Maža molekulė slopino parathormono tarpininkaujamą stovyklos atsaką, jungdamasi n – galinius peptidus | mokslinės ataskaitos

Maža molekulė slopino parathormono tarpininkaujamą stovyklos atsaką, jungdamasi n – galinius peptidus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Narkotikų reguliavimas
  • Peptidai
  • Mažos molekulės

Anotacija

Ligando prisijungimas prie tam tikrų klasių G baltymų sujungtų receptorių (GPCR) skatina greitą cAMP sintezę per G baltymą. Žmogaus parathormonas (PTH), B klasės GPCR narys, jungiasi su savo receptoriais per savo N-galinį domeną, taip suaktyvindamas kelią į šį antrinį pasiuntinį ląstelių viduje. Šiuo metu GPCR yra daugelio vaistų taikinys, tačiau šie vaistai yra skirti tik mažai daliai struktūriškai žinomų GPCR. Koordinavimo kompleksai sulaukia susidomėjimo dėl jų plataus pritaikymo medicinos srityje. Šiuose tyrimuose mes ištyrėme Zn (II) ir antracenila-terpiridino koordinavimo komplekso, kaip parathormono atsako modifikatoriaus, galimybes. Preferencinė sąveika peptido hormono N-galo srityje pasireiškė slopintu cAMP generavimu ląstelių viduje. Šie stebėjimai prisideda prie dabartinės GPCR – cAMP paradigmos reguliavimo komponento, kai taikinys yra ne pats receptorius, o aktyvinantis hormonas. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita apie koordinavimo kompleksą, moduliuojantį GPCR veiklą jo agonisto išjungimo lygiu. Tokių molekulių sukūrimas gali padėti kontroliuoti patogeninę PTH funkciją, pavyzdžiui, hiperparatiroidizmą, kai iš esmės reikia kontroliuoti perteklinį hormonų aktyvumą.

Įvadas

Mišrių ligandų kompleksų naudojimas yra sparčiai auganti sritis, nes jie naudojami pramonėje, aplinkos ir medicinos srityse 1 . Jų taikymo sritis svyruoja nuo priešvėžinių 2, 3, 4, 5 iki antimikrobinių 3, 4, 6, 7 ir priešgrybelinių poveikių 3, 4, 8 . Normaliam biocheminių kelių funkcionavimui organizmuose pereiti metalų jonai yra pagrindiniai komponentai. Todėl nenuostabu, kad koordinavimo kompleksai kelia didelį susidomėjimą. Šie kompleksai pasižymi įvairiomis spektrinėmis ir elektrocheminėmis savybėmis, suderinamomis su chemijos derinimu, kurie vėliau suteikia didžiulę galimybę kurti naujas rūšis. Įvairių metalų jonų kompleksai yra intensyviai tiriami siekiant išryškinti jų galimybes medicininėje chemijoje 9, 10, 11 . Zn yra vienas iš labiausiai paplitusių metalų jonų, randamų biologinėse sistemose 12, 13, pvz., Atliekantis svarbų vaidmenį daugelyje transkripcijos veiksnių. Įvairios Zn (II) biologinės funkcijos atsiranda dėl jo redokso stabilumo ir koordinacijos chemijos kintamumo. Koordinaciniai junginiai, kurių pagrindiniai komponentai yra Zn, sulaukia didesnio susidomėjimo, nes jie parodo geresnį biologinį atsaką į užkrečiamus organizmus nei laisvieji metalai 2, 5, 6, 7, 8 . Pavyzdžiui, buvo tiriami Zn kompleksai, skirti indukuoti Akt pasroviui veikiančio efektoriaus glikogeno sintazės kinazės 3β fosforilinimą, ir buvo priskirti naudingi įrankiai gliukozės metabolizmo reguliavimui arba naudojami kaip pagrindinės struktūros kuriant antidiabetinius vaistus 14 . Kiti tyrimai parodė, kad slopinamas kaspazės-3 aktyvumas ir skatinamas ErbB1-ErbB2 heterodimerizavimas Cinko piritionu 15 ir nuo ciklino priklausomos kinazės CDK1 16 slopinimu. Kiti pavyzdžiai yra Zn kompleksai, pasižymintys antibakteriniu / antimikrobiniu, priešvėžiniu veikimu, sąveikaujantys su DNR ir sukeliantys baltymų agregaciją 2, 5, 6, 7, 8, 17 .

