Tarpdomenų komunikacija vietoje gali būti tarpininkaujant įvairiems funkcijų praradimo mechanizmams su vėžiu susijusiame nqo1 polimorfizme | mokslinės ataskaitos

Tarpdomenų komunikacija vietoje gali būti tarpininkaujant įvairiems funkcijų praradimo mechanizmams su vėžiu susijusiame nqo1 polimorfizme | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biofizinė chemija
  • Molekulinė biofizika
  • Onkogeniniai baltymai

Anotacija

Su ligomis susijusios genetinės variacijos dažnai sukelia ląstelių fermentų inaktyvaciją, disreguliaciją ir nestabilumą. Tačiau alosterinis mutacijos efektų perdavimas tolimoms funkcinėms vietoms, dėl kurių prarandama funkcija, išlieka menkai suprantamas. Čia apibūdiname tarpdomenų ryšį tarp vietų, pagal kuriuos bendras su vėžiu susijęs vieno nukleotido polimorfizmas (c.C609T / p.P187S) sumažina NAD (P) H aktyvumą ir stabilumą in vivo : chinono oksidoreduktazė 1 (NQO1). NQO1 yra nuo FAD priklausomas daugiafunkcinis streso baltymas, veikiantis kaip II fazės fermentas, suaktyvinantis vėžio prevencinius vaistus ir stabilizuojantis p53 ir p73α onkosupresorius. Mes parodome, kad p.P187S sukelia struktūrinius ir dinaminius pokyčius, perduodamus funkcinėms vietoms, esančioms toli nuo mutacijos, paveikdamas FAD surišimo vietą, esančią N-galiniame domene (NTD), ir paspartindamas proteasominį skilimą per dinaminį poveikį C-terminalo domenui ( CTD). Struktūriniai baltymų: baltymų sąveikos tyrimai rodo, kad su vėžiu susijęs polimorfizmas nepanaikina sąveikos su p73α, ir tai rodo, kad onkosupresoriaus destabilizacija daugiausia atspindi mažą p.P187S tarpląstelinį stabilumą. Pabaigoje parodome, kaip dėl vienos ligos, susijusios su aminorūgšties pasikeitimu, alosteriškai gali būti sutrikdytos kelios funkcinės vietos oligomeriniame ir daugiadominiame baltyme. Šie rezultatai turi didelę reikšmę suprantant funkcijų praradimo genetines ligas ir nustatant naujas struktūrines karštas vietas kaip farmakologinės intervencijos taikinius.

Įvadas

Natūralūs baltymai yra heterogeniški junginiai, imantys daugybę mikroskopinių pokyčių 1 . Santykinį šių būsenų skaičių lemia jų vidinis stabilumas (ty laisvosios energijos ) ir jų tarpusavio virsmo greičiai (ty kinetinės kliūtys ) 1, 2 . Didelio masto ir lėti kolektyviniai judesiai (ms – s laiko skalėmis) nulemia perėjimus tarp nedidelio skaičiaus mažai energijos turinčių būsenų, atitinkančių skirtingas konformacijos būsenas (turinčias iš esmės skirtingą struktūrą ir energetinę pusiausvyrą). 1, 2, 3, 4 . Šiose mažos energijos būsenose greitai atsiranda nedidelio masto svyravimai, tokie kaip stuburo ir šoninių grandinių dinamika, kurie yra pagrindinis konformacinės dinamikos šaltinis 1, 3, 4 . Norint suprasti baltymų funkciją, reguliavimą, skilimą ir evoliuciją, būtinas gilus struktūrinis, termodinaminis ir kinetinis kolektyvinio ir vietinio baltymo judesių supratimas. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 .

Baltymų alterija yra reiškinys, leidžiantis susisiekti tarp dviejų nutolusių baltymo vietų (pvz., Dviejų skirtingų ligandų surišimo vietos arba tarp ligando surišimo vietų ir mutavusio / posttransliacinio modifikavimo vietos) 11 . Ligandą surišantys baltymai keičia konformacinius junginius, stabilizuodami surišimo kompetentingas būsenas iš tokios konformaciškai heterogeniškos buvusios pusiausvyros. Todėl mikrostatų populiacijos poslinkis makroskopiškai stebimas kaip konformacijos pokytis 11, 12, 13, 14 . Atitinkamai, šių konformacijos pokyčių struktūriniai ir dinaminiai aspektai daro didelę įtaką baltymų funkcijai ir reguliavimui (pvz., Ligando surišimo afinitetui ir energetikai). 2, 3, 4, 12, 15 . Funkcinių, struktūrinių ir termodinaminių analizių derinys yra galingas metodas identifikuoti alosterinius tinklus ir baltymų kelius bei atskirti įvairius alosterinius mechanizmus (pvz., Indukuotas pritaikymas vs. konformacinė atranka ) 4, 12, 14, 16 .

Ligos paveldimi baltymų sekos pokyčiai (ty mutacijos ir polimorfizmai) turi įtakos baltymų aktyvumui, reguliavimui ir stabilumui. 17, 18, 19, 20, 21, 22 . Vis dėlto alosterinis ryšys tarp vietos, dėl kurio prarandami genetiniai funkcijų praradimai, retai buvo tiriamas daugiadomeniuose oligomeriniuose baltymuose 23, 24, 25 . Mes hipotezuojame, kad su vėžiu susijęs vieno nukleotido polimorfizmas p.P187S (rs1800566 / c.C609T) NADP (H): chinono oksidoreduktazė 1 (NQO1; EC 1.6.5.2) tarpininkauja fermentų funkcijos praradimui per ilgą laiką. p.P187S vietoje atsirandantys skirtingi efektai tarp vietų, perduodami į tolimas funkcines vietas per hipotetinį alosterinės sąveikos tinklą (1 pav.). NQO1 yra dviejų domenų FAD priklausomas fermentas (1A pav., B pav.), Dalyvaujantis chinonų redukcijai dviem elektronų elementais, svarbus II fazės detoksikacijos reakcijoms, superoksido pašalinimui ir tam tikrų vėžio prevencinių vaistų aktyvinimui 26 . N-galinis domenas (NTD) jungiasi su FAD, o mažesnis C-galo domenas (CTD, liekanos 225–274) yra struktūriškai susijęs su NADH, substratų ir konkurencinių inhibitorių (pvz., Dikumaarolio) surišimu (1B pav., C). NQO1 taip pat sąveikauja ir stabilizuoja su vėžiu susijusius transkripcijos veiksnius, tokius kaip p53 ir p73α 27, 28, 29, 30, net jei šios tarpląstelinės sąveikos struktūros pagrindas nežinomas. Nors p.P187S smarkiai sumažina NQO1 lygį ir aktyvumą in vivo , holo-p.P187S kristalografinės analizės neparodė reikšmingo poveikio funkcinėms ar struktūrinėms vietoms, tokioms kaip FAD surišimo vieta, CTD ar monomero: monomero sąsaja 31 . Tačiau molekulinės dinamikos (MD) modeliavimas, biofiziniai eksperimentai ir ekspresijos analizė patvirtino hipotezę, kad p.P187S inaktyvina ir destabilizuoja NQO1 per dinaminius apo būklės pokyčius, ypač dviejose funkciškai ir struktūriškai tolimose vietose (1 pav. D): FAD surišimo vieta, susijusi su fermento inaktyvacija; ir CTD, susijęs su padidintu proteasominiu p.P187S 22, 24, 31 skilimu .

