Ska3 užtikrina savalaikę mitozinę progresavimą tiesiogiai sąveikaujant su mikrotubuliais ir ska1 mikrotubuliais mokslinės ataskaitos

Ska3 užtikrina savalaikę mitozinę progresavimą tiesiogiai sąveikaujant su mikrotubuliais ir ska1 mikrotubuliais mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Kinetochores
  • Baltymai

Anotacija

Norint tiksliai nustatyti chromosomų atskyrimą, būtina nustatyti fizinį prisirišimą tarp kinetochorinės ir dinaminės verpstės mikrotubulų, kuriuose vyksta polimerizacijos ir depolimerizacijos ciklai, sukuriantys tiesias ir išlenktas mikrotubulų struktūras. Ndc80 ir Ska kompleksai yra pagrindiniai kinetochoros mikrotubulius jungiantys faktoriai, atsakingi už chromosomos ir mikrotubulų sujungimo palaikymą chromosomų atskyrimo metu. Anksčiau mes parodėme, kad „Ska1“ komplekso „Ska1“ subvienetas suriša dinaminius mikrotubules, naudodamas kelias kontaktines vietas tokiu būdu, kuris leidžia nuo konformacijos nepriklausyti. Čia mes parodome, kad „Ska3“ subvienetas turi modifikuoti „Ska“ komplekso mikrotubulų surišimo galimybes (i) tiesiogiai sąveikaudamas su tubulino monomerais ir (ii) netiesiogiai sąveikaudamas su Ska1 regionais, kontaktuojančiais su tubulinu, ir tai rodo alosterinį reguliavimą. Ska3 mikrotubulų sąveikos ar Ska3-Ska1 sąveikos neigiama įtaka Ska komplekso mikrotubulų jungimuisi in vitro ir tinkama anafazės pradžia ląstelėse. Taigi „Ska3“ „Ska“ komplekse naudoja papildomus moduliacinius elementus, kad užtikrintų tvirtą kinetochoros ir mikrotubulų tvirtinimą bei laiku vyktų mitozės progresavimas.

Įvadas

Fizinis chromosomų prisijungimas prie verpstės mikrotubulų, tarpininkaujant kinetochorijai, yra būtinas norint tiksliai atskirti chromosomas dukterinėms ląstelėms, kai ląstelės dalijasi 1, 2, 3 . Pliusiniai mikrotubulų galai, artėjantys prie kinetochoros, patiria polimerizacijos ir depolimerizacijos ciklus - reiškinį, vadinamą dinaminiu nestabilumu, kuris lemia laikiną „tiesių“ ir „išlenktų“ mikrotubulų struktūrų stabilizavimąsi. Jėgos, susijusios su mikrotubulų dinaminiu nestabilumu, yra lemiamos norint lemti chromosomų atskyrimą 4, 5, 6, 7, 8, 9 . Taigi, siekiant palengvinti verpstės sukeltą chromosomų atskyrimą, kinetochoros turi išlikti stabiliai pritvirtintos prie mikrotubulų, kol šios įgauna dinamines struktūras.

Tarp su kinetochoromis susijusių baltymų, keturių subvienetų Ndc80 (Ndc80-Nuf2-Spc24-Spc25) ir trijų subvienetų Ska (Ska1-Ska2-Ska3) kompleksai yra pagrindiniai mikrotubulų surišimo faktoriai, atsakingi už kinetochoros ir mikrotubulų priedų palaikymą ., 11, 12, 13, 14 . Ndc80 kompleksas yra ~ 55 nm ilgio lazdelės formos struktūra, turinti mikrotubulus ir kinetochorą jungiančius kamuolinius domenus (atitinkamai Ndc80-Nuf2 ir Spc24-Spc25), atskirtus ilgą suvyniotą ritę 10, 13, 14, 15, 16 . Struktūriniai tyrimai rodo, kad Ndc80 kompleksas suriša mikrotubules, atpažindamas α- ir β-tubuliną tiek vidinėje, tiek tarp tubulino dimerų sąsajoje 14 . Taigi, Ndc80 komplekso gebėjimas surišti mikrotubulus yra jautrus mikrotubulų formavimui, „tiesus“ yra geriau nei „išlenktas“ 14, 17, 18 . Nors Ndc80 kompleksas taip pat gali sekti depolimerizuojančius mikrotubulus, kai jie yra prijungti prie mikrosferų 19, 20, stabiliems kinetochorų ir mikrotubulų prisijungimams ląstelėse sukurti reikia papildomai „Ska“ komplekso 18, 21, 22, 23, 24 .

