Lėtai besisukanti žemosios šoninės juostos hr-mas nmr spektroskopija: subtili biologinių mėginių analizė | mokslinės ataskaitos

Lėtai besisukanti žemosios šoninės juostos hr-mas nmr spektroskopija: subtili biologinių mėginių analizė | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Metabolomika
  • NMR spektroskopija

Anotacija

Didelės skiriamosios gebos maginio kampo besisukančio (HR-MAS) BMR spektroskopija tapo ypač universalia analitine priemone tiriant nevienalytes sistemas, pasižyminčias skysčio tipo dinamika. Tačiau norint gauti BMR spektrus, neturinčius besisukančių šoninių juostų, skiriamąją galią turi keletą kHz, o skiriamoji geba artima grynai izotropinių skysčių pavyzdžių spektrui. Svarbus metodo apribojimas yra didelės išcentrinės jėgos, kurios gali pakenkti mėginio struktūrai. Šiame pranešime mes parodome, kad optimizavus mėginio paruošimą, ypač vengiant oro burbuliukų, ir HR-MAS rotoriaus mėginio kameros geometrija lemia aukštos kokybės žemųjų šoninių juostų BMR spektrus net esant labai nedideliam sukimosi dažniui, tokiu būdu leidžiant nusistovėjusių tirpalo būsenos BMR procedūrų taikymas mažoms ir labai dinamiškoms molekulėms apibūdinti pažeidžiamiausiuose mėginiuose, tokiuose kaip gyvos ląstelės ir nepažeisti audiniai.

Įvadas

Didelės skiriamosios gebos maginio kampo besisukantys (HR-MAS) NMR dažniausiai naudojami atliekant daugelio didelio poveikio analizę, galbūt svarbiausius iš jų atliekant biopsijų ar gyvų organizmų tyrimus. Iš tikrųjų, nors heterogeniniai mėginiai paprastai nesudaro aukštos kokybės BMR spektrų, mėginio sukinio ryšys ir greita kai kurių mėginio sudedamųjų dalių dinamika leidžia šiuose mėginiuose gauti labai išskaidytus spektrus. HRMAS ypač tinka mėginiams, kuriuose vyraujantis išplėtimo mechanizmas yra dėl magnetinio jautrumo poveikio. Kita vertus, ši technika yra įprasta taikyti esant santykinai dideliam sukimosi greičiui (maždaug 4 kHz), nes eksperimentiniai spektrai, įgyti mažesniais sukimosi greičiais, yra veržiami besisukančiomis šoninėmis juostomis (SSB). Tai yra apgaulingi signalai, kurie dažnai priskiriami neišsamiam vidurkio magiško kampo besisukančio proceso metu, kai vyksta anisotropinės vidinės sąveikos (cheminė poslinkio anizotropija, dipolinės jungtys) arba magnetinių jautrių, susijusių su bet kokia nevienalytė medžiaga, pasiskirstymas. Buvo pasiūlyti kiti šoninių juostų buvimo mechanizmai, tačiau HRMAS reiškinys iš esmės viršija numatytas vertes. Biologiniams mėginiams nerekomenduojama naudoti didelių sukimosi dažnių, nes susijusios išcentrinės jėgos gali sutrikdyti biologinį aktyvumą, net ir išlaikant mėginio morfologiją. Dėl šios priežasties HRMAS dažniausiai buvo atliekamas esant vidutinio sunkumo magnetiniams laukams (paprastai nuo 400 iki 600 MHz), nes esant didesniam magnetiniam laukui reikia didesnio sukimosi greičio.

