Tirpus cd83 palengvina eksperimentinį pelių kolitą | gleivinės imunologija

Tirpus cd83 palengvina eksperimentinį pelių kolitą | gleivinės imunologija

Anonim

Dalykai

  • Uždegimas
  • Uždegiminė žarnų liga
  • Gleivinės imunologija

Anotacija

Fiziologinė pusiausvyra tarp priešuždegiminių ir priešuždegiminių procesų yra sutrikusi esant uždegiminėms žarnyno ligoms (IBD), kaip ir Krono ligai bei opiniam kolitui. Įprastinėje terapijoje ūmios fazės simptomams gydyti naudojami priešuždegiminiai ir imunosupresiniai kortikosteroidai. Tačiau mažas šių gydymo būdų remisijos laipsnis ir stiprus šalutinis poveikis nėra patenkinti. Taigi yra didelis medicininis poreikis naujų terapinių strategijų. Pranešama, kad tirpus CD83, tarpląstelinis transmembraninės CD83 molekulės domenas, pasižymi įdomiomis terapinėmis ir imuninę sistemą slopinančiomis savybėmis, slopindamas dendritinių ląstelių (DC) sukeltą T-ląstelių aktyvaciją ir sukeldamas tolerogenines DC. Tačiau CD83 išraiška ir funkcija IBD vis dar nežinoma. Čia parodyta, kad CD83 raišką padidina skirtingos leukocitų populiacijos cheminio sukelto pelių kolito modelyje. Be to, šiame tyrime buvo tiriama sCD83 galimybė moduliuoti kolitą naudojant eksperimentinį pelių kolito modelį. Stebėtina, kad sCD83 palengvino klinikinius ligos simptomus, drastiškai sumažino mirtingumą ir smarkiai sumažino uždegiminių citokinų ekspresiją mezenteriniuose limfmazgiuose ir storosios žarnos srityje. Buvo smarkiai slopinama makrofagų ir granulocitų infiltracija į storosios žarnos audinius. Mechaniškai mes galime parodyti, kad sCD83 sukelta indolamino 2, 3-dioksigenazės ekspresija yra būtina jos apsauginiam poveikiui.

ĮVADAS

Uždegiminės žarnyno ligos (IBD), Krono liga ir opinis kolitas vis dar kelia didelę sveikatos problemą. Šiems pacientams sutrikdyta virškinimo trakto (GI) imunostimuliacinių ir imunosupresinių mechanizmų fiziologinė pusiausvyra. Abi jos išsivysto lėtiniu ir recidyvuojančiu virškinimo trakto uždegimu, smarkiai pablogindamos gyvenimo kokybę. Imunokompetentingiems asmenims šios patologijos išsivysto dėl citokinų sukelto žarnų uždegimo. 1, 2 IBD sergantiems pacientams pastebėtas stiprus antigeną pristatančių ir T ląstelių aktyvinimas. Krono liga sergančių pacientų storosios žarnos ir žarnyno intersticyje yra nemažai T tipo pagalbininkų T (Th1) ir Th17 ląstelių, susijusių su per didele interferono (IL) -12 / IL-23 ir γ-interferono (IFN-γ) / IL-17 ekspresija., o padidėjęs IL-5 ir IL-13 ekspresija pacientams, sergantiems opiniu kolitu. 1, 2 T ląstelių gauti citokinai, tokie kaip IFN-γ ir naviko nekrozės faktorius α (TNF-α), aktyvuoja audinių makrofagus ir granulocitus, skatindami uždegimą, išskirdami priešuždegiminius citokinus, įskaitant TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 ir mediatoriai kaip azoto oksidas. 3 Atrodo, kad šalia makrofagų ir granulocitų vaidmens bakterinė žarnos mikroflora skatina IBD. Nepaisant intensyvių tyrimų, opinis kolitas išgydomas tik chirurginiu būdu pašalinant storąją žarną. Krono liga vis dar nėra išgydoma. Klasikinei medicinos terapijai ūmios fazės simptomams gydyti naudojami priešuždegiminiai ir imuninę sistemą slopinantys vaistai, tokie kaip kortikosteroidai. Tačiau dėl šios terapijos tik ∼ 60% gydytų pacientų remisija pasireiškia stipriu šalutiniu poveikiu. Naujesni vaistai, įskaitant anti-TNF-α antikūnus, tiesiogiai nukreipti į uždegimą sukeliančius citokinus. Tačiau iki šiol vien jų terapinis poveikis arba derinimas su klasikiniais imunosupresantais yra ribotas ir sukelia šalutinį poveikį. 2, 5 Todėl gyvybiškai reikalingas naujas ir efektyvesnis gydymas, turintis mažiau šalutinių poveikių.

Neseniai įrodyta, kad tirpi CD83 (sCD83) molekulė yra stiprus priešuždegiminis ir imuninę sistemą slopinantis tarpininkas. sCD83 sudaro tarpląstelinis su membrana susijusios CD83 molekulės (mCD83) domenas. mCD83 yra ekspresuojamas savitomis savybėmis subrendusiose dendritinėse ląstelėse (DC), bet ne nesubrendusiose DC. Parodyta, kad šalia DC, jis taip pat ekspresuojamas aktyvuotose T ir B ląstelėse. 7 Hock ir kt. 8 nustatė sCD83 sveikų asmenų serumuose ir subrendusių DC ir B ląstelių supernatante. Neseniai ši grupė pranešė apie padidėjusį sCD83 lygį sergančių pacientų, sergančių piktybine hematologine liga, sergantiems 9, o pacientams, sergantiems lėtine limfocitine leukemija, tiesioginį sCD83 koncentracijos serume ryšį su išgyvenimu be gydymo. Tai reiškia, kad sCD83 daro fiziologinį poveikį in vivo ir gali prisidėti prie imuninio pabėgimo nuo piktybinių sutrikimų. Be to, pranešta, kad po subrendusių DC užkrėtimo žmogaus citomegalovirusu 11 yra imunosupresinės sCD83 molekulės išsiskyrimas, reiškiantis naują viruso imuninio pabėgimo mechanizmą, nes galima įrodyti, kad rekombinantinis sCD83 blokuoja T-ląstelių stimuliaciją 12, 13 ir slopina DC. brendimas in vitro . 12, 13, 14 Be to, įrodyta, kad sCD83 turi labai įdomų farmakologinį potencialą alogeninių pelių odos, širdies ir inkstų transplantacijos modeliuose ir eksperimentiniame autoimuninio encefalomielito modelyje. 14, 15, 16, 17 Klinikinis sCD83 poveikis IBD nebuvo žinomas.

Šiame tyrime, norėdami ištirti sCD83 terapinį potencialą, mes panaudojome nusistovėjusį eksperimentinį IBD gyvūnų modelį - 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) sukeltą kolitą. Įdomu tai, kad gydomiems gyvūnams pasireiškė mažiau sunkūs klinikiniai simptomai, sumažėjo makrofagų ir granulocitų infiltracija storosios žarnos intersticyje ir sumažėjo uždegiminių citokinų raiška. Anksčiau buvo pranešta, kad siekiant išvengti organų persodinimo atmetimo naudojant sCD83, sCD83 sukelta indoleamino 2, 3-dioksigenazės (IDO) raiška yra absoliučiai būtina. 14 Mechaniniu požiūriu, čia pateiktame IBD tyrime mes galime parodyti, kad sCD83 sukelta IDO raiška yra absoliučiai būtina, nes tuo pat metu sCD83 vartojimas su IDO specifiniu inhibitoriumi 1-metil-triptofanu (1-MT) drastiškai sumažino imunosupresinį sCD83 poveikį. . Apibendrinant, pateikiame pirmąjį principo įrodymą, kad sCD83 yra stiprus imuninės sistemos moduliatorius DNBS sukeltam pelių kolitui. Tačiau reikia papildomų tyrimų, kad būtų galima toliau ištirti jo terapinį potencialą IBD sergantiems pacientams.

