Slarf2a vaidina neigiamą vaidmenį tarpininkaujant ašilinių ūglių formavimui | mokslinės ataskaitos

Slarf2a vaidina neigiamą vaidmenį tarpininkaujant ašilinių ūglių formavimui | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Augalų vystymasis
  • Augalų fiziologija

Anotacija

SlARF2a yra ekspresuojamas daugumoje augalų organų, įskaitant šaknis, lapus, gėles ir vaisius. Išsamus ekspresijos tyrimas atskleidė, kad SlARF2a daugiausia ekspresuojamas lapų mazguose ir mazgų skerspjūviuose, rodo, kad SlARF2a ekspresija yra tik kraujagyslių organuose. Dekapitacija arba 6-benzilaminopurino (BAP) panaudojimas iš pradžių gali paskatinti ašinius ūglius, kurių metu SlARF2a ekspresija žymiai sumažėja. Dėl sumažėjusio SlARF2a ekspresijos padidėja dviskilčių dažnis ir žymiai padidėja šoninių organų vystymasis. Kamieninės anatomijos tyrimai parodė, kad pomidorų augaluose smarkiai pakito kampis ir floemas, išreiškiantis žemai sureguliuotą ARF2a lygį, o tai susiję su akivaizdžiais auksino pasiskirstymo pokyčiais. Tolesnė analizė atskleidė, kad pakitęs auksino pernešimas gali įvykti pakitusia kaiščio išraiška. Norint nustatyti AUX / IAA ir TPL sąveiką su ARF2a, buvo išbandyti keturi ašilinių šaudų vystymosi represoriai, kurių veikimas ašiliarinių šaudų vystymosi metu yra žemas, IAA3, IAA9, SlTPL1 ir SlTPL6, siekiant nustatyti jų tiesioginę sąveiką su ARF2a. Nors nė vienas iš šių represorių nėra tiesiogiai susijęs su ARF2a veikla, panašūs IAA3 , IAA9 ir ARF2a raiškos modeliai suponavo , kad jie gali glaudžiai veikti ašiliarinių ūglių formavime ir kituose vystymosi procesuose.

Įvadas

Paprastas fitohormonas „Auxin“ dalyvauja daugelyje augalų augimo ir vystymosi procesų. Tiksliau sakant, indolo-3-acto rūgštis (IAA) tarpininkauja viršūninei dominavimui; stimuliuoja kraujagyslių audinio diferenciaciją; skatina šaknies iniciaciją ir šoninį šaknies vystymąsi; tarpininkauja tropistinėse reakcijose; ir daro įvairią įtaką lapų ir vaisių atsiskyrimui ir vaisių sudėjimui, vystymuisi ir nokinimui. 1, 2, 3 . Molekuliniai tyrimai atskleidė, kad auksino signalizavimas nustatomas veikiant trims baltymų šeimoms: TIR1 / AFB auksino receptoriams 1, 4, 5, AUXIN / INDOLE 3-AKETINĖS RŪGŠTIES (Aux / IAA) baltymams ir augalui būdingam transkripcijos faktoriui (B3). tipo) auksino atsako faktoriai (ARF). ARF turi iš N-galo B3 išvestą DNR surišimo domeną (DBD), o viduriniai regionai (MR) lemia jų transkripcijos aktyvavimo ar represijos funkcijas. MRT, kuriame gausu gliutamino, veikia kaip transkripcijos aktyvatorius, o prolino ir serino turtingas MR veikia kaip transkripcijos represorius 6, 7 . C-galo domeno (CTD) III ir IV ARF motyvai yra atsakingi už homodimerizaciją arba heterodimerizaciją su kitais Aux / IAA baltymais 8 . Esant mažoms auksino koncentracijoms, transkripcinė ARF funkcija yra slopinama tiesioginės sąveikos su Aux / IAA baltymais 9, 10, 11 . Kai auksino koncentracija yra aukšta, TIR1 / AFB sąveikauja su Skp1 – Cullin – F-dėžutės (SCF) E3 ubiquitino ligaze 4, 12, kad gautų polibiquitylatą ir nukreiptų Aux / IAA baltymą skaidymui pagal ubikvitino tarpininkaujamą baltymų skilimo kelią; vėliau ARF transkripcijos faktoriaus represijos palengvėja ir vyksta aktyvi nuo auksino priklausoma geno ekspresija 10, 13, 14 . Tačiau kai kurie ARF transkripcijos represoriai nesąveikauja ar heterodimerizuojasi su Aux / IAA.

Neseniai buvo įrodyta, kad transkripciniai pagrindiniai kompresoriai, susiję su TOPLESS / TOPLESS (TPL / TPR), slopina neapibrėžtus meristemos likimus 15 per sąveiką su skirtingais transkripcijos veiksniais, įskaitant AUX / IAA ir ARF. BODENLOS (BDL) yra AUX / IAA baltymas, kuris sąveikauja su TPL tarpininkaudamas šaknies vystymuisi. TPL bendradarbiauja su AUX / IAA baltymais, jungdamasis aktyvinančiu ARF, kad slopintų į auksiną reaguojančių genų ekspresiją esant žemoms auksino 16, 17 koncentracijoms. Be to, du transkripcijos represoriai AtARF2 ir AtARF9 taip pat gali tiesiogiai sąveikauti su TPL / TPR baltymais, atskleisdami, kad TPL / TPR ko-represoriai gali atsirasti tiek nuo TIR1 / auksino priklausomų, tiek nuo TIR1 nepriklausomų, ARF tarpininkautų represorių 18 .

ARF šeimos nariai (23 nariai - „ Arabidopsis“ ) buvo atidžiai ištirti. Atsižvelgiant į didelį ARF baltymų funkcinį dubliavimąsi, kelios pavienės ARF mutacijos turi gana gilius fenotipus ir vystymosi trūkumus 19 . ARF3 , ARF5 ir ARF7 T-DNR linijos pasižymi įvairiais su auksinu susijusiais defektais, įskaitant netaisyklingą ginekio struktūros modeliavimą, pakitusį hipokotilo atsaką į mėlyną šviesą ir jautrumo auxinui pokyčius, kraujagyslių vystymąsi ir ankstyvą embriogenezę. 20, 21, 22, 23 . ARF2 ir ARF8 veikia kaip jungikliai tarp etileno ir auksino signalizacijos takų, kurie reguliuoja hipokotilo lenkimą ir tarpininkauja auksino homeostazei hipokotilo pailgėjimo metu, atitinkamai, 24, 25, 26, 27 . „ Arf7 arf19“ dvigubas mutantas parodo labiau matomą su auksinu susijusį fenotipą, nepastebėtą „ arf7“ ar „ arf19“ pavieniuose mutantuose , panaikinus šoninį šaknies vystymąsi ir hipokotilo gravitropizmą 19, 28 .