Čia mes eksperimentuojame su skirtingais veiksniais, lemiančiais intensyvaus SSB atsiradimą lėtuose HR-MAS BMR spektruose, ir pateikiame protokolą, kad gautume aukštos kokybės daugialypius HR-MAS NMR spektrus heterogeninėse sistemose, tokiose kaip nepažeisti audiniai, esant labai vidutinio sunkumo sukimosi greitis. HR-MAS BMR spektroskopija tapo pamatiniu analizės metodu daugelyje disciplinų, įskaitant medžiagų mokslą, kombinatorinę chemiją, maisto mokslus ir biomedicininius tyrimus iš dalies imobilizuotų molekulių tyrimui ne kietoje ir nevienalytėje aplinkoje 1 . Nors šios molekulės paprastai yra pakankamai judrios, kad labai padidėtų branduolinės anizotropinės sąveikos, stebuklingojo kampo sukinimas (MAS) yra naudojamas kaip linijos susiaurinimo būdas, sumažinantis nehomogeninių junginių tūrinių magnetinių jautrių pasiskirstymo padarinius. Apskritai, MAS dažnis turi būti didelis, palyginti su linijos išplėtimu, kad būtų išvengta SSB pasireiškimo spektruose 2, 3, 4 . Heterogeninėms sistemoms, kuriose nėra stiprių magnetinių centrų, linijos praplečiama turėtų būti apie kelis šimtus Hz. Praktiškai norint gauti aukštos skiriamosios gebos SSB neturinčius 1 H HR-MAS NMR (apie 2, 5–4 kHz, kai naudojamas 400 MHz spektrometras), 5–7, 7, įskaitant signalus iš skystųjų pavyzdys. Tačiau daugelis bandinių reikalauja subtilesnių eksperimentinių sąlygų ir negali ištverti išcentrinių jėgų, sukeltų HR-MAS eksperimentų metu 8, 9, 10 . Šiame kontekste ypač svarbu gebėjimas generuoti aukštos kokybės daugialypius BMR spektrus žemu MAS dažniu (ty mažesniu kaip 1 kHz 10 ). Iš tikrųjų jautrus HR-MAS BMR taikymo aspektas yra galimybė tiksliai apibūdinti biocheminius junginius ir metabolinius profilius gyvuose ląstelėse, nepažeistuose audiniuose ar biopsijose 11, 12 . Šis supratimas paskatino nemažai pastangų plėtoti lėtus HR-MAS BMR eksperimentus, apimančius efektyvias SSB slopinimo schemas 13, 14, 15 . Tačiau pastarųjų perkėlimas į klasikinius daugialypius tirpalo būsenos BMR eksperimentus (pvz., TOCSY, HSQC) audinių atveju yra gana paprastas ir neįrodytas 16, 17, 18, 19, 20, 21 . Siekdami supaprastinto lėtai besisukančio HRMAS protokolo, mes ištyrėme mažesnių mėginių tūrių naudojimą ir visiško mėginių kameros užpildymo įtaką („nėra oro burbuliukų“). Tikimasi, kad tai sumažins jautrumo sukeltą SSB intensyvumą esant mažam sukimosi greičiui. Atkreipkite dėmesį, kad nors anksčiau buvo pasiūlyta galimybė naudoti mažesnes kameras biopsijų HRMAS, naudojant komerciškai prieinamą medžiagą 11, 22, jokio poveikio SSB intensyvumui nebuvo aprašyta, tik izotropinių smailių linijų pločiui.

Rezultatai

Pirmasis ištirtas mėginys buvo 50 mM fenilalanino tirpalas 100% D 2 O, užfiksuotas esant 298 K temperatūrai. Greitas ir izotropinis molekulių sulipimas esant 298 K temperatūrai garantuoja, kad neišnyks jokia anizotropinė BMR sąveika. Todėl tirpalo SSB buvimas turi priklausyti nuo skysčio izotropinio pobūdžio sutrikimo dėl oro burbuliukų ir (arba) nuo ritės radijo dažnio lauko nehomogeniškumo 23 . Be to, buvo pasiūlyta įvesti šonines juostas dėl rotoriaus sukamojo magiško kampo sukimosi metu 24 .