REZULTATAI

CD83 yra ekspresuojamas virškinimo trakte ir MLN

Anksčiau buvo pranešta, kad CD83 turi imunomoduliacines savybes. 14, 15, 16, 17 Norėdami ištirti CD83 vaidmenį žarnyne, atlikome CD83eGFP reporterių pelių multispektrinę kamerų analizę, atskleisdami didelę CD83 raišką naivių pelių virškinimo trakte. Panašiai kaip blužnyje ir periferiniuose limfmazgiuose, 18 mes nustatėme stiprų CD83 promotoriaus aktyvumą mezenterinių limfmazgių (MLN) ląstelėse, Peyer pleistrai ir izoliuoti žarnos limfoidiniai folikulai (1a pav.). Stebėjimas srauto citometrija (1b paveikslas) parodė, kad ~ 30% MLN ląstelių ir 0, 08% visų storosios žarnos ląstelių ekspresuoja CD83 naiviose pelėse (1c paveikslas). Pagrindinės MLN ir dvitaškių CD83 + populiacijos buvo B ląstelės (73%; 1b, d pav.). MLN ląstelėse CD83 + populiacijoje (1d paveikslas kairėje) buvo pastebėta daugiau CD3 + CD4 + (15, 5%) ir CD3 + CD8 + (5, 6%) T ląstelių, palyginti su storosios žarnos (atitinkamai 7% ir 1, 6%) pav. 1d, dešinėje). Tačiau analizuojant mieloidinius subpopuliacijas, buvo daugiau CD11c + DC (10, 2%), Ly6C + F4 / 80 - monocitų / neutrofilų (7, 8%) ir Ly6C - F4 / 80 + naiviosios gaubtinės žarnos makrofagų (1d pav., Dešinėje). dalis CD83 + ląstelių nei MLN (atitinkamai 1, 5%, 2, 8% ir 2, 7%; 1d pav., kairėje). Pranešama, kad CD83 yra DC, B ląstelių ir T ląstelių subpopuliacijų aktyvacijos žymeklis. Taigi stebėjome CD83 raišką DNBS kolito modelyje ligos piko metu, ty 3 dieną po gydymo DNBS. Naudojant imunohistocheminius tyrimus, DNBS gydytų gyvūnų lamina propria (LP), kurie sutapo su CD8 + ląstelėmis infiltruotomis vietomis, buvo pastebėti stiprūs CD83 teigiamų ląstelių įsiskverbimai (2a, b pav.). Be to, srauto citometrija parodė reikšmingą CD83 + B220 + ląstelių (2c paveikslas) ir CD83 + CD3 + T ląstelių (2d paveikslas) padidėjimą gyvūnų, kenčiančių nuo DNBS kolito, storosios žarnos audiniuose. Tačiau, naudodamiesi multiepitopinių ligandų kartografija (MELC), mes galime parodyti, kad dauguma infiltruojančių leukocitų buvo CD11b + Ly6G + neutrofilų granulocitai (2e paveikslas, geltonos ląstelės) ir CD11b + Ly6G - monocitai / makrofagai (2e paveikslas, raudonosios ląstelės). Norėdami išsamesnį LP infiltruojančių CD83 + leukocitų apibrėžimą, mes išskyrėme mononuklearines ląsteles iš pelių storosios žarnos CD83eGFP reporterių pelių LP ir išanalizavome CD83 + ląstelių populiacijas srauto citometrija (papildomas paveikslas S1 internete). Čia mes nustatėme ∼ 10% LP ląstelių kaip CD83 + (papildomas paveikslas S1B), kurios gerai koreliavo su histologija (2a paveikslas). Didžioji dauguma CD83 + ląstelių buvo B220 + B ląstelės (70–80%), po jų sekė CD11c + DC (11%), CD3 + T ląstelės (6%) ir CD11b + ląstelės (4%) (papildomas S1D ​​paveikslas), kairėje). Atidžiau ištyrus, paaiškėjo, kad dauguma CD83 + T ląstelių buvo CD4 + (56%) ir tik 13% buvo CD8 + T ląstelių. Keista, bet gana didelę dalį (∼ 30%) sudarė DN T ląstelės (papildomas S1D ​​paveikslas, dešinėje). Beveik visi CD83 + DC buvo CD8 neigiami CD11c + (91%), 5% pDC ir tik 1% CD8 + CD11c + DC (papildomas paveikslas S1F, kairėje). Įdomu tai, kad daugiau nei 50% CD83 + CD11b + ląstelių buvo eozinofilai, ∼ 40% monocitų / makrofagų ir tik 2% CD11b + Ly6G hi F4 / 80neg neutrofilų (papildomas paveikslas S1F, dešinėje).

Image

CD83 yra labai ekspresuojamas virškinimo trakte (GI) ir mezenteriniuose limfmazgiuose (MLN). Šviežiai išgauti ( a, kairės) laukinio tipo arba ( a, vidurio, dešinės) CD83eGFP reporterių pelių GI audiniai buvo analizuojami multispektrine fotoaparatų sistema (Maestro, Cri); CD83 promotoriaus veikla (žalia); (balta): audinio ir išmatų autofluorescencija; pateikti duomenys yra nesujungti spektriniai vaizdai. ( b ) MpNL, gautų ant naivios CD83eGFP reporterio pelės CD83eGFP + ląstelių (kairėje), srauto citometrinė analizė. Vidutinis CD83eGFP + ląstelių pasiskirstymas ( c, kairėje) bendrojoje MLN ir ( c, dešinėje) storosios žarnos audinyje kartu su ( d ) CD83eGFP + pogrupiais buvo stebimas srauto citometrija ( n = 5).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

Eksperimentinio kolito metu CD83 ekspresija yra reguliuojama gaubtinėje žarnoje. a ) CD83 ir CD8 imuninis dažymas negyvose Balb / c pelių (maketas) ir 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) / etanolio (4 mg) storosios žarnos užšaldytuose skyriuose - 72 valandas po gydymo. DNBS kolito gyvūnams nustatyta CD83 + ląstelių infiltracija į lamina propria (LP) (viduryje) panašiais atstumais kaip infiltruojančių CD8 + ląstelių (dešinėje); mikrofotografijos padarytos padidinus x 20; strypai = 50 μm. ( b - d ) Neapdoroto (maketas) ir DNBS / etanolio (4 mg) - neapdoroto CD83eGFP reporterio srauto citometrija, palyginti su C57Bl / 6 kontrole, patvirtino padidėjusią CD83 + ląstelių infiltraciją į storosios žarnos audinius praėjus 72 valandoms po gydymo ( b ) su infiltruojančiu CD83 + B220 + ląstelės ( c ) ir CD83 + CD3 + T ląstelės ( d ); ( n = 3–9). ( e ) storosios žarnos audinio 3 dienos imunofluorescencinės mikroskopijos (daugiaepitopinių ligandų kartografija (MELC)) RGB vaizdas po DNBS gydymo parodė infiltracines CD11b + (raudonas) ir CD11b + Ly6G + (geltonas) ląsteles. CD11b: raudona, Ly6G: žalia ir CD31: mėlyna; baras = 10 μm. ( f ) Tirpus CD83 (sCD83) su fermentais susietas imunosorbentų tyrimas (ELISA) parodė, kad sCD83 išsiskiria gaubtinės ir DNBS pelių (3 diena) storosios vienos ląstelės suspensijomis (3 diena), inkubuotoms 5 h ( n = 6–7). ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė (ANOVA) Tukey daugkartinis palyginimo testas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Kaip buvo pranešta, kad CD83 + ląstelės sugeba atpalaiduoti tirpią CD83 molekulės formą, toliau išanalizavome, ar tokią tirpią formą galima aptikti dvitaškyje. Taigi buvo paruoštos vienaląsčių storosios žarnos audinių suspensijos, o tada ląstelės buvo inkubuotos in vitro, o supernatantai buvo analizuojami fermentais sujungtu imunosorbentų tyrimu (ELISA), kad būtų galima aptikti sCD83 molekules. Įdomu tai, kad ypač ląstelėse, gautose iš DNBS gydytų gyvūnų, buvo galima nustatyti sCD83 padidėjimą (2f pav.). Taigi, DNBS kolito metu: (i) CD83 + ląstelės verbuojamos į uždegimines storosios žarnos sritis ir (ii) išsiskiria tirpi CD83 izoforma. Tačiau galimas sCD83 buvimo biologinis reikšmingumas kolito metu nebuvo žinomas, todėl vėliau buvo nagrinėjamas.

