Snat2 ekspresija ir reguliavimas žmogaus augimo ribotose placentose | vaikų tyrimai

Snat2 ekspresija ir reguliavimas žmogaus augimo ribotose placentose | vaikų tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Genų išraiška
  • Augimo sutrikimai
  • Pediatrija
  • Reprodukcinė biologija

Anotacija

Pagrindiniai faktai:

Žmogaus vaisiaus, kurio augimas ribojamas (vidinis gimdos augimas) (IUGR), aminorūgščių patekimas į placentą yra mažesnis, o placentos aminotransporterių aktyvumas nuolat sumažėjo in vitro tyrimais. Mes iškėlėme hipotezę dėl mažesnės placentos ekspresijos ir lokalizacijos su natriu sujungto neutralaus aminorūgšties pernešėjo 2 ( SNAT2 (dar žinomo kaip SLC38A2 )), pakitusiu intron -1 metilinimo lygiu ir pakitusiu vieno nukleotido polimorfizmų pasiskirstymu žmogaus IUGR, palyginti su normaliu nėštumu.

Metodai:

Mes ištyrėme 88 IUGR ir 84 kontrolines placentas iš pavienių nėštumų pasirenkamojo cezario pjūvio metu. SNAT2 ekspresija buvo tiriama realaus laiko PGR ir imunohistochemijos metodais . Intron-1 metilinimo lygiai buvo analizuojami atliekant pirosekvinimą, o vieno nukleotido polimorfizmo pasiskirstymas analizuotas alelinės diskriminacijos būdu.

Rezultatai:

mRNR lygis reikšmingai sumažėjo IUGR placentoje su sumažėjusiais virkštelės kraujo srautais. IUCR placentose sintezitrofoblastų imuninis dažymas buvo mažesnis nei kontrolinėse placentose. Metilinimo lygis buvo stabiliai žemas tiek IUGR, tiek kontrolinėse placentose. SNP genotipo ir alelių dažnis abiejose grupėse nesiskyrė.

Išvada:

Tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis SNAT2 ekspresijos ir reguliavimo mechanizmus žmogaus IUGR placentose. Mes patvirtiname ankstesnius rezultatus, gautus žiurkėms ir ląstelių kultūroms, kurie palaiko pagrindinį SNAT2 vaidmenį vaisiaus augime ir gerovėje , taip pat galimą deguonies lygio vaidmenį reguliuojant SNAT2 raišką, rodantį hipoksijos svarbą IUGR.

Pagrindinis

Sumažėjęs deguonies ir maistinių medžiagų pasiskirstymas per placentą buvo akivaizdžiai įrodytas nėštumo metu, kurio augimas ribojamas (I, M, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, I, V, I, I, I, I, I, I, bei. Aminorūgštys yra reikalingos vaisiaus augimui baltymų sintezei ir energijos gamybai. Jiems patenkinti reikia 20–40% vaisiaus ir placentos vieneto energijos poreikio (8). Pati placenta sunaudoja daug aminorūgščių, kurios lemia aktyvią metabolizmą (9).

Anksčiau pranešėme apie sumažėjusią aminorūgščių koncentraciją, taip pat pakitusį vaisiaus ir motinos aminorūgšties gradientą IUGR nėštumo metu, iš kurio buvo imtasi cezario pjūvio metu ar kordocentezės metu (3, 4). Ankstesniuose in vivo tyrimuose, išmatuotuose stabilių izotopų atsekamųjų medžiagų, nustatyta, kad sumažėjo nepakeičiamų aminorūgščių placentos pernešimo greitis (5, 6), o in vitro eksperimentai patvirtino sumažėjusį placentos aminorūgščių pernešimo sistemų (10, 11) aktyvumą IUGR ir mažo nėštumo metu amžiaus nėštumo, palyginti su įprastu nėštumu.

Aminorūgščių pernešėjai vaidina svarbų vaidmenį reguliuodami vaisiaus plazmos aminorūgščių sudėtį (12). Sistemos A šeima, kurią sudaro trys labai homologiški baltymų potipiai (su natriu sujungtas neutralių aminorūgščių pernešėjas 1 (SNAT1; taip pat žinomas kaip SLC38A1), SNAT2 (dar žinomas kaip SLC38A2) ir SNAT4 (dar žinomas kaip SLC38A4), skatina transportavimą neutralių aminorūgščių iš motinos į vaisius, kurios yra gyvybiškai svarbios vaisiaus ir placentos vystymuisi ir augimui bei gali veikti aminorūgštims pernešti per kraujo ir smegenų barjerą. Visų pirma, SNAT2 yra išreikštas tiek vaisiui ir placentai ir turi lemiamą vaidmenį kontroliuojant vaisiaus augimą (13). Keli tyrimai rodo sumažėjusį sistemos A membranos aktyvumą miligramui mikrovilgiosios membranos žmogaus IUGR placentoje (10, 14, 15) .Pažymėtina, kad žiurkėms. Buvo įrodyta, kad placentos „ Snat2“ reguliavimas sumažėjo prieš gimdos augimo apribojimą (13). Tai rodo, kad jo sumažėjimas yra ligos priežastis, o ne pasekmė. Tačiau SNAT2 ekspresijos ir reguliavimo mechanizmai niekada nebuvo buvo ištirtas žmogaus placentos audinyje.