„Ska“ kompleksas lokalizuojasi išoriniame kinetochoroje priklausomai nuo Ndc80 ir yra reguliuojamas „Aurora B“ kinazės 18, 23, 25 . Ankstesnis mūsų struktūrinis darbas atskleidė, kad žmogaus „Ska“ kompleksas yra „W“ formos dimeris iš trijų spiralinių pluoštų (suformuotų Ska1, Ska2 ir Ska3) su Ska1 ir Ska3 C galiniais domenais, kurie išsikiša į dimerio galus, ir kad Ska1 C-galinis domenas yra pagrindinis šio komplekso mikrotubules jungiantis fragmentas 17, 18, 24 . „Ska1“ C galinis domenas apima sparnuotosios spiralės motyvą (aminorūgštys 133–255, Ska1-MTBD), kuris per kelias sąveikos vietas jungiasi su paviršiais veikiamomis tubulino monomerų sritimis. Kadangi mikrotubulų polimerizacija / depolimerizacija neturi įtakos šiems regionams, Ska kompleksas gali beatodairiškai surišti dinamines mikrotubulų struktūras. Šie pastebėjimai rodo, kad Ska kompleksas greičiausiai vaidina lemiamą vaidmenį, leisdamas kinetochoroms išlikti pritvirtintoms prie dinaminių verpstės mikrotubulų pliusų 17, 18 . Kaip ir „Ska1“, „Ska3“ C-galinis domenas taip pat reikalingas kinetochoros ir mikrotubulų prisitvirtinimui stabilizuoti ir mitotinei progresijai 24 . Nepaisant esminio „Ska3 C“ galinio domeno reikalavimo, kad „Ska“ kompleksiškai veiktų, molekulinis mechanizmas, kuriuo „Ska3“ atlieka savo vaidmenį, iš esmės nežinomas.

Čia mes sujungėme biochemijos, kryžminio susiejimo / masės spektrometrijos (CLMS) ir siRNR gelbėjimo tyrimus, kad apibūdintume Ska3 C-galinį domeną ir įvertintume jo poveikį Ska komplekso mikrotubulų surišimo savybėms in vitro ir in vivo . Parodome, kad „Ska3 C“ galinis domenas, kuris, kaip prognozuojama, daugiausia nestruktūrizuotas, prisideda prie tinkamos anafazės pradžios, moduliuodamas „Ska“ komplekso mikrotubulų surišimo galimybes per tiesioginę sąveiką tiek su mikrotubuliais, tiek su Ska1-MTBD.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Ska3 turi iš esmės netvarkingą C-galo domeną, reikalingą efektyviam Ska komplekso mikrotubulų sujungimui

Atlikus aminorūgščių sekos „Ska3“ analizę, naudojant antrinės struktūros ir sutrikimo prognozavimo metodus, nustatyta, kad iš esmės yra netvarkingas nežinomos funkcijos C-galo domenas (102–412 aminorūgštys, Ska3 C terminas ; 1a, b pav.), Turinčios aukštą polinkis dalyvauti baltymų ir baltymų sąveikoje (1b pav.). Šis domenas yra labai rūgštaus pobūdžio (teorinis izoelektrinis taškas yra ~ 4, 5) ir turi didelę prolinų dalį (30 iš 311 liekanų; 9, 6%), savybes, kurios yra nepaprastai išsaugotos tarp rūšių (1c pav.). Ankstesnis mūsų darbas parodė, kad nors Ska3 C-terminas savarankiškai nesirišo mikrotubulų, pašalinus jį iš Ska komplekso, pastarųjų mikrotubulų gebėjimas sumažėjo 24 . Tai leido manyti, kad „Ska3 C-term“ gali teigiamai prisidėti prie „Ska“ komplekso mikrotubulų surišimo, sukurdamas mikrotubulus rišančias sąsajas kartu su „Ska1“, kai jie yra prijungti prie „Ska“ komplekso, sudaryto iš suvyniotų ritinių 24 struktūrinės šerdies. Norėdami kiekybiškai įvertinti šią galimybę, mes atlikome mikrotubulų kosedimentacijos tyrimus su Ska kompleksais, neturinčiais Ska1 C-galinio domeno (Ska1 1–91 -Ska2-Ska3; Ska1ΔC) arba Ska3 C-galinio domeno (Ska1-Ska2-Ska3 1). –101 ; Ska3ΔC). Nors Ska3ΔC komplekse buvo sumažintas mikrotubulių jungimasis, „Ska1ΔC“ kompleksas, kaip tikėtasi 24, nesugebėjo sąveikauti su mikrotubuliais (1d ir e pav., Papildoma S1a pav.). Ska3ΔC komplekso mikrotubulų surišimo afinitetas, išmatuotas mikrotubulų kosedimentacijos tyrimu, yra 13, 6 μM, tai yra 4, 5 karto mažesnis nei laukinio tipo (wt) „Ska“ komplekse, apimančiame visą ilgį „Ska3“ (Kd = 3 μM) (1e pav.) . Išmatuotos wt Ska komplekso ir Ska3ΔC molekulinės masės, nustatytos SEC-MALS (dydžio pašalinimo chromatografija kartu su daugiakampiu šviesos sklaidymu), analizė parodė, kad pašalinus „Ska3 C“ terminą, oligomerinė būsena nepakito. sudėtingas (papildomas S1b pav.). Todėl sumažėjęs Ska3ΔC komplekso mikrotubulų surišimas yra tiesioginė Ska3 C galinio domeno praradimo pasekmė.