Šiuo metu ląstelių paviršiaus receptoriai, įskaitant GPCR, yra dažnai nukreipti į galimas vaisto molekules farmakologiniam pritaikymui 18, 19, 20, 21 . GPCR yra didžiausia žmogaus transmembraninių baltymų šeima ir vaidina svarbų vaidmenį atliekant įvairias fiziologines funkcijas, įskaitant ląstelių ir ląstelių ryšį, ląstelių diferenciaciją, metabolizmą ir sinapsių perdavimą. Įvairios signalizacijos molekulės, įskaitant hormonus, neurotransmiterius, chemokinus, jonus, skonius ir kvapiklius, jungiasi prie GPCR 22 ir aktyvuoja kelius į antrinius pasiuntinius, tokius kaip inozitolio trisfosfatas, diacilglicerolis, cGMP arba cAMP 23, 24, 25, 26 . Agonistai, tokie kaip PTH, su PTH susijęs peptidas arba tuberoinfundibular peptidas iš 39 liekanų (TIP39), sąveikauja su 1 ir 2 parathormono receptoriais (PTH1R / 2R), abiem B klasės GPCR nariais, ir aktyvuoja tarpląstelinį signalizavimą, savo ruožtu moduliuodami ląstelės funkciją, įskaitant skeleto, endokrininės, širdies ir kraujagyslių bei nervų sistemos 24, 27, 28, 29, 30 . Todėl PTH (1–34) ir PTH (1–84) taip pat naudojami kaip vaistai nuo osteoporozės 31, 32 .

PTH išskiria prieskydinė liauka kaip 84 liekanų peptidas ir reguliuoja kalcio ir fosfato kiekį kraujyje. Tačiau hiperparatiroidizmo atveju PTH lygis padidėja, o tai skatina kalcio išsiskyrimą į kraują. Šis kalcis yra paimamas iš kaulų, kuris vėliau sukelia kaulų nuovargį. Padidėjęs kalcio kiekis šlapime gali padidėti ir sukelti inkstų akmenis. Molekuliniame lygmenyje pagrindinis signalo perdavimas prasideda, kai PTH jungiasi prie savo receptorių, todėl jie suaktyvėja ir vėliau generuoja antrinius pasiuntinius 22, 24, 33 . PTH surišimą ir receptoriaus aktyvavimą vykdo 34 peptido N-galinė dalis. Tai reiškia, kad vienas galimas hormoninio aktyvumo reguliavimas gali būti ligando lygyje, ypač PTH N-galo srityje. Neseniai buvo pranešta, kad PTH N-terminis fosforilinimas Ser1, Ser3 ir Ser17 panaikino receptorių aktyvumą 24 .

Kadangi GPCR yra susiję su daugeliu ligų, jie yra skirti maždaug 40% visų šiuolaikinių žmonių vartojamų vaistinių preparatų 35, 36 . Tačiau šie vaistai yra skirti tik mažai daliai (apie 10%) žinomų GPCR 37 . Kalbant apie receptorius, įskaitant GPCR, paprastai turimos vaistų molekulės, skirtos farmakologiniam naudojimui, tiesiogiai nukreiptos į receptorius 18, 19, 20, 21 . Tačiau literatūra yra ribota molekulių, kurios jungiasi su agonistu, kad pakeistų jo receptorių aktyvinimo funkciją, atžvilgiu. Potenciali molekulių klasė šiam tikslui gali būti organiniai / koordinaciniai / mišriųjų ligandų kompleksai. Mišraus ligando kompleksuose vienas metalo jonas gali pakeisti kitą metalo joną, turintį pradinę skeleto sistemą. Metalo pakeitimas gali sukelti slopintą arba nereikšmingą biologinį atsaką 9 . Anksčiau mes sukūrėme antracenilterpiridino Cu (II) kompleksą, kuris parodė nukleazę ir antiprolifiracinį aktyvumą daugeliui vėžio ląstelių 9 . Iš esmės Zn (II) yra mažiau toksiškas nei Cu (II) ir yra redoksinis, todėl šis metalas buvo pasirinktas mainais į Cu (II). Be to, būtina įterpti metalą, nes antracenylterpiridinas yra netirpus vandenyje, jei nėra metalo. Zn (II) pakeitimas antracenilterpiridinu neparodė nukleazės ar antiproliferacinio aktyvumo 9 .

Šių tyrimų metu ZN (II) ir antracenilaterpiridino (1 pav.) 9 mišrus ligandas buvo naudojamas kaip PTH atsako moduliatorius tiesiogiai nukreipiant į agonistą. Mes nustatėme, kad Zn kompleksas jungia PTH su mikromoliniu afinitetu, nesukeldamas didelių peptido hormono konformacinių pokyčių. BMR spektroskopija atskleidė, kad Zn kompleksas pirmiausia jungiasi su PTH N-galiniu domenu, kuris yra svarbus receptorių prisijungimui ir aktyvacijai. Priskiriame specifines hidrofobines PTH ir Zn komplekso sąsajas. Intraląstelinis signalizacijos testas atskleidė, kad sąveikos N-galo srityje sukėlė antrinės kurjerio cAMP generacijos auginamoje ląstelėje slopinimą. Taigi metalų mišrus ligandų kompleksas suteikia papildomą reguliavimo komponentą specifiniam agonisto slopinimui GPCR aktyvacijai.