Gydymas sCD83 palengvino DNBS sukelto kolito simptomus

Anksčiau mūsų ir kitų grupių atstovai pranešė, kad tirpios CD83 molekulės gali slopinti pelių DC tarpinamą T-ląstelių aktyvaciją in vitro ir pelių imuninį atsaką autoimuninio eksperimentinio autoimuninio encefalomielito, taip pat alogeninių transplantacijų modeliuose in vivo . 12, 13, 14, 15, 16, 17 Dėl įdomios CD83 raiškos žarnyne ir aptikimo sCD83 eksperimentiniame IBD, mes ištyrėme sCD83 terapinį poveikį uždegiminiams virškinimo trakto procesams. Pamatę endogeninio sCD83 reguliavimą nusistovėjusiame DNBS sukeltame kolite, mes panaudojome šį modelį ūmaus uždegimo ir opų sukėlimui pelių dvitaškiuose. Klinikinės šio modelio savybės yra hemoraginis viduriavimas, didelis kūno svorio praradimas ir storosios žarnos sienelių sustorėjimas. 19 Eksperimentinis nustatymas buvo toks: pelėms 0 dieną buvo pasėjama DNBS, o −1, 0 ir +1 dienomis jos buvo gydomos sCD83 su 100 μg sCD83 intraperitoniniu būdu (papildomas paveikslas S2). Kaip ir tikėtasi, BALB / c pelių DNBS gydymas sukėlė laikiną kolitą, kuriam būdingas svorio kritimas, viduriavimas, edema, opos ir audinių struktūros praradimas. Klinikiniai ligos simptomai, įvertinti makroskopiniais ir histologiniais pažeidimų balais, taip pat DNBS sukelto kolito sunkumas, pasiekė aukščiausią reikšmę 3 dieną po injekcijos ir išnyko po to. Pirmasis labai ryškus sCD83 poveikis buvo labai sumažėjęs DNBS + sCD83 gydytų pelių mirtingumas (3a pav.). Svorio kinetikos analizė taip pat pabrėžė sCD83 apsauginį poveikį (3b paveikslas). Pelių, gydytų DNBS + sCD83, rodikliai atsigavo nuo 2 iki 3 dienos, o svoris padidėjo trečią dieną, tuo tarpu tik DNBS gydytų gyvūnų vidutinis svorio kritimas 22% ligos piko metu buvo 3 diena. DNBS + sCD83 pelių vidutinis svorio kritimas trečią dieną buvo tik 13%. 3 dienos makroskopinių rodiklių palyginimas parodė, kad pelių, padidėjusių tik DNBS, patologija yra padidėjusi (3c, d pav.). Histologinė hematoksilino ir eozino audinių dažų analizė patvirtino šiuos duomenis (3e pav.). SCD83 gydytų gyvūnų organizme buvo sumažėjęs infiltruojančių leukocitų skaičius, ne toks didelis storosios žarnos struktūros sunaikinimas ir nedidelis gobtelės ląstelių praradimas (3e, f pav.). Taigi gydymas sCD83 atskleidė didelį galimą apsauginį poveikį DNBS kolito metu.

Image

Tirpus CD83 (sCD83) palengvina 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) sukeltą kolitą. DNBS gydytų Balb / c pelių uždegimas buvo įvertintas pagal: a ) išgyvenamumą, n = 55–75 pelės / grupė. ( b, kairysis skydelis) Svorio netekimas praėjus 72 valandoms po gydymo. ( b, dešinysis skydelis) Svorio metimas 3 dieną, n = 57–80 pelių / grupė. c ) storosios žarnos ilgis: DNBS + sCD83, vidurys: tik DNBS, apačia: etanolio kontrolė. Juosta = 1 cm. d ) Makroskopinės ligos balas, n = 55–75 pelės / grupė. e ) f ) histologinė žala; n = 18–27 pelės / grupė. Vidurkis ± sem, *** P <0, 001, dispersijos analizė (ANOVA) Tukey daugkartinis palyginimo testas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Gydymas sCD83 slopino uždegiminių leukocitų įsiskverbimą į storąją žarną

DNBS sukelia T ląstelių sukeltą uždegimą storosios žarnos gleivinėje, kuriam būdingas aktyvuotų T ląstelių, makrofagų ir neutrofilų įsiskverbimas į storosios žarnos sienelę. 20 iš T ląstelių gaunami citokinai, kaip IL-2, TNF-α ir IFN-γ, skatina žarnų uždegimą suaktyvindami makrofagus, monocitus ir granulocitus, kad išskiria didelius kiekius TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12. ir reaktyviosios oksido rūšys. Ypač neutrofilai ir monocitai yra pagrindiniai infiltruojantys traumą sukeliantys fagocitiniai leukocitai. 3

Mūsų eksperimentuose DNBS sukeltas kolitas buvo susijęs su padidėjusia uždegiminių citokinų TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 ir mediatorių kaip arginase-1, ciklooksigenazės 2 ir indukuojamo azoto oksido sintazės ekspresija (pav. 4). Pelių, gydytų tik DNBS, dvitaškėse taip pat buvo padidėjusi IFN-γ ekspresija (4 paveikslas). DNBS pelėms reaguojant į sunkius audinių pažeidimus ir oksidacinį stresą, padidėjo ir citochromo P 450 super šeimos nariai Cyp1A1 ir Cyp1B1. Įdomu tai, kad sCD83 gydytų DNBS pelių dvitaškėse buvo stiprus ir reikšmingas šių uždegimo mediatorių slopinimas (4 paveikslas). 3 dieną visi mRNR lygiai buvo panašūs į tuos, kurie buvo nustatyti kontroliniais gyvūnais, gydytais etanoliu. DNBS + sCD83 gydytų reikšmingų Th2 citokinų mRNR (GATA 3, IL-4 ir IL-10) pokyčių ar reguliuojamųjų T ląstelių (Treg) specifinių žymenų genų (Foxp3, TGF-β) padidėjimo nepastebėta. pelės (4 paveikslas, trečia eilutė). DNBS + sCD83 gydytų pelių Foxp3 mRNR lygiai mėgdžioja kontrolinių gyvūnų lygius, kaip patvirtinta papildomais eksperimentais (papildomas S3A paveikslas). Šlaunies stromos limfopoetino (TSLP) kiekis DNBS + sCD83 gydytoje grupėje buvo žymiai didesnis, palyginti su pelėmis, kurios buvo gydomos tik DNBS +, ir panašus į etanoliu gydytų kontrolinių raiškos lygius (4 paveikslas). TSLP gamina epitelio ląstelės, keratinocitai ir žarnyno DC. Apsaugo nuo kolito, ribodamas Th17 ląsteles ir skatindamas Treg vystymąsi, 21 bei tarpininkaudamas atsigauti po storosios žarnos uždegimo. 22 Panašu, kad sCD83 nesukelia TSLP ekspresijos, tačiau blokuodamas epitelio barjero sunaikinimą, kurį sukelia uždegimas, jis gali užkirsti kelią TSLP ekspresijos sumažėjimui.

