Specifinis treonino-4 fosforilinimas ir rna polimerazės ii ctd funkcija vykstant m fazei | mokslinės ataskaitos

Specifinis treonino-4 fosforilinimas ir rna polimerazės ii ctd funkcija vykstant m fazei | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių biologija
  • Genetika

Anotacija

Dinaminis Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7 heptado pasikartojimų didžiojo subvieneto C-galiniame domene (CTD) fosforilinimas koordinuoja RNR polimerazės (Pol) II progresavimą per transkripcijos ciklą. Čia aprašome M fazei būdingą Pol II formą, fosforilintą Thr4, bet ne Tir1, Ser2, Ser5 ir Ser7 liekanose. „Thr4“ fosforilintas Pol II jungiasi prie centrosomų ir vidurio kūno bei sąveikauja su Thr4 specifine Polo tipo kinaze 1. Pol II jungimasis prie centrosomų nereikalauja CTD, tačiau gali apimti nekanoninio R2TP-Prefoldino tipo komplekso subvienetus, kurie jungiasi ir kartu lokalizuojasi su Pol II centrosomose. CTD Thr4 mutantai, bet ne Ser2 ir Ser5 mutantai, turi rimtų mitozės ir citokinezės defektų, kuriems būdingi daugiapoliai verpstės ir poliploidinės ląstelės. Mes darome išvadą, kad norint tinkamai ląstelių M fazės progresuoti, reikia surišti Pol II prie centrosomų, kad būtų lengviau reguliuoti mitozę ir citokinezę priklausomai nuo CTD Thr4-P.

Įvadas

Eukariotai ekspresuoja tris skirtingas nuo DNR priklausančias RNR polimerazes: Pol I, Pol II ir Pol III. Visos polimerazės yra labai susijusios ir turi vienodus ir panašius subvienetus bendroje 1 . Tačiau didelis „Pol II“ subvienetas (Rpb1) sukūrė unikalų karboksi-galinį domeną (CTD), susidedantį iš nestruktūrizuotos heptado pakartojimų uodegos, turinčios bendrą sutarimo seką Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Šios uodegos ilgis svyruoja nuo 26 pakartojimų mielėse iki 52 pakartojimų žinduoliams 2 . Dinaminis posttransliacinis modifikavimas ir struktūrinis plastiškumas leidžia CTD tarnauti kaip surišimo platforma įvairiems veiksniams, reguliuojantiems chromatino šablonų transkripciją ir besiformuojančių nuorašų brendimą. Ser, Tyr ir Thr liekanų fosforilinimas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, prolino liekanų cis / trans izomerizacija 11, 12, 13, taip pat Lys ir Arg liekanų metilinimas ir acetilinimas nekonsensuso kartojimuose 14, 15, 16, 17, 18 sukelia vietinius CTD struktūros pokyčius ir tokiu būdu reguliuoja sąveiką su transkripcijos mechanizmo veiksniais 19, 20, 21, 22, 23 . Įvairios CTD modifikacijos buvo susietos su specifiniais Pol II etapais transkripcijos cikle ir vyksta CTD heptado kartojimais koordinuotai 24, 25, 26, palaikant kodo modelį, pagrindžiantį įvairias CTD modifikacijas 20, 27, 28 .

Postransliaciniai KD modifikacijos buvo tiriamos daugiausia tarpfazinėse ląstelėse, o apie KT modifikaciją M fazės metu mažai žinoma. Pol II transkribuoti genai visame pasaulyje yra represuojami pradiniame lygyje, pradedant M fazę. Genai, turintys pristabdytą ar pailginantį Pol II, tęsia ir užbaigia transkripciją genų pabaigoje 29 . Tačiau naujausi tyrimai pranešė apie specifinę Pol II transkripciją taip pat M fazės ląstelėse. Centromerų regionuose esantis Pol II fosforilinamas ties CTD Ser2 ir Ser5 likučiais, perrašo centromerinę α-palydovo RNR 30, 31 ir palaiko reguliavimo faktorių (pvz., Sgo1) nukreipimą į sutankintą mitozinį chromatiną, kad būtų galima koordinuoti chromosomų atskyrimą žinduolių ląstelėse 32 . Taigi, nors didžioji Pol II frakcija nebėra susijusi su chromatinu po mitozės pradžios, nedidelė frakcija yra įtraukiama į centromerų sekas ir išlieka aktyvi transkripcija. Taip pat pastebėta mitozės specifinė Pol II transkripcija ribosominių genų tarpgeninėms spacerinėms sekoms ir S. pombe subtelomerinėms sekoms. Šios transkripcijos tylėjimas pasiekiamas pašalinus CTD Ser2-P ir Ser5-P žymes fosfatazės Cdc14 pagalba. Tai yra būtina sąlyga mitoziniam 33 išėjimui.