Pomidoruose buvo nustatyti 22 numanomi funkciniai ARF genai 29 . ARF7 ir ARF9 veikia vaisių vystymąsi, tarpininkaudami ląstelių dalijimuisi 30, 31 . Sumažinta Sl-ARF4 ekspresija pagerina pomidorų vaisių elgesį po derliaus nuėmimo, kontroliuodama cukraus metabolizmą 32 ; per didelis miR167 išraiška nutildo ARF6 ir 8 , o tai sukelia moters sterilumą 33 ; sumažėjęs ARF2a ir ARF2b reguliavimas skatina vaisių brendimą 34 . Nors šie ARF buvo gerai apibūdinti, kitų pomidorų ARF funkcijos išlieka neaiškios. Todėl norint suprasti ARF signalizacijos tinklų vaidmenį pomidorų vystymesi, reikia daugiau žinių apie kitų atskirų ARF funkciją.

Oro organai, kilę iš ūglio viršūninio meristemo (SAM), susideda iš trijų dalių: vidinio mazgo, lapo ir ašinio meristemos (AM), suformuoto lapo ašyje 35, 36 . Dėl auksino pernešimo ir pasiskirstymo SAM epidermio sluoksnyje (L1 sluoksnyje) susidaro auksino maksimumas, sukeliantis lapo pradžią, tuo tarpu aksiliniam meristemos formavimui reikalingas auksino minimumas37. Didelio poliarinio auksino pernaša skatina ląstelių dauginimąsi diferenciacijos metu ir kartu meristemos augimą. Pakeitus auksino pasiskirstymą arba auksino polinį transportą, naudojant auksino transportavimo inhibitorių arba auksino transportavimo / signalizacijos mutantą, sumažėja SAM dydis arba slopinamas AM inicijavimas ir taip trukdoma šaudymo ir žiedyno architektūra. 36, 38, 39 . Apibūdinant kelis pomidorų mutantus, kuriems trūksta SAM ir AM raidos, paaiškėjo keli transkripcijos veiksniai, susiję su AM inicijavimu. Pomidorų aklųjų (Bl ) mutantuose ( Bl koduojamas R2R3 MYB genas) slopinamas ūglių ir žiedynų inicijavimas šoniniu meristemu ( Bl koduoja R2R3 MYB geną) 40 . Šoninis slopintuvas ( Ls ) yra išreikštas lapelių ašimis, o Ls mutantai visiškai praranda AM inicijavimo pajėgumą 41 . Kita AM mutacija pomidoruose yra Goblet (Gob ) genas, homologas CUP-Shaped COTYLEDON1 (CUC1) / CUC2 Arabidopsis thaliana ; šio geno mutacija sąlygoja visišką vegetatyvinės AM nepradėjimą ir KNOX geno transkripcijos 42, 43 sumažėjusį reguliavimą . Tolesni tyrimai atskleidė, kad Gobas yra funkciškai lygiagretus Bl, kai pradedama ašinė meristema. Be to, šoninis slopintuvas, aklasis ir GOB gali tarpininkauti ašilinių ūglių formavime, nes tuoj pat paskirstomas auksinas ir signalizuojama 44, 45, 46 .

Yra žinoma, kad PIN šeimos baltymai yra atsakingi už poliarinio auksino pernešimą. Šie baltymai nustato smulkius auksino gradientus, nustatytus per specialius organus, kad jie tinkamai vystytųsi. „Auxin“ transporto mutantinis kaištis nesudaro šoninių organų, nes kaupiasi vietiniai auksino sutrikimai. Auxin gradientai pasiekiami per auxin polinį transportą, kuris nurodo organo vystymąsi kartu su auxin signalo elementais, tokiais kaip AUX / IAA ir auxin atsako koeficientu. Auxin transportui vėliau įtakos turi auxin response factor, kuris tarpininkauja PIN kodo transkripcijos lygiui. Nors vienas nph4 / arf 7 mutantas neparodė jokio poveikio auksino sukeltam PIN perkėlimui, arf7 arf16 arf19 ir arf7 arf17 arf19 trigubų mutantų žymiai sumažėjo nuo auksino priklausomas PIN perkėlimas. Taip pat pranešama, kad PIN baltymų ekspresiją tarpininkauja auksinas per TIR1-Aux / IAA-ARF kelią. Poliarinio auksino pernaša (PAT) ir auksino atsakai yra glaudžiai susiję, todėl augaluose juos sunku išspręsti 47 .

Tikslus auksino veikimas yra suderintas šiais sudėtingais būdais. Auksinas vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį formuojant AM, o kai kurių augalų auksino signalų, tokių kaip IAA3 ir 9 , pin3 ir pin4 , silpnas reguliavimas gali sukelti stipriai modifikuotus ašilinių ūglių formavimo fenotipus 48, 49, 50 . Tačiau informacijos apie specialų auksino transkripcijos faktorių, dalyvaujantį šiame procese, yra nedaug.

Čia mes panaudojome P SlARF2a :: GUS ir qRT-PCR, norėdami parodyti, kad SlARF2a pomidorų vystymosi metu eksponuoja platų spektrą. SlARF2a yra ekspresuojamas šaknyse, lapuose, žieduose, vaisiuose ir sėklose, o tai reiškia, kad jis gali būti svarbus pomidorų organų vystymuisi. Be to, SlARF2a ekspresija sumažėja dekapitacijos metu, o gydymas BAP skatina ašilinių ūglių formavimąsi. Sumažėjęs SlARF2a ekspresijos reguliavimas dar labiau patvirtino išvadą, kad SlARF2a vaidina neigiamą vaidmenį ašilinių ūglių meristemų formavime. Be to, SlARF2a RNRi linijose taip pat buvo pastebėtas padidėjęs poliklinikių branduolių ir organų suliejimo dažnis - du su auksinu susiję defektai. Šie fenotipai gali būti grindžiami auksino pasiskirstymo ir smeigtukų ekspresijos pokyčiais SlARF2a RNRi linijose. Galiausiai aptariami ARF2a , IAA3 ir IAA9 santykiai.