Image

a ) „Ska“ komponentų domeno architektūra, kai užpildyti langeliai žymi struktūrizuotus regionus. MTBD: „Ska1“ mikrotubulų surišimo sritis (liekanos nuo 133 iki 255). ( b ) Prognozuojami netvarkingi ir baltymus jungiantys Ska3 regionai, naudojant disopred (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred). Mėlyna: numatomi netvarkingi likučiai, oranžinė: numatomi baltymus jungiantys likučiai. c ) „Ska3“ aminorūgščių išsaugojimas (išsaugojimo balas yra skirstomas nuo raudonos iki žalsvai melsvos, kai raudona atitinka labai konservuotą, o žili - iki silpnai konservuotą). Deriniai apima ortologus iš H. sapiens (hs), Bos taurus (bt), Sus scrofa (ss), Mus musculus (mm), Echinops telfairi (et), Orcinus orca (oo). Šiame tyrime įvertinti „Ska3“ likučiai yra pažymėti žvaigždutėmis. Kelių sekų derinimas buvo atliktas su MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation, EMBL-EBI) ir suredaguotas naudojant Aline 35 . ( d ) MT kosedimentacijos tyrimo kiekybinis įvertinimas, lyginant wt Ska komplekso, Ska1ΔC ir Ska3ΔC mikrotubulų surišimo aktyvumą. Tyrime naudojamos koncentracijos: 1 μM baltymo, 9 μM MT (vidurkis ± sd, n = 3, ** P ≤

Image

0, 01, *** P ≤

Image

0, 001; t- testas). ( e ) Kairysis, reprezentatyvus MT-kosedimentacijos SDS-PAGE bandymas, lyginant wt Ska komplekso, Ska1ΔC ir Ska3ΔC mikrotubulus. Dešinėje, wt Ska komplekso, Ska1ΔC ir Ska3ΔC, mikrotubulų surišimo kreivė. Kd vertės buvo apskaičiuotos naudojant 1 μM Ska ir 0–15 μM MT (vidurkis ± sd, n = 4).

Visas dydis

Norėdami susiaurinti „Ska3“ regioną, kuris daro įtaką „Ska“ komplekso mikrotubulų jungimosi savybėms, mes rekonstravome „Ska“ kompleksus, turinčius du skirtingus „Ska3“ C-termino sutrumpinimus, kurie buvo sukurti remiantis konservuotų aminorūgščių ruožų buvimu (Ska1-Ska2-Ska3 1 –151 ; Ska1 – Ska2 – Ska3 1–195 ). Kaip ir tikėtasi, SEC-MALS analizė patvirtino, kad Ska3 C-galo regionų sutrumpinimas neturi įtakos bendrajai šių kompleksų oligomerinei struktūrai (papildomas S2a pav.). Mikrotubulų kosedimentacijos testai parodė, kad šie kompleksai surišo mikrotubules su afinitetais, panašiais į Ska1-Ska2-Ska3ΔC (2a pav., Papildomas S2b pav.; Kd = atitinkamai 13, 9 μM ir 14, 3 μM), nurodant, kad Ska3 sritis tarp 196 ir 196 liekanų. C-galinis galas yra labai svarbus modifikuojant Ska komplekso mikrotubulų surišimą.