Image

( A ) du NQO1 dimerų vaizdai, rodantys baltymo paviršių ir dimerizacijos sąsają (apskaičiuota naudojant PISA serverį 34 ); N-galiniai domenai (NTD) rodomi raudonai (monomero Nr. 1) ir rudai (monomero Nr. 2), o C-galo domenai (CTD) - mėlynai (monomeras # 1) ir cianui (monomero Nr. 2); ( B ) Du vaizdai iš NQO1 dimerų, demonstruojančių NTD antrines struktūras (2–225 liekanos, mėlynos spalvos) ir CTD (226–271 liekanos, raudonos spalvos). FAD, dicoumarol (dic) ir P187 pavaizduoti atitinkamai žalsvai melsva, šviesiai ruda ir žalia spalvomis. ( C ) FAD ir dikoumarolio rišamųjų vietų vaizdas iš arti, pažymėti likučiai, priklausantys NTD (mėlyna) ir CTD (raudona). ( D ) Hipotezuoto alosterinės sąveikos tinklo, apimančio p.P187S ir FAD surišimo vietas bei CTD, schema. FAD rišamojoje vietoje (kairiajame skydelyje) labai dinamiška 57–66 kilpa, esanti p.P187S apo-būsenoje, pažymėta cyan cyan, kad būtų parodyta tolima jos vieta nuo CTD ir p.P187S vietų. Konstrukcijos buvo parodytos „Pymol 60“ naudojant NQO1 struktūrą (PDB: 2F1O).

Visas dydis

Šiame darbe mes tiriame, kaip p.P187S polimorfizmas veikia FAD surišimo vietą ir NQO1 CTD per ilgą nuotolį perduodant struktūrinius ir dinaminius pasipiktinimus (1 pav. D), taip pat koks yra jų galimas poveikis onkosupresorių surišimo vietai. . Norėdami tai padaryti, apibūdiname laukinio tipo (WT) ir p.P187S NQO1 jų pilno ilgio ir C-termino sutrumpintose (Δ50-NQO1) formose, naudodamiesi daugiadalykine metodika. Apskritai parodome, kaip vienas aminorūgšties pakeitimas gali sukelti baltymų funkcijos praradimą, tuo pačiu paveikdamas kelias funkcines vietas sudėtiniame oligomeriniame ir daugiadomenyje baltyme, turinčiame metabolinį ir reguliavimo vaidmenį.

Rezultatai

NQO1 CTD vaidina svarbų vaidmenį apo būsenos konformacinėje pusiausvyroje

Struktūrinės analizės 32 parodė, kad CTD yra NQO1 dimerio sąsajos dalis (1A pav., B), pridedant iki 35% viso šioje sąsajoje palaidoto paviršiaus (960 Å 2 iš 2700 Å 2 vienam monomerui; apskaičiuota naudojant cpptraj 33). ). Skaičiavimai, naudojant PISA serverį (//www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/ 34 ), rodo, kad bent vienas CTD likutis yra susijęs su 40% vandenilio jungčių ir puse druskos tiltelių ties dimerio sąsaja . Be to, CTD yra dikoumarolio rišamosios vietos dalis (Phe232 ir Phe236; 1C pav.), Tačiau neatrodo, kad tai būtina FAD surišimui ar stabiliam NTD lankstymui (S1 pav. 31 ). Nors Pro187 nėra arti FAD ar dikoumarolio rišamųjų vietų, jo trumpiausias atstumas iki KTD yra apie 4 Ä (su Gln268 ir Ile269) (1B pav., D). Todėl neaišku, ar CTD išbraukimas daro įtaką NQO1 dimerizacijai, aktyvumui ir stabilumui, taip pat struktūriniam ir dinaminiam poveikiui, kurį p.P187S sukelia FAD surišimo vietoje ir CTD (1 pav., C ir D. 24).

NQO1 WT ir p.P187S viso ilgio ir C-gale išbraukti (neturintys paskutinių 50 liekanų C gale, Δ50-NQO1) versijos buvo ekspresuojamos ir išgrynintos iš E. coli . Norint ištirti jų oligomerinę būseną, jų hidrodinaminė elgsena buvo analizuojama atliekant dydžio išskyrimo chromatografiją (SEC) ir dinaminę šviesos sklaidą (DLS) (S2A ir S2B paveikslai). Mūsų rezultatai rodo, kad visi NQO1 variantai tirpale elgiasi kaip dimeriai, net esant ≤1 μM koncentracijai (atkreipkite dėmesį, kad NQO1 ir Δ50-NQO1 dimerų molekulinė masė turėtų būti atitinkamai 65, 2 ir 53, 9 kDa). NQO1 WT ir P187S mutantų 1-1 aido impulsų seka taip pat buvo naudojama matuojant abiejų spektrų labiausiai žemyn nukreiptų izoliuotų amidų protonų T2 relaksacijos laikus, gaunant maždaug 78 kDa molekulinę masę (esant 20 μM monomero koncentracijai) vienetai; žr. papildomą informaciją). Bandėme aptikti dimerų disociaciją ir nustatyti jų disociacijos konstantas izoterminės titravimo kalorimetrijos metodu (ITC; S2C pav.). Tačiau NQO1 dimerio skiedimas sąlygojo nedidelį šilumos pasikeitimą arba jo nedaug, palyginti su tuščiojo tuščiojo tirpalo (ty buferinio tirpalo) skiedimu, ir tai patvirtina, kad titrai, kurie iš pradžių buvo naudojami titravimo metu, mažo mikromolių diapazono dimerų atsiribojimas įvyko mažai arba nereikšmingai. Šis rezultatas yra svarbus atsižvelgiant į tai, kad tirpiklio paveiktas paviršiaus kiekis, dimerui išsiskyrus (tikimasi, kad jis bus apie 5400 Å 2 ; žr. Aukščiau), užtikrins puikų šilumos išsiskyrimą 10–15 kcal · mol −1 diapazone 25 ° temperatūroje. C, naudojant anksčiau paskelbtas struktūros ir energetikos koreliacijas 35 .