Rezultatai

SlARF2a (Solyc03g118290.2.1) genas turi 2511 bp atvirą skaitymo rėmą, kuris išskaičiuoja 846 aminorūgščių baltymą. „SlARF2a“ baltyme yra trys konservuoti domenai: B3 (135–237), ARF (263–345) ir „Aux / IAA“ (709–803). Prognozuojama, kad SlARF2a veiks kaip transkripcijos represorius, nes MR domenų sekose buvo nustatyti regionai, kuriuose didelis prolino procentas (7, 87%), serinas (12, 55%) ir treoninas (6, 38%) (papildoma S1 pav.).

Norėdami suprasti SlARF2a funkcijas pomidorų augimo ir vystymosi metu, mes įvertinome SlARF2a raiškos modelius įvairiuose organuose, naudodamiesi GUS reporterio geno sinteze (1a pav.). SlARF2a yra ekspresuojamas pagrindiniuose augalų organuose, įskaitant sėklas, šaknis, lapus, žiedus ir vaisius. GUS aktyvumas nustatytas 3 dienų amžiaus, lengvai užaugintuose, transgeniniuose daigais. Sėklų sudygimo metu aušino reporteris DR5 pasirodė žievėje, o SlARF2a :: GUS griežtai pasirodė skydliaukėje (1b, c pav.). Nustatyta, kad „SlARF2a :: GUS“ dažymas buvo pastebimas gėlių skutimosi ir stigmos pavidalu (1d pav.), O žiedadulkių grūdeliai parodė stiprų GUS aktyvumą (1e pav.). SlARF2a: GUS taip pat buvo išreikštas besivystančiuose vaisiuose, o GUS dažymas buvo daugiausia stebimas kraujagyslių audiniuose ir sėklose (1f pav.). „SlARF2a :: GUS“ taip pat buvo stipriai ekspresuojamas lapuose, tačiau tolesnė analizė parodė, kad trichomas žymiai dažosi , o šaknies galiuko ir šoninės šaknies formavimosi vietose yra stipri ekspresija (1g pav., H). Šaknies pjūviai parodė ARF2a raišką kraujagyslių audinyje ir epicikle (1i pav., J). Šakoje taip pat pastebėtas dažymas (1k pav.). Šie ekspresijos profiliai buvo patvirtinti atliekant GUS aktyvumą ir qRT-PGR analizę (2a pav. Ir papildomos S2 ir S3 figūros). Nepaisant to, kamiene buvo aptikta žema SlARF2a ekspresija, lapų mazge, ypač kraujagyslių audinyje, buvo nustatytas stiprus dažymas. Kamieno skerspjūvio analizė parodė pagrindinę ARF2a ekspresiją kraujagyslių audinyje (2b, c pav.).

Image

P SlARF2a :: GUS vektoriaus struktūra ( a ); GUS dažymo modeliai daigintuose P SlARF2a :: GUS sėklose (2 dienų amžiaus) ( b ); GUS dažymo modeliai daigintame DR5 :: GUS sėklose (2 dienų amžiaus) ( c ); GUS dažymo modeliai P SlARF2a gėlėse : GUS augalai antitezėje ( d ); žiedadulkės parodė stiprų mėlyną dažymą ( e ); MG buvo išreikšta vaisiais, o dažymas daugiausia pasiskirstė kraujagyslių audiniuose ir sėklose ( f ); pagrindinis GUS dažymas pastebėtas lapų trichomose ( g ); GUS dažymas pradinėje šoninėje šaknies vietoje ( h ); P SlARF2a :: GUS ekspresija šoniniame šaknyje ir kraujagyslių šaknų tinkle ( i ); P SlARF2a :: GUS ekspresija kraujagyslių kamienų tinkle ( j ); P SlARF2a :: GUS išraiška ašiniame širdyje ( k ).

Visas dydis

Image

Skirtingi SlARF2a raiškos modeliai pomidorų organuose ( a ); santykiniai SlARF2a ekspresijos lygiai 6 savaičių pomidorų augalų stiebuose, mazguose ir žievelėse ( b ); SlARF2a ekspresija kamieninių mazgų priekinėje dalyje, kraujagyslėse ir žievėje ( c ); SlARF2a ekspresija praėjus 1, 3 ir 5 dienoms po dekapitacijos ( d ); SlARF2a ekspresija praėjus 1, 3 ir 5 dienoms po gydymo BAP ( e ); SlARF2a ekspresija praėjus 1, 3 ir 5 dienoms po dekapitacijos ir gydymo auksinu ( f ). Klaidų juostos rodo mažiausiai trijų nepriklausomų pakartojimų vidurkį ± SE, n ≥ 9. * Reikšmingi skirtumai, kai P <0, 05 nustatyti naudojant t- testą. P ARF2a :: GUS ekspresija skydliaukėje (kairėje) ir po dekapitacijos (dešinėje) ( g ).

Visas dydis

Dekapitacijos sukeltų ašilinių ūglių vystymosi metu SlARF2a parodė sumažėjusią ekspresijos tendenciją. Auxin pernešamas ūglio apačioje, o nuėmus augalą, pagrindinis auksino šaltinis pašalinamas. Šis viršūninio dominavimo pašalinimas skatina ašilinių ūglių susidarymą per 4 d., O ARF2a ekspresija šio proceso metu žymiai sumažėja (2d pav.). Kitas ašiliarinis šaudymas buvo stimuliuotas BAP būdu dyglialapių ašilių pumpurų vietose, o tai veiksmingai paskatino ašilinio šaudymo vystymąsi per 6 valandas. Stebimas žemai sureguliuotos ARF2a ekspresijos modelis, kai 6-BA skatino ašilinių ūglių vystymąsi (2e pav.). ARF2a ekspresijos sumažėjimą slopino auksino užtepimas ant pjaustomo paviršiaus (2f pav.). Be to, nesubrendusių lapų iškirpimas žymiai paskatino ašilinių ūglių vystymąsi ir sumažino ARF2a ekspresiją (2g pav.).