„Snat2“ reguliavimą skatina keli veiksniai (13, 16, 17, 18, 19), ypač hipoksijos ir tarpląstelinių aminorūgščių koncentracijos. SNAT2 intron -1 yra nekoduojantis SNAT2 geno regionas, apimantis 54 nukleotidus ir turintis sekas, galinčias reaguoti į aminorūgščių trūkumą ir suaktyvinti SNAT2 geno ekspresiją (20). Be to, intron-1 yra CpG salos (CpG), kurios yra pakartotos CG sekos, kuriose C nukleotidas yra DNR metilinimo vieta.

Čia išmatuota SNAT2 geno ekspresija ir baltymų lokalizacija žmogaus IUGR placentose, palyginti su kontrolinėmis placentomis. Tada mes išmatuojome CpG salų, esančių placentos SNAT2 intron -1, metilinimo lygius, kad patikrintume galimus metilinimo profilio skirtumus tarp IUGR ir normalaus nėštumo. Galiausiai mes ištyrėme vieno nukleotido polimorfizmo (SNP), esančio SNAT2 intron -1 CpG saloje, kurio protėvių nukleotidas yra citozinas, priklausantis CpG salai, ryšį su intrauterininiu augimo ribojimu.

Rezultatai

Virkštelės kraujo analizė

IUGR bambos arterijų ir venų kraujyje pO 2 buvo žymiai mažesnis nei kontroliniame ( P <0, 001) ( 1 lentelė ). Panašiai deguonies įsotinimas ir kiekis buvo žymiai mažesnis, o laktato buvo žymiai daugiau IUGR bambos venose ir arterijose nei kontroliniuose. Šie skirtumai laipsniškai didėjo dėl intrauterininio augimo apribojimo sunkumo.

Pilno dydžio lentelė

SNAT2 genų ekspresija IUGR ir kontroliniuose placentuose

SNAT2 mRNR lygiai iš 49 IUGR ir 41 kontrolinės placentos buvo analizuojami realaus laiko PGR.

SNAT2 geno ekspresijos lygis buvo žymiai mažesnis IUGR placentoje - sumažėjo 27%, palyginti su kontrolinėmis ( P = 0, 03) ( 1a pav. ). Tačiau padalijus IUGR placentą į tris sunkumo grupes, SNAT2 ekspresijos lygis buvo žymiai mažesnis nei kontrolinės tik dviejose sunkiausiose grupėse (tai yra IUGR2 ir IUGR3) ( P = 0, 007) ( 1b paveikslas ).

Image

Natrio ryšiu sujungtos 2 aminorūgšties pernešėjo ( SNAT2 ) geno ekspresija. a ) SNAT2 geno ekspresija kontroliuojamose ir intrauterininėje augimo ribotoje (IUGR) placentose. Juostos žymi vidutines vertes. mRNR lygis IUGR placentose yra žymiai mažesnis, palyginti su kontrolinėmis placentomis. ( b ) SNAT2 geno ekspresija kontrolinėje ir IUGR placentose, padalyta iš sunkumo. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SE. mRNR lygis sumažėja dėl IUGR sunkumo. c ) reikšmingas ryšys tarp SNAT2 mRNR lygio ir virkštelės venų deguonies kiekio IUGR grupėje. * P <0, 05 ir ** P <0, 01.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

SNAT2 mRNR lygis sumažėjo, atsižvelgiant į deguonies kiekį bambos venoje, ir šis ryšys buvo statistiškai reikšmingas ( P = 0, 03) ( 1c paveikslas ). Tiriamųjų populiacijoje buvo pastebėtas reikšmingas teigiamas ryšys tarp SNAT2 mRNR lygio ir motinos amžiaus, taip pat su nėštumo amžiumi bei vaisiaus ir placentos svoriu. Tačiau išanalizavę IUGR populiacijos skirtumus, kai gestacinis amžius svyruoja nuo 30 iki 39 savaitės, atstovaujantis visoms trims sunkumo grupėms, mes pastebėjome reikšmingą nėštumo amžiaus skirtumą tarp sunkumo grupių, tačiau reikšmingos koreliacijos tarp SNAT2 išraiškos ir gestacinio amžiaus nenustatyta . SNAT2 genų ekspresijoje reikšmingų su lytimi susijusių skirtumų nebuvo .

SNAT2 lokalizavimas IUGR ir „Control Placentas“

SNAT2 baltymas buvo ekspresuojamas placentos audiniuose tiek iš IUGR pacientų, tiek iš kontrolinės grupės. Citoplazminis SNAT2 imunoreaktingumas buvo stebimas amniono epitelyje, chorioninių ir kamieninių indų sienelėse bei neryškiame ir ekstravilgiškame trofoblaste. Imuninis dažymas pasireiškė tiek cito-, tiek sincitiatrofoblastuose.