Image

a ) MT-kosedimentacijos tyrimų kiekybinis įvertinimas lyginant wt Ska kompleksą ir Ska1-Ska2-Ska3ΔC su Ska1-Ska2-Ska3 1–151 ir Ska1 – Ska2 – Ska3 1–195 . Kd vertės buvo apskaičiuotos naudojant 1 μM Ska ir 0–12 μM MT (vidurkis ± sd, n = 4). b ) dėžutės ir šnabždesio schema, kurioje pavaizduotas laikas (min) tarp branduolinio apvalkalo skilimo (NEBD) ir atskirų ląstelių pradinės fazės / mirties fazės. Virš kiekvieno langelio pateiktas langelių skaičius (n) iš trijų nepriklausomų eksperimentų, kurių trukmė yra trumpa. Apatiniai ir viršutiniai ūsai reiškia atitinkamai 10 -ąjį ir 90 -ąjį procentilius. Žemiau pateikiama lentelė, kurioje apibendrinta gyvų ląstelių eksperimentų informacija apie vidutinį laiką nuo NEBD iki anafazės pradžios / mirties ir procentinę ląstelių, mirusių nuo mitozės, procentą. „Myc-V“ ir „mCherry-V“ buvo naudojami kaip transfekcijos kontrolė. ( c ) Atsparūs vaizdo įrašų mikroskopijos eksperimentai, iliustruojantys HeLa S3 ląstelių, stabiliai ekspresuojančių histoną H2B-GFP, mitozinę progresiją, apdorotą kaip ( b ) punkte. Laikas valandomis: min nurodoma. T = 0 buvo apibrėžtas kaip laiko momentas, kai paaiškėjo NEBD. Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Atsižvelgdami į nedidelį „Ska3 C-term“ indėlį į mikrotubulų jungimąsi in vitro , mes manėme, kad bet kokį siRNR pagrįstą šios srities vertinimą in vivo reikia atlikti ląstelėse, kuriose pasiektas visiškas Ska komplekso išeikvojimas (kad būtų išvengta stabilizacijos likęs endogeninis kompleksas, galintis užmaskuoti specifinį „Ska3 C“ termino indėlį). Anksčiau mes parodėme, kad bendras „Ska1“ ir „Ska3“ išeikvojimas leido veiksmingai sumažinti endogeninio „Ska“ komplekso kiekį 23, 24 (papildoma S2c pav.). Taigi mes pirmiausia sunaikinome „Ska1“ ir „Ska3“ HeLa S3 ląstelėse, stabiliai išreiškiančiose H2B-GFP, ir kartu kartu transfekavome visą ilgį „Myc-Ska1“ ir skirtingus „Ska3“ sutrumpinimus, išbandytus in vitro , būtent „mCherry-Ska3 1–101“, „Ska3 1–1“. 151 arba „Ska3 1–195“ (atitinkamai reprezentuojančius kompleksus „Ska1-Ska2-Ska3ΔC“, „Ska1-Ska2-Ska3 1–151“ ir „Ska1-Ska2-Ska3 1–195“ ). Skirtingų Ska3 C-terminalo regionų indėlis buvo įvertintas kiekybiškai įvertinant laiką tarp branduolinio apvalkalo skilimo (NEBD) ir pradinės fazės pradžios, atsižvelgiant į laiką, kai sesuo chromatidai atsiskyrė vienas nuo kito. Ląstelės, atstatytos naudojant „Ska1-Ska2-Ska3“ kompleksą (turinčią „Myc-Ska1“ ir „mCherry-Ska3“), per mitozę progresavo panašiai kaip kontrolinės (GL2 apdorotos, siRNR prieš žvirblinės luciferazės) ląstelės. Remiantis in vitro duomenimis (2a pav., Taip pat ir ankstesniais stebėjimais „Ska1-Ska2-Ska3ΔC 24“ atveju ), „Ska“ kompleksų, apimančių C-gale sutrumpintą „Ska3“, ekspresija sąlygojo ilgesnį anafazės pradžios uždelsimą ir padidėjimą. negyvų ląstelių skaičiuje (2b, c pav.). Šie stebėjimai rodo „Ska3 C-term“ vaidmenį keičiant Ska komplekso mikrotubulų jungimosi gebėjimus ir funkcijas. Pastebėtina, kad „Ska1-Ska2-Ska3ΔC“ ir „Ska1-Ska2-Ska3 1–151“ fenotipas buvo šiek tiek stipresnis (~ 3 kartus vėlesnis anafazės pradžioje), palyginti su „Ska1-Ska2-Ska3 – 1–195“ (2 kartus vėlavimas). Atsižvelgiant į duomenis, parodytus 2a pav., Tai rodo, kad Ska3 sritis, apimanti 152–194 likučius, nesusijusi su mikrotubuliais.