Norint išsamiau išaiškinti SlARF2a funkciją, transgeninės SlARF2aRNAi linijos buvo sukurtos remiantis 277 bp fragmentu (3a pav.). Fragmentas buvo klonuotas į RNR dvejetainį vektorių (pB7GWIWG2 (I)), kuris vėliau buvo perkeltas į pomidorą, naudojant Agrobacterium tumefaciens . Gavome keturias nepriklausomas RNAi linijas, kuriose ARF2a ekspresija buvo sumažinta daugiau kaip 20% (pvz., RNAi SlARF2a - 2, 3, 5 ir 7 ). Tolimesniam tyrimui buvo parinkti SlARF2a - 2 ir 5 , kurie atitinkamai sumažino 38% ir 42% SlARF2a nuorašo lygius (3b pav.).

Image

SlARF2aRNAi vektoriaus struktūra ( a ); santykiniai SlARF2a ekspresijos lygiai skirtingose SlARF2aRNAi linijose ( b ); SlARF2aRNAi-2 ir SlARF2aRNAi-5 skatina ašies smaigalio skaičių ( c ); paprastieji skydliaukės laukinio tipo pomidorai ( d ); padidėjęs trigubų ir keturių skydliaukių fenotipų dažnis SlARF2aRNAi linijose ( e ). Klaidų juostos rodo vidurkius ± SE. * Reikšmingi transgeninių ir laukinio tipo augalų skirtumai, kai P <0, 05 nustatytas naudojant t- testą.

Visas dydis

SlARF2aRNAi žemas reguliavimas (2 ir 5 eilutės) reikšmingai skatino šoninės šakos vystymąsi visose transgeninėse linijose (3c pav.). Be to, SlARF2a RNRi linijos turėjo daugiabriaunius augalus dažniau nei laukinio tipo augalai. Daugiakampių skilčių dažnis padidėjo atitinkamai 25% ir 28% SlARF2aRNAi-2 ir SlARF2a RNAi -5 linijose, palyginti su tik 2% negimdinių vėžimėlių laukinio tipo augaluose. Be to, maždaug 15% ir 17% dviskilčių turi nenormalius fenotipus atitinkamai RNAi SlARF2a-2 ir RNAi SlARF2a-5 linijose (3d pav., E, 1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Paprastai šoniniai ūgliai atsiranda aštuntame lapų mazge tik po gėlių perėjimo (4a pav.). Transgeninėje SlARF2aRNAi linijoje šoniniai ūgliai atsirado pirmame lapo mazge (4b, c pav.). Neįprastas meristemas atsirado ir subrendusiame lape (4d pav.). Išskirtinis reiškinys buvo pastebėtas maždaug 10% SlARF2aRNAi -2 augalų, kuriuose šoninės šakos atsirado dėl nenormalių posūkių ir skilusių skydliaukių, bet nesugebėjo subręsti dėl skydliaukės absceso (4e pav.). Be to, „ SlARF2aRNAi -2“ linijose, kuriose didžiausias žemutinis reguliavimas, šoniniai ūglių išsivystymai atsirado žemiau skydliaukės mazgų padėties (4f pav.). Be to, neįprastos šoninės šakos pasirodė ir stiebe, kuris yra toli nuo lapų mazgo (4g pav., H).

Image

Iki pirmo žiedyno atsiradimo laukinio tipo ( a ) skydliaukėje ir lapų mazge neatsiranda ašilinių ūglių; SlARF2aRNAi-5 augalai, rodantys neįprastos šoninės šakos, įkištos žemyn kampu nuo skydliaukės mazgo ( b ), išsivystymą; išsivysčiusi SlARF2aRNAi-5 ( c ) šoninė šaka; SlARF2a sumažėjęs reguliavimas sukėlė šoninės šakos formavimąsi toli nuo lapo mazgo ( d ); šoninės šakos atsiranda dėl nenormalių susisukusių ir suskaidytų skydliaukių SlARF2aRNAi-5 augale ( e ); dvi nenormalios meristemos SlARF2aRNAi-5 sėklose ( f ); neįprastas ašilinių ūglių susidarymas vietoje, esančioje toli nuo mazgo, SlARF2aRNAi-5 augale ( g ); neįprastas ašilinių ūglių susidarymas SlARF2aRNAi-5 kamiene.

Visas dydis

Šios šoninės šakos iš pradžių davė tik vieną lapą, kuriame nebuvo matomos viršūninės meristemos (5a, b pav.). Kai lapai buvo visiškai išplėsti, ūglių meristema tapo matoma ir atsirado visos šoninės šakos, panašios į tas, kurios anksčiau buvo nurodytos dgt mutantuose . Reikėtų pažymėti vietą, kurioje atsirado neįprasta meristema, nes epidermas paprastai atrodė suskaidytas išilgai ašies (5c pav.). Pradinį šoninės šakos meristemą patvirtino anatominiai stebėjimai. Anatominė ūglio analizė atskleidė, kad neįprastos ašilinės meristemos atsirado iš kamino. Pagrindinis laukinio tipo ir ARF2a RNRi augalų skirtumas yra susijęs su kraujagyslių pokyčiais (5d, e pav.). Tipiška anatominė struktūra atskleidė neįprastai padidėjusią tarpskilvelinę kampiją ir floemą pomidorų augaluose, turinčiuose žemyn sureguliuotą ARF2a (5f pav., G). Šie rezultatai rodo, kad sumažėjęs ARF2a reguliavimas skatina šoninių ūglių vystymąsi ir keičia kraujagyslių vystymąsi. Be to, ARF2a RNR padidina ūglių sintezės dažnį (papildomas S4 pav.).

Image

Padidėjęs meristemą primenančio organo vaizdas kamieno paviršiuje ( a ); kamiene, bet toli nuo mazgo esančioje SlARF2aRNAi-5 ( b ), atsirado nenormalios į meristemą panašios struktūros; šoninės šakos sulaužo stiebo paviršių SlARF2aRNAi-5 ( c ); laukinio tipo stiebų anatominė analizė ( d ); išplėstas filoemas ir kambaras SlARF2aRNAi ( e ); į kaiščius panašių struktūrų skerspjūvis, parodantis, kad struktūros yra kilusios iš kambro, esančio SlARF2aRNAi ( f ); Meristemą primenančios struktūros skerspjūvis SlARF2aRNAi ( g ). Žvaigždė žymi ašinį šūvį; juodos rodyklės žymi ksilemą; baltos strėlės žymi filemą.