Image

Tirpus CD83 (sCD83) panaikina uždegiminių mediatorių raišką ir makrofagų bei neutrofilų įsiskverbimą į 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) gydytų pelių dvitaškius. Interleukino (IL) -1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, arginazės 1 (Arg-1), ciklooksigenazės 2 (Cox) kiekybinis realiojo laiko atvirkštinės transkriptazės – PGR (qRT – PGR) -2), Cyp1A1, Cyp1B1, indukuojama azoto oksido sintazė (iNOS), naviko nekrozės faktorius α (TNF-α), interferonas-γ (IFN-γ), transformuojantis augimo faktorių β (TGF-β), šlaunies stromos limfopoetiną. (TSLP), GATA3, Foxp3 ir CD11b ekspresija storosios žarnos audinyje po DNBS kolito 3 dieną. Vidurkis ± sem, n = 5–10 pelių / grupė, duomenys normalizuoti pagal HPRT; valdymas (juodos juostos), DNBS (atviros juostos), DNBS + sCD83 (pilkos juostos); * P <0, 05, ** P <0, 01, studento t- testas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Remiantis histologija ir patologija, sCD83 gydytuose gyvūnuose nepastebėta didesnio CD11b ekspresuojančių ląstelių įsiskverbimo, palyginti su kontroliniais gyvūnais, gydytais etanoliu (4 paveikslas, apatinė eilutė).

IDO raišką MLN padidino sCD83 DNBS kolito metu

Norėdami gauti daugiau įžvalgos, MLN esančios ląstelių subpopuliacijos buvo analizuojamos srauto citometrijos metodu. Pelėms, kurios buvo gydomos tik DNBS, buvo nustatytas mažesnis CD3 + / CD4 + ir CD3 + / CD8 + T ląstelių skaičius. 3 dieną pasireiškė sunkus kolitas. Priešingai, SCD83 gydytų DNBS pelių T ląstelių skaičius MLN buvo panašus į tuos, kurie randami kontroliniais gyvūnais, gydytais etanoliu (5a pav.). Nebuvo pastebėta jokių reikšmingų skirtumų, susijusių su CD3 + / CD4 + / Foxp3 + Tregs skaičiumi (5a paveikslas). DNBS apdorotose pelėse vėl buvo padidėjęs CD11b + ląstelių lygis (5a pav.).

Image

Tirpus CD83 (sCD83) normalizavo T-ląstelių skaičių ir padidino indoleamino 2, 3-dioksigenazės (IDO) ekspresiją mezenteriniuose limfmazgiuose (MLN). a ) MLN srauto citometrija parodė, kad DNBS + sCD83 ir etanolio pelėse buvo lygus CD3 + CD4 + ir CD3 + CD8 + T ląstelių skaičius, CD3 + CD4 + Foxp3 + reguliuojančių T ląstelių (Tregai) pokyčių visose grupėse nebuvo, ir daugiau CD11b + ląstelių 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) pelėse tik 3 dieną ( n = 5–9). b ) Kiekybinis realaus laiko atvirkštinės transkriptazės – PGR (qRT – PGR) CD3e, CD83, γ-interferono (IFN-γ), IDO, interleukino (IL) -1β, IL-6, IL-17A, IL- 17F, arginazė 1 (Arg-1), ciklooksigenazė 2 (Cox-2) ir indukuojama azoto oksido sintazės (iNOS) ekspresija MLN po DNBS sukelto kolito 3 dieną (vidurkis ± sem, n = 5–11 pelių / grupė), duomenys normalizuoti iki HPRT; kontrolė (juoda juosta), DNBS (atvira juosta), DNBS + sCD83 (pilka juosta); * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, studento t- testas).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Papildomi CD3e specifiniai kiekybiniai realiojo laiko atvirkštinės transkriptazės – PGR (qRT – PGR) duomenys patvirtino, kad T ląstelių emigracija sumažėjo DNBS + sCD83 gydytų grupių metu, palyginti su tik DNBS gydytais gyvūnais (5b paveikslas). Be to, DNBS + sCD83 apdorotos pelės atitiko pelių, pagamintų etanoliu, atitiktį, atsižvelgiant į jų didesnę CD83 ir IFN-γ išraišką MLN (5b paveikslas). DNBS + sCD83 pelių MLNs ir etanolio kontrolėse taip pat buvo palyginamų arginazės-1, ciklooksigenazės 2 ir indukuojamų azoto oksido sintazės ekspresijos lygių (5b paveikslas). Uždegiminiai citokinai, tokie kaip IL-1β, IL-6, IL-17A ir IL-17F, taip pat buvo sumažinti DNBS + sCD83 gydytose pelėse, palyginti su pelėmis, kurios buvo gydomos tik DNBS (5b paveikslas). Taigi sCD83 sumažina T-ląstelių aktyvaciją, todėl DNBS kolito metu mažiau aktyvuotų ląstelių išeina iš MLN. Dėl aktyvacijos sumažėjusi aktyvuotų leukocitų infiltracija žarnyne gali atsirasti dėl sCD83 sukeltos ląstelių migracijos defekto, todėl tai buvo ištirta. Tačiau gyvūnams, kuriems buvo skirtas CD83, nepavyko aptikti skirtingo žarnyne esančių receptorių CCR9 ir α4 integrino CD49d ekspresijos lygio (papildomas S3C paveikslas). Be to, mes ištyrėme sCD83 gebėjimą blokuoti lipopolisaharidų stimuliuojamų kaulų čiulpų (BM) sukeliamų BM-DC migraciją prieš CCL19 chemokino gradientą in vitro . Tačiau, kaip parodyta papildomame S3D paveiksle, sCD83 visiškai nepaveikė nuolatinės srovės migracijos. Kitas galimas sumažėjusio aktyvuotų ląstelių skaičiaus paaiškinimas galėtų būti tas, kad sCD83 sukelia apoptozę. Dėl uždegimo tik DNBS gydytų pelių audiniuose apoptozės dažnis bus daug didesnis, palyginti su DNBS + sCD83 gydytais gyvūnais. Todėl palyginome naivias, su SCD83 gydytas, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, nesukeliančiomis kolito. Pelėms buvo įšvirkšta 100 μg sCD83 į pilvaplėvės ertmę 3 dienas, o jų splenocitus analizavome 4 dieną srauto citometrijos būdu (papildomas S3E paveikslas). B-ląstelių, T-ląstelių, DC ar CD11b + ląstelių homeostazei įtakos neturėjo. Naudojant 7-aminoaktinomiciną D ir aneksiną V, blužnies dažymas taip pat neparodė didesnės ląstelių žūties in vivo pelių , gydomų sCD83 , (papildomas paveikslas S3E). Identiška MLN ląstelių ex vivo srauto citometrinė analizė parodė palyginamus rezultatus (duomenys nepateikti). Taigi sCD83 nesukelia padidėjusios pagrindinių leukocitų populiacijos ląstelių mirties. Be to, mes ištyrėme pelių dvitaškius, kuriems 3 dienas 5 dienas buvo įšvirkšta 100 μg sCD83. 5 kartus sCD83 gydomoms pelėms buvo nustatytas nuolatinis storosios žarnos ląstelių proliferacija, pasireiškiant spalvai Ki67, panašiai kaip naivioms pelėms, o kaspazės-3 ir -8 nepadidėjusios apoptozės. dažymas (papildomas paveikslas S3F).

Gerai žinoma, kad IDO yra susijęs su imuninės sistemos slopinimu ir per mažu imuninės sistemos atsakų sumažėjimu tiek in vitro , tiek in vivo . 23, 24, 25 Todėl, naudodamiesi qRT – PGR, mes taip pat išanalizavome, ar IDO ekspresijos lygius keičia žarnyno uždegimo modelis sCD83. Tiesą sakant, mes galime aptikti žymiai padidėjusius IDO mRNR ekspresijos lygius DNBS + sCD83 gydytų gyvūnų MLNs, palyginti su kontrolinėmis ir DNBS gydomomis pelėmis (5b paveikslas). Šie duomenys parodė, kad IDO iš tikrųjų gali būti reikšmingas apsauginiam poveikiui, stebėtam sCD83 gydytų gyvūnų.