Pažymėtina, kad išgryninti NQO1 baltymai rodo skirtingus surištų FAD kiekius, o WT turi didžiausią kiekį, Δ50-WT rodo vidutinius lygius (maždaug 4 kartus mažesnis nei WT), o p.P187S ir Δ50-p.P187S rodo nežymų lygį. surišto FAD, remiantis jų atitinkamais absorbcijos artimais UV / matomaisiais spektrais (2A pav.). Norėdami ištirti bendrą jų konformaciją, mes paruošėme apo-baltymus ir pridėjome tikslias ligandų koncentracijas, kad pasiektume skirtingas ligavimo būsenas (holo-NQO1, su FAD, ir holo-NQO1 + dikoumarolis, turinčios FAD ir dikumarolio perteklių). Tolimojo ultravioletinio apskritimo dichroizmo (CD) spektrai išilginio ilgio ir 50 apo-baltymų rodo didelį užsakytos antrinės struktūros kiekį (2B – E pav.). FAD surišimas keičia antrinės struktūros kiekį, padidindamas elipsės stiprumą esant 222 nm (α-spiralės turinio požymis) 20–25%, išskyrus p.P187S, kur šis padidėjimas yra 10% (2F pav. G; atkreipkite dėmesį, kad visais atvejais statistinis tam tikrų variantų palyginimas kaip holo- ir apo-baltymai duoda ap vertę <0, 05, naudojant t-testą). Dikumaarolio, sąveikaujančio tiek su NTD, tiek su CTD, surišimas viso ilgio NQO1, lemia dar didesnį 16% holo-p.P187S padidėjimą (p <0, 05), bet ne holo-WT, o tai sukelia tik nedidelį padidėjimą (6). –9%) Δ50 variantuose (2F pav., G). Kadangi apo-NQO1 iš dalies iš dalies atlenkia konformacijas 22, 24, 31, 36, šie rezultatai leidžia manyti, kad FAD ir dikoumarolio jungimasis prie viso ilgio ir Δ50 variantų lemia NQO1 konformacinės pusiausvyros poslinkį link kompaktiškesnio, ligandą surišančio kompetentingo. konformacijos. Atitinkamai, DLS eksperimentai parodė sumažėjusį WT ir p.P187S hidrodinaminius spindulius, kai atitinkamai pridedami FAD arba FAD + dikoumarolis (2H pav.), Dar labiau palaikydami kompaktiškesnę vidutinę dimerų konformaciją esant šiems ligandams. Kalbant apie Δ50 variantus, FAD ir (arba) dikoumarolio jungimasis turėjo daug mažesnį poveikį hidrodinaminiam spinduliui (2H pav.), Rodantį svarbų CTD vaidmenį apo-NQO1 konformacinėje pusiausvyroje.

Image

( A ) FAD, prijungtas prie baltymų, išgrynintų iš beveik UV / matomos absorbcijos spektro. ( B - E ) NQO1 variantų, kaip apo-baltymų, tolimojo UV UV spektro spektras, esant FAD (Holo) arba FAD + dikoumaroliui (Holo + dic); Vidutinių liekanų elipsės ([Θ] MRE ) vertės ( F, G ) esant 222 nm bangos ilgiui nuo spektrų, parodytų plokštėse ( B - E, H ), hidrodinaminis spindulys NQO1 variantams skirtingose ​​ligacijos būsenose. Duomenys A – G grupėse yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis, o H skydelyje - nuo 3 iki 6 nepriklausomų eksperimentų. F, G ir H plokščių vertės yra lygios ± sd nuo pakartojimų. Visais atvejais buvo naudojami nuo dviejų iki trijų skirtingų baltymų gryninimo, o temperatūra buvo 25 ° C.

Visas dydis

P.P187S dinaminis CTD nei prisideda prie jo žemo kinetinio stabilumo in vitro, nei prie ligandų sąlygojamo NQO1 dimerų stabilizacijos.

p.P187S smarkiai sumažina NQO1 in vitro šiluminį ir kinetinį stabilumą, pagreitindamas dimerio atsiskleidimą ir atsiribojimą 22, 24 . Norėdami ištirti KTD įtaką mažam kinetiniam stabilumui, mes atlikome terminės denatūracijos tyrimus, stebimus CD spektroskopijos būdu (3 pav.). CTD pašalinimas sukelia nedidelę 3 ° C temperatūros destabilizaciją WT ir p.P187S fonuose (3 pav. Ir 1 lentelė). Didelis FAD (holo-baltymų) perteklius sukelia nepaprastą stabilizaciją - nuo 5 iki 10 ° C (3 pav. Ir 1 lentelė), o FAD ir dikoumarolio perteklius daro maždaug papildomą poveikį stabilumui (12–17). ° C). Šie rezultatai rodo, kad KTD pašalinimas šiek tiek destabilizuoja NQO1, ir tai nėra p.P187S žemo kinetinio stabilumo in vitro priežastis.