Norint ištirti galimą pirmojo efekto poveikį, buvo užfiksuota 1D1H HRMAS spektro serija dviem preparatais, kuriuose aptiktas tūris buvo visiškai arba iš dalies užimtas tirpalo. Ši sąranka atkartoja labiausiai klasikinį nehomogeninės sistemos vadovėlį, atsižvelgiant į jos magnetinį jautrumą. Šis poveikis buvo išsamiai ištirtas atliekant MRT ir gali paskatinti liniją išplėsti keletą šimtų Hz 25, 26, 27 . 1A pav. Parodyta, kad tirpalo HRMAS spektre yra didelis SSB, užfiksuotas 1 kHz sukimosi dažniu, kai yra „oro burbuliukai“, tuo tarpu SSB nenustatoma, jei skysčio visiškai užima tūris (1B paveikslas). Tai vienareikšmiškai parodo, kad nepilnas aptikto tūrio užpildymas gali sukelti didelį kiekį SSB skysčiuose esant nedideliam sukimosi greičiui. Be to, mes pastebėjome, kad magnetinio jautrumo išplėtimas yra didesnis nei tikėtasi, nes SSB vis dar yra didesnis nei 1 kHz greitis. Tai gali atsitikti dėl burbulų išsidėstymo, ypač esant mažam sukimosi greičiui 28, ir (arba) dėl radialinio B 1 lauko kitimo 23, 29 . Iš tikrųjų vaizdiniai eksperimentai, atlikti išilgai besisukančios ašies, patvirtina, kad mėginyje nėra tuštumos (1A pav., Intarpai), tačiau norint tiksliai nuskaičiuoti atitinkamo spektro plotį 30, 31, reikia tikslios burbuliukų pasiskirstymo ir dinamikos vertės . Didesnių kamerų tūriams (50 μl) esant oro burbuliukams, taip pat buvo pasiektas šoninių juostų spektras, nesant oro burbuliukų (1 papildomas paveikslas), pateikiantys papildomą šio faktoriaus, kaip dominuojančio elemento kuriant SSB, įrodymą. Įvertinę nepilno rotoriaus užpildymo vaidmenį indukuojant šonines juostas izotropiniuose mėginiuose, nagrinėjome HRMAS BMR biopsijų spektroskopiją. Tai yra viena iš svarbiausių analitinių problemų, susijusių su HRMAS NMR, ir ji būdinga kitiems biologiniams bandiniams, atsižvelgiant į struktūrinį nevienalytiškumą. 2 paveiksle pateikiami vandenyje prisotinti 1D1H HR-MAS BMR spektrai, gauti kepenų audinyje esant 280 K ir esant MAS dažniams 150, 500 ir 4000 Hz, naudojant 4 mm rotorių su KelF intarpu, siekiant apriboti mėginio tūrį, bet su dviem šiek tiek skirtingomis geometrijomis. Pirmajame iš šių dviejų nepriklausomų preparatų kamera yra beveik sferinė, jos tūris yra 12 μl, o kitu atveju intarpas buvo pastatytas šiek tiek aukštesnėje padėtyje, kad būtų gautas šiek tiek didesnis tūris su nesferine forma. Abiems rotoriams kamera buvo kruopščiai užpildyta, kad nesusidarytų oro burbuliukai. Esant 4000 Hz dažniui, abu atitinkami HRMAS spektrai rodo plačių signalų, gautų iš makromolekulių ir komponentų su ribotais molekuliniais judesiais, apvalkalą ant gerai išskaidytų smailių iš mažų molekulių, pasižyminčių greitu ir izotropiniu mobilumu. Esant žemesniems MAS dažniams, 2A pav. Parodyta, kad nemažas šoninių juostų skaičius išgyveno 500 Hz dažniu, kai HRMAS rotorius naudojamas didesnėje kameroje. Esant 150 Hz, būdingas 1H BMR spektro vaizdas tampa nesuprantamas. Atkreipkite dėmesį, kad esant audiniui, vanduo nėra izotropinėje aplinkoje, todėl jo signalas gali pateikti SSB žemiau slenkstinės verpimo vertės. Antrosios kameros geometrijai atvirkščiai, tiek SSB skaičius, tiek dydis yra žymiai sumažintas (2B paveikslas). Dėl oro burbuliukų padidėja didesnių kamerų SSB skaičius (2 papildomas paveikslas), o tai rodo, kad mėginio magnetinio jautrumo pasiskirstymas turi didelę reikšmę SSB, stebimo labai mažu sukimosi greičiu (pradedant maždaug 300–300). 500 Hz). Įvertinę tai, mes ištyrėme, ar labai mažu sukimosi greičiu būtų galima gauti aukštos kokybės dvimatį hetero- ir homo-branduolinį HR-MAS BMR koreliacijos spektrą. 3 paveiksle parodyti 2D1H-13C HSQC ir 1H - 1H TOCSY HR-MAS BMR spektrai, užregistruoti esant 280 K ir 500 Hz MAS dažniui. Apskritai, abu spektrai rodo spektrinę skiriamąją gebą ir jautrumą, lygiavertį tiems, kurie paprastai gaunami esant 32 k3 4 kHz sukimosi dažniui, tačiau išcentrinės jėgos sumažėja maždaug dviem didumo laipsniais. Vienareikšmis 1H ir 13 C rezonansų priskyrimas iš įvairių metabolitų buvo gautas identifikuojant būdingus spin-spin junginius iš aminorūgščių, sacharidų ir lipidų. Išsamiai ištyrę TOCSY spektrą, mes nustatėme papildomas koreliacijas, susijusias su 1H vandens rezonansu ir dviem netipiniais mažo intensyvumo kryžminiais pjūviais, atitinkančiais likusį SSB iš cholino ir glicerofosfocholino intensyvių metilo signalų. Nors norint gauti pakankamai didelę mūsų duomenų skiriamąją gebą, reikėjo 20–30 valandų BMR gavimo laiko, dabar galima numatyti nevienodų mėginių ėmimo metodų naudojimą, siekiant sumažinti gavimo laiką. Šios trukmės yra palyginamos su panašios kokybės spektrais, gautais esant greitesniam sukimosi greičiui 34 . Apibendrinant galima pasakyti, kad šie rezultatai sudaro kelią metabolizuotoms nepažeistoms ląstelėms ir audiniams, esantiems fiziologinėse sąlygose ir atliekant eksperimentinius parametrus, kurie iš esmės sumažina mėginio pakeitimo riziką.