Image

Visas dydis

Rezultatai

Ryšys atskleistas fluorescencine spektroskopija

Natūralią parathormono formą sudaro 84 liekanos, tačiau PTH (1–34) pakanka receptoriams suaktyvinti 38 . PTH 23 padėtyje yra vienas triptofano liekana. Taigi jis gali būti naudojamas kaip labai jautrus fluorescencinis zondas ligando surišimo analizei fluorescencijos spektroskopijos būdu. PTH sudaro struktūriniai skyriai, daugiausia iš 1–37 pozicijų, o C – galo dalis iš esmės nestruktūrizuota 39, 40 . Kai sužadintas esant 280 nm bangos ilgiui, PTH parodė vidinės fluorescencijos emisijos maksimumą, nukreiptą ties 348 nm, o tai būdinga tirpikliui veikiamam Trp, kurį palaiko NMR struktūra. Norint nustatyti surišimą, buvo atliktas titravimo eksperimentas, kuriame PTH (1–34) koncentracija buvo palaikoma pastovi, o Zn komplekso koncentracija kinta. Didėjant Zn komplekso koncentracijai, buvo pastebėtas netiesinis fluorescencijos intensyvumo sumažėjimas, kas rodo triptofano fluorescencijos užgesimą Zn komplekso sujungimo metu.

Fluorescencinis gesinimo elgesys buvo analizuojamas pagal lygtį, pateiktą eksperimentiniame skyriuje. Duomenys parodė eksponentinį irimą kaip Zn komplekso funkciją (2a pav. Ir S1 pav.). Duomenų pritaikymas davė KD reikšmę kaip 27 ± 1, 8 μM, rodančią vidutinį Zn komplekso surišimo afinitetą su PTH (1–34) ir stechiometriją - 1, 9 (surišimo vietų skaičius su vienoda afinitete). Siekiant įvertinti PTH sąveiką C-galinėje dalyje ir jos vaidmenį jungiantis, buvo paimtas viso ilgio PTH (1–84) ir nustatytas jo surišimas. Panašiai kaip PTH (1–34), PTH (1–84) taip pat parodė fluorescencijos intensyvumo sumažėjimą kaip Zn komplekso koncentracijos funkciją. Dėl to KD vertė buvo 34 ± 1, 7 μM, o stechiometrija - 2, 0. Taigi, Zn kompleksas parodė beveik tą patį afinitetą PTH (1–34) ir PTH (1–84) ir abu peptidiniai hormonai sąveikauja su dviem Zn komplekso molekulėmis. Iki 200 μM esantis Zn – perchloratas reikšmingų fluorescencijos intensyvumo pokyčių neparodė (S1 pav.). Antrame kontroliniame eksperimente 9-antracenemetanolis buvo titruojamas prieš PTH (1–84), kuris parodė reikšmingai silpną afinitetą ( K D = 3, 52 ± 0, 38 mM), palyginti su Zn kompleksu (S2 pav.). Tai pabrėžia svarbų organinio skeleto ir metalo jonų vaidmenį užtikrinant veiksmingą surišimą už neapibrėžtos hidrofobinės sąveikos.

Image

a ) Santykinis fluorescencijos intensyvumo grafikas ir geriausiai tinka (raudonos linijos) pagal ■ - PTH (1–34) lygtį ir

Image
- PTH (1–84). b ) CF 50 μM (Zn komplekso koncentracija reikalinga 50% fluorescencijos gesinimui) grafikas.

Visas dydis

Atidžiau išanalizavus fluorescencijos duomenis, nustatyta, kad PTH (1–34) ir PTH (1–84) gesinimo elgesys skiriasi nežymiai. Duomenys buvo toliau analizuojami remiantis santykinio intensyvumo diagrama (2a pav.). PTH (1–84) diagrama rodo apie 75% sumažėjusį intensyvumą titravimo pabaigoje (76 μM Zn komplekso), PTH (1–34) toje pačioje koncentracijoje ji buvo ~ 86%. Šis elgesys gali būti suprantamas iš Zn komplekso koncentracijos, reikalingos 50% fluorescencijos intensyvumui numalšinti (CF 50 ) 41 . PTH (1–34) CF50 buvo 21, 46 ± 0, 5 μM, o PTH (1–84) - 31, 8 ± 0, 8 μM (2b pav.). Šios analizės patvirtina, kad Zn kompleksas panašiai jungiasi su PTH (1–34) ir PTH (1–84), nors sąveikos skirtumai yra nereikšmingi.