Image

Eksperimentai buvo atlikti naudojant NQO1 variantus skirtingose ​​ligacijos būsenose. Neapdorotos denatūracijos kreivės buvo normalizuotos, naudojant palyginimo pradinę liniją prieš ir po pereinamojo laikotarpio.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Dalinė viso ilgio NQO1 baltymų proteolizė suteikia kiekybinę informaciją apie polimorfizmų ir ligando surišimo poveikį vietinei dinamikai 24 . Dalinė 5050 variantų kaip apo-baltymų proteolizė parodė greitą natūralaus baltymo skilimą (4A, B pav.) Ir atsirado 3–4 proteolizės produktai, kurių molekulinis dydis yra 16–19 kDa (S1 lentelė), remiantis HPLC / ESI-MS. FAD surišimas sukelia pastebimą 10 kartų padidėjusį atsparumą skilimui (4A, B pav.) Ir 18 ir 15 kDa iš dalies proteolizuotų rūšių kaupimąsi (S1 lentelė). Dicoumarolio jungimasis su holo-baltymais lemia 10–20 kartų didesnį natūralaus Δ50 baltymo stabilizavimąsi (4A pav., B). Atliekant pirštų atspaudų ištirpintų mėginių paėmimą, naudojant MS / MS, nustatyta, kad skilimas pradedamas C-galinėje A50-NQO1 dalyje, apimančioje keletą aktyvių skilimo vietų 150–170 regione (ypač dinamiškas Δ50-NQO1 apo būsenoje, žr.). mūsų MD modeliavimas žemiau), dėl kurio susidaro stabilus tarpinis produktas, turintis liekanas 1–143 (4A ir S3 pav.). Mūsų palyginamosios proteolizės kinetikos analizės palaiko mūsų ankstesnį pasiūlymą dėl labai dinamiškos CTD, esant apo-būsenai NQO1, kuris išlieka dinamiškas holo-p.P187S, nebent dikumaarolis yra surištas (4 pav. C). Turime atkreipti dėmesį, kad absoliutus vietinės dinamikos palyginimas tarp NQO1 ir Δ50 variantų yra neįmanomas, nes eksperimentinės proteolizės greičio konstantos yra proporcingos pirminėms skilimo vietoms nuo sekos priklausančioms vidinėms proteolizės greičio konstantoms naudojamomis sąlygomis.

Image

( A ) reprezentatyvūs SDS-PAGE geliai, skaidydami Δ50-WT skilimo kinetiką skirtingose ​​ligavimo būsenose (apo, holo ir holo-holo + dic). Regionai, atitinkantys molekulinius dydžius nuo 45 iki 14 kDa juostų, aiškumo sumetimais pavaizduoti (papildomų gelių paveikslėlių ieškokite S3 paveiksle); ( B ) Gimtosios juostos Δ50 degradacijos laikas. Eksperimentai atlikti 25 ° C temperatūroje esant 0, 1 μM termolizino. ( C ) proteolizės greičio konstantos viso ilgio ir Δ50-NQO1 variantams skirtingose ​​ligavimo būsenose (duomenys apie viso ilgio variantus pateikti iš nuorodos 24).

Visas dydis

Dėl p.P187S CTD vyksta didelis konformacinis persitvarkymas, kai jungiasi dikoumarolis, ir tai prisideda prie tolimojo dinaminio poveikio, veikiančio FAD surišimą.

Mažas specifinis p.P187S tarpląstelinis aktyvumas daugiausia susijęs su trūkumų turinčiu FAD surišimu (5A pav. Ir 24 nuoroda). Dėl CTD pašalinimo labai sumažėja specifinis aktyvumas, atsirandantis dėl sumažėjusio katalizinio efektyvumo, o ne dėl FAD kiekio, nes prisotinimas FAD sukelia tik nedidelį aktyvumo padidėjimą (5A pav.). Buvo nustatyti fermento kinetiniai NADH ir holo-fermentų DCPIP (2, 6-dichlorfenolindofenolio) parametrai (5B – E pav.), Parodantys nedidelį p.P187S poveikį kataliziniam veikimui, o pašalinus CTD 30–100 kartų sumažėjęs specifinis aktyvumas ir, svarbiausia, kad tariamasis afinitetas NADH sumažėtų nuo 30 iki 50 kartų (5B – E pav. ir 2 lentelė). Šie rezultatai patvirtina, kad p.P187S ir CTD išbraukimas sukelia NQO1 inaktyvaciją skirtingais mechanizmais: pirmasis sumažina FAD surišimo afinitetą, o antrasis stipriai sumažina katalizinį efektyvumą.

Image

( A ) Veiklos matavimai, kai nėra (NQO1) arba nėra (Holo) FAD pertekliaus, naudojant 70 μM DCPIP ir 1 mM NADH. Atkreipkite dėmesį į y ašies logaritminę skalę. ( B ) WT / p.P187S ( B, C ) ir Δ50-WT / Δ50-p.P187S ( D, E ) aktyvumo priklausomybė nuo NADH ( B, D ) ir DCPIP ( C, E ) koncentracijų. Linijos tinka Michaelio-Menteno lygčiai.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Šiame etape mes iškėlėme hipotezę, kad CTD gali ypač paveikti p.P187S katalizinį veikimą in vivo dėl tolimojo susisiekimo su FAD surišimo vietomis (1 pav. D). „NQO1 WT“ rodo 10–100 didesnį afinitetą FAD nei p.P187S ir šiek tiek neigiamo kooperacijos laipsnio 22, todėl sunku tiksliai palyginti jų rišamąją energiją. Nepaisant to, pašalinus CTD panaikinamas neigiamas NQO1 WT kooperatyvas (tai matyti iš gero jų rišimosi izotermų aprašymo, naudojant nebendradarbiaujančio surišimo modelį; S4A pav.), Taip pat žalingo p.P187S poveikio FAD surišimui su WT. ir p.P187S sutrumpintos formos, turinčios panašiai aukštą surišimo afinitetą ir termodinaminius parašus (6A pav., B). Pažymėtina, kad pašalinus KTD, p.P187S afinitetas padidėja keturis kartus, dėl nedidelio palankaus entropinio indėlio į surišimą (6 pav. C). Šie rezultatai atskleidžia CTD indėlį į FAD surišimo afinitetą, atliekant priešingus vaidmenis WT ir p.P187S, tikriausiai per didelio nuotolio ryšį tarp p.P187S ir funkcinių CTD ir FAD surišančių vietų. Tai ypač įdomu, nes CTD pašalinimas turi mažai arba visai neturi struktūrinio ir dinaminio poveikio holo-p.P187S 31 FAD surišimo režimui (S1 paveikslas ir kitas skyrius), taip parodydamas, kad ryšys tarp p.P187S ir funkcinių vietų daugiausia veikia p.P187S apo būsenos konformacinę pusiausvyrą. Be to (žr. Kitą skyrių), p.P187S apatinio FAD surišimo afiniteto entropinė kilmė patvirtina, kad jis pirmiausia atsiranda dėl baltymų konformacijos dinamikos pokyčių (ty, konformacinė entropija , žr. 6C pav. Ir kitą skyrių).