„Ska3“ C-galinis domenas tiesiogiai sąveikauja su mikrotubuliais ir „Ska1-MTBD“

Norėdami geriau suprasti „Ska3 C-term“ mikrotubulų surišimo molekulinius pagrindus, mes dar kartą ištyrėme ankstesnio mūsų tyrimo 17 CLMS eksperimentus, kuriuose buvo naudojamas nulinio ilgio kryžminio jungiklio EDC (1-etil-3- [3- dimetilaminopropil] karbodiimido hidrochloridas) ir išpjaustė „Ska1“ mikrotubulų surišimo sąsają identifikuodamas specifinius tarpmolekulinius kryžminius ryšius, kuriuose dalyvavo Lys (ir mažiau palankiai Ser, Thr ir Tyr) ir Asp / Glu. Dabar mes išanalizavome didesnės molekulinės masės sukryžiuotus produktus, turinčius visus Ska komplekso subvienetus ir mikrotubules. Tai atskleidė kryžminius ryšius, susijusius su „Ska3 C“ terminų liekanomis: (i) Lys199 / Lys202 / Ser394 / Lys399 / Lys410 ir β tubulinas; (ii) „Lys399“ ir α tubulinas ir (iii) „Asp321 / Glu323 / Asp326“ ir „Ska1-MTBD“ liekanos „Lys183“, dalis „Lys“ klasterio (Lys183 / Lys184 / Lys203 / Lys206), anksčiau nustatytų kaip svarbūs mikrotubuliams surišti 17 (3 pav. b, papildomas S3a pav.). Atkreipiame dėmesį, kad Ska3 liekanos, identifikuotos CLMS, yra arba konservuotos, arba apjuostos labai konservuotomis sritimis (1c pav.). Įdomu tai, kad „Ska3 C-term“ kontaktuoja su tubulino monomerais tose pačiose vietose, kur anksčiau jau parodėme, kad Ska1-MTBD jungiasi su mikrotubuliais (β-tubulino H3 ir H4 ir α-tubulino H12) (3b pav.). Šie stebėjimai rodo, kad Ska3 C- terminalas prisideda prie Ska komplekso mikrotubulių jungimosi tiesiogiai kontaktuodamas tiek su tubulino monomerais, tiek su Ska1-MTBD. Norėdami tai patvirtinti, mutavome „Ska3 C“ termino likučius, kontaktuojančius su mikrotubuliais (Ska3 K199 / 202A ir Ska3 S394 / K399A) ir „Ska1-MTBD“ (Ska3 D321 / E323 / D326K), ir atskirai išbandėme juos mikrotubulų kosedimentacijos tyrimuose. Svarbu tai, kad visi „Ska“ kompleksai, kuriuose yra aukščiau paminėtų „Ska3“ mutantų, mikrotubulus suriša mažiau efektyviai, palyginti su „wt Ska“ kompleksu (3c pav., D, papildomas S3b pav.). „Ska3“ mutantų „Ska“ kompleksų dydžio išskyrimo chromatografijos profiliai buvo beveik identiški (papildomas S3c pav.), Kas rodo, kad mutacijos neturi įtakos bendrai „Ska“ komplekso architektūrai. Taigi darome išvadą, kad šių mutacijų poveikį mikrotubulų rišimo aktyvumui lemia Ska3 C-termino- mikrotubulų ir Ska3 C-termino -Ska1-MTBD sąveika.

Image

a ) Tipinis SDS-PAGE 6 μM Ska kompleksas, susietas su 10 μM mikrotubuliais su EDC. Šiame tyrime analizuota juosta pažymėta žvaigždute. b ) Tubulino dimerio (rausva: β-tubulinas, mėlyna: α-tubulinas) pavaizduotas piešinys, kuriame liekanos, susijusios su kryžminimu su Ska3 (oranžinė) ir Ska1-MTBD (žalia), pavaizduotos lazdelėje. Žalia, mėlyna ir violetinė linijos žymi kryžminius ryšius tarp stebimų Ska3 K199 / K202 ir β-tubulino, Ska3 S394 / K399 ir α ir β tubulino, atitinkamai Ska3 D321 / E323 / D326 ir Ska1. c ) wt Ska komplekso (pilkos spalvos) ir „Ska3“ mikrotubulius surišančių mutantų mikrotubulus rišančios kreivės (atitinkamai K199 / 202A ir S394 / K399A; atitinkamai žalia ir mėlyna). Kd vertės buvo apskaičiuotos naudojant 1 μM Ska ir 0–15 μM MT (vidurkis ± sd, n ≥ 4). ( d ) wt Ska komplekso (pilkos spalvos) mikrotubulius rišančios kreivės ir Ska1 surišančio neefektyvaus Ska3 mutanto (D321 / E323 / D326K, violetinė) kreivė. Kd vertės buvo apskaičiuotos naudojant 1 μM Ska ir 0–15 μM MT (vidurkis ± sd, n ≥ 4).