Įrišimas atskleistas CD spektroskopijos būdu

Galimi PTH (1–34) arba PTH (1–84) sukeliami peptidų antrinės struktūros pokyčiai, jungiant Zn kompleksą, gali būti parodyti žiedinės dichroizmo (CD) spektroskopijos būdu. PTH (1–34) 42 ir PTH (1–84) 43 CD spektras rodė minimumus, esant 222 nm, būdingus α spiralės turiniui. Ryškus minimumas esant 202 nm bangos ilgiui priskiriamas nestruktūrizuotoms sritims peptido C-gale, dominuojančioje tolimojo UV CD spektre. Zn komplekso jungimasis su PTH (1–34) ar PTH (1–84) neparodė reikšmingų CD spektro pokyčių ir todėl jokių antrinių peptidų struktūrinių pokyčių nebuvo (3a pav. Ir S3 pav.).

Image

a ) CDTH PTH (1–34), titruojant Zn kompleksu (nuo 10 μM iki 50 μM). Juodasis spektras atitinka laisvąjį PTH (1–34). Spektrų, viršijančių 215 nm, nebuvo galima užregistruoti dėl didelės absorbcijos pridedant Zn komplekso ( b ) ITC profilį ir geriausiai tinkančio Zn komplekso sąveiką su PTH (1–34). Viršuje: neapdoroti duomenys, gauti iš Zn komplekso injekcijų į PTH (1–34) tirpalą. Apatinė dalis rodo integruotą kreivę, parodančią eksperimentinius taškus (■) ir geriausiai tinkančius (-).

Visas dydis

Termodinamika rišimo atliekant ITC tyrimus

ITC yra tinkamas metodas baltymų ir ligandų sąveikai įvertinti 41, 44 . ITC 25 ° C temperatūroje įvertino Zn komplekso sąveiką su PTH (1–34) ir PTH (1–84). Abiejų peptidų pririšimas prie Zn komplekso buvo egzoterminio pobūdžio (3b pav. Ir S4 pav.). Duomenų pritaikymas davė n reikšmes atitinkamai 2, 28 ± 0, 13 ir 1, 93 ± 0, 04 PTH (1–34) ir PTH (1–84). Tai rodo mažiausiai dvi Zn komplekso molekules, sąveikaujančias su peptidais. Izoterma gauna šiuos termodinaminius parametrus: ( K D = 55, 06 ± 0, 06 μM, ∆H = −5, 9 ± 0, 1 kcal mol −1 ir ∆S = −5, 37 cal mol −1 K −1 ) ir ( K D = 54, 1 ± 0, 08 μM, ∆H −11, 25 ± 0, 3 kcal mol −1 ir ∆S = −7, 15 cal mol −1 K −1 ) atitinkamai PTH (1–34) ir PTH (1–84). Disociacijos konstanta mažame mikromolių diapazone ir neigiama ∆H rodo, kad Zn kompleksas sąveikauja su peptido hormonais per gana silpną sąveiką. Entalpinis pelnas atsveria nepalankią sistemos entropijos praradimą, kai sudėtinga jungtis.

NMR titravimas Zn kompleksu su 15 N – PTH (1–34) ir 15 N – PTH (1–84)

BMR spektroskopija yra tinkamas metodas tikslioms surišimo vietoms ir konformaciniams bei (arba) dinaminiams pokyčiams ištirti, kai baltymo ir ligando sąveika tirpale yra 24, 45, 46 . Todėl buvo atlikti 15N – PTH (1–34) ir 15 N – PTH (1–84) BMR titravimo eksperimentai su Zn kompleksu. Užfiksuotas 15 N – HSQC eksperimentas nustato tik 15 N – PTH (1–34) arba 15 N – PTH (1–84) amidus ir slopina visus Zn komplekso rezonansus. Palyginus 15 N – PTH (1–34) laisvosios (juodos) ir surištosios (raudonos) būsenos (4 pav.) Spektrus, paaiškėjo atskirų likučių cheminių poslinkių ir linijų pločio skirtumai. Daugelis rezonansų buvo išplėsti už aptikimo ribų, galbūt dėl ​​vidutinių keitimo kursų BMR cheminio poslinkio laiko skalėje tarp laisvojo ir surištojo PTH. Kiti likučiai keičia savo cheminio poslinkio reikšmes. Įdomu pastebėti, kad beveik visi likučiai rodė kryžminio smailės intensyvumo ir (arba) cheminio poslinkio pokyčius. Tai reiškia, kad visa PTH (1–34) peptidų seka dalyvauja jungiantis su Zn kompleksu.

Image

Pridedami 2 N 1 H– 15 N HSQC spektrai laisvoje būsenoje (juoda) 15 N PTH (1–34) ir surišti su Zn kompleksu (raudona).