Visų tirtų mėginių SNAT2 erdvinio pasiskirstymo skirtumai tarp atvejų ir kontrolinių grupių nebuvo pastebėti. Mūsų populiacijoje IUGR placentos dažnai rodė nenormalius išsišakojimus ir Tenney-Parker pokyčius. Šiomis sąlygomis buvo nustatytas reikšmingas dažymo intensyvumo skirtumas tarp normalios ir IUGR placentos ( 2a, b pav. ). Kontrolinėse placentose imuninis dažymas vyravo sinkitiatrofoblaste, stipresniu būdu nudažant mikrovilnių membraną. IUGR atvejais sincititrofoblastas parodė silpną SNAT2 imunoreaktyvumą, nepadidėjo dažymo ant mikrovilnės membranos intensyvumas, tuo tarpu citotrofoblastas parodė stiprų imunoreaktyvumą. Pusiau kiekybinė analizė atlikus aklą atsitiktinai parinktų skaidrių vertinimą parodė, kad IUGR 1 tipo (IUGR1) grupėje kontrolinis (atitinkamai 2, 6 ± 0, 5 ir 2, 8 ± 0, 4) pasiskirstymas (3 ± 0) ir sincitiatrofoblastų intensyvumas (3 ± 0) buvo panašūs, tuo tarpu IUGR2 ir IUGR3 grupės turėjo žymiai mažesnes vertes tiek pasiskirstymui (1, 3 ± 0, 6), tiek intensyvumui (1, 6 ± 0, 6) ( P <0, 05).

Image

Su natriu sujungto neutralaus aminorūgšties pernešėjo 2 (SNAT2) imunohistocheminė ekspresija riboto augimo intrauterineje (IUGR) ir normaliose placentose. a ) Kontrolės metu imuninis dažymas atliekamas trofoblastinėse ląstelėse, tiek citotrofoblastuose (rodyklės galvutėje), tiek sincitrofoblastuose, intensyviai dažant ant mikrovilnių membranos (rodyklė; pusiau kiekybinis įvertinimas 3+). Masto juosta: 20 μm. ( b ) placentos iš IUGR 3 tipo (IUGR3) grupės, turinčios silpną SNAT2 imunoreaktyvumą, pavyzdys sincitiatrofoblaste (rodyklė; pusiau kiekybinis balas 1+). Citotrofoblastas (strėlės galvutė) parodė stiprų dažymą, taip pat ir esant stipriam intrauterininiam augimo ribojimui. Masto juosta: 20 μm.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

SNAT2 Intron-1 metilinimo lygiai IUGR ir kontroliniuose placentuose

Metilinimo analizė buvo atlikta iš DNR, ekstrahuotos iš 37 IUGR placentos ir 28 kontrolinės placentos, taip pat iš 10 periferinio kraujo mėginių, paimtų iš sveikų suaugusiųjų, kurie buvo naudojami kaip išorinė kontrolė.

Vidutinis sveikų suaugusiųjų periferinio kraujo metilinimo lygis buvo 3, 02% (diapazonas: 2, 50–3, 69%) ( 3a pav. ), O visų stebimų CpG buvo stabiliai žemas. Kontrolinės placentos apibūdino tą patį profilį kaip ir išorinės kontrolinės medžiagos, vidutinis metilinimo lygis buvo 3, 16% (diapazonas: 1, 92–7, 15%) ( 3b paveikslas ). Panašiai IUGR placentos metilinimas buvo stabiliai žemas - vidutiniškai 3, 08% (diapazonas: 2, 00–6, 53%) ( 3c pav. ) Ir nebuvo skirtumų tarp trijų IUGR sunkumo grupių (duomenys nepateikti). Taigi iš viso CpG vietos SNAT2 intron -1 srityje buvo visos hipometilinės, reikšmingo skirtumo tarp analizuotų grupių nebuvo.

Image

13 analizuotų CpG salų metilinimo lygiai (%) natrio jungties neutralių aminorūgščių pernešėjo 2 ( SNAT2 ) intron -1 srityje. Kiekvienas mėginys pavaizduotas skirtinga linija, nubrėžta metilinimo svyravimus analizuojamuose lokusuose (procentinės vertės kiekvienoje CpG vietoje). a ) 10 sveikų suaugusiųjų periferinis kraujas (išorinė kontrolė); b ) 28 kontrolinės placentos; ir c ) 35 intrauterininio augimo ribojamos (IUGR) placentos.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

SNP alerginė diskriminacija

Intron-1 rs10880961 SNP, kuriame protėvių alelį (C) galima pakeisti G, buvo atliktas genotipas 68 IUGR ir 68 kontrolinėse placentose. Duomenys buvo analizuojami pagal kodominantinį modelį (atskirai atsižvelgiant į genotipus CC, CG ir GG), dominuojantį modelį (atsižvelgiant į visus atvejus, kai genotipas turėjo C alelį: CC + CG vs. GG) ir recesyvinį modelį ( kartu įvertinant visus atvejus, kai genotipas neturėjo C alelio: CC prieš CG + GG), ir įvertinant alelio dažnį. 2 lentelėje pateikti genotipai ir alelių dažnis dviejose tirtose grupėse.