IDO slopinimas sutrikdo sCD83 sukeltą apsauginį poveikį

IDO yra fermentas, katalizuojantis daugelio tipų ląstelių esminės aminorūgšties triptofano skaidymąsi. IDO fermentinis aktyvumas gali būti specialiai blokuojamas, naudojant inhibitorių 1-MT. Taigi, siekiant toliau tirti IDO vaidmenį, susijusį su sCD83 sukeltu imunosupresiniu poveikiu mūsų IBD modelyje, sekančiuose in vivo eksperimentuose IDO aktyvumas buvo užblokuotas implantuojant 1 MT impregnuotas granules (15 mg per dieną –1 ) arba transporto priemonės kontrolinės granulės, esančios po kaklo oda, per dieną –1. DNBS buvo skiriamas 0 dieną, o pelės buvo gydomos sCD83 −1, 0 ir +1 dienomis. Įdomu tai, kad kai DNBS + sCD83 gydytiems gyvūnams IDO aktyvumą blokavo 1-MT, ankstesnis stebėtas sCD83 sukeliamas apsauginis poveikis buvo prarastas (žr. 6a paveikslą ir papildomą S4A paveikslą). DNBS + sCD83 gydyti gyvūnai, kuriems buvo implantuotos placebo granulės, priešingai, parodė anksčiau stebėtą apsauginį sCD83 poveikį.

Image

Indoleamino 2, 3-dioksigenazės (IDO) inhibitorius 1-metil-triptofanas (1-MT) sumažino tirpiojo CD83 (sCD83) apsauginį poveikį 2, 4-dinitrobenzeno sulfonrūgšties (DNBS) kolitui. sCD83 arba kontrolinėmis DNBS sukeltomis kolito pelėmis buvo implantuotos 1-MT impregnuotos tabletės arba nešiklis (placebas) ir stebimos nuo 0 iki 3 dienos ( a ) mirtingumas. ( b ) Endoskopinės etanolio kontrolės nuotraukos, DNBS + placebas, DNBS + 1-MT + sCD83 ir DNBS + placebas + sCD83. c ) gaubtinės žarnos ilgis. d ) Makroskopinis rezultatas. e ) Histologinis įvertinimas. ( a ) n = 15 pelių / grupė; ** P <0, 01, Mantel – Cox testas; ( c - e ) vidutinis ± sem, n = mažiausiai 10 pelių / grupė; * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė (ANOVA) Tukey daugkartinis palyginimo testas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Atliekant standartinę endoskopijos analizę, DNBS + placebo ir DNBS + 1-MT + sCD83 gydytų gyvūnų neskaidriosios storosios žarnos ir galutinis fibrininis apvalkalas parodė (6b paveikslas). DNBS + placebo + sCD83 gydytais gyvūnais, priešingai, buvo pastebėtas skaidrus ir tik nedidelis storosios žarnos sustorėjimas (6b paveikslas), palyginamas su kontroliniais gyvūnais, gydytais etanoliu (6b paveikslas). Be to, kai rodmenimis buvo naudojamas storosios žarnos ilgis (6c paveikslas), svorio kritimas (papildomas S4C paveikslas) ir bendras makroskopinis bei histologinis rodikliai (6d, e paveikslas), vėl buvo galima pastebėti, kad prarastas SCD83 sukeltas terapinis poveikis. gyvūnams, gydomiems 1 MT. Taigi IDO yra kritiškai susijęs su sCD83 sukeltu imunomoduliaciniu poveikiu, o IDO aktyvumo blokavimas padidino DNBS sukeltą pelių mirtingumą ir klinikinius simptomus sCD83 gydytose pelėse.

DISKUSIJA

IBD etiologija vis dar nėra visiškai suprantama. Dešimtmečių tyrimai atskleidė, kad tai turi būti daugiafaktorinis sutrikimas. Dabartinėje terapijoje derinami vaistai nuo uždegimo ir agentai, mažinantys su IBD susijusius simptomus. Vis dėlto šiems pacientams priklausomybė nuo steroidų vystosi gana dažnai. Anti-TNF-α, vienas iš naujų biologinių vaistų, tiesiogiai nukreiptas į uždegiminius citokinus, tačiau jis taip pat reiškia ir toksinio šalutinio poveikio riziką. 2, 3, 5, 27 Kitas aptartas požiūris, be antikūnų pagrįstų imunosupresinių strategijų, yra fiziologinių imuninių moduliatorių, pvz., Priešuždegiminių neuropeptidų, tokių kaip vazoaktyvusis žarnyno peptidas, kuris reguliuoja imuninę toleranciją, naudojimas. Įrodyta, kad vazoaktyvus žarnyno peptidas vaidina fiziologinį homeostatinį vaidmenį sergant TNBS sukeltu kolitu 29 ir pasižymi terapiniu poveikiu šiame ligos modelyje. 30

Čia mes išanalizavome sCD83, naują fiziologinį imuninį tarpininką 8, 9, kuris parodė labai daug žadančias terapines savybes uždegiminėse ligose. Keletas tyrimų išaiškino, kad sCD83 slopina imuninės sistemos aktyvaciją DC ir T ląstelių sąlygotame aktyvume. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 31, 32 Šiuo atžvilgiu sCD83 galėtų užkirsti kelią ūminiams eksperimentinio autoimuninio encefalomielito autoimuniniams simptomams - pelės modeliui ankstyvoje žmogaus išsėtinės sklerozės uždegiminėje fazėje. 15 Be to, tai sukėlė transplantanto toleranciją pelių inkstų, 14, 17 odos, 16 ir širdies 17 transplantacijos tyrimuose. SCD83 molekulė yra fiziologinis tarpininkas, nes jos taip pat yra sveikų asmenų serumuose. Be to, jis yra virusų 11 ir navikų imuninio pabėgimo mechanizmo dalis. 9

Pradėjus šį tyrimą nebuvo žinoma, ar CD83 fiziologinėmis sąlygomis taip pat yra ekspresuojamas virškinimo trakte. Naudodamiesi CD83eGFP reporterio pelių sistema, 18 pirmą kartą galėjome parodyti, kad CD83 promotorius yra labai aktyvus MLN, Peyer pleistruose ir izoliuotuose limfmazgių folikuluose GI trakte, palyginti su aukšta ekspresija kituose limfiniuose organuose, tokiuose kaip blužnis ir periferinė limfa. mazgai (1b, c pav.). Pagrindinės CD83 + populiacijos buvo identifikuotos kaip B ląstelės, po kurių seka CD3 + / CD4 + ir CD3 + / CD8 + T limfocitai (1b, d pav.). Tarp mieloidinių subpopuliacijų CD83 daugiausia buvo ekspresuojamas CD11c + DC ir Ly6C + uždegiminiais monocitais, taip pat F4 / 80 + makrofagais (1b, d pav.). Išsamūs LP infiltracinių ląstelių ir uždegiminių būklių tyrimai parodė, kad šalia didžiosios B ląstelių populiacijos (70–80%) buvo nedidelė CD3 + T ląstelių populiacija (∼ 6%). Pažymėtina, kad stebėtinai didelė DN T-ląstelių populiacija (29%) išreiškė CD83 CD3 + T-ląstelių populiacijoje (papildomas paveikslas S1D). Be DC (11% CD83 + ląstelių), mes taip pat nustatėme CD83 + eozinofilus (50%), taip pat monocitus / makrofagus (38%), tačiau tik nedidelę neutrofilų populiaciją (2%) CD11b + ląstelių populiacijoje. LP (papildomas paveikslas S1E, F). Įdomu tai, kad bandomuosiuose tyrimuose su Krono pacientų žarnyno audiniais taip pat aptikome padidėjusį CD83 mRNR kiekį, esant tiesioginiam ryšiui su uždegiminių citokinų mRNR, pavyzdžiui, IFN-γ (duomenys nepateikti).

Kitas ryškus šio tyrimo atradimas buvo masinė CD83 + leukocitų infiltracija į uždegiminius storosios žarnos audinius DNBS gydytose pelėse (2 paveikslas). Kaip jau buvo pranešta, kad CD83 + ląstelės sugeba skleisti imunosupresinę tirpią CD83, 8, 9, 11 formą, toliau analizavome, ar taip yra ir storosios žarnos atveju. Ypač DNBS gydytais gyvūnais aptikome padidėjusį sCD83 lygį storosios žarnos ląstelėse (2f pav.).