Visas dydis

Preferencinis surišimas atliekant liekanų lygio tyrimą buvo toliau tiriamas pasirenkant viso ilgio 15 N PTH (1–84), kad būtų nustatyta, ar C – galo sritis yra susijusi su Zn komplekso sąveika. Bendroji analizė parodė, kad Zn kompleksas jungiasi su N-galo likučiais (5a pav.). Titravimo pabaigoje keli likučiai parodė sumažėjusį BMR intensyvumą. Visų pirma, V2, Q6, M8, H9, N10, L11, G12, H14, L15, N16, E19, W23, L24, R25, Q29, D30, H32, N33, F34, V35 ir H63 liekanų natūralieji rezonansai buvo beveik visiškai trūksta Zn komplekso. Kaip kontrolė, 200 μM Zn-perchlorato pridėjimas prie PTH (1–84) neparodė reikšmingų BMR kryžminių smailių pokyčių (S5 pav.). Šie duomenys buvo įvertinti kiekybiškai, palyginant kiekvieno atskiro PTH (1–84) / Zn komplekso kryžiaus smailių intensyvumą su PTH (1–84), kai nėra Zn komplekso (5b pav.). Šie BMR spektrai rodo, kad PTH N-galinis domenas (1–84) jungiasi su Zn kompleksu, tuo tarpu C-galo dalis yra veikiama tirpiklio ir pakankamai lanksti, kad būtų galima pastebėti rezonansus. Įdomu pastebėti, kad aromatiniai liekanos (W23, F34) ir visi histidinai (H9, H14, H32 ir H63) bei jų hidrofobinės gretimos liekanos yra NMR intensyvumo sumažėjimo, pridedant Zn kompleksą, taškai, kurie rodo, kad jų šoninės grandinės palengvina surišimą. . Histidinas 63 yra vienintelė išimtis PTH (1–84) C – galinėje dalyje, apimančioje sudėtingą formavimąsi. Kontroliniame NMR titravimo eksperimente 9-antracenemetanolio sąveika su PTH (1–84) nerodė jokio specifinio likučio BMR intensyvumo sumažėjimo, taigi buvo nustatyta, kad nespecifinė hidrofobinė PTH peptido sąveika (S6 pav.).

Image

a ) 2D1H– 15 N HSQC laisvosios būsenos (juoda) 15 N PTH (1–84) spektras yra perdengtas ir sujungtas su Zn kompleksu (raudona). ( b ) Likučio santykinis 15N PTH (1–84) NMR intensyvumo diagrama, sujungtoje būsenoje su Zn kompleksu, palyginti su laisvu 15 N PTH (1–84). Likučiai, prarasti> 80% intensyvumo, pažymėti raudonai, 50–20% nuostoliai nurodomi žalsvai mėlynoje spalvoje, o mėlynos spalvos reikšmingų pokyčių nėra. PTH (1–84) struktūra (1–39 liekanų struktūra, PDB: 1BWX) 63 rodoma virš intensyvumo diagramos. 40, 43 ir 51 padėtyse pailginamiesiems strypai neteikiami.

Visas dydis

BMR duomenys aiškiai parodė, kad Zn kompleksas jungiasi geriau prie peptido hormono N-galo srities, nepriklausomai nuo peptido ilgio. Tai galbūt paaiškino surišimo elgesį, stebimą fluorescencijos spektroskopijos ir ITC metodais, kurie davė beveik identišką afinitetą. Papildomos Zn kompleksinės V35 – A42 ir S62 – H63 sąveikos PTH (1–84), palyginti su PTH (1–34), neturi reikšmingos įtakos stebėtoms KD reikšmėms.

CAMP kelio slopinimas

Fluorescencijos spektroskopija ir ITC atskleidė Zn komplekso jungimąsi su PTH (1–34) ir PTH (1–84). BMR spektroskopija nustatė, kad Zn kompleksas sąveikauja su peptido hormono N-galine dalimi. Ryšio sritis iš PTH liekanų 1–37 (84) liekanų (84) yra svarbi atpažinimui, sąveikai su tarpląstelinėmis kilpomis ir receptoriaus membranos spiralėmis ir suaktyvina vėlesnius. Yra du pagrindiniai signalo perdavimo moduliai, apimantys su G baltymu sujungtus receptorius: cAMP signalo kelias ir fosfatidilinozitolio signalo kelias 47 . Parathormonas yra susijęs su CAMP keliu jo biologiniam reguliavimui. Kadangi Zn komplekso surišimas buvo NTH galinėje dalyje, įdomu ištirti cAMP atsaką į jo receptorius, esant Zn kompleksui. Todėl PTH (1–34) ir PTH (1–84) sukeltas cAMP kaupimasis buvo matuojamas stabiliose HEK 293 ląstelių linijose, ekspresuojančiose rekombinantinį PTH1R 33 . CAMP kartos tyrimas buvo atliktas priklausomai nuo Zn koncentracijos, išlaikant pastovias ląstelių ir peptido hormonų koncentracijas. PTH atsakas be Zn komplekso buvo laikomas 100% cAMP atsaku. Peptidiniai hormonai buvo veikiami Zn kompleksu 15 minučių, kad būtų galima susidaryti kompleksui, o po to buvo tiriama cAMP generacija. Pastebėtas 50% sumažėjęs aktyvumas, kai 2 μM Zn komplekso, ir visiškas cAMP atsako slopinimas pastebėtas esant ~ 20 μM abiem peptidams (6 pav.). Šie rezultatai patvirtina, kad Zn komplekso jungimasis N-galo srityje sukėlė peptidinių hormonų inaktyvaciją.