Pilno dydžio lentelė

Nė viename iš trijų paminėtų modelių nerasta jokio ryšio tarp polimorfizmo ir IUGR patologijos. Alelių dažnis reikšmingai nesiskyrė tarp IUGR placentos ir kontrolinės grupės.

Diskusija

Keli in vivo ir in vitro tyrimai pranešė apie placentos aminorūgščių transportavimo pakitimus žmogaus IUGR vaisiuose (3, 5, 6). SNAT2, neutralių aminorūgščių pernešėjo, funkcinis vaidmuo buvo išsamiai aprašytas įvairių rūšių placentos audiniuose ir žmogaus placentos ląstelėse in vitro (13, 16, 17, 18, 19).

Šiame tyrime pirmą kartą apibūdinome SNAT2 raišką ribotose žmogaus augimo placentose, atlikus darbą su kitomis rūšimis ir ląstelių kultūrą. Dideliame IUGR placentos mėginyje SNAT2 geno ekspresija buvo žymiai mažesnė, palyginti su kontrolinėmis placentomis. Tai rodo, kad ankstesni duomenys apie sumažintą vaisiaus aminorūgščių koncentraciją (4) ir sumažintą placentos aminorūgščių transportavimo aktyvumą (10), ribojant intrauterininį augimo augimą, yra susiję su SNAT2 transkripcijos žeminimu . Taip pat ištyrėme SNAT2 geno raišką, atsižvelgiant į intrauterininio augimo apribojimo sunkumą. IUGR placentą padalijome pagal anksčiau aprašytą klasifikaciją (2) pagal vaisiaus širdies ritmą ir virkštelės arterijos pulsacinį indeksą. Pagal šią klasifikaciją mūsų populiacijoje IUGR placentos buvo laipsniškai hipoksinės ir laktacideminės, didėjant sunkumui.

SNAT2 mRNR lygis buvo žymiai mažesnis tik sunkiausiais atvejais, kai sumažėjo virkštelės kraujotaka, kas rodo, kad sumažėjusi SNAT2 geno ekspresija gali būti susijusi su sumažėjusiu placentos deguonimi. Šie duomenys patvirtina mūsų ankstesnius rezultatus, kurie parodė mažesnį A sistemos aktyvumą IUGR2 ir IUGR3 placentos mikrovillar membranos pūslelėse (10). Nepaisant to, ankstesnis tyrimas (13) parodė, kad nėščioms žiurkėms, maitinančioms mažai baltymų, „ Snat2“ sureguliavimas vyksta anksčiau nei prasideda intrauterininis augimo ribojimas. Galima dabartinio žmogaus nėštumo metu atlikto tyrimo riba yra ta, kad mūsų duomenys yra placentos gimdymo metu vaizdas, todėl negali paaiškinti, ar SNAT2 ekspresija sumažėja esant stipriam intrauterininio augimo apribojimui prieš vaisiaus augimo sumažėjimą. Tačiau teigiama koreliacija tarp SNAT2 mRNR lygio ir vaisiaus bei placentos svorio patvirtina atitinkamą šio baltymo funkciją tiekiant aminorūgštis iš motinos vaisiui.

Mūsų populiacijoje gestacinis amžius, kuris buvo žymiai mažesnis IUGR nėštumų metu, taip pat buvo teigiamai susijęs su SNAT2 geno raiška. Tai yra visų tyrimų, tiriančių žmogaus IUGR ir placentos kontrolinį terminą, riba, nes vaisiaus labui IUGR nėštumas pasirenkamas anksčiau. Tačiau mes išanalizavome ryšį tarp gestacinio amžiaus ir SNAT2 mRNR lygio IUGR populiacijoje, kai nėštumo amžius svyravo nuo 30 iki 39 savaičių. Šiame diapazone buvo atstovaujamos visos trys IUGR sunkumo grupės. Nors IUGR2 ir IUGR3 grupėse nėštumo amžius buvo ženkliai mažesnis nei IUGR1 grupėje, reikšmingos koreliacijos tarp SNAT2 ekspresijos ir gestacinio amžiaus nenustatyta.

Sumažėjęs aminorūgščių įsisavinimas placentoje dėl sumažėjusios SNAT2 ekspresijos taip pat gali turėti reikšmingą poveikį, nes žmogaus placentos baltymų apykaita yra labai didelė (8). Be to, SNAT2 tarpininkauja neutralių α-amino rūgščių, tokių kaip glutaminas, transportavimui. Iš tiesų, anksčiau mes pranešėme, kad bambos veninio glutamino koncentracija yra žymiai mažesnė mažo nėštumo amžiaus pacientams, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (21). Glutaminas yra apsauginis faktorius nuo mitochondrijų lipidų peroksidacijos ir turi svarbų vaidmenį antioksidantų veikloje (22). Jis taip pat atlieka svarbias metabolines funkcijas perduodant anglies atomus, yra degalai greitai dalijamosioms ląstelėms ir yra daugelio biologiškai aktyvių molekulių pirmtakas. Be to, glutaminas stimuliuoja signalizacijos kelius, tokius kaip heksozamino kelias, kurie daro įtaką ląstelių signalizacijai, baltymų apykaitai ir genų ekspresijai (23). Todėl dėl SNAT2 sumažėjusios mažesnės placentos glutamino koncentracijos gali atsirasti mitochondrijų oksidacinis stresas ir ląstelių distresas, dėl to gali pakisti ląstelių metabolizmas ir molekulių (pvz., Progesterono) biosintezė, kurios yra esminės nėštumo palaikymo sąlygoms (24). Iš tiesų, tai yra tipiškos savybės, lemiančios IUGR būklę, ir apie žmogaus IUGR placentos mitochondrijų pokyčius (25).