Visas dydis

Norint laiku pradėti anafazę, reikalinga „Ska3 C“ trukmės mikrotubulų ir „Ska1-MTBD“ jungimosi veikla.

Toliau mes įvertinome Ska3 C-termino - mikrotubulų ir Ska3 C-termino -Ska1-MTBD sąveikos sutrikdymo pasekmes mitozinei progresijai, naudodamiesi siRNR gelbėjimo tyrimais su aukščiau aprašytais Ska3 mutantais. Sutikus su in vitro rezultatais, „Ska3 K199 / 202A“ ir „K394 / 399A“ išgelbėjimai sukėlė sutrikusią mitozinę progresavimą, kuriam būdinga maždaug 2 kartus vėluojanti anafazė ir žymiai padidėjęs negyvų ląstelių skaičius (4a pav. c). Panašiai ir su „Ska3 D321 / 323 / 326K“ mutantu, kuris, kaip prognozuojama, nesąveikauja su „Ska1-MTBD“, todėl anafazės pradžioje užtruko 3 kartus, o ląstelės mirė maždaug 17% ląstelių (4b, c pav.), Pabrėždamas reikalavimą. „Ska3 C-term“ - mikrotubulų ir „Ska3 C-term -Ska1-MTBD“ sąveikoms. Visi ištirti Ska3 mutantai sugebėjo sudaryti kompleksą su kitais Ska subvienetais, panašiais į wt Ska3 (papildomas S4 pav.; Parodyti Ska1), nurodant, kad pastebėti mitoziniai defektai atsirado ne dėl komplekso formavimo sutrikimo. Taip pat pažymėjome, kad dauguma ląstelių, ekspresuojančių šiuos mutantus, sugebėjo laiku suderinti savo chromosomas (duomenys nepateikti), kaip matyti iš „Ska1“ mikrotubulų surišimo trūkumų turinčių mutantų 17, kas rodo, kad „Ska3 C“ terminas prisideda prie tvirtumo. kinetochoros ir mikrotubulų priedus, o ne pradinius kinetochoros ir mikrotubulų kontaktus.

Image

( a, b ) laukelio ir šnabždesio schema, nurodanti laiko tarpą (min) nuo branduolinio apvalkalo skilimo (NEBD) iki atskirų ląstelių pradinės fazės / mirties fazėje. Virš kiekvieno langelio pateiktas bendras ląstelių skaičius (n) iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Apatiniai ir viršutiniai ūsai reiškia atitinkamai 10 -ąjį ir 90 -ąjį procentilius. Lentelė, kurioje apibendrinta žemiau pateiktų gyvų ląstelių eksperimentų informacija apie vidutinį laiką nuo NEBD iki anafazės pradžios / mirties ir procentinę ląstelių, mirusių nuo mitozės, procentą. c ) Atsparūs vaizdo įrašo mikroskopijos eksperimentams, iliustruojantiems H2B-GFP stabiliai ekspresuojančių HeLa S3 ląstelių mitozinę progresiją, apdorotas kaip ( a, b ). Laikas valandomis: min nurodoma. T = 0 buvo apibrėžtas kaip laiko momentas, kai paaiškėjo NEBD. Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Apskritai šis tyrimas nustato „Ska3 C-term“ mikrotubules ir kontaktinius „Ska1“ regionus ir parodo, kad šie tarpmolekuliniai kontaktai veikia kaip svarbūs moduliaciniai elementai „Ska“ komplekse, siekiant užtikrinti savalaikę mitozinę progresą. Ska3 C terminas, nors ir prognozuojamas kaip nestruktūrizuotas, turi labai konservuotus aminorūgščių ruožus, kurie gali būti susiję su baltymų ir baltymų sąveika, ir tai rodo evoliuciškai konservuotą šios srities vaidmenį „Ska“ sudėtingai funkcijai ir be klaidų ląstelių dalijimuiisi. Kokie kiti kinetochoros faktoriai prisiriša prie Ska3 C termino ir kaip Ska komplekso mikrotubulius jungiantys faktoriai bendradarbiauja su Ndc80 kompleksu, yra svarbūs atviri klausimai, norint suprasti mechanizmo detales, kurių pagrindinė suklio vedama chromosomų segregacija.