Image

Prieš pridedant ląsteles, Zn kompleksas buvo inkubuotas su peptidiniais hormonais. Viršutiniame skydelyje rodomas PTH (1–34) atsakas, o apatiniame skydelyje - PTH (1–84). Klaidų juostos pateikia trijų nepriklausomų eksperimentinių bandymų vidurkį trimis egzemplioriais.

Visas dydis

Taip pat buvo analizuojama cAMP karta, siekiant nustatyti Zn komplekso poveikį pačiam receptoriui. Čia Zn kompleksas buvo iš anksto inkubuotas su ląstelėmis, po to pridedant PTH (1–84). Šis eksperimentas neparodė reikšmingo cAMP kartos slopinimo ląstelių viduje (juodos juostos S7 pav.). Tiesioginė Zn komplekso sąveika su PTH 1 receptoriaus (nECD) N-galo tarpląsteliniu domenu buvo toliau analizuojama fluorescencijos spektroskopijos metodu, kur jis parodė reikšmingai silpną afinitetą (KD = 3, 05 ± 0, 2 mM) (S8 pav.). Kitame kontroliniame eksperimente taip pat buvo tiriama cAMP generacija inkubuojant 9-antracenemetanolį su peptidu (S9 pav.) Arba tiesiogiai su ląstelėmis (pilkos juostos S7 paveiksle). Abiem atvejais reikšmingo tarpląstelinės cAMP kartos slopinimo nepastebėta. Be to, nepastebėta cAMP atsako slopinimo ar ląstelių toksiškumo iki 100 μM Zn-perchlorato (S10 pav.).

Diskusija

Čia pateikiame išsamią antracecililterpiridino Zn (II) komplekso sąveikos su žmogaus peptidiniais hormonais PTH (1–34) ir PTH (1–84) analizę ir jo moduliacinį atsaką į jų PTH1 receptorius. Fluorescencijos ir ITC tyrimai parodė, kad bent dvi šio Zn komplekso molekulės jungiasi PTH N-gale. Pririšimas keliose vietose yra dažnas reiškinys mažiems ligandams, sąveikaujantiems su tiksliniais baltymais. Pavyzdžiui, BMR spektroskopinė analizė parodė, kad du c – Myc – Max komplekso inhibitoriai, 10058 – F4 ir 10074 – G5, jungiasi prie kelių monomerinio c – Myc bHLHZip domeno sričių, kad slopintų sąveiką tarp rišančių partnerių 48 . Kiti pavyzdžiai yra epigallochatechingalato (EGCG) jungimasis su polipeptidais, įskaitant α-sinukleiną ir amiloidą β, tokiu būdu nukreipiant sistemas į netoksiškus baltymų agregatus 49, 50 arba EGCG slopinant PTH (1–84) fibrilių augimą 46 . Natūraliai išskiriamame subrendusiame PTH peptide yra 84 liekanos, PTH (1–84), sudarytos iš trijų skirtingų sričių: liekanos ~ 1–15 yra susijusios su sąveika su membranos spiralėmis ir receptoriaus aktyvacija 51, 52, ~ 15–37 yra atsakingi už receptorių atpažinimą jo ektodomene 53, 54, 55, tuo tarpu liekanų funkcija ~ 37–84 nėra aiški 56 . Tiek laisvas PTH peptidas, tiek receptorių surišta būsena rodo α-spiralinę antrinę liekanų struktūrą nuo 1 iki 34 (atitinkami PDB kodai yra 1ZWB 39 ir 3C4M) 40 . Pateikti BMR duomenys lėmė cheminių likučių pokyčių pokyčius nuo 2 iki ~ 42. Taigi struktūrizuoti elementai vaidino svarbų vaidmenį sąveikoje su Zn kompleksu.

Visi pagrindiniai PTH (1–84) liekanų NMR intensyvumo nuostoliai, susisiejant su Zn kompleksu, įvyksta arti peptido N-galinių aromatinių ir histidino liekanų. Titravimas Zn-perchloratu parodė, kad laisvasis Zn (II) negali prisijungti prie PTH, todėl pabrėžta, kad organinė skeleto sistema vaidina svarbų vaidmenį sąveikoje. Mes taip pat siūlome, kad ši sistema užtikrintų specifinę hidrofobinę PTH atpažinimo sąveiką, nes surišimo tyrimai su 9-antracenemetanoliu parodė, kad NMR titravimo eksperimente nėra jokio palankesnio surišimo, ir tik labai silpnas afinitetas, kurį parodo fluorescencijos ir ITC eksperimentai.