Be to, papildomos neigiamos pasekmės placentai gali būti susijusios su sumažėjusia aminorūgščių koncentracija dėl mažesnės SNAT2 ekspresijos, o tai savo ruožtu lemia pagrindinių elementų, kurie paprastai sunaudojami dideliais kiekiais placentos metabolizmo metu, trūkumą (9).

Imunohistocheminiai duomenys patvirtino, kad žmogaus placentoje SNAT2 yra ekspresuojamas ir trofoblastuose, ir sincitio-, ir citotrofoblastuose (26). Tačiau IUGR placentose SNAT2 dažymo intensyvumas atrodė mažesnis sincititrofoblaste. Kaip ir tikėtasi, IUGR placentos turėjo nenormalų silpną išsišakojimą ir padidintą sincitinių mazgų skaičių (vadinamieji Tenney – Parker pokyčiai). IUGR placentose dažnai stebimas padidėjęs sincitinių mazgų skaičius (

Kitas svarbus SNAT2 ekspresijos reguliavimo elementas yra intron -1 sritis, esanti SNAT2 gene. Pranešama, kad šiame regione yra aminorūgščių atsako elementų, kurie reaguoja į aminorūgščių trūkumą ir aktyvuoja SNAT2 geno raišką (20). Mes nustatėme, kad SNAT2 intron -1 gausu CpG salose; šios nukleotidų sekos yra jautrios DNR metilinimui, kuri yra viena iš sąlygų, reguliuojančių epigenetinę genų raišką. Todėl mes ištyrėme SNAT2 metilinimą ir SNP būklę, kad nustatytume, ar jie skiriasi tarp kontrolinės ir IUGR nėštumų. Nors šie kintamieji nesiskyrė, šie radiniai yra informatyvūs dėl to, kad placentoje nėra SNAT2 metilinimo pokyčių, nors metilinimas gali įvykti (ir gali turėti didelę įtaką genų ekspresijai) už CpG salų. Gerai pripažįstama, kad CpG salų hipermetilinimas genų kontrolės regionuose lemia stabilią transkripcijos represiją (29), tuo tarpu hipometilinimas yra geno ekspresijos garantija, suteikiant genui galimybę ekspresuoti (30). Todėl mūsų duomenys apie kontrolinių mėginių hipometilinimą patvirtina didelę placentos SNAT2 svarbą . Tačiau jie rodo, kad SNAT2 ekspresijos sumažėjimas IUGR placentose nėra susijęs su SNAT2 introno-1 epigenetinėmis modifikacijomis.

Taip pat mes atlikome SNP, esančio intron-1 srityje, alelinę diskriminaciją, kurios protėvių aleliai yra citozinas, kuris tam tikroje CpG saloje gali atsirasti kaip guaninas. Tokiu atveju seka, kuri iš protėvių yra CG, atsirastų vietoje GG, kuri nėra metilinimo taikinys. Todėl pasidomėjome, ar CG sekos nebuvimas, atsirandantis polimorfinėse formose, gali būti ligos rizikos veiksnys. Tačiau IUGR ir kontrolinės grupės genotipas ir alelių dažnis nesiskyrė, net svarstant duomenis pagal skirtingus modelius. Todėl mes padarėme išvadą, kad tiriamoje populiacijoje intrauterininis augimo apribojimas nėra susijęs su SNP, esančiu šiame regione.

Taigi SNAT2 sumažėjęs reguliavimas, apie kurį pranešėme šiame tyrime, gali atsirasti dėl kitų reguliavimo sistemų, dalyvaujančių SNAT2 ekspresijos moduliavime, tokių kaip anksčiau minėti deguonies lygiai, panaikinimo. IUGR mėginiuose deguonies lygis tiek virkštelės arterijoje, tiek venoje buvo žymiai sumažėjęs, ypač sunkesnėse grupėse, turint reikšmingą ryšį tarp O 2 kiekio ir SNAT2 ekspresijos. Tai sutinka su ankstesniais tyrimais, rodančiais SNAT2 sumažėjusį reguliavimą trofoblastų kultūrose hipoksinėmis sąlygomis (19).

Tolesnį kelią, kuris lemia SNAT2 sumažėjusį reguliavimą, gali atspindėti rapamicino 1 komplekso taikinys žinduoliams, kuris, kaip buvo pranešta, slopinamas žmogaus IUGR placentoje (31, 32). Potencialiai sumažėjusi SNAT2 ekspresija taip pat gali atsirasti dėl trumpesnio SNAT2 mRNR pusinės eliminacijos laiko, o ne dėl vertimo greičio trūkumų; tačiau mūsų tyrimas šios hipotezės nenagrinėjo.