Image

( A - C ) surišimo afinitetas ( A ) ir termodinaminiai profiliai, skirti surišti FAD ( B ). C skydelyje parodytas C-terminalo pasitraukimo poveikis termodinaminiams p.P187S jungties parametrams. ( D, E ) Dikoumarolio surišimo afinitetas ( D ) ir termodinaminiai surišimo profiliai ( E ) WT ir p.P187S, kaip išgryninta. ( F - H ) surišimo afinitetas ( F ) ir termodinaminiai profiliai, skirti dikoumaroliui jungtis ( G ) prie holo-baltymų. Skydelyje H rodomas C-galinio trynimo poveikis termodinaminiuose surišimo parametruose.

Visas dydis

Kaip išgrynintas, p.P187S suriša dikoumarolį 90 kartų mažesniu afinitetu nei NQO1 WT (6 pav. D). Dažniausiai tai lemia daug mažesnis palankus entalpinis indėlis, kurį daugiausia kompensuoja palankesnis entropinis pokytis (6 pav. E). Šis didelis afinitetų skirtumas greičiausiai paaiškinamas daug mažesniu FAD kiekiu išgrynintame p.P187S. Remiantis ankstesnėmis kristalografinėmis analizėmis ir MD modeliavimu 24, 32, dikoumarolio ribojimą turi teikti pirmenybė surištam FAD (ty holo- ir apo-būsenai), pirmiausia per stipresnę (entalpijos sąlygojamą) sąveiką, kurią atsveria didelis baltymų dinamikos sumažėjimas (ty konformacinės entropijos praradimas). Nuosekliai dikoumarolio prisijungimas prie holo-fermentų (ty prisotintų FAD) rodo 5 kartus (WT) ir 75 kartus (p.P187S) afinitetus, palyginti su baltymais, kurie yra išgryninti (6F ir S4B pav.). Šie rezultatai parodo svarbų struktūrinį ir energetinį FAD vaidmenį veiksmingai jungiant dikoumarolį, taip pat rodo dikoumarolio jungimosi su p.P187S ir WT holo formomis skirtumus. Iš tikrųjų, dikoumarolio prisijungimas prie holo-p.P187S rodo daug didesnį teigiamą entalpinį indėlį (apie –21 kcal · mol – 1 ), kurį kompensuoja didelis entropijos sumažėjimas (6 pav. G). Tinkamas to paaiškinimas gali būti didelis solvacijos / konformacinės entropijos praradimas, atsvertas dėl baltymo struktūros pertvarkymo, ypač esant labai dinaminei p.P187S CTD. Tiesą sakant, paprastos struktūros ir energetinės koreliacijos, susijusios su baltymų sulankstymu 35, 25 ° C temperatūroje sukelia py 0, 21 kcal · mol −1 · (liekanos) −1 entalpijos pokytį, suderinamą su žymiai didesniu konformaciniu pertvarkymu (maždaug šimtu liekanų) p. .P187S rišant dikumaarolį. Remiantis tuo, dikoumarolio prisijungimas prie holo-Δ50-WT ir holo-50-p.P187S yra labai panašus (S4C pav.), Patvirtinantis, kad dikoumarolio prisijungimas prie viso ilgio holo-p.P187S yra susijęs su dideliais struktūriniais ir dinaminiais pertvarkymais. jo CTD (6G pav., H).

Molekulinės dinamikos (MD) modeliavimas palaiko CTD vaidmenį bendraujant tarp p.P187S ir FAD surišimo vietų.

Molekulinės dinamikos (MD) modeliavimas parodė, kad p.P187S veikia greitą vidinę baltymų dinamiką, sukeldamas ilgalaikį poveikį FAD surišimo vietai ir CTD 24 . Norėdami ištirti, ar CTD pašalinimas gali turėti įtakos dinaminiam ryšiui tarp p.P187S ir FAD surišimo vietų, mes atlikome MD modeliavimą Δ50-NQO1 variantams ir išanalizavome jų stuburo dinamiką naudodami du reikšmingus parametrus 24 : B faktoriai (7 pav.) ir diario entropijos (S5 pav.).

Image

( A, B ) Poveikis globalios ( A ) ir dimerinės sąsajos ( B ) dinamikai viso ilgio ir apipjaustytuose NQO1 variantuose skirtingose ​​ligavimo būsenose (apo, holo ir holo + dicoumarol); ( C, D ) Skirtumas tarp C-terminalo sutrumpinto ir viso ilgio dinamikos WT ( C ) ir p.P187S ( D ) skirtingose ​​ligavimo būsenose; ( E - G ) Skirtumas tarp p.P187S ir WT, kaip pilno ilgio ir C-galo apipjaustytų baltymų, skirtingose ​​ligavimo būsenose (( E ), apo; ( F), holo; ( G), holo + dikumarolis).

Visas dydis

CTD pašalinimas padidina vidutinį NQO1 lankstumą, ypač dimerio sąsajoje, atsižvelgiant į jo kuklią kinetinę destabilizaciją in vitro , o terminė stabilizacija, kai FAD ir dikoumarolis jungiasi, gerai koreliuoja su ligandų sukeltu globalios dinamikos sumažėjimu (7A, B ir S5A pav.) -B). Įdomu tai, kad sumažėjęs jungimosi afinitetas FAD Δ50-NQO1 WT atrodo dėl didesnių konformacinių svyravimų apo būsenos FAD surišimo vietoje (ties 57–66, 125–136 ir 150–166 liekanomis; 7C ir S5C pav.) . Svarbu, mes pastebime, kad CTD yra būtinas p.P187S, siekiant sustiprinti vietinę dinamiką apo būsenos FAD rišamojoje vietoje, ypač 57–66 kilpoje (7 pav. D). Todėl mūsų MD modeliavimai atomine skiriamąja geba paaiškina, kaip CTD pašalinimas žymiai padidina p.P187S surišimo afinitetą, kukliai sumažinant surišimo (konformacinę) entropiją. Todėl CTD turi priešingą poveikį WT ir p.P187S FAD surišimo vietos dinamikai apo būsenoje (7C pav., D), sutinkant su mūsų eksperimentiniais stebėjimais (žr. 22 ir 6A – C pav.). Atitinkamai, CTD sutrumpintos WT ir p.P187S formos rodo panašius FAD jungiančius energetinius ir dinaminius signalus (6B, 7E ir S5E pav.).