Metodai

Rekombinantinio baltymo gryninimas ir mikrotubulų kosedimentacijos tyrimas

„Ska1“, „Ska2“ ir „Ska3 V58I“ buvo klonuoti atskirai į pEC-S-CDF-His, pEC-A-HT-His-GST, pEC-K-HT-His vektorius atitinkamai su TEV skilimo vietomis. Ska3 mutantai ir sutrumpinimai buvo sukurti naudojant Quikchange vietinio mutagenezės metodą (Stratagene). Visi baltymų kompleksai buvo ekspresuojami E. coli padermėje BL21 Gold, kartu transformuojant visas tris plazmides, turinčias atskirus Ska komponentus. Baltymų ekspresija buvo sukelta per naktį 18 ° C temperatūroje ir išgryninama naudojant tą patį protokolą, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, po ląstelių lizės 20 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl ir 5 mM DTT, baltymų kompleksai buvo išgryninti afininės chromatografijos būdu partijos režimu, naudojant glutationo sepharose („GE Healthcare“) granules ir kruopščiai nuplauti 20 mM Tris, pH 8, 500. mM NaCl ir 5 mM DTT, po to 20 mM Tris, pH 8, 1 M NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM ATP ir 5 mM DTT, galiausiai su 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl ir 5 mM. DTT. Baltymai išplaunami 50 mM glutationo, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl ir 5 mM DTT, ir žymės buvo perpjautos TEV proteaze per naktį. Galutinis dydžio išskyrimo chromatografijos etapas buvo atliktas 20 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM NaCl ir 5 mM DTT (Superose 6, GE Healthcare).

Mikrotubulų kosedimentacijos testai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 17 . Tubulinas buvo pirktas iš „Cytoskeleton Inc.“ ir mikrotubuliai buvo polimerizuoti pagal gamintojo instrukcijas. Taksoliais stabilizuotos mikrotubulės 10 minučių inkubuojamos kambario temperatūroje su 1 μM baltymu 50 μl reakcijos tūrio BRB80 buferyje (80 mM PIPES, pH 6, 9, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2) su 100 mM NaCl ir 4 mM DTT. yra 50 μM taksolio. Po to reakcija buvo sluoksniuota ant 250 μl glicerolio pagalbinio buferio (BRB80, 50% glicerolio, 4 mM DTT ir 50 μM taksolio) ir ultracentrifuguota 10 min., Esant 80 000 aps./min., Beckman TLA 100.3 rotoriuje 25 ° C temperatūroje. Granulės ir supernatantai buvo analizuojami SDS-PAGE, dažomi Coomassie Blue, o kiekybiškai įvertinti naudojant ImageJ. Normalizuoti surišimo duomenys buvo gauti dalijant granulės frakcijos juostos intensyvumą iš nuosėdų ir supernatanto juostos intensyvumų sumos. Kd (koncentracija, reikalinga norint pasiekti maksimalų pusinės jungties laipsnį) buvo nustatyta netiesine regresija, naudojant „GraphPad Prism“ („GraphPad Software“, La Jolla, Kalifornija, JAV).

Cheminis kryžminis sujungimas / masių spektrometrija (CLMS)

Kryžminio jungimo eksperimentai buvo atlikti naudojant EDC (Thermo Fisher Scientific), dalyvaujant N-hidroksisulfosukcinimidui (Sulfo-NHS, Thermo Fisher Scientific), kaip aprašyta anksčiau 17 . Trumpai tariant, susietų kompleksų gelinės juostos buvo apdorotos laikantis standartinių procedūrų 26 ir suardyti peptidai buvo nudruskinami, naudojant C18 StageTips 27, 28. Peptidai buvo analizuojami naudojant „LTQ Orbitrap Velos“ masių spektrometrą („Thermo Fisher Scientific“), sujungtą su „Dionex Ultimate 3000 RSLC“ nano HPLC sistema, naudojant aukštą / aukštą strategiją 29 : „Orbitrap“ buvo gauti ir MS, ir MS2 spektrai. Neapdoroti masės spektrometriniai duomenys buvo apdoroti, norint gauti „MaxQuant“ (1.5.1.2 versija) 30 smailių sąrašus, ir susieti peptidai buvo suderinti su spektru, naudojant Xi programinę įrangą (ERI, Edinburgas). Masės spektrometrijos proteomikos duomenys buvo perduoti „ProteomeXchange Consortium“ per PRIDE 31 partnerių saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD004952.