Galiausiai, kadangi kitos SNAT geno izoformos ( SNAT1 ir SNAT4 ) gali prisidėti prie A sistemos aminorūgščių pernešėjo aktyvumo žmogaus placentos trofoblaste (26), jų ekspresijos analizė šioje tyrimo populiacijoje gali paaiškinti A sistemos aminorūgščių pernešėjo vaidmenį. intrauterininio augimo apribojimo etiopatogenezės panaikinimas.

Apibendrinant tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis SNAT2 ekspresijos ir reguliavimo mechanizmus žmogaus IUGR placentos audiniuose. Mūsų rezultatai patvirtina ankstesnius tyrimus su žiurkėmis ir žmogaus placentos ląstelėmis (13, 19), patvirtinančius esminį SNAT2 vaidmenį vaisiaus augime ir gerovėje bei galimą deguonies lygio vaidmenį reguliuojant SNAT2 raišką, nurodant hipoksijos svarbą intrauterinėje augimo apribojimas.

Metodai

Tyrimą patvirtino vietinė institucinė apžvalgos taryba (Luigi Sacco ligoninė), ir visi nėščios pacientai davė informuotą sutikimą.

Studijų populiacija

Pasirenkamojo cezario pjūvio metu iš viso ištyrėme 172 nėščiųjų nėštumus (88 IUGR nėštumai ir 84 kontroliniai). Nėštumo amžius buvo apskaičiuotas nuo paskutinių mėnesinių ir patvirtintas atliekant įprastinę ultragarsinę tyrimą 11–12 nėštumo savaitės (33). Abiejų grupių išskyrimo kriterijai buvo vaisiaus ar motinos infekcijos, motinos vartojami narkotikai ar alkoholis, vaisiaus apsigimimai, chromosomų anomalijos, lėtinė motinos hipertenzija, motinos širdies ir kraujagyslių ar autoimuninės ligos ir diabetas.

IUGR vaisius gimdoje nustatėme pakartotiniais išilginiais matavimais, kurie parodė vaisiaus augimo greičio sumažėjimą, ir toliau juos suskirstėme pagal virkštelės arterinio Doplerio greičio ir vaisiaus širdies susitraukimų dažnio (FHR) pėdsakus (2, 34), kaip aprašyta anksčiau (35). . Augimo apribojimas buvo patvirtintas gimus, jei naujagimio svoris buvo mažesnis nei 10 procentilio pagal Italijos gimimo svorio ir gestacinio amžiaus standartus (36).

Remiantis virkštelės arterijos Doplerio greičio ir FHR, IUGR vaisiai buvo suskirstyti į tris didėjančio klinikinio sunkumo grupes, kaip buvo pasiūlyta anksčiau (2). Trumpai tariant, IUGR1 grupė turėjo normalų pulsacijos indeksą ir normalų FHR; IUGR2 grupė turėjo nenormalų pulsacinį indeksą ir normalų FHR; ir IUGR3 grupė turėjo nenormalų pulsacijos indeksą ir nenormalų FHR.

Normalūs nėštumai buvo sveikų motinų, kurių KMI nebuvo normalus, nėštumo komplikacijų nebuvo, o vaisiaus normalus augimas buvo patvirtintas gimimo svoriu nuo 10 iki 90 procentilio pagal italų referencines vertes (37).

Kontrolinės motinos ir vaisiaus charakteristikos ir intrauterininis augimo apribojimas pateiktos 3 lentelėje . Motinos amžius ir KMI reikšmingai nesiskyrė tarp dviejų grupių. Kaip ir buvo galima tikėtis, IUGR grupėje gestacinis amžius ir vaisiaus bei placentos svoris buvo ženkliai mažesni.

Pilno dydžio lentelė

Procedūros

Placentinio mėginio kolekcija. Placentos mėginiai buvo imami RNR ir baltymų ekstrakcijai; fragmentai buvo plaunami naudojant PBS („Dulbecco's Phosphate Buffered Solution“, „Euroclone“, Milanas, Italija), tada supjaustyti į mažus gabalėlius, kurie po to buvo patikrinti optiniu mikroskopu, kad būtų pašalinti visi motinos decidua fragmentai. Tada atrinkti chorioniniai vyniotiniai buvo užšaldyti skystu azotu baltymams ekstrahuoti arba sudedami į RNR stabilizuojantį tirpalą (RNR vėliau, Ambion, Austin, TX) RNR ekstrakcijai; pastaruoju atveju mėginiai 24 valandas buvo laikomi 4 ° C temperatūroje, po to buvo laikomi –20 ° C temperatūroje.

Imunohistochemijos eksperimentams placentos švieži viso storio mėginiai 12–24 valandas buvo fiksuojami 10% neutraliame buferiniame formaline (Bio-optica Milano Spa, Milanas, Italija) 12–24 valandas.