Čia aprašome tolesnę specifinę Pol II funkciją M fazės ląstelėse. Pol II fosforilinamas ties CTD Thr4, bet ne Tyr1, Ser2, Ser5 ir Ser7 liekanomis, specialiai asocijuojasi su M fazės ląstelėse esančiomis centrosomomis ir viduriniu kūnu. Šis ryšys yra labai svarbus koordinuotai M fazės progresavimui, nes Thr4 mutantų, bet ne kitų CTD mutantų ekspresija neturi rimtų M fazės progresavimo defektų ir tinkamo chromosomų atskyrimo.

Rezultatai

Pol II M-fazei specifinė, fosforilinta, fosforilinta, didelės molekulinės masės forma

Transkripciniu būdu įsitraukusio Pol II CTD fosforilinamas Tyr1, Ser2, Thr4, Ser5 ir Ser7 liekanose įvairiomis kinazėmis tarpfazinėse ląstelėse 21 (1a pav.). M fazės pradžioje Pol II išsiskiria iš chromatino ir tolygiai pasiskirsto citoplazmoje. Norėdami palyginti Pol II fosforilinimo būklę tarpfazinėse ir mitozinėse ląstelėse, sulaikėme HeLa ląsteles pro-metafazėje su nokodazoliu. Nocodazole neleidžia polimerizuotis ir mikrotubuliams prisitvirtinti prie kinetochorų ir suaktyvina suklio mazgo patikros tašką. Ekstraktai buvo paruošti iš atskirtų ir prilipusių ląstelių skirtingu laiko momentu, pridedant nokodazolą, ir buvo tiriami naudojant CTD fosforilinimo specifinius antikūnus Western blot tyrimais. Nocodazole sukėlė transkripciniu būdu įsitraukusio Pol II0 poslinkį į transkripciniu požiūriu neaktyvų Pol IIA pavidalą praėjus keturioms valandoms po gydymo (1b pav., 3 juosta, αRpb1). Atsižvelgiant į šį poslinkį, CTD Ser2-P ir Ser5-P signalai buvo stipriai sumažinti. Priešingai, „Ser7-P“ signalai po 4 valandos silpnėjo ir po to atsigavo. Stebėtina, kad nokodazoliu apdorotų ląstelių ekstraktuose buvo nustatyta nauja Pol II forma. Ši forma, kurią mes vadinome II00, migruoja žymiai lėčiau nei II0 forma gelio elektroforezės metu, stipriai reaguoja su Thr4-P specifiniu antikūnu, bet nereaguoja su Ser2-P, Ser5-P ir Ser7-P specifiniais antikūnais. . Naujoji II00 forma buvo vos aptinkama su Rpb1 specifiniu monokloniniu antikūnu Pol3.3, atpažįstančiu Rpb1 KTD ribose esantį epitopą. Mes darome išvadą, kad Pol II00 forma yra mažai gausi M fazės ląstelėse ir sudaro mažiau nei 10% viso Pol II. „Pol II00“ forma buvo aptinkama ir nokodazoliu apdorotose HepG2 ir H1299 ląstelėse (papildomas 1a pav.) Ir naudojant kitus skirtingų poklasių specifinius Thr4-P mAb (papildomas 1b – e pav.).