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad organų suliejimas ir papildomų skilčių formavimasis bei ašilinis šaudymas yra susijęs su pakitusiais auksinų signalizavimu specializuotuose organuose, auksino pasiskirstymas buvo toliau tiriamas ARF2a RNAi linijose kryžminant su DR5 :: GUS linija, vadinama geras žymeklis auksino tyrimui (6a, b pav.). Auxin transporterio ekspresijos analizė parodė, kad kaiščių ekspresija buvo sumažinta ARF2aRNAi (6c – j pav.). Rezultatai parodė, kad pin1 , 2 , 4 , 8 ir 10 reikšmingai sumažėjo ARF2a RNAi linijų. Priešingai, „ pin9“ išraiška nebuvo pakeista, o „ PIN3“ ir „ 7“ išraiškos lygiai buvo pakoreguoti ( PIN5 ir 6 nebuvo galima aptikti). Pomidoruose buvo nustatyti keli su negimdiniais ašiliariniais ūgliais susiję transkripcijos veiksniai, o aklųjų , gobų ir Ls ekspresijos lygis buvo reikšmingai padidintas ARF2aRNAi (6k – m pav.). IAA3 ir IAA9 ekspresijos lygiai buvo sureguliuoti po dekapitacijos ir gydymo BAP (6n, o pav.). Panašios SlTPL1 ir SlTPL6 raiškos tendencijos taip pat pastebėtos reaguojant į šiuos gydymo būdus (papildomas S5 pav.).

Image

DR5 :: stebimas laukinis tipas ( a ) ir SlARF2RNR ( b ). Kaištis 1 ( c ), 2 ( d ), 3 ( e ), 4 ( f ), 7 ( g ), 8 ( h ), 9 ( i ), 10 ( j ), aklas ( k ), gobas ( l) ) ir ls ( m ) transkripto lygiai SlARF2aRNAi linijose ir laukinio tipo analizuoti qRT-PCR metodu . Nereguliuojama IAA3 ekspresija dekapitacijos metu ir BAP sukelta ašilinių šaudų raida ( n ); žemai sureguliuota IAA9 raiška dekapitacijos metu ir BAP sukelta ašilinių šaudų raida ( o ). Klaidų juostos rodo mažiausiai trijų nepriklausomų pakartojimų vidurkį ± SE, n ≥ 9. * Reikšmingi skirtumai tarp transgeninių ir laukinio tipo augalų, kai P <0, 05 nustatomi naudojant t- testą.

Visas dydis

SlARF2a ir SlIAA (3 ir 9) bei SlTPL (1 ir 6) baltymų sąveika buvo įvertinta naudojant mielių dviejų hibridų testą. Sąveikai tirti mes naudojome viso ilgio ARF2a, Aux / IAA ir SlTPL. Mėlynos kolonijos buvo gautos dedant į selektyvią QDO terpę. Mūsų rezultatai parodė, kad ARF2a nesugeba sąveikauti su SlTPL (1, 6), SlIAA3 ir SlIAA9 (7 pav.).

Image

Y2HGold mielių padermė buvo bendrai transformuota naudojant ARF2a jauko vektorių kartu su SlIAA3, SlIAA9, SlTPL1 ir SlTPL6 grobio vektoriais. Mielių dviejų hibridų sąveikos tarp ARF2a ir IAA3 arba IAA9 ( a ); mielių dviejų hibridų sąveikos tarp ARF2a ir SlTPL1 arba SlTPL6 ( b ).

Visas dydis

Diskusija

Žinių apie ARF genų vaidmenį augalų morfogenezėje buvo gauta juos identifikuojant ir apibūdinant Arabidopsis. Naudojant T - DNR įterpimo įrankius, buvo gauti 22 Arabidopsis ARF ir keli mutantai turėjo nenormalius fenotipus 19 . Pavyzdžiui, arf3 / ettin mutantas turi gėlių vystymosi defektų, o arf5 / mp mutantas rodo šaknies meristemą ir skydliaukės vystymosi defektus 22, 51, 52 . Arf7 / nph4 / msg1 ir arf19 mutantams nepavyksta atlikti fototropinių atsakų ir šoninės šaknies išsivystymo 19, 23, 24, 53 . Šie rezultatai rodo ARF baltymų funkcinį perteklių. Palyginti su Arabidopsis modelio augalu, pakanka nutildyti vieną ARF geną, kad pomidoruose atsirastų matomi, stabilūs ir išskirtiniai fenotipai . „Sl-ARF4“ , „ Sl-ARF7“ ir „Sl-ARF9“ dalyvauja vaisių rinkinyje, vystyme ir kokybei, atitinkamai, 30, 31, 32, 54 . Šis tyrimas atskleidė, kad normali ARF2a ekspresija yra būtina pomidorų ašilių ūglių ir kraujagyslių vystymuisi, todėl aprašomi nauji ARF vaidmenys pomidorų vystymuisi.

Viso genomo skenavimas nustatė du tariamus Arabidopsis ARF2 ortologus pomidorų genome. Šie baltymai turi didelę aminorūgščių tapatybę (83%). Nutildžius „SlARF2a“ arba „ SlARF2b“ , vaisiai buvo nokinami atskirai, o sumažėjęs abiejų genų reguliavimas turėjo rimtų nokinimo trūkumų 34 . SlARF2a MR srities sekų prolino, serino ir treonino turtingos sritys yra spėjami transkripcijos represoriai. DR5:: GFP reporterio eksperimentas dar labiau patvirtino šiuos rezultatus, leidžiančius manyti, kad SlARF2a gali veikti kaip transkripcijos represorius formuojant ašilinius šaudmenis. „ SlARF2aRNAi“ transgeninės linijos turėjo akivaizdžius fenotipus, taip dar labiau patvirtindamos „SlARF2“, kaip represoriaus, vaidmenį. Ataskaitoje nurodoma, kad žemai sureguliuotą SlARF2a ekspresiją kompensuoja padidėjusi SlARF2b ekspresija , kuri rodo diskretišką etileno nejautrumą pomidorų vaisių nokinimo metu. Šiame straipsnyje ši kompensacija nebuvo akivaizdi pradiniame ašilinių ūglių ar skydliaukės vystymosi metu. Žemas SlARF2b išraiškos lygis šiuose organuose gali paaiškinti, kad nėra tinkamos kompensacijos, kad būtų atkurti ARF2a aktyvumo trūkumai (papildomas S6 pav.).