Biocheminės analizės. Virkštelinis veninis ir arterinis kraujas buvo paimti iš dvigubai užrišto virkštelės segmento iškart po vaisiaus ištraukimo. Visi mėginiai buvo surinkti heparinizuotuose švirkštuose ir laikomi ant ledo iki analizės pabaigos. Dujų ir laktorato koncentracija kraujyje buvo matuojama „GEM Premier 3000“ (Instrumentacijos laboratorija, Briuselis, Belgija). Deguonies kiekis buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę (2): deguonies kiekis (mmol / l) = hemoglobinas (g / l) * prisotinimas deguonimi * 0, 005982.

SNAT2 geno ekspresija: kiekybinė realaus laiko PGR analizė. SNAT2 mRNR lygio placentos buvo analizuojamos naudojant realaus laiko PGR. Visa RNR buvo išskirti iš audinių, naudojant reagentą „Trizol“ (Invitrogen, Life Technologies, Cergy, Prancūzija), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, ir buvo apdoroti komplektu be DNR (Ambion), kad būtų pašalinta potencialiai užteršianti DNR. RNR koncentracija buvo nustatyta naudojant NanoDrop ND1000 spektrofotometrą (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). SNAT2 ekspresijos tyrimams 500 ng visos RNR buvo transkribuota atvirkščiai, naudojant didelės talpos cDNR atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Applied Biosystems, Foster City, CA), o gauta cDNR buvo naudojama kaip šablonas kiekybiniam realiojo laiko PGR, remiantis „TaqMan“ metodika, naudojant 7500 greito realaus laiko PGR sistemą („Applied Biosystems“).

SNAT2 RNR kiekis buvo apskaičiuotas naudojant 2- ACt metodą hipoksantino-guanino fosforibosiltransferazės ( HPRT ) ir sukcinato dehidrogenazės komplekso-subvieneto A ( SDHA ) namų tvarkymo genų atžvilgiu, kurie buvo parinkti iš patikrintų namų tvarkymo genų grupės, nes jie parodė panašus amplifikacijos efektyvumas RNR koncentracijos skalėje (38). Visus tyrimus atliko „Applied Biosystems“. Visi mėginiai buvo atvirkščiai perrašyti dviem egzemplioriais, o cDNR buvo paleisti trimis egzemplioriais, kad būtų galima įvertinti mėginio homogeniškumą ir techninį kintamumą. Kaip buvo aprašyta anksčiau, normaliai pasiskirsčiusioms vertėms gauti buvo naudojami „Log 10“ transformuoti rezultatai (39).

Realaus laiko duomenys buvo analizuojami naudojant Sequence Detector programinę įrangą (Applied Biosystems).

SNAT2 baltymo lokalizacija: imunohistochemija. Imunohistocheminiai tyrimai buvo atlikti su 4 μm storio, formalinu fiksuotų, parafinu įterptų placentos audinių pjūviais, naudojant Novolynk polimero aptikimo sistemą (Novocastra Laboratories, Newcastle, JK). Pirminiai antikūnai (afinitetu išgrynintas triušio IgG) buvo gaminami pagal užsakymą (Eurogentec, Seraing, Belgija), naudojant antigeną šias SNAT2 aminorūgščių sekas: SNLGKKKYETEFHPG (55–69 liekanos).

Skyriai buvo deparafinuoti 20 min., Išvalius iš biolako, po to du kartus plaunami etanoliu. Objektyvai buvo dedami į vandens vonią, kurioje buvo 0, 01 mol / l natrio citrato, esant pH 6, 0, 30 minučių 95 ° C temperatūroje. Endogeninis peroksidazės aktyvumas 10 minučių buvo sustabdytas 3% vandenilio peroksidu distiliuotame vandenyje. Dažymas buvo atliktas naudojant 3, 3 ′ diaminobenzidiną kaip chromogeną. Norint nudažyti SNAT2, pirminis antikūnas buvo užpilamas santykiu 1: 1 000 0, 5% BSA ir natrio azide ir inkubuojamas 30 minučių kambario temperatūroje. Antikūnų specifiškumas buvo patvirtintas iš anksto inkubuojant SNAT2 antikūną su jo antigeniniu peptidu, o skaidrės, kuriose nebuvo pirminio antikūno, buvo įtrauktos kaip neigiamos kontrolinės medžiagos.

Baltymų intensyvumas ir pasiskirstymas buvo įvertinti penkiose atsitiktinai pasirinktose vietose, padidinant x 40, naudojant pusiau kiekybinę 0–3 pliuso skalę: 0 = be dažymo; 1 = silpnas dažymo intensyvumas, židinio pasiskirstymas (pozityvumas <25% sinkitiatrofoblastų); 2 = vidutinis dažymas, pasiskirstymas 25–50% sincitrofoblastų; ir 3 = stiprus dažymas, difuzinis pasiskirstymas (> 50% sincititrofoblastų). Pusiau kiekybinis vertinimas nebuvo įtrauktas į sritis, kuriose gausu nekrozių ar infarktų.

Intron-1 CpG metilinimo lygiai: pirosekvinimas. SNAT2 intron -1 yra SNAT2 geno sritis, svarbi jos ekspresijos reguliavimui, nes tai yra aminorūgščių koncentracijos „jutiklis“ (20). Todėl mes analizavome SNAT2 introno-1 srities seką naudodami CpG salų ieškiklį (40) ir nustatėme keletą CG vietų (CpG salos), kuriose citozinas yra potencialus DNR metilinimo taikinys.