Image

( a ) Pol II didelis subvienetas (Rpb1) karboksi-galinis domenas (CTD), turintis heptadą, kartojasi su konsensuso seka Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Konsensuso kartojimai turi penkias galimas fosforilinimo vietas. Aminorūgščių liekanos, kurios skiriasi nuo bendro sutarimo motyvo, pavaizduotos raudonai. ( b ) HeLa ląstelių gydymas nokodazoliu sukėlė lėčiau migruojančią Thr4-P specifinę Pol II00 formą. Ląstelės buvo apdorotos nokodazoliu (20 ng / ml) nurodytais laiko momentais, o prilipusių ir nupurtytų ląstelių ekstraktai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę, naudojant mAb, specifinius CTD modifikacijoms: Thr4-P (6D7), Ser2-P (3E10), Ser5. -P (3E8), Ser7-P (4E12) arba Rpb1 (Pol 3, 3). II0 ir IIA žymi žinomas Pol II didelio subvieneto Rpb1 hiper- ir hipofosforilintas formas; II00 žymi naują lėčiau migruojančią formą. H3Ser10-P tarnavo kaip mitozinių ląstelių žymeklis, o aktinas buvo įkrovimo kontrolė. WCE, visos ląstelės ekstraktas. a, asinchroninės ląstelės. m, mitoziškai sukrėsti ląsteles. c ) HeLa ląstelių apdorojimas 500 nM okadainės rūgštimi (OA) sukėlė specifinę Thr4-P Pol II00 formą. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis OA koncentracijomis 90 min., O sveikų ląstelių ekstraktai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę antikūnais, kurie nustatė specifinius CTD pakitimus, Rpb1 arba H3Ser10-P. Tubulinas tarnavo kaip krovimo kontrolė.

Visas dydis

Fosfatazės inhibitoriaus okadaino rūgštis gali sukelti ląstelių ciklo sustojimą tarpfazinėse ląstelėse, lydimą chromatino kondensacijos, branduolio sluoksnio depolimerizacijos ir dalinio centrosomų atskyrimo. 34, 35 . Okadainė rūgštis, panašiai kaip nokodazolas, taip pat skatina histono H3 Ser10 liekanų fosforilinimąsi ir skatina Polo tipo kinazės 1 (Plk1) aktyvavimą - abu M fazės įėjimo požymius. Todėl mes paklausėme, ar okadainė rūgštis taip pat gali sukelti mitozės specifinę, Thr4 fosforilintą Pol II CTD formą. HeLa ląstelės buvo apdorotos didėjančia okadaino rūgšties koncentracija 90 min., O skirtingos CTD modifikacijos buvo ištirtos visos ląstelės ekstrakte, naudojant Western blot metodą. Nors okadainė rūgštis neturėjo įtakos Ser2, Ser5 ir Ser7 fosforilinimo lygiams Pol II0 formoje, didelės okadainės rūgšties koncentracijos sukėlė Thr4 fosforilintą Pol II00 formą. Vėlgi, II00 forma neparodė jokių Ser2, Ser5 ar Ser7 fosforilinimo požymių (1c pav.). Darome išvadą, kad okadainė rūgštis, be anksčiau praneštų apie mitozės specifinius žymenis, taip pat sukelia Pol II00 formą. Išskirtinis „Thr4“ liekanų fosforilinimas Pol II00 formoje gali apimti arba mitozės specifinės kinazės aktyvaciją, arba Thr4-P specifinės fosfatazės slopinimą. Galima mitozės specifinio „Plk1“ funkcija, skirta Thr4 fosforilinti, bus nagrinėjama toliau.