BMR aptikti cheminio poslinkio pokyčiai buvo pastebėti peptido hormono N-gale, todėl gaunamas slopinamas cAMP atsakas (6 pav.). Sumažėjęs atsakas taip pat buvo nustatytas pakeitus PTH likučius. Dešimtasis ir vienuoliktasis parathormono PTH (1–12) likučiai yra svarbūs stabilizuojant jo spiralinę struktūrą. Leu7 pakeitimas Phe7, Ala10 su Glu10 ir (arba) Arg11 su Ile11 žymiai sumažino cAMP 25 generaciją. Taip pat buvo pranešta, kad pirmoji, antroji, ketvirtoji, penktoji, septintoji ir aštuntoji PTH liekanos, taip pat W23 ir F34 yra svarbūs receptorių jungimosi / aktyvavimo komponentai . Dabartiniuose tyrimuose šie likučiai parodė reikšmingus cheminių poslinkių pokyčius, todėl tikimasi, kad jie turės įtakos biologiniam atsakui.

Mažų molekulių sąveika su baltymais dažnai vyksta visoje molekulėje, pvz., NMR nustatė EGCG jungimąsi su α-sinukleinu 49, tuo tarpu tiriamas Zn kompleksas parodė, kad peptidinių hormonų jungtis N-gale yra palanki. Nedaug sintetinių molekulių, pavyzdžiui, 1, 3, 4 – benzotriazepino nepeptidas 58 arba peptidais pagrįstas DPC – AJ1951 59, buvo identifikuoti kaip parathormono – 1 receptorių (PTH1R) antagonistai. Šios sintetinės molekulės veikia kaip receptoriaus aktyvatorius, o dabartinis Zn kompleksas veikia kaip agonisto inhibitorius. Su parathormonu susijusių baltymų mono- ir bicikliniai analogai buvo paruošti ir struktūriškai apibūdinti TFE: vandens mišinyje. Tačiau jų in vitro apibūdinimas (toks kaip cAMP susidarymas) nebuvo ištirtas 60, 61 .

Galimas tolesnis tokių mažų molekulių vystymas galėtų būti naudojamas kombinuotam gydymui. Tam tikrais ligos atvejais, pavyzdžiui, hiperparatiroidizmu, būtina kontroliuoti PTH funkciją ligando lygyje. Iki šiol galimi įvairūs gydymo būdai, pvz., Kalcimimetikai, bisfosfonatai ar pakaitinė hormonų terapija prieskydinės liaukos srityje, siekiant slopinti hormonų sekreciją. Tačiau dėl hiperkalcemijos ir hiperkalciurijos, dažnai pastebimo šalutinio poveikio, reikia vengti nuolatinio gydymo 32 . Todėl PTH atsako kontrolės agonistų lygiu derinys, pateiktas čia, kartu su PTH sekrecijos slopinimu gali būti naudingi norint nedelsiant reaguoti ir pagerinti terapinį pritaikymą.

Metodai

Baltymų išraiška ir gryninimas

Žmogaus PTH (1–34) ir PTH (1–84) buvo išgryninti, kaip anksčiau pranešta 23 . Abiejų peptidinių hormonų ekspresijos plazmidės yra pagrįstos pET SUMO adaptuojančiu vektoriu, turinčiu C – galo His žymes. Plazmidės buvo transformuotos į E. coli BL21 kodono + ląsteles. Peptidinių hormonų 15 N izotopų vienodas žymėjimas buvo pasiektas naudojant minimalią M9 terpę, papildytą 15 N NH4 Cl. Peptidiniai hormonai buvo išgryninti iš tirpių frakcijų, naudojant Ni – NTA afiniteto chromatografiją. Frakcijos, kuriose yra peptidų, buvo suskaidytos SUMO proteaze (santykiu 1: 100) 50–150 μg / ml 62 . Suskaidytos frakcijos buvo papildomai išgrynintos naudojant S – 75 gelio filtravimo chromatografiją.

Fluorescencinė spektroskopija

Fluorescencijos titravimas buvo atliktas JASCO FP6500. Mėginiai buvo sužadinti esant 280 nm bangos ilgiui, o emisijos spektrai buvo registruojami intervale nuo 290 nm iki 450 nm. Tyrimai buvo atlikti su 10 mM BisTris, 300 mM Na2S04, 0, 02% NaN3, pH 7, 2, naudojant 1 cm ilgio kvarco ląsteles. Titravimo eksperimentuose naudojamos PTH (1–34), PTH (1–84) ir nECD-PTH1R koncentracijos buvo atitinkamai 7, 4 μM, 8, 1 μM ir 5 μM. Įprasto titravimo eksperimento metu buvo pridėta 4 μM Zn komplekso arba 9-antracenemetanolio, o spektrai buvo registruojami po kiekvieno papildymo. Tuščiam titravimui buvo naudojamas Zn kompleksas arba 9-antracenemetanolis buferyje, ir šie spektriniai pėdsakai buvo atimti iš pagrindinio titravimo. Zn kompleksas arba 9-antracenemetanolis buvo ištirpintas dimetilsulfokside ir toliau atskiestas eksperimentams. Bet kuriame eksperimente galutinė DMSO koncentracija buvo <1%.