Dėl dikumaarolio prisijungimo, holo-p.P187S jungiasi su inhibitoriumi dvigubai mažesniu afinitetu nei apipjaustyta versija dėl didelės entropinės baudos, kurią atsveria didelis palankus entalpinis indėlis (6F – H pav.). Tai galima paaiškinti dideliu 231–236 srities konformaciniu apribojimu (ty konformacinės entropijos sumažėjimu) prisijungiant (tai apima Phe232 ir Phe236, kurie tiesiogiai sąveikauja su dikoumaroliu; 1C, 7G, S5G ir 24 pav.). Be to, šį didelį konformacijos apribojimą savo ruožtu entalpiškai kompensuoja papildomos sąveikos, nustatytos p.P187S CTD dikoumarolio rišimo vietoje ir jungimosi metu vykstantys konformaciniai pokyčiai.

NQO1 variantų sąveikos su p73α SAM domenu struktūrinės analizės rodo, kad aktyvus NQO1 nėra būtinas jungiantis

Ankstesni biocheminiai eksperimentai patvirtino CTD vaidmenį sąveikaujant NQO1 su onkosupresoriais, tokiais kaip p73α. Panašu, kad ši sąveika sustiprėja, jei NADH yra prisijungęs prie NQO1 (nors tikimasi, kad ši būsena bus nestabili, FAD redukuojama į FADH 2 ir vėliau NAD + išsiskiria), ir ją gali slopinti dikoumarolis 30, bet ne mechanizmas. pagrindu veikiantis inhibitorius ES936, kuris taip pat sąveikauja su CTD 32 . KTL sutrumpinimas (209–274 liekanos) arba tarpląsteliniu požiūriu nestabilus p.P187S taip pat gali susilpninti šiuos baltymus: baltymų sąveika 29, 37 .

Be transaktyvacijos domeno, p73 taip pat turi sekai būdingą DNR surišimo domeną ir oligomerizacijos sritį. Visų pirma, p73α sujungimo variantas turi išplėstą C galą, kuriame yra sterilus alfa motyvas (SAMp73), galintis slopinti p73 38 aktyvacijos domeno funkciją ir, atrodo, susijusį su sąveika su NQO1 30 . Todėl atlikome NQO1 ir SAMp73 sąveikų BMR (HSQC) matavimus, naudodami išgrynintus baltymus. Esant NQO1 WT, SAMp73 HSQC spektrai parodė likučių, kurie yra erdvėje artimi, kryžminių smailių išplėtimo arba cheminių poslinkių pokyčius (S2 lentelė), ypač aminorūgštose aplink SAMp73 Gly513 ir dalyvaujantys N galinėje spiralėje (8A pav.). NADH pridėjimas nepakeitė likučių, kuriuos paveikė NQO1 WT, rinkinio, tai rodo, kad ši sąveika nėra griežtai priklausoma nuo NADH. Naudodamiesi fluorescencinėmis ir tolimosios UV ultravioletinių spindulių spektroskopijomis (8B – E pav.), Mes taip pat stebėjome nedidelius, bet atkuriamus struktūrinius pokyčius, susijusius su NQO1: SAMp73 jungimu, ir NADH pridėjimas atrodė, kad padidins šių struktūrinių pokyčių mastą. Bandymai pateikti kiekybinius duomenis apie afinitetą NQO1 ir SAMp73 sąveikai fluorescencijos ir ITC būdu buvo eksperimentiniai iššūkiai dėl akivaizdaus mažo afiniteto (galbūt aukšto mikromolių diapazono) ir nestabilių kalorimetrinių bazinių linijų (S6 paveikslas ir duomenys nepateikti). Kadangi HSQC eksperimentai parodė, kad pridedant NQO1, SAMp73 spektras nebuvo labai įvairus, pastebėti pokyčiai greičiausiai įvyks aromatinių liekanų (Trp ir Tyr) ir antrinės NQO1 struktūros aplinkoje. Kalbant apie SAMp73, „Gly513“ parodė didžiausius CSP pokyčius (0, 03) (S7 paveikslas), tuo tarpu daugumoje paveiktų kryžminių smailių išplatėjantys pokyčiai rodo, kad komplekso formavimosi kinetika (tarp NMR laiko skalės) yra vidutinio ir lėto kinetika, atitinkanti mažą afinitetą sąveika. Nors cheminių poslinkių pokyčiai buvo maži, panašūs cheminių poslinkių pokyčiai buvo pastebėti ir kitose sistemose 39 . Šie rezultatai patvirtina, kad NQO1 WT ir SAMp73 sąveika nėra griežtai priklausoma nuo NADH buvimo, tačiau vietoj to, NADH surišimas ir FAD sumažinimas gali palengvinti komplekso susidarymą.

Image

( A ) SAMp73 (PDB: 1COK) struktūra, kurioje pavaizduoti likučiai (lazdelėse), kuriuos paveikė (arba išplėsdamas signalas, arba CSP ≥ 0, 01 ppm) (BRMB numeris 4413), jei buvo išgrynintas NQO1 WT. SAMp73 α-spiralės pateikiamos skirtingomis spalvomis (pirmoji - raudona; antra - mėlyna; trumpa - trumpa 3 10- spiralė; auksas - ketvirtai α-spiralė; geltona - penkta). Figūra buvo pagaminta su „Pymol 60“ . ( B, C ) 2 μM SAMp73 arba NQO1 WT fluorescencijos spektrai (sužadinant esant 280 nm bangos ilgiui), jų suma ir ekvivalentinio mišinio spektrai (2 μM kiekvieno baltymo monomerų vienetuose). ( D, E ) 10 μM SAMp73 arba NQO1 WT tolimųjų UV CD spektrai, jų suma ir lygiaverčio mišinio spektrai (10 μM kiekvieno baltymo monomerų vienetuose). ( B - E ) spektrai, kai nėra arba nėra NADH, rodomi skirtingose ​​plokštėse.