Taigi galima kelti hipotezę, kad imunosupresinis endogeninis sCD83 gali vaidinti svarbą kontroliuojant IBD. Tačiau sergant sunkiu kolitu, sumos, reikalingos iš esmės slopinti ligos vystymąsi, gali būti nepakankamos. Taigi būsimuose tyrimuose būtų perspektyvus būdas ištirti galimus būdus, kaip padidinti sCD83 išsiskyrimą, infiltruojant in vivo uždegtų audinių CD83 + ląsteles. Tačiau sCD83 išleidimo mechanizmai vis dar nėra aiškūs. Taigi, realus ir įdomus pasirinkimas yra terapinis sCD83 taikymas tokiose koncentracijose, kurios yra pakankamos su IBD susijusių ligos simptomų slopinimui. Norėdami patikrinti šią hipotezę in vivo , mes panaudojome gerai apibūdintą DNBS sukeltą kolito modelį, kuris dažnai buvo naudojamas tiriant storosios žarnos uždegimo mechanizmus ir tiriant naujus priešuždegiminius komponentus. 33, 34, 35 Šis modelis primena žmogaus IBD, įskaitant stiprią storosios žarnos gleivinės infiltraciją per neutrofilus ir makrofagus. Taip pat padidėja uždegiminių mediatorių, įskaitant Th1 citokinus, gamyba. Taigi, dvitaškis, įvestas DNBS, sukelia T ląstelių tarpinį imuninį atsaką, sukeliantį aktyvuotų T ląstelių, makrofagų ir neutrofilų tankią infiltraciją į storosios žarnos sienelę. 20

Mirtingumas yra labai aiški klinikinė baigtis, norint ištirti naujo gydomojo agento veiksmingumą. Kaip parodyta skyriuje Rezultatas, vartojant SCD83, mirtingumas dramatiškai sumažėjo iki <3% (3a pav.). Be to, svorio kinetika aiškiai parodė, kad DNBS + sCD83 gydytos pelės pradėjo atsigauti jau nuo 2 iki 3 dienų po gydymo DNBS, o tik DNBS gydomos pelės vis tiek prarado svorį 3 dieną (3b paveikslas). Pažymėtina, kad DNBS + sCD83 gydytų gyvūnų svorio kritimas buvo daugiau kaip 40% mažesnis, palyginti su pelėmis, kurios buvo gydomos tik DNBS +3, 3 dieną (3b pav.). Makroskopinio rezultato pagerėjimas 3-ą dieną po DNBS taikymo buvo labai reikšmingas sCD83 gydytų gyvūnų (3d paveikslas). Histologinis storosios žarnos įvertinimas praėjus 3 dienoms po DNBS vartojimo, žymiai sumažėjo granulocitų infiltratai gleivinėje ir submucosa, taip pat sumažėjo storosios žarnos sienelės sustorėjimas ir nebuvo gobtelio ląstelių išeikvojimo DNBS + sCD83 gydytiems gyvūnams (3e, f pav.).

Visų pirma, citokinų disbalansas ir uždegiminių mediatorių, daugiausia TNF-α, gamyba turi lemiamos reikšmės eksperimentiniam DNBS kolitui ir žmogaus IBD. 36 iš T ląstelių gaunami citokinai, tokie kaip IL-2, IFN-γ ir TNF-α, tęsia žarnos uždegimą, suaktyvindami audinių makrofagus ir granulocitus, kad atpalaiduotų priešuždegiminius citokinus ir mediatorius, įskaitant IL-1β, IL-6, IL-12., azoto oksidas ir TNF-α. 3 Taigi mes ištyrėme citokinų raišką qRT – PGR storosios žarnos audiniuose. DNBS + sCD83 gydytų pelių dvitaškėse buvo akivaizdus TNF-α, IL-1β, IL-6 ir IL-17A sumažėjimas, taip pat sumažėjusi IFN-γ išraiška (paveikslas 2 pav.) 4). Apskritai gydymas sCD83 smarkiai sumažino uždegiminių citokinų, taip pat kitų uždegimą slopinančių mediatorių, įskaitant arginase-1, ciklooksigenazės 2 ir indukuojamo azoto oksido sintazę, kurie yra tipiniai aktyvuotų makrofagų ir neutrofilų storosios žarnos audiniuose, ekspresiją (4 paveikslas).

Tai koreliavo su sumažėjusiu CD11b teigiamų ląstelių skaičiumi po gydymo sCD83 (4 paveikslas). Tolesnė imunofluorescencijos analizė naudojant MELC nustatė šias CD11b pozityvias ląsteles kaip CD11b + / Ly6G + neutrofilų granulocitus (geltonus) ir CD11b + / Ly6G - monocitus / makrofagus (raudona) (2e pav.). Masinis neutrofilų granulocitų ir monocitų / makrofagų įsiskverbimas į storosios žarnos audinį, kurį parodė hematoksilino ir eozino dažymas bei imunofluorescencinė mikroskopija, 3 dieną po DNBS sukeltos kolito, buvo aiškiai užkirstas kelias gydymu sCD83 (3e, f ir 4 pav.).

MLN gydymas sCD83 atkūrė ląstelių pasiskirstymą, būdingą sveikoms pelėms (5a pav.). Be to, sCD83 sukėlė reikšmingai padidėjusį IDO ekspresijos lygį MLN (5b pav.). IDO ekspresiją gali sukelti IFN-γ ir jis yra pirmasis fermentas kinurenino kelyje ir katabolizuoja N- formilkinnurenino susidarymą iš aminorūgšties L-triptofano. L-triptofano pasišalinimas sukelia antiproliferacinį poveikį tikslinėms ląstelėms, todėl pranešta, kad IDO yra pagrindinis fermentas, slopinantis T ląstelių proliferaciją IFN-γ stimuliuotų DC ir makrofagų pagalba. 23, 24, 37

Įdomu tai, kad DNBS + sCD83 gydytų pelių IFL-γ ekspresijos lygiai MLN yra panašūs kaip kontroliniuose gyvūnuose, gydomuose etanoliu (žr. 5 paveikslą). Padidėjęs IFN-γ ekspresijos lygis, palyginti su tik DNBS gydytais gyvūnais, galėtų būti paaiškinamas tokia hipoteze: gydymas sCD83 lemia mažesnę CD11b + ląstelių infiltraciją (žr. 5a pav.) Ir stiprų uždegiminių citokinų sumažėjimą ( IL-1β, IL-6, IL-17A ir IL-17F; žr. 5b paveikslą), kurie yra būtini norint sukelti visišką T-ląstelių aktyvaciją MLNs ir vėliau T-ląstelių emigraciją. Tai taip pat atspindi sumažėjęs T-ląstelių skaičius MLN, gautų iš tik DNBS gydytų gyvūnų (žr. 5a paveikslą). DNBS + sCD83 gydomiems gyvūnams, priešingai, T ląstelių lygis, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, nesumažėjo. Tai galbūt galėtų paaiškinti, kodėl IFN-γ, kurį daugiausia ekspresuoja aktyvuotos T ląstelės, yra ekspresuojamas didesniais kiekiais sCD83 gydytuose gyvūnuose, palyginamas su lygiais, stebimais etanoliu paveiktose kontrolinėse pelėse. Be to, šie IFN-γ lygiai vėliau gali sukelti IDO indukciją, kaip aptarta aukščiau. Tačiau tikslus (-i) mechanizmas (-ai) turi būti ištirti tolesniuose tyrimuose.