Thr4 fosforilintas Pol II specifiškai asocijuojasi su centrosomomis ir viduriniu kūnu

Mitozės pradžioje didžioji dalis Pol II išsiskiria iš chromatino ir lokalizuojasi išsisklaidžiusių mitozinių ląstelių citoplazmoje (2aαRpb1 pav.). Matyt, dėl šios atsiribojimo nėra visiško CTD defosforilinimo. Mitozinių ląstelių citoplazmoje galima aptikti nemažą kiekį Tyr1-P, Ser2-P, Ser5-P ir Ser7-P modifikuotų CTD (papildomas 2 pav.). Pažymėtina, kad Thr4-P signalai žymiai skyrėsi nuo kitų CTD modifikacijų pasiskirstymo ir buvo stipriai sustiprinti dviem skirtingais židiniais mitozinėse HeLa ląstelėse (2a pav.). Specifinis Thr4-P signalų praturtėjimas taip pat buvo pastebėtas mitozinėse HepG2 ir H1299 ląstelėse (2b pav.) Ir jei buvo naudojami kiti poklasių Thr4-P specifiniai monokloniniai antikūnai (2c pav.). Pasidomėjome, ar dvi Thr4-P teigiamos dėmės, pastebimos mitozinėse ląstelėse, gali atitikti centrosomas, nes jos buvo simetriškai išdėstytos kondensuoto chromatino atžvilgiu. Iš tikrųjų buvo patvirtinta, kad Thr4 fosforilintas Pol II yra lokalizuotas kartu su centrosomomis po dažymo γ-tubulinui specifiniu antikūnu. Γ-tubulino ir Thr4-P signalų sujungimas atskleidė Thr4-P signalus centriniame regione, o ne centrosomų periferijoje, kaip rodo RGB profiliuotojas (2c pav.).

Image

( a ) Pol 3.3 monokloninis antikūnas (mAb) (αRpb1) atpažįsta Pol II epitopą už CTD ribų ir leidžia vizualizuoti bendro Pol II pasiskirstymą ląstelėse (žalia). Tyr1-P, Ser2-P, Ser5-P, Ser7-P arba Thr4-P specifiniai mAb parodo atskirų CTD modifikacijų (raudonos) gausą ir pasiskirstymą mitozės metu. Sujungti vaizdai parodo signalų lokalizaciją citoplazmoje, bet taip pat rodo stiprų Thr4-P signalų praturtėjimą dviem skirtingais židiniais (raudona). DAPI: 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindolis. Parodyti metafazių chromosomų tipiniai vaizdai. Duomenys gauti iš trijų eksperimentų, kurių metu buvo ištirta mažiausiai 100 ląstelių ir> 98% mitozinių ląstelių rodo šiuos Pol II CTD-P pasiskirstymus. ( b ) Thr4-P specifinio mAb (6D7) ir DNR (DAPI) vaizdai skirtingose ​​mitozinėse žmogaus ląstelėse (HepG2, H1299). c ) skirtingų poklasių (6D7, 1G7, 4H2; raudona) ir specifinėms centrosomoms skirto Ab (γ-tubulino; žalia) mAb imunofluorescenciniai vaizdai HeLa ląstelėse. Parodyti reprezentatyvūs metafazių chromosomų vaizdai iš trijų eksperimentų. Signalai buvo sujungti ir kiekybiškai įvertinti naudojant „Image J 1, 37 V“ ir papildomą RGB profilį. Linijų skenavimas buvo naudojamas norint išmatuoti specifinius Thr4-P ir γ-tubulino signalus. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

Toliau paklausėme, ar Thr4-P signalų ryšys su centrosomomis pastebimas visose mitozės fazėse ir ar ryšį su centrosomomis galima pastebėti ir kitose ląstelių ciklo fazėse. Tikrinant mitozines ląsteles, buvo aptiktas Thr4-P signalas nuosekliai centrosomose profazės, metafazės, anafazės ir telofazės ląstelėse (papildomas 3 pav.). Toliau buvo pastebėtas stiprus Thr4-P signalo sodrinimas telofazės ląstelių vidurio kūne (papildomas 3a pav., Balta rodyklė). Svarbu tai, kad apžiūrėjus didelę ląstelių grupę, niekada nebuvo nustatytas Thr4-P signalų ryšys su tarpfazinių ląstelių centrosoma (-omis) (papildomas 3a pav.). Todėl darome išvadą, kad Thr4 fosforilinta Pol II forma yra susijusi būtent su M fazės ląstelių centrosomomis ir viduriniu kūnu.