Duomenys apie fluorescenciją buvo analizuojami pagal šią lygtį:

Image

su P = ( P 0 / ( V 0 + L )) V 0 ir L 1 = ( L 0 / ( V 0 + L )) L ir Q - fluorescencijos intensyvumas, P - baltymų koncentracija, L - ligando koncentracija, V - tūris, n - rišimosi vietos ir 0 - nurodo pradžios tašką.

CD spektroskopija

CD spektrai buvo registruojami 25 ° C temperatūroje, naudojant Jasco – J – 810 spektropolarimetrą, skenavimo greičiu 20 nm / min. Matavimai buvo atlikti 5 mM BisTris buferiu, kurio pH 7, 2, naudojant 15 μM peptido. Titravimo bandymai buvo atlikti pridedant 10 μM Zn komplekso kiekvienu metu. Kiekvienas pateiktas spektras yra vidutiniškai keturi iš eilės nuskaitymai. Tuščias skenavimas tomis pačiomis sąlygomis buvo atimtas iš pagrindinių spektrinių duomenų.

ITC eksperimentas

Kalorimetriniai titravimai buvo atlikti 25 ° C temperatūroje naudojant „MicroCal VPITC“ izoterminį titravimo kalorimetrą. Į atitinkamo peptido tirpalą kalorimetro ląstelėje buvo įpilama nedidelių (7 μl) Zn komplekso alikvotų. Pavieniai papildymai buvo atskirti 300 sekundžių intervalu, kad susidariusi peptido Zn komplekso sąveikos piko vėl grįžtų į pradinę liniją. Visi tyrimai buvo atlikti su 10 mM BisTris, 300 mM Na2S04, pH 7, 2.

NMR spektroskopija

Spektrai buvo registruojami esant 50 μM peptidinių hormonų koncentracijai. Vėliau titravimas buvo atliktas pridedant 0, 5 μl 10 mM Zn komplekso, kol nebebuvo stebimas BMR intensyvumas. Analizei buvo naudojamas spektras, atitinkantis 1: 4 sudėtines formacijas. 9-antracenemetanolio titravimo eksperimentui panaudota 20 μM PTH. Atliktas titravimas ir išsamiai išanalizuotas PTH: 9-antracenemetanolio 1: 4 kompleksas. Spektrai buvo pataisyti pagal skiedimo koeficientą. Anksčiau nustatyti PTH rezonansų NMR priskyrimai buvo naudojami 24, 63, 64 . Spektrai buvo užrašyti 10 mM BisTris, 300 mM Na2S04, 0, 02% NaN 3, pH 5, 3, naudojant Bruker 800 MHz Avance III spektrometrą su CP-TCI kriofobu 25 ° C temperatūroje. Spektrai buvo apdoroti naudojant programas NMRPipe ir NMR Draw.

cAMP kaupimosi tyrimas

CAMP kaupimosi tyrimui buvo naudojamos HEK 293 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios hPTH1R, laikantis anksčiau aprašytos 24, 33 procedūros. Reakcija buvo atlikta 37 ° C temperatūroje, o fluorescencijos matavimai buvo atlikti naudojant plokštelių skaitytuvą VICTOR X4 2030 („PerkinElmer Life and Analytical Sciences“). CAMP reakcijai stebėti buvo naudojamas fiksuotas 0, 01 μM peptido hormonų kiekis ir 4 x 103 ląstelės kiekviename šulinyje. Zn kompleksas arba 9-antracenemetanolis buvo praskiestas nuo 0, 1 μM iki 100 μM ir 15 minučių inkubuotas su peptido hormonu, prieš pridedant HEK 293 ląsteles. Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais ir pakartoti savarankiškai tris kartus. Maksimalus cAMP atsakas buvo apskaičiuotas kaip maksimalaus PTH (1–34) arba PTH (1–84) atsako procentas. Zn komplekso arba 9-antracenemetanolio poveikis receptoriams buvo įvertintas inkubuojant juos su ląstelėmis 15 minučių, po to plaunant buferiu. Šios apdorotos ląstelės buvo pridėtos prie reakcijos mišinio, kuriame yra neapdorotas PTH (1–84), kaip aprašyta aukščiau.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Kumar, A. et al . Mažos molekulės slopinamas prieskydinės liaukos hormonų susijęs cAMP atsakas, jungiantis N – terminalo peptidus. Mokslas. Atstovas 6, 22533; „doi“: 10.1038 / srep22533 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.