Image

Spektrai buvo gauti naudojant 4 mm HRMAS rotorių su 12 μl KelF intarpu, pilnai užpildytu (B) arba iš dalies (A), užpildytu tirpalu. Įdėklai yra vaizdai išilgai sukimosi krypties.

Visas dydis

Image

Žvaigždutės rodo SSB vietą iš gerai apibūdintų izotropinių smailių.

Visas dydis

Image

Nurodomi svarbiausių metabolitų (acetis, acetatas, Ala, alaninas; Asn, asparaginas, Asp, aspartatas, Cho, cholinas; α / β-Glc, α / β-D-gliukozė, Glu, glutamatas, GPC, NMR) priskyrimai NMR. glicerofosfocholinas; Gly, glicinas, Ile, izoleucinas; Lac, laktatas; Leu, leucinas; Lys, lizinas; Thr, treoninas; Val, valinas). Vandens ir cholino 1 H dažniai yra nurodyti rodyklėmis spektro viršuje ir pažymėti punktyrinėmis linijomis. Simbolis # žymi sulankstytas kryžmines viršūnes. Žvaigždutės rodo likusį SSB, kurį sukelia intensyvus cholino ir GPC signalai, esant atitinkamai 3, 21 ir 3, 23 ppm. HSQC ir TOCSY spektrai buvo užregistruoti atitinkamai per 26 ir 30 valandų.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų rezultatai rodo, kad labai dinamiškų molekulių HR-MAS BMR spektrų kokybė tiek gryname tirpale, tiek heterogeniškoje aplinkoje, esant žemiems MAS dažniams, labai priklauso nuo rotoriaus konfigūracijos. Visų pirma parodyta, kad SSB buvimas ir intensyvumas labai priklauso nuo veiksnių, susijusių su mėginio paruošimu (mėginio padėtis ir forma, oro burbuliukų buvimas). Tokie stebėjimai reikalauja tolesnių tyrimų ir išsamios mėginių kameros geometrijos analizės, siekiant suprojektuoti optimalias HR-MAS rotorių sistemas, kurios galėtų efektyviai pašalinti arba kompensuoti radijo dažnio lauko nevienalytiškumą ir magnetinio jautrumo poveikį išlaikant aukštą signalo ir triukšmo santykį. Nepaisant to, įmanoma iš esmės atsverti šiuos efektus, ribojant mėginio kamerą iki nedidelio tūrio ritės centre su įdėklu, esančiu rotoriaus viršuje. Taikant šią procedūrą, drastiškai sumažinamas SSB skaičius ir dydis, o aukšto lygio NMR spektrai gali būti gaunami esant saikingam MAS dažniui, tokiu būdu atveriant naujas galimybes apibūdinti trapių mėginių biocheminius komponentus gerai nustatytomis procedūromis. Tiksliau, mes parodėme pirmąją klasikinę daugialypių BMR spektrų (HSQC, TOCSY) serijas pagal nepažeisto audinio HR-MAS labai vidutiniu verpimo dažniu. Įdomus dalykas yra tai, kad TOCSY eksperimentas yra linkęs trukdyti MAS vidurkiui, kai sukimosi dažnis yra artimas nugaros užrakto RF lauko amplitudės 35 . Ši sąlyga privalo atsipalaiduoti lėtam sukimui, nes naudojami du laiko intervalai, kai naudojami kelių šimtų Hz dažnių MAS dažnio dažniai.

Metodai

Mėginio paruošimas

50 mM fenilalanino tirpalas, paruoštas ištirpinus 4, 2 mg aminorūgšties miltelių (Sigma Aldrich) 500 μl D 2 O, buvo įpiltas į 4 mm cirkonio HR-MAS rotorių (Bruker BioSpin), kuriame yra arba 12- μl arba 50 μl KelF įdėklai. Maždaug 23 miligramai audinio buvo pašalinami iš telyčios kepenų, keletą kartų plaunami D 2 O, kad būtų pašalintas likęs kraujas ir užtikrintas užrakto dažnis, o po to perkeliami 4 mm cirkonio HR-MAS rotoriuje, turinčiame 12 μl KelF intarpų. Mėginiai be oro burbuliukų buvo paruošti naudojant tirpiklio perteklių, kuris lėtai ir atsargiai pašalinamas dedant viršutinį įdėklą. Tada rotorius buvo įterptas į HR-MAS zondą ir tuoj pat buvo atlikta 1 H ir 13 C HR-MAS spektroskopija.