Sėklų daiginimo metu ARF2a daugiausia eksploatuojamas skydliaukėse , o auksinas daugiausia pasiskirsto radikale. Šis pasiskirstymas skydliaukėje suponavo, kad ARF2a daugiausia dalyvauja skydliaukės vystymesi sodinuko metu. ARF2a RNRi linijos su žemyn sureguliuojamu ARF2a parodė padidėjusį daugiabriaunių ir ašilinių ūglių formavimosi dažnį. Mūsų tyrime labiausiai neįprastas atradimas buvo susijęs su stipria ekspresija kamieno kraujagyslių audinyje, atsižvelgiant į santykinai žemą ekspresiją kamiene. Be to, dekavitacija ir citokinino panaudojimas, skatinantys ašilinių ūglių formavimąsi, žymiai sumažino SlARF2a raišką. Šie raiškos modeliai leidžia manyti, kad ARF2a gali būti susijęs su kraujagyslių vystymusi ir ašilinių ūglių formavimu. Be to, mūsų pomidorų rezultatai parodė, kad SlARF2a ypač išsiskiria vaisiuose; ypač neseniai pranešta, kad SlARF2a tarpininkauja pomidorų vaisių nokinimui . Šie radiniai patvirtina nuostatą, kad SlARF2a yra pagrindinis pomidorų vystymosi reguliatorius, o tai dar labiau reiškia, kad ARF2a gali atlikti ypatingą ir išskirtinį vaidmenį tarpininkaujant pomidorų daržovėms, palyginti su kitais ARF 30, 31, 32, 34, 54 .

Akivaizdžiausias „ SlARF2a RNAi“ linijų reiškinys buvo reikšmingas ašilinių ūglių padidėjimas. Poliarinis auksino pernešimas ir maksimalių vietinių auksin koncentracijų nustatymas reguliuoja embriono vystymąsi ir šaudymo architektūrą. Pagrindinis sintezuotas auksinas yra kilęs iš jauno organo 55, 56 ir yra transportuojamas į pagrindinę bazę. Aukštaūgio ūglio pašalinimas sumažina pradinį auksino kiekį ir sumažina auksino koncentraciją 36, 57, 58, 59 . „ Pin1“ neturinčiuose mutantuose auuksino gradientas nėra nustatytas, tačiau jį galima atstatyti naudojant auxin 37, 60, 61 . Arabidopsis thaliana ir pomidorų ( Solanum lycopersicum ) atveju aksiliniam meristemos formavimui būtinas auksino minimumas aksilo lapuose36. Auksino uždėjimas dekapitacijos vietoje trukdo PIN kodo perkėlimui, o polinis auksino transportavimas slopina ašilinių ūglių padidėjimą. Citokinino uždėjimas ant lapų mazgo efektyviai skatina ašilinių ūglių susidarymą, nes maža auksino koncentracija kamiene sustiprina citokinino signalus 36, 62, 63 . Lapų mazgelyje ARF2a ekspresija ypač sumažėjo, atsižvelgiant į tai, kad dekapitacija ir gydymas citokininu sukėlė ašilių formavimąsi. Šie rezultatai rodo, kad ARF2a gali atlikti gyvybiškai svarbų vaidmenį tarpininkaujant ašilinių ūglių formavimuisi. Mažėjantis ARF2a ekspresijos reguliavimas sukelia gausų ašilinių ūglių formavimosi padidėjimą net iš skydliaukės mazgų. Be to, keliose eilutėse buvo pastebimas nenormalus negimdinių ašilinių ūglių susidarymas skydliaukėje , lapuose ir stiebuose , o tai dar labiau patvirtino nuostatą, kad ARF2a vaidina svarbų vaidmenį ašilinių ūglių vystymesi. Be to, organų atsiradimo vietas reguliuoja auksino pasiskirstymas, o kontroliuojamas auksinų persiskirstymas pasiekiamas kryptiniu auksinų transportavimu 37, 64, 65, 66 .

Auxin pasiskirstymo pokyčiai SlARF2a RNRi augaluose visų pirma priskiriami skirtingai auxin poliarinio pernešimo sistemai SlARF2a RNRi, atsižvelgiant į tai, kad daigose nebuvo pastebėtas reikšmingas auksino kiekio skirtumas (duomenys nepateikti). Genų ekspresija, reaguojant į gydymą auksinu, vyksta AUX / IAA-ARF 57, 67 keliu. Axr3 mutantuose, kurių Aux / IAA signalizacija blokuojama, auksinas negalėjo sukelti PIN geno ekspresijos 47 . IAA15 per didelis ekspresija neigiamai reguliuoja auksino nešėjų gausą transkripcijos lygyje, o pertraukus auksino homeostazę atsiranda šaknų gravitropizmo defektai 68 . Be to, du nereikalingai veikiantys ARF transkripcijos veiksniai, ARF5 / MONOPTEROS (MP ) ir ARF7 / NPH4 , kartu reguliuoja tiek pin1 išraišką, tiek lokalizaciją šoninių šaknų modeliavimo metu Arabidopsis 22, 23 . Kaiščių išraiškos analizė parodė, kad 1 , 2, 4, 8 ir 10 reikšmingai sumažėja ARF2aRNAi , tuo tarpu PIN3 ir 7 išraiškos yra padidintos. Ankstesnėje ataskaitoje nurodoma, kad pomidorų pin4RNRi , dgt mutantas, ir NPA (auksino transportavimo inhibitorius, mažinantis auksino transportą) skatina didesnį ašilinių ūglių vystymąsi 50, 69 . Stiprus žnyplių ekspresijos reguliavimas gali būti patikimas paaiškinimas dėl ARF2a RNRi augalų auksino gradiento pokyčių ir gausaus ašilinių ūglių vystymosi. Auxin kaupimasis reiškia auksino transporterio kaiščio išraišką, kuris taip pat tarpininkauja pirmame periklinalinių ląstelių dalijime ir žymi tarpskilvelinio kampio pradžią 70, 71 . Be to, auksino signalai taip pat yra susiję su kambio inicijavimu ir aktyvumu 72, 73 . „pin1“ ir „ pin3“ funkcijos praradimai ir nejautrūs auuksinams atsparūs 1 mutantai rodo sumažintą arba sutrikusį tarpfazinį karabino inicijavimą ir aktyvumą 73, 74 . Šiame tyrime kraujagyslių ir tarpskilvelinės kampijos išsiplėtimo priežastis ARF2aRNAi gali būti dėl pakitusio auksino pasiskirstymo ir nuo ARF2a priklausomo auksino signalizacijos.