Visas dydis

P.P187S ir Δ50-WT sąveika su SAMp73 sukelia signalų rinkinio išplėtimą panašų į tuos, kurie randami NQO1 WT (S2 ​​lentelė). Δ50-WT, esant NADH, sukėlė visų kryžminių smailių išsiplėtimą, ir net Tyr487 (Ile541), Asp490, Asn504 (Met539), Gly513, Ser516, Glu535, Leu545 ir Gly551 padidėjo visiškai (dingo signalai, tarp Tyr487 ir Ile541, ir Asn504 ir Met539). Taigi, pašalinus KTD, p.P187S buvimą arba FAD surišto nebuvimą (atkreipkite dėmesį, kad p.P187S iš esmės yra apo-baltymas, kaip išgrynintas) nepanaikina sąveikos su SAMp73, bet šiek tiek keičia sąveikos režimą. Įdomu tai, kad SAMp73 prisijungimo prie NQO1 WT režimą taip pat veikia dikoumarolis, rodantis tik mažus CSP labai sumažintame signalų rinkinyje (Leu493, Gly513 ir Trp542) (duomenys nepateikti).

Apskritai šios biofizinės analizės patvirtina, kad nors skirtingi faktoriai, turintys įtakos NQO1 aktyvumui, struktūrai ir dinamikai (įskaitant p.P187S, kofaktorius ir inhibitorius ar CTD), gali šiek tiek pakeisti prisijungimo prie SAMp73 režimą, šios sąveikos netrukdo nė vienas iš minėti veiksniai. Be to, mūsų rezultatai taip pat pateikia pirmąsias įžvalgas apie p73α ir NQO1 sąveiką.

CTD daugiausia lemia greitą proteasominį p.P187S skaidymą

Atrodo, kad labai dinamiškas p.P187S CTD veikia kaip efektyvus jo proteasominio skilimo inicijavimo puslapis 24 . Nuosekliai CTD pašalinimas turėjo reikšmingą poveikį baltymų lygiui ir skilimo greičiui, kai jie ekspresuojasi eukariotų raiškos ląstelių neturinčioje sistemoje (9 pav.). Pulso sintezės metu p.P187S parodė 2, 4 karto mažesnį baltymų kiekį, palyginti su WT, kaip viso ilgio baltymai, o CTD pašalinimas (ty Δ50 variantuose) sukėlė daug didesnį WT baltymų lygio sumažėjimą nei p.P187S (3). sulankstomas palyginti su 1, 5 karto; 9A – C pav.). Iš Chase eksperimentų mes taip pat pastebėjome, kad ryšys tarp baltymų lygio ir skilimo greičio po sintezės impulso, patvirtinantis, kad proteasominis skilimo greitis stipriai lemia baltymų pusiausvyros būseną (9 pav. B – E). Atitinkamai, p.P187S buvo skaidomas 1, 75 karto greičiau nei NQO1 WT (9B pav., D), o CTD pašalinimas pagreitino WT skilimą 2, 5 karto, o tik p.P187S - 1, 3 karto (pav. 9B, D). Šie rezultatai rodo, kad CTD pašalinimas labiau destabilizuoja NQO1 WT nei polimorfizmas, todėl labai lankstus p.P187S CTD pagreitina NQO1 proteasominį skilimą. Didesnis Δ50-NQO1 skaidymas greičiausiai bus susijęs su didesniu jo lankstumu, palyginti su viso ilgio fermentu, kaip tai patvirtina mūsų MD modeliavimas (7 pav.).

Image

( A ) NQO1 variantų sintezės impulsai. ( B ) Chase eksperimentai. ( C ) baltymų lygis po sintezės impulsų (normalizuotas palyginti su NQO1 WT lygiais); D ) puslaidininkiniai kinetikos brėžiniai; ( E ) koreliacija tarp baltymų lygio po sintezės impulsų ir skilimo pusperiodžių. Duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd.

Visas dydis

Diskusija

Šiame darbe parodyta, kad LŠD vaidina pagrindinius NQO1 funkcinius ir reguliavimo vaidmenis, ir nepaprastai svarbu, kaip tai svarbu, norint pasireikšti daugybiniu žalingu vėžio sukelto p.P187S polimorfizmo poveikiu. Kaip tikėtasi iš ankstesnių kristalografinių įrodymų, CTD yra svarbus NQO1 aktyvumui, užtikrinant tinkamą koenzimų (FAD ir NADH) ir substrato orientaciją. Netikėtai pateikiame įrodymų, kad tarp p.P187S svetainės ir funkcinių vietų, tokių kaip CTD ir FAD rišamosios vietos, yra didelis nuotolis ryšys, todėl vadiname allosterinės sąveikos tinklu (10 pav.). NQO1 WT atveju mes siūlome, kad šis allosterinis tinklas prisidėtų prie jo labai didelio afiniteto FAD, taip pat įpareigotų neigiamą kooperatyvą, kuris didžiąja dalimi trikdo pašalinus KTD. Be to, p.P187S gali sutrikdyti šį allosterinį tinklą, skatindamas dinaminius ir struktūrinius FAD surišimo vietos ir CTD pokyčius ir atitinkamai sumažinantis surišimo afinitetą FAD ir dikumaarolio atžvilgiu. Nutrauktą allosterinį ryšį tarp FAD surišimo vietų ir KTD papildomai palaiko stiprus CTD atsitraukimo poveikis p.P187S, kuris pašalina polimorfizmo poveikį apo būsenos FAD surišimo vietos dinamikai ir taip padidina jo FAD surišimo afinitetą. Įdomu tai, kad kitos funkcinės vietos (pvz., P73α surišimo vieta) gali būti stipriai neprijungtos prie šio allosterinės sąveikos tinklo, apimančio FAD surišimo vietą, CTD ir p.P187S vietą (10 pav.).

Image

NQO1 WT alosterinis tinklas tarp P187 vietos, FAD surišimo vietos ir CTD gali prisidėti prie didelio afiniteto kooperatinio FAD surišimo ir dėl to atsirandančio struktūrinio ir dinaminio poveikio CTD po jungimosi. NQO1 p.P187S, S187 vieta daro įtaką FAD surišimui, pakeisdama jo surišimo vietos dinamiką ir užkertant kelią CTD struktūriniams ir dinaminiams pokyčiams po FAD surišimo. Pašalinus CTD, panaikinamas S187 vietos dinaminis poveikis FAD surišimo vietoje. Visais atvejais šio allosterinio tinklo pokyčiai daro silpną poveikį sąveikos su p73α vietai.