Duomenų kaupimas ir analizė

HR-MAS spektrai buvo užfiksuoti Bruker Avance III 400 spektrometru, veikiančiu protonų Larmor dažniu 400, 36 MHz ir turinčiu 4 mm dvigubo rezonanso ( 1 H, 13 C) gradiento HR-MAS zondą. Visi BMR eksperimentai buvo atlikti nuo 150 iki 4000 Hz MAS dažnių. Sukimosi greitis buvo kontroliuojamas naudojant komercinį automatinį lėtojo MAS II greičio reguliatorių, kurio dažnio stabilumas yra geresnis nei +/− 3 Hz. NMR eksperimentai, atlikti su fenilalanino tirpalu, buvo atlikti kambario temperatūroje, tuo tarpu kepenų audinyje mėginio temperatūra buvo reguliuojama 7 ° C temperatūroje, atšaldant guolio orą, tekantį „Bruker II“ aušinimo bloku (Xtreme). Kiekvienam bandiniui buvo atlikti vieno matmens vandens prisotintų protonų spektrai, naudojant spektro plotį 20 ppm, 16 K taškų, 32 nuskaitymus, relaksacijos delsą 2 sek. Ir gavimo laiką 1 sek. FID buvo padauginta iš eksponentinės svėrimo funkcijos, atitinkančios linijos išplėtimą 3 Hz prieš Furjė transformaciją. Visi 1D spektrai buvo apdoroti naudojant automatines pradinės padėties korekcijos procedūras. Dvimatių homonuklearinių ir heteronuklearinių HR-MAS koreliacijos eksperimentų metu mes įvertinome signalo stabilumą laikui bėgant, registruodami tarpsluoksniuotu vandeniu prisotintus 1D protonų įsisavinimus, naudodami aukščiau aprašytus parametrus. 2D1H-1H TOCSY spektras buvo gautas naudojant DIPSI2 impulsų seką iš „Bruker“ / „Topspin 3.0“ bibliotekos ir šiuos gavimo parametrus: 232 ms gavimo laikas, 70 ms DIPSI2 maišymo laikas, 11, 0 ppm 1 H spektrinis plotis ir a. 3, 0 sek. Atpalaidavimo delsimas. Du identiški eksperimentai buvo nuosekliai užfiksuoti, naudojant 64 nuskaitymus kiekvienam iš 256 žingsnių per t 1 , tai atitinka bendrą kiekvieno eksperimento gavimo laiką 15 h. Du duomenų rinkiniai buvo visiškai identiški ir tokiu būdu pridedami, nulis užpildytas 2 k × 1 k matrica ir pasvertas pasislinkusio kvadrato formos sinuso signalo funkcija prieš atliekant Furjė transformaciją. Panašiai buvo gautas dviejų identiškų 2D 1 H- 13 C HSQC eksperimentų rinkinys, naudojant echo-antiecho gradiento parinkimą fazėms jautriam aptikimui, naudojant 96 ms gavimo laiką su GARP 13 C atsiejimu 3, 3 kHz galios lygiu ir 2, 0 sek. Relaksacijos delsą. . Buvo naudojami du 1 ms sinuso formos gradiento impulsai, kurių stipris 42, 8 G / cm ir 10, 75 G / cm. Iš viso buvo atliktas 512 nuskaitymų vidurkis kiekvienam iš 42 t 1 žingsnių, o tai atitinka bendrą eksperimento gavimo laiką - 13 h. Vėliau du duomenų rinkiniai buvo pridėti, nulio užpildyti 2 k × 512 matrica ir pasverti pasislinkusio kvadrato formos sinuso signalo funkcija prieš Furjė transformaciją. Visi spektrai, gauti dėl kepenų audinio, buvo palyginti su cholino metilo1H ir 13C rezonanso reikšmėmis, atitinkamai nustatytomis ties 3, 20 ir 54, 1 ppm. Visi spektrai buvo apdoroti ir išanalizuoti naudojant „Topspin 3.0“ programinę įrangą (Bruker BioSpin).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    HRMAS spektrai didesnio tūrio fenilalanino tirpalo (50 μl) ir kepenų audinio (apie 16 μl) rotoriuje, pastarajame su oro burbulu ir be jo.

    Komentarai

    Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.