Ls, Gob ir Bl mutantai taip pat tarpininkauja auksino pasiskirstymui. Ls augalų lapai, lapai ir stiebai sukaupė daugiau auksino, palyginti su laukinio tipo augalais, ir panašūs rezultatai rasti Bl mutantuose, išskyrus lapus. Taip pat pranešama, kad Gobas gali tarpininkauti auksinų pasiskirstymui, o jo per didelis ekspresijos fenotipas turi įtakos auxin tarpininkaujamam Gob aktyvumui, kuris parodo, kad auxin ir Gob bendradarbiavimas tarpininkauja lapų formavimui 42, 65, 75 . Auksino signalas taip pat dalyvauja tarpininkaujant jų išraiškai. „ SlIAA15“ vaidina neigiamą reguliavimo vaidmenį prieš akląjį. Daiguose su žemai sureguliuotu SlARF2a šie pagrindiniai pradiniai ašilinių ūglių reguliatoriai pasižymėjo padidinta ekspresija, o tai gali sukelti skirtingus auksinų pasiskirstymo modelius SlARF2aRNAi augaluose. Be to, aukšta Ls , Gob ir Bl išraiška potencialiai bendradarbiauja su auksinu, kad padidėtų ašinių ūglių formavimas.

Pomidorams vystytis reikalinga normali auxin funkcija per ARF-Aux / IAA signalizacijos kelią. ARF transkripcinį aktyvumą tarpininkauja AUX / IAA, o dviejų pomidorų pavienių AUX / IAA žemyn reguliuojamų linijų, IAA3 ir IAA9 , fenotipai yra panašūs į ARF2a RNAi, pavyzdžiui, padidėjęs daugiabriaunių letenų dažnis, pakitęs kraujagyslių formavimasis ir padidėjęs ašilinių ūglių vystymasis 48, 49, 76 . Pagrįsta daryti išvadą, kad ARF2a gali veikti pagal tuos AUX / IAA. Ankstesnis tyrimas pasiūlė, kad SlIAA3 yra junginys tarp auksino ir etileno signalų, dėl kurio padidėja skirtingas augimas ir padidėja kablio kreivumas. Be to, šio proceso metu SlIAA3 ir SlHLS gali veikti lygiagrečiais keliais, kuriuose ARF2 veikia kaip vartotojų komponentas. Atitinkamai, ARF2a reikšmingai sumažėjo AS- SlIAA3 linijose. Šie rezultatai rodo, kad ARF2a gali prisidėti mažinant SlIAA3 fenotipą. Be to, ARF2a vaidmuo reaguojant į etileną dabar yra aiškus, atsižvelgiant į tai, kad ARF2a RNR sulėtina pomidorų vaisių brendimą mažindamas etileno gamybą ir signalizavimą, o tai gali prisidėti prie sumažėjusio etileno reagavimo ir pakitusių fenotipų, stebimų AS- SlIAA3 . Šiame tyrime dekapatacijos ir egzogeninio citokinino panaudojimas ašiliarinių formavimų indukcijai taip pat sumažino SlIAA3 raišką. Taigi, numanomas IAA3-ARF2a kelias taip pat funkcionuoja plėtojant ašilę.

AS- SlIAA9 lapuose taip pat pastebėtas kraujagyslių tinklo padidėjimas ir ašilinių ūglių formavimasis. Šie radiniai rodo, kad dėl SlIAA9 sumažėjusio reguliavimo padidėja kraujagyslių diferenciacija ir kad SlIAA9 yra pagrindinis tarpininkas, veikiantis nuo auksino priklausomą kraujagyslių venų modeliavimą ir šoninių ūglių vystymąsi 48 . However, whether the activity or expression levels of ARF2a under SlIAA9 directly mediate these processes remains unknown. An earlier report indicates that auxin-induced fruit set is affected by GA through the simultaneous down-regulation of ARF2a and SlIAA9 , a finding that also reveals the close relationship between ARF2a and SlIAA9 77 . The down-regulation of these proteins during axillary shoot development after decapitation and exogenous cytokinin treatment implied that ARF2a acts downstream of IAA9. ARF2a is a potential central mediator of AUX/IAAs (at least SlIAA3 and SlIAA9) for tomato axillary shoot development and the ethylene response. Another view suggests that a fine and precise mechanism mediates cooperative SlIAA3 and SlARF2a expression (along with SlIAA9 and SlARF2a expression) to promote a proper response to developmental and environmental signals. The similar cis-acting elements found in the SlIAA3 , SlIAA9 and SlARF2a promoters might explain their similar expression patterns (Supplementary Table S3).

The lack of interaction among SlIAA3, SlIAA9 and SlARF2a suggests that SlARF2a transcriptional repression is not directly mediated by SlIAA3 and SlIAA9. Other reports also indicate that compared to other ARFs, only a few SlIAAs (SlIAA26 and 29) interact with SlARF2a 78 . Combined with the earlier report that the transcriptional repressor ARF might act without AUX/IAA repression given that very weak or no interaction was observed between the repressor ARF and AUX/IAA, these results indicate that ARF2a potentially functions as a transcriptional repressor in the absence of AUX/IAA.