Norint papildomai įrodyti svarbų IDO vaidmenį sCD83 sukeltoje imunosupresijoje, buvo naudojamas 1-MT, triptofano analogas ir IDO farmakologinis inhibitorius. Stebėtina, kad sisteminis 1-MT skyrimas panaikino apsauginį sCD83 poveikį mūsų eksperimentiniame kolito modelyje (6a – e paveikslas ir papildomas S4 paveikslas). Šie rezultatai labai gerai koreliuoja su inksto persodinimo transplantacijos eksperimentais, kai įrodyta, kad sCD83 sukelia tolerogeninį DC nuo IDO priklausomu būdu. 14 Šiuo atžvilgiu neseniai buvo pranešta, kad IDO, be savo fermentinių savybių, turi ir signalą pernešantį aktyvumą, ir, priklausomai nuo TGF-β, indukuoja ilgalaikį tolerogeninių DC ir Tregių toleravimą. 25, 38

Tačiau čia taikytame uždegiminio kolito modelyje sCD83 nepadidino Trego, o užkirto kelią uždegiminių makrofagų ir granulocitų infiltracijai. Taigi šiame trumpalaikio ūminio kolito modelyje tolerancijos skatinimas gali būti ne pagrindinis elementas. Be to, mes negalėjome aptikti padidėjusio TGF-β ir (arba) Foxp3 ekspresijos lygio sCD83 gydytose apsaugotose pelėse (4 ir 5a paveikslai bei papildomas S3 paveikslas). Vietoj to, mes stebėjome palyginamus IFN-γ raiškos lygius kaip kontrolinėse pelėse su etanoliu. Buvo pranešta, kad IFN-γ yra susijęs su trumpalaikiu IDO sukeltu imunosupresiniu aktyvumu, tuo tarpu ilgalaikis poveikis priklauso nuo TGF-β. 25 Be to, Gurtner ir kt. parodė, kad IDO ekspresuoja antigenus pristatančios ląstelės LP pradžioje ir yra indukuojamos keliose ląstelėse rIFN-γ. Jų tyrime IDO slopinimas 1-MT sukėlė sunkesnį TNBS kolitą. 39 Remiantis šiuo tyrimu, vien IDO slopinimas taip pat padidino mūsų DNBS gydytų pelių kolito sunkumą (6 paveikslas ir papildomas S4 paveikslas).

Be to, labai neseni tyrimai parodė, kad neutrofilai apoptozė patiriami esant kinurinui ir neturint triptofano. Van der Sluijs ir kt. 40 pasiūlė, kad plaučių IDO aktyvumas, katalizuojantis triptofano skaidymą, yra atsakingas už neutrofilų apoptozę gripo infekcijos metu. Taip pat matėme smarkiai sumažėjusią arginase-1, ciklooksigenazės 2 ir indukuojamo azoto oksido sintazės, kuri daugiausia ekspresuojama proinflammatoziniuose neutrofiluose ir makrofaguose (4 pav.). Tai bent iš dalies galėtų paaiškinti stiprų apsauginį SCD83 poveikį šiame daugiausia neutrofilų sukeliamame ūminio kolito modelyje. Nepaisant to, nepastebėta jokių pokyčių leukocitų populiacijų pusiausvyroje ir nepadidėjo leukocitų apoptozė, kurią sukėlė sCD83 be uždegimo (papildomas paveikslas S3E). Taigi sCD83 gali blokuoti tik ūminėje uždegimo fazėje, neturėdamas bendro apoptozinio poveikio naiviems leukocitams.

Be to, nebuvo aptiktas jokio sCD83 poveikio žarnyne esančio receptoriaus CCR9 ir α4 integrino CD49d (papildomas S3C paveikslas) ekspresijos lygiams (papildomas S3C paveikslas). Taigi sCD83 greičiausiai neturi tiesioginės įtakos ląstelių migracijai.

Apibendrinant, mes pateikiame pirmąjį principinio įrodymo, kad SCD83 yra terapinis poveikis, esant eksperimentiniam kolitui. Mūsų rezultatai rodo, kad pelių gydymas sCD83 efektyviai sumažina DNBS sukelto kolito sunkumą, kaip parodyta drastiškai sumažėjusiame mirštamumo laipsnyje, slopinant proinflammatinį citokinų raišką ir sumažinant uždegiminių granulocitų ir makrofagų infiltraciją į virškinimo traktą. Taigi sCD83 atveria naujas ir daug žadančias terapines galimybes ir turi galimybę būti toliau nagrinėjamas būsimuose tyrimuose.

METODAI

Pelės. CD83eGFP įmušamos pelės buvo veisiamos Franz-Penzolt-Zentrum (Erlangen, Vokietija). Šis reporterio pelės kamienas buvo aprašytas anksčiau. 18 BALB / c pelių buvo įsigytos iš Charles River Laboratories, Sulzfeld, Vokietija. Buvo laikomasi institucinio ir nacionalinio laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo.

Eksperimentinis kolitas. Kolitas buvo sukeltas įšvirkščiant į vidinę kraują 4 mg DNBS (Sigma, Deisenhofen, Vokietija) į 100 μl 1: 1 etanolio / fosfato buferinio druskos tirpalo (PBS) tirpalą per 4 cm kateterį BALB / c pelėms. Pelės, gavusios vien 50% etanolio arba PBS, buvo naudojamos tik kaip laiko kontrolė. Pelės buvo nužudytos praėjus 3 dienoms po gydymo. Kolitas buvo vertinamas pagal klinikinius ligos balus (maksimalus = 5), remiantis: (1) ar nebuvimu (0):> 10% svorio netekimas, šlapi išangė / minkšta išmatos / tuščia dvitaškis, gaubtinės žarnos sutrumpėjimas, išangės kraujavimas / paslėptas kraujas, makroskopinės opos ir mirtis. Histologinių pažeidimų balai buvo nustatyti hematoksilinu ir eozinu dažytose atkarpose (formalinu fiksuotuose, parafino pavidalo audiniuose; 3 μm pjūviai) ir yra pagrįsti tokiu balu: architektūros praradimas, 0–3; uždegiminis infiltratas, 0–3; taurelės ląstelių išeikvojimas, 0 arba 1; opa, 0 arba 1; edema, 0 arba 1; raumenų sustorėjimas, 0–2; ir 0 arba 1 kripto abscesų buvimas (didžiausias balas = 12), kaip skelbta anksčiau. 41

LP mononuklearinių ląstelių išskyrimas iš pelės storosios žarnos audinio. Norėdami išskirti mononuklearines ląsteles iš žarnyno LP, atskirtos užmuštų pelių gaubtinės žarnos buvo atskirtos, derinant mechaninę disociaciją su fermentiniu skaidymu, naudojant pelę „Lamina Propria Dissociation Kit“ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, pirmiausia buvo pažeisti intraepiteliniai limfocitai iš gleivinės, suplakant audinį 1 x Hanks subalansuotame druskos tirpale (be o), kuriame yra 5 mM EDTA, 5% vaisiaus galvijų serumo ir 1 m M ditiotreitolio. Tada, naudojant švelniusMACSTM disociatorius (Miltenyi Biotec), LP audinys fermentais ir mechaniškai buvo atskirtas į vienos ląstelės suspensiją. Be gamintojo protokolo, gautos ląstelės buvo toliau išgrynintos naudojant „Percoll“ gradientą (40% / 80%).

Imuninės sistemos slopinimas. The extracellular domain of human CD83 (amino acids 20–145), sCD83, was purified from bacteria before intraperitoneal injection of 100 μg sCD83 in 100 μl saline solution (>50 endotoxin units/mg protein); 42 at −1, 0, and +1 days to DNBS instillation.

IDO inhibition by 1-MT pellet implantation. Slow-release polymer pellets (IRA, Sarasota, FL) impregnated with 1-MT (15 mg/day for 14 days) or placebo pellets were inserted surgically under the dorsal skin between ear and shoulder 1 day before the intrarectal administration of DNBS (day −1).

qRT–PCR. Tissues were removed and stored in RNAlater solution (Life Technologies, Darmstadt, Germany) at −80 °C. Total RNA was prepared from tissue using the RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Traces of genomic DNA were removed by DNase digestion with the RNase-free DNase Set (Qiagen). Subsequently, cDNA synthesis was performed (First Strand cDNA Synthesis Kit; Thermo Scientific, Schwerte, Germany). Primers selected from a primerbank or previously published primers (Supplementary Table S1) were used in qRT–PCR with the DyNAmoTM Capillary SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes, Espoo, Finland). Relative Quantification normalizing to HPRT was performed using the Light Cycler Software (Roche, Mannheim, Germany).