Visas dydis

FAD ir dikoumarolis sukelia skirtingus konformacinius pokyčius, prisijungus prie WT ir p.P187S. FAD jungimasis prie NQO1 WT sukelia didesnius hidrodinaminio tūrio, antrinės struktūros ir būdingosios dinamikos pokyčius nei tas, kuris aprašytas p.P187S, tuo tarpu dikoumarolio surišimas daro didesnį poveikį holo-p.P187S konformacijai (2, 6 ir 7 pav., Ir ref. 24). Šie skirtingi konformaciniai pokyčiai dažniausiai siejami su dinamiškesne ir mažiau struktūruota CTD holo būsenoje p.P187S. Atitinkamai, atliekant struktūrinius skaičiavimus, taikomus dikumaarolį jungiančiai energijai, buvo patvirtintas daug didesnis p.P187S CTD konformacinis pokytis (energetiškai primenantis mažo baltymo sulankstymą ). Šis scenarijus atitinka egzistuojančią konformacinę pusiausvyrą, kurioje apo-NQO1 daugiausia populiacijos veikia nekompetentingose ​​FAD jungimosi būsenose ir kad FAD buvimas keičia konformacinę pusiausvyrą link mažiau dinamiškų ir labiau struktūruotų FAD surišančių kompetentingų valstybių (ši populiacija - poslinkis makroskopiškai stebimas kaip konformacinis pokytis ). Dėl jungimo su dikoumaroliu, p.P187S sukeliami konformaciniai pokyčiai yra didesni nei WT dėl lankstaus ir iš dalies nestruktūruoto polimorfizmo KTD nesusietoje holo būsenoje, kuri, norint pasiekti surišimą, turi smarkiai pakeisti struktūrą ir dinamiką. kompetentinga valstybė (taip baudžiama už jos įpareigojimą). Svarbu ir tai, kad mes pateikiame įrodymų, kad p.P187S daro įtaką nesusietų konformacinių ansamblių lokaliai funkcinei dinamikai, ypač kai apo būsena jungiasi su FAD (svarbi FAD sąveika) ir holo būsenos CTD (svarbu, kad prisijungtų dikumaarolis). . Deja, turimi duomenys neleidžia atskirti FAD indukuoto pritaikymo ar konformacijos atrankos mechanizmų ir dikoumarolio jungimosi prie NQO1, šis atskyrimas priklausys nuo to, ar surišančios kompetentingos būsenos yra žymiai apgyvendintos apo-NQO1 konformacinėje pusiausvyroje 12 .

Proteasominis baltymų skaidymas yra pagrindinis dalykas norint suprasti genetinių pakitimų paveldimų ligų, susijusių su funkcijos sutrikimu, poveikį 20 . Šiame kontekste dinaminiai arba nestruktūruoti regionai yra pagrindiniai veiksniai atpažinimui ir efektyviam skilimui per 20S ir 26S proteasomas 8, 9 . NQO1 yra puikus modelis proteasominiam baltymų skilimui tirti, ypač įdomus genetinių variacijų, surišimo su ligandu ir baltymų stabilumo bei dinamikos vaidmuo modultuojant skaidymo greitį 8, 22, 24, 36, 40 . Šiame darbe mes parodome, kad patobulinta CTD dinamika yra pagrindinė priemonė nustatant NQO1 proteasominį skilimą, be to, kad pašalinus KTD (pvz., Proteasominiu šio domeno skilimu), likusių baltymų yra daug daugiau. lankstus ir efektyviai nusidėvėjęs (7 ir 9 pav.). Šis rezultatas palaiko laipsnišką NQO1 skaidymą per jo C-galą. Apskritai, mūsų darbas pabrėžia idėją ištirti mutacinį poveikį baltymų dinamikai ir visuotiniam stabilumui, siekiant įvertinti padidėjusio proteasominio skilimo vaidmenį prarandant genetines genetines ligas.

Norėdami dar labiau suprasti NQO1 vaidmenį žmogaus fiziologijoje ir patologijoje, turime žinoti molekulinius ir struktūrinius jo sugebėjimo sąveikauti su ląstelių ciklo reguliatoriais, tokiais kaip p53 ir p73α, pagrindus ir jo slopinamąjį poveikį 20S proteasomai 26, 36 . Čia pateikiame naujas struktūrines įžvalgas apie silpną NQO1: onkosupresoriaus sąveiką. Svarbu tai, kad mes parodome, kad nei CTD, nei aktyvus NQO1 nėra būtinas sąveikai su p73α, net jei skirtingi ligandai, surišti su NQO1, gali modifikuoti iš esmės žemą šios sąveikos afinitetą, suderintą su ankstesniais šių baltymų biocheminiais tyrimais: baltymų sąveika 29, 30, 37, 41 . Įdomu tai, kad mūsų tyrimai rodo, kad SAMp73 regionas, susijęs su prisijungimu prie NQO1, yra tas pats, susijęs su prisijungimu prie kitų molekulių SAM domenuose: vadinamasis vidurinės kilpos galo-spiralės polipeptido pleistras su penktąja α-spiralė. ir trumpoji 3 10 spiralė kaip kritiniai antrinės struktūros elementai 42, 43, 44, 45 . Galiausiai turime pažymėti, kad turimi įrodymai patvirtina, kad p.P187S šių ląstelių destabilizacija ląstelėse atspindi tik jo paties tarpląstelinį nestabilumą, o ne nesugebėjimą įsitraukti į šiuos baltymus: baltymų sąveika 24, 29, 36, 40 .

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis darbas remia sudėtingo alosterinio ryšio tarp dviejų sričių oligomerinio baltymo funkcinių vietų egzistavimą, pasižymintį puikia funkcine chemija ir kaip su liga susijęs vienos aminorūgšties pakeitimas gali paveikti skirtingas funkcines vietas per alosterinių tinklų trikdymą. . Dėl didelio missense mutacijų, turinčių įtakos baltymų stabilumui, aktyvumui ir reguliavimui, paplitimo 19, 21, 46, 47, 48, mūsų mutacijos strategija kartu su funkciniais, struktūriniais, energetiniais ir dinaminiais tyrimais galėtų padėti iššifruoti sudėtingą su liga susijusį mutacinį poveikį daugeliui kitas genetinių funkcijų praradimo ligas ir nustatyti terapinės korekcijos struktūrinius tikslus.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.