Ląstelių kultūros ir siRNR gelbėjimo eksperimentai

„HeLa S3“ ląstelės, ekspresuojančios histoną H2B-GFP 32, buvo palaikomos DMEM (Invitrogen), papildytame 10% galvijo vaisiaus serumu ir penicilinu / streptomicinu (atitinkamai 100 TV ml −1 ir 100 mg ml −1 ; Gibco). siRNR gelbėjimo eksperimentai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 24 . SiRNR sąlygotas Ska1 ir Ska3 išeikvojimas buvo atliktas per 72 valandas, o siRNR oligonukleotidai buvo perkrėsti naudojant oligofektaminą (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. „Ska1“, „Ska3“ ir kontrolinio GL2 dupleksų sekos yra: 5′-CCCGCTTAACCTATAATCAAA-3 ′, 5′-AGACAAACATGAACATTAA-3 ′ ir 5′ – AACGTACGCGGAATACTTCGA-3 ′, atitinkamai 17, 21, 23, 24, 33 . „Ska1“ ir „Ska3“ siRNR atsparios konstrukcijos buvo generuojamos pcDNA3.1 plazmidėje (Invitrogen), turinčios N-galo trigubą „Myc“ žymą („Myc-Ska1“ atveju) arba vieną „mCherry“ žymą („Ska3“ atveju). „Myc-V“ ir „mCherry-V“ buvo naudojami kaip transfekcijos kontrolė. Plazmidės buvo transfekuotos naudojant X-tremeGENE HP (Roche) pagal gamintojo instrukcijas. Sinchronizacijos tyrimams ląstelės buvo sulaikytos 20 valandų su 2 mM timidinu, po to 6–8 valandas paleistos į šviežią terpę ir antrą 16 h timidino bloką ir 10 valandų paleidžiamos prieš fiksaciją ar vizualizaciją.

Laiko mikroskopija

Laiko mikroskopijai visi gydymo metodai buvo atlikti vienu eksperimentu tuo pačiu metu. Ląstelės, stabiliai ekspresuojančios H2B-GFP ir laikinai ekspresuojančios atitinkamas „mCherry“ konstrukcijas, buvo pavaizduotos naudojant „Olympus“ daugiamatį mikroskopą „CellR IX81“ su 150 W MT-ARC / XeHg sužadinimo sistema, 20x / NA 0, 45 ir C9100-02 EMCCD kamera. Atvaizdavimo metu atmosfera buvo palaikoma 37 ° C ir 5% CO 2 temperatūroje. Vaizdai buvo fiksuojami 5 minučių intervalais 22 valandas keliose vietose. GFP ir mCherry fluorescenciniai vaizdai buvo gauti atitinkamai su 30 ms ir 60 ms ekspozicijos trukme. „mCherry“ fluorescencija buvo vaizduojama tik kas penkis laiko taškus stebint transfekuotas ląsteles. Buvo kiekybiškai įvertintas laikas, perėjęs nuo branduolinio apvalkalo skilimo (NEBD) iki pradinės fazės (skaičiuojamas kaip laikas, kai seserų chromatidai atsiskyrė vienas nuo kito), o duomenims apdoroti buvo naudojama „ImageJ“ programinė įranga.

Imuninis nusėdimas ir Vakarų pūtimas

Imunoprecipitacijai lizatai (1–2 mg bendro baltymo kiekio) iš HEK293T ląstelių 2 valandas buvo inkubuojami 4 ° C temperatūroje su 9E10 anti-Myc antikūnais. Kiekvienu atveju 1 mg antikūno buvo sujungtas su 1 ml sepharose-A granulėmis (Pierce, Rockford, IL). Po baltymų surinkimo, granulės 4x plaunamos HEPES lizės buferiu (50 mM Hepes, pH 7, 4, 150 mM NaCl, 0, 5% Triton X-100, 30 μg / ml RNazės, 30 μg / ml DNazės, 100 μM DTT, proteazės inhibitoriai (ROCHE). ), fosfatazės inhibitorių (Sigma) kokteilis), suspenduotų gelio mėginio buferyje, ir baltymai buvo analizuojami SDS – PAGE ir imunoblotu. Membranos buvo tiriamos šiais antikūnais: triušio anti-mCherry 17 (1: 3000), pelės anti-myc (klonas 9E10) 34 (1:10), anti-Ska1 (1: 1000) 21, anti-Ska3 (1: 10). 3000) 23 ir pelių anti-tubulino antikūnai (Sigma-Aldrich) (1: 1000), kaip anksčiau buvo pranešta 21 .

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Abad, MA et al. „Ska3“ užtikrina, kad laiku vyktų mitozinis progresas, tiesiogiai sąveikaujant su mikrotubuliais ir „Ska1“ mikrotubulų surišimo domenu. Mokslas. 6 rep. , 34042; „doi“: 10.1038 / srep34042 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.