High-resolution colonoscopy. Endoscopy in live mice has been performed as previously described. 43

Imunohistochemija. Tissues were formalin fixed and processed according to standard histological protocols. Staining with ABC reagent was conducted according to the manufacturer's instructions (Vector Laboratories, Peterborough, UK). Sections were stained for CD83 (AF-1437 (R&D, Wiesbaden, Germany) and rabbit anti-goat IgG biotin, (Dako Cytomation, Hamburg, Germany)) and CD8 (eBioH35 (eBioscience, Frankfurt, Germany) and goat anti-rat IgG biotin, (Pharmingen, Heidelberg, Germany)) with a standard protocol for development with AEC substrate. Tissues were counterstained with haemalaun (Merck, Darmstadt, Germany). In some samples, immunofluorescence of tissue sections was performed using the TSC Cy3 system as recommended by the manufacturer (PerkinElmer, Hamburg, Germany) and the following antibodies were used: the primary antibodies anti-activated caspase-3 (polyclonal Cat. no. 9661, Cell Signaling, Frankfurt, Germany), anti-activated caspase-8 (D5B2 Cat. no. 8592, Cell Signaling), anti-Ki67 (SP6 Cat. no. ab16667, Abcam, Cambridge, UK), and a biotinylated secondary anti-rabbit-antibody (goat anti-rabbit IgG-B: sc-2040, Santa Cruz, Heidelberg, Germany). The nuclei were counterstained with Hoechst 33342 (Invitrogen, Darmstadt, Germany). Fluorescence microscopy (Leica, Wetzlar, Germany) was used for analysis.

ELISA. Colons were dissociated mechanically. Colonic single-cell suspensions of 10 5 cells were incubated in 100 μl RPMI for 6 h at 37 °C in a CO 2 incubator. sCD83 ELISA was conducted in a sCD83 sandwich enzyme immunoassay kit (Uscn Life Science, Wuhan, China) according to the protocol of the manufacturer.

Srauto citometrija. Colons and MLNs were dissociated mechanically. Cell surface staining using flow cytometry employed the standard procedures and the following conjugated antibodies: anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD3 (500A2), anti-CD4 (RM4-5), anti-CD11b (M1/70), anti-CD11c (HL3), anti-CD83 (Michel-19), anti-CD103 (M290), anti–Ly-6G (1A8) (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany); anti-CD8 (53-6.7), anti-Ly6C (HK1.4) (Biolegend, London, UK); and anti-F4/80 (BM8) (eBioscience). Intracellular staining for Foxp3 (FJK-16s) was conducted according to the manufacturers' instructions (eBioscience). Colon and MLN single-cell suspensions were incubated with appropriate fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies and run for 4- or 7-color fluorescence staining on a cytofluorometer (FACS Canto II, BD, Heidelberg, Germany) and analyzed with FlowJo 10 (Tree star, Ashland, OR).

Multiepitope ligand cartography. Cryostat tissue sections (5 μm) were performed from colon using a cryotome (Leica CM 3050S). Samples were incubated in acetone for 10 s, air dried, and kept on storage at −20 °C for several days. In immediate preparation for subsequent MELC analysis, the samples were incubated in acetone for 10 min at −20 °C and then air dried for 10 min at room temperature. For rehydration the sections were incubated with PBS pH 7.4 (Lonza, Verviers, Belgium) for 5 min and then rinsed five times in PBS. Afterwards, the samples were incubated in normal goat serum (Dako, Hamburg, Germany, 1:30 in PBS) for 30 min and then washed five times with PBS. For the MELC measurement, a slide with a colon sample was placed on the stage of a fluorescence microscope as part of the MELC robot technology. 44, 45 Then, fluorescein isothiocyanate (FITC)–labeled antibodies (anti-Ly6G, clone 1A8; anti-CD11b, clone M1/70; anti-CD31, clone 390, all provided by BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) and washing solution (PBS; Lonza) were added and removed under temperature control by the MELC robot. The phase contrast and fluorescence images were acquired by an inverted wide-field fluorescence microscope (Leica DM IRE2; × 20 air lens; numerical aperature 0.7) with a cooled CCD camera (Apogee KX4, Apogee Instruments, Roseville, CA), followed by soft bleaching (centered at 488 nm for FITC). Recording of all image data and coordination of all system components were controlled by software developed by MelTec GmbH (Magdeburg, Germany). All these processes (antibody binding/fluorescence detection/soft bleaching) were part of a fully automated cycle. As a control for unspecific tag-binding, the first MELC cycles were performed with FITC-labeled mouse immunoglobulin G in different dilutions. For MELC data analysis, the fluorescence images produced for each tag binding site were aligned pixel-wise using the corresponding phase contrast images. Flat-field corrections were used to correct the images for illumination.

Generation of BM-DCs. DCs were generated from BM cells derived from Balb/c mice. After removing all muscle tissues with gauze from the femurs and tibias, the bones were placed in a 60-mm dish with 70% ethanol for 1 min and then rinsed with PBS, and transferred into a fresh dish. Both ends of the bones were cut with scissors and the marrow was flushed out using ∼ 20 ml PBS with a syringe and 25-gauge needle. The BM was suspended and passed through a 70 μm cell strainer to remove small pieces of bone and debris. After washing, the cells were diluted 1:1000 in Casyton and counted in the CASY Cell Counter (Schärfe System, Reutlingen, Germany). 2 × 10 6 fresh BM cells were cultured in 10 ml R10 medium with 10% culture supernatant of a murine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)–transfected cell line (equivalent to >200 U ml −1 ). At day 3, 10 ml of fresh medium (R10+10% GM-CSF) was added. At days 6 and 8, 10 ml medium was removed and replaced with 10 ml fresh medium (R10+10% GM-CSF). Mature DCs were generated by adding lipopolysaccharide (100 ng ml −1 ; Sigma-Aldrich) overnight to day 8 BM cultures. The BM-DCs were harvested at day 9 and counted in the CASY Cell Counter.

DC migration assay. Lipopolysaccharide-stimulated BM-DCs were resuspended in migration medium to a final cell number of 2 × 10 6 /ml. In each of the 24 wells of the transwell plate (Corning Costar, London, UK), 600 μl migration medium per well was added. Subsequently, preequilibrated transwell inserts with a pore size of 5 μm were added to the wells. 2 × 10 5 cells (100 μl) were seeded into the inserts. To specific ones, 25 or 50 μg ml −1 sCD83 were added. In addition, cells were also put aside for the standard curve. In order to analyze the migration toward the chemokine gradient, CCL19 (100 ng ml −1, Peprotech, Hamburg, Germany) was added to the lower compartment. Cells were allowed to migrate for 2 h at 37 °C. Afterward, DCs were harvested from the lower chamber and the cell numbers were determined by measuring the β-glucuronidase activity of migrated cells as compared with the standard curve as described below.

β-Glucoronidase assay. To determine the numbers of migrated BM-DCs, cells were resuspended in 25 μl PBS and 5 μl 1% TritonX-100 in PBS was added. After 15 min of incubation at room temperature, the debris was removed by centrifugation and 25 μl of the respective lysates were incubated with 75 μl 10 m M 4-nitrophenyl-β- D -glucuronide (NPDG) solved in 100 m M sodium acetate, pH 4, for 2 h at 37 °C. Subsequently, 100 μl 0.4 M glycin, pH 10, was added and the absorbance at 405 nm was measured using a Victor2 multilabel counter (PerkinElmer, Jugesheim, Germany).

Statistics and data presentation. All statistics were calculated in Prism 5.0 (GraphPad, La Jolla, CA) and are analysis of variance with Tukey's post-test or Student's t -test as indicated in the respective figure legends. Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Supplementary Figure S1A–D

  2. 2.

    Supplementary Figure S1E, F

  3. 3.

    Papildomas S2 paveikslas

  4. 4.

    Supplementary Figure S3A–D

  5. 5.

    Supplementary Figure S3E, F

  6. 6.

    Supplementary Figure S4A–C

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

  2. 2.

    Papildoma S1 lentelė

    PAPILDOMA MEDŽIAGA susieta su internetine šio leidinio versija adresu //www.nature.com/mi