Kiekybinės metilinimo lygio analizės buvo atliktos naudojant pirosequencing metodą 365 bazių porų regione SNAT2 intron -1 (iš viso 13 CpG salų).

DNR metilinimo analizė. Genomo DNR buvo išskirtas naudojant „Trizol“ reagentą (Invitrogen - Life Technologies, Cergy, Prancūzija) laikantis standartinių procedūrų. Natrio bisulfito DNR konversija (700 ng) buvo atlikta naudojant EZ DNR metilinimo aukso rinkinį („Zymo Research“, Orange, CA). Bisulfitu paversta DNR buvo išplauta su 30 μl eliuavimo buferiu („Thermo Fisher Scientific“, Rokfordas, IL) ir koncentracija buvo nustatyta „NanoDrop ND1000“ spektrofotometru (NanoDrop Technologies).

PGR reakcija buvo atlikta naudojant 20 ng bisulfitu apdorotos DNR, 10 pmol priekinio pradmens 5′-GAGGGATAATAGAGAGGGT-3 ′ ir 10 pmol atvirkštinio biotinilinto pradmens 5′-CTTCTTCATACTAAACACTA-3 ′, leidžiant sustiprinti 365 bazę. poros produktas, esantis SNAT2 1 introne, kuriame yra 13 CpG vietų. PGR sąlygos buvo tokios: 95 ° C 30 s, 55 ° C 30 s ir 72 ° C 20 s, 45 ciklų.

PGR produktai buvo naudojami kiekybinei DNR metilinimo analizei naudojant Pyro Mark ID instrumentą (Biotage AB, Upsala, Švedija) PSQ HS 96 sistemoje (Biotage AB), naudojant PyroGold SQA reagento rinkinį (Biotage AB) pagal gamintojo instrukcijas. .

Neapdoroti duomenys buvo analizuojami naudojant Q-CpG programinę įrangą v1.0.9 („Biotage AB“), kuri apskaičiuoja konvertuotų Cs (Ts) ir nekonvertuotų Cs santykį kiekvienoje CpG, nurodant metilinimo procentą.

Kiekvieno mėginio metilinimo vertė parodo 13 CpG vietų vidutinę metilinimo vertę ir buvo gauta atliekant bent du nepriklausomus PGR ir pirosequencingo eksperimentus.

„Intron-1 SNP“: alelinė diskriminacija realaus laiko PGR pagalba. Intron-1 rs10880961 SNP buvo atliktas genotipas naudojant „Real Time 7500 Fast System Instrument“ („Applied Biosystems“). Reakcijos mišinyje (bendras tūris 15 µl) buvo 100 ng DNR, 1X SNP genotipų nustatymo mišinys ir 1X „Taqman“ genotipų nustatymo mišinys („Applied Biosystems“). Amplifikavimo sąlygos buvo 95 ° C 10 min., Po to sekė 40 ciklų, esant 95 ° C temperatūrai 15 s, o 60 ° C - 1 min.

Statistinė analizė. Duomenys apie populiacijos klinikines charakteristikas, pateikti kaip vidurkis ± SD, buvo lyginti naudojant nesuporuotą Studento t- testą.

SNAT2 geno ekspresijos duomenys normalių ir IUGR nėštumų metu buvo lyginami naudojant neparametrinį Manno – Whitney U testą ir Kruskalio – Wallis testą.

SNAT2 imunohistocheminiai balai buvo lyginami naudojant neparametrinį Manno – Whitney U testą. Metilinimo lygių statistinė analizė buvo atlikta naudojant neporinį Studento t- testą.

Nepriklausomų mėginių test 2 testas buvo naudojamas nustatyti, ar intron-1 SNP yra susijęs su intrauterininiu augimo ribojimu. Duomenys buvo analizuojami naudojant kodominantį, dominuojantį ir recesyvinį modelį, įvertinant alelių dažnį. Alelių dažnis buvo apskaičiuojamas taip:

Dažnis = ((homozigotų mėginių skaičius × 2) + (heterozigotų mėginių skaičius)) / (bendras mėginių skaičius × 2)

Statistiškai reikšmingi buvo skirtumai tarp atvejų ir kontrolinės, kai P <0, 05. Koreliacija tarp reikšmių buvo atlikta naudojant Spearman koreliaciją. Koreliacijos buvo laikomos reikšmingomis, kai P <0, 05. Visi testai buvo atlikti naudojant statistinį paketą SPSS („IBM SPSS Statistics“, 17.00 versija, „Windows“, Čikaga, IL).

Finansinės paramos ataskaita

Šį darbą rėmė Italijos tyrimų ministerijos PRIN 2008 dotacija (2008K9RY7C_004), Fondazione Giorgio Pardi ir „Associazione Italiana per lo Studio delle Malformazioni“ (ASM).

Atskleidimas

Tyrime nėra jokių finansinių ryšių ar galimų / suvokiamų interesų konfliktų.