinių ląstelių uždegiminius atsakus, moduliuodami NF-κB signalizacijos kelią. TNF-α, priešuždegiminis citokinas, dalyvavo ankstyvuosiuose įvykiuose, susijusiuose su osteoblastų ląstelių sunaikinimu. TNF-α gamybos slopinimas arba jo sąveikos su jo ląstelių receptoriais blokavimas reikšmingai slopina žalingą poveikį susijusioms osteoporozinėms ligoms 24, 25, 26, 27 . TNF-α suaktyvina kelis tarpląstelinius signalizacijos kelius, įskaitant AP-1 kelią, MAPK kelią ir JNK kelią osteoblastinėse ląstelėse 28, 29, 30 . Tačiau mūsų žiniomis, TNF-α daro žalingą poveikį pirmiausia per NF- KB signalizacijos kelią osteoblastinėse ląstelėse 31, 32, 33 . Kadangi NF-κB yra molekulinis Sirt1 34, 35 taikinys, mes ištyrėme Sirt1 perraiškos įtaką NF-κB signalizacijos keliams TNF-α gydomuose osteoblastuose. Kaip ir tikėtasi, per didelis Sirt1 ekspresija slopino TNF-α sukeltą NF-κB aktyvumą. Be to, gydymas resveratroliu, „Sirt1“ aktyvatoriu, taip pat susilpnino TNF-α sukeltą ląstelių pažeidimą, kurį bent iš dalies lėmė Sirt1 deacetilazės aktyvacija ir vėlesnis NF-κB aktyvumo slopinimas.

„Sirt1“ perdėta ekspresija taip pat blokavo TNF-α sukeltą iNOS ekspresiją ir NO susidarymą. Įrodyta, kad iNOS sistemos aktyvavimas iš dalies tarpininkauja uždegimo sukeltai osteoporozei 16 . Didelės NO koncentracijos, tokios, kaip po stimuliacijos priešuždegiminiais citokinais, ne tik tarpininkauja citokinų sukeltai apoptozei 17, bet ir stipriai slopina osteoblastų augimą bei diferenciaciją. 20, 36, 37 . Todėl „Sirt1“, bent jau iš dalies, atliko apsauginį vaidmenį nuo TNF-α, slopindamas iNOS baltymo ekspresiją pasroviui nuo NF-κB.

Apibendrinant galima teigti, kad per didelis Sirt1 ekspresija apsaugo osteoblastus nuo TNF-α sukeltų ląstelių pažeidimų, bent iš dalies, slopindamas NF-κB aktyvumą ir genus, esančius pasroviui nuo NF-κB, įskaitant iNOS. Mūsų rezultatai rodo, kad Sirt1 yra naujas terapinis taikinys, skirtas gydyti su uždegimu susijusį kaulų retėjimą.

Autoriaus indėlis

Šį tyrimą sukūrė Wei Huang. Eksperimentus atliko Wei HUANG, Wei-lin SHANG, Hua-dong WANG, Wen-wen WU ir Shu-xun HOU. Rankraštį parašė Wei HUANG, Wei-lin SHANG ir Hua-dong WANG.