These results have provided a framework for TPL/TPR-dependent transcriptional repression that is also involved in AUX/IAA-ARF-dependent auxin signaling. The interaction between Aux/IAA and TPL/TPR proteins to abolish ARF activity and inhibit auxin-responsive expression genes in low auxin concentrations indicates that TPL plays an important role in Aux/IAA-inhibited ARF transcriptional activity 16 . Although most ARF activators can directly interact with most Aux/IAAs, ARF repressors show minimal interactions with Aux/IAAs 17, 79, 80, implying that ARF repressors are less affected by AUX/IAA compared to ARF activators. Further study revealed that AtARF2 and AtARF9, two repressive ARF proteins, can interact directly with TPL/TPR proteins to form co-repressors in mediating the auxin response, providing a new mechanism for repression and indicating that TPL/TPR act as co-repressors in both forms of ARF-mediated repression 17 . In tomato, IAA3 and IAA9 interact with all TPLs 18 . SlTPL1 and SlTPL6, which exhibit significantly down-regulated expression during axillary shoot development, did not directly interact with ARF2a in this study. It is reasonable to deduce that after decapitation or BAP treatment, SlTPL1 and SlTPL6 exhibited significantly decreased expression. Thus, fewer SlTPLs cooperate in transcriptional repression, and the reduced number of SlTPLs combined with the low expression levels of IAA3 and IAA9 resulted in reduced AUX/IAA-mediated repression of auxin signals and the release of more ARF activators. Thus, the coordinated accumulation of low levels of ARF2a leads to the release of ARF2a repression, and its binding site is available to ARF activators to activate the expression of auxin-responsive genes. Given that ARF2a activity is less affected by AUX/IAA and TPL and that this distinct ARF function is very rare (as most ARF activities are repressed by AUX/IAA and TPL), this finding implied that ARF2a activity is only dependent on itself at the transcriptional and translational levels; moreover, ARF2a might play a more direct role in adjusting auxin signals. Given that ARF2a expression primarily occurs in response to phytohormones, such as ethylene, abscisic acid and auxin 34, 81 (Supplementary Fig. S7 and Table S3), it is reasonable to deduce that ARF2a might be integral to those signals that direct tomato development.

Metodai

Augalinės medžiagos

Tomato cultivars ( Solanum lycopersicum L. cv Zhongshu No 6) or “ Pro ARF 2a :: GUS ” and “ ARF 2a RNA i” transgenic lines were grown in soil for 6 weeks in a greenhouse with natural light under a daytime temperature of 25 ± 3 °C and a nighttime temperature of 15 ± 3 °C.

Pro ARF2a ::GUS and ARF2aRNAi vector construction and tomato transformation

The partial ARF 2 a clone was amplified using the following pairs of primers: ARF 2 a partial fw (5′-CACCAGACCATTCCCAAGCCAGTG-3′) and ARF 2a partial rev (5′-TTGGTCCGCAGAGGGTAAAC-3′). The sequence was fused into the pENTR D-TOPO plasmid (Invitrogen) and then transferred to the binary vector pB7GWIWG2(I) via LR recombination according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). A 2.4-kb ARF2a promoter fragment was obtained by PCR using the following primers: Pro ARF2a fw (5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCGTAATCATAATATCACGTCACATCGG-3′) and Pro ARF2a rev (5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT CACAAAATAAAACTTCCTTCTCCAAA-3′). The 2462-bp PCR product was transferred into pDONR221 (Invitrogen) and fused into the pBGWFS7 binary vector, which harbors two reporter genes for GUS (beta-glucuronidase) and GFP (green fluorescent protein) and the marker gene for bar. After sequencing, the vector with the correct sequence was electroporated into EHA105 cells. The T1 and T2 lines were obtained for the expression of the target and bar genes by qPCR using the primer pairs listed in Supplementary Table S1.

RNA extract and expression assay

An RNAprep pure plant total RNA extraction kit (Qiagen, Germany) was used to extract total RNA. The genomic DNA was removed using DNase I and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis was carried according to Jain methods 82 . In brief, 2 μg cDNA samples were used as templates and were mixed with 200 nM of each primer and the SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germany) for RT-PCR analysis in an ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (PE Applied Biosystems). The melting curve analysis was used to verify the reaction specificity. At least three independent biological replicates of each sample in technological triplicate were subjected to qRT-PCR.

Statistinė analizė

P < 0.05 and P < 0.01 were considered statistically significant according to Duncan's Multiple Range Test. The Statistical Analysis System (SAS, version 9.1) was used for the data analyses.

GUS analysis

For GUS staining, samples from T3 plants were incubated in pH 7.0 50 mM sodium phosphate solution containing 0.4 mg·ml −1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bD-glucuronicacid, 1 mM potassium ferricyanide, and 1 mM potassium ferrocyanide for 5 h at 37 °C or 24 h at 4 °C, followed by incubation in 95% ethanol for 2 h. Pictures were obtained with a digital camera using a Nikon Eclipse 80i and a Zeiss Axio Observe A1 microscope.

Šviesos mikroskopija

The excised stem samples were immediately fixed in an FAA solution, dehydrated using a graded ethanol series (50, 60, 70, 90, 95 and 100%) for 30 min at each concentration, and embedded in paraffin. Paraffin-embedded sections (18–25 μm thick) were cut Using a Leica RM2245 microtome to obtain 8–25 μm thick sections, which were then de-paraffinized using 100% Histoclear. After Safranin-O or Toluidine blue staining, the samples were examined under a light microscope (Nikon Eclipse 80i).

Hormone treatments

Decapitation treatment was performed by excising the shoot tip below the oldest unexpanded leaf while the remaining five leaves were allowed to expand. For the BAP treatments, 0.5 mM BAP was applied around the stem immediately below the oldest unexpanded leaf. IAA treatment was performed by applying lanolin containing 3 mg g −1 IAA to the decapitated stump.

Yeast two-hybrid assays

The Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 (Clontech) was used for the yeast two-hybrid assays. The full-length sequences of SlIAA3 and 9 , SlTPL1 and 6, and SlARF2a were obtained by PCR amplification (Supplementary Table S2). ARF2a PCR products were used to generate pGBKT7- ARF2a t. IAA3, IAA9, SlTPL1 and SlTPL6 PCR products were used to generate pGADT7- IAA3, IAA9, SlTPL1 and SlTPL6, respectively. All constructs were verified by sequencing. Different pairs of pGBKT7-ARF and pGADT7- IAA3, IAA9, SlTPL1 and SlTPL6 vectors were co-transformed into the Y2HGold strain and selected on SD/-Leu/-Trp medium. The interactions between ARF2a and IAA3, IAA9, SlTPL1 and SlTPL6 were assayed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp selective medium using at least 10 independent colonies.

Papildoma informacija

How to cite this article : Xu, T. et al. SlARF2a plays a negative role in mediating axillary shoot formation. Mokslas. Rep. 6, 33728; doi: 10.1038/srep33728 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.