Norint įdarbinti Pol II į centrosomas, CTD nereikia

Toliau mes tyrėme Pol II įdarbinimą į centrosomas. Mes paklausėme, ar visiškai surinktas Pol II fermentas sąveikauja su centrosomomis ir ar sąveikai reikalingas KTD. Mitozinės ląstelės buvo permeabiluojamos ir plaunamos buferiu, kuriame yra nejoninis ploviklis Triton X-100. Esant tokioms sąlygoms, Thr4-P signalai išlieka stabiliai susiję su centrosomomis (3a pav.), Tuo tarpu Tyr II, Ser2, Ser5 ir Ser7 liekanų fosforilinto Pol II frakcija iš esmės pašalinama iš citoplazmos (duomenys nepateikti). Norėdami patvirtinti visiškai surinktų Pol II jungimosi prie centrosomų įrodymus, mes išbandėme kitus Pol II specifinius mAb. MAb 8WG16, atpažįstantis nuo Pol II CTD nepriklausomai nuo fosforilinimo, ir nudažo dvi ryškias dėmeles mitozinėse HeLa ląstelėse, kurios atitinka Thr4-P specifines dėmeles (3a pav.), Ir tai rodo, kad 8WG16 ir Thr4-P specifiniai mAb atpažįsta ta pati ląstelės struktūra. Šias dvi vietas dar atpažįsta αRpb3, Pol II 3 subvieneto specifinis antikūnas ir γ-tubulinui specifinis antikūnas (3b pav., Papildomas 3b pav.). Taigi antikūnai skirtingiems subvienetams atpažįsta Pol II, esant mitozinių ląstelių centrosomoms. Todėl darome išvadą, kad visiškai surinktas Pol II yra įdarbinamas į centrosomas.

Image

Tipiški metafazės ląstelių, apdorotų 0, 1% Triton X-100, vaizdai prieš PFA fiksaciją. ( a ) HeLa ląstelės buvo nudažytos Thr4-P specifiniu mAb (6D7, raudonas) ir mAb 8WG16 (žalias), atpažįstančiais Pol II KTD, nepriklausomai nuo specifinių modifikacijų. Thr4-P ir 8WG16 mAb signalų bendra lokalizacija buvo nustatyta> 98% mitozinių ląstelių. ( b ) Rpb3 mAb imunofluorescencinis vaizdas, atpažįstantis žmogaus RNR polimerazės II 3 subvienetą (raudoną) ir centrosomoms būdingą Ab (γ-tubulinas; žalias). Sujungtų vaizdų signalai buvo įvertinti kiekybiškai naudojant „Image J 1, 37 V“ ir papildomą RGB profilį. Linijų skenavimas buvo naudojamas išmatuoti 8WG16 / Rpb3 ir Thr4-P specifinių signalų santykinę lokalizaciją. c ) Sąlyginė 5 mutanto išraiška Raji ląstelėse. Rekombinantinė polimerazė buvo indukuota pašalinant tetracikliną. Po 24 valandų endogeninių ir rekombinantinių polimerazių ekspresijos lygiai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę. HA mAb leidžia vizualizuoti rekombinantinį HA pažymėtą Pol II (raudoną). Pol II įterpimas į centrosomas vyksta nepriklausomai nuo KTD. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

Ar reikalinga CTD, norint įdarbinti Pol II į centrosomas? Norėdami atsakyti į šį klausimą, mes išreiškėme ir išanalizavome HA pažymėtą Pol II versiją, kurioje nėra CTD (Δ5) žmogaus B ląstelių linijoje Raji. Ankstesni tyrimai parodė, kad CTD išbraukimas netrukdo tinkamai surinkti Pol II in vivo . Tačiau Δ5 turi mažesnį transkripcinį aktyvumą reporterio geno konstrukcijose 36, 37 ir yra transkripciniu būdu miręs ant chromatinu supakuotų genų 37 . Panašiai kaip laukinio tipo Pol II, CTD apipjaustyta versija A5 nuosekliai praturtėja centrosomomis, kai buvo analizuojama didelė mitozinių ląstelių grupė (3c pav.). Tai rodo, kad Pol II gali būti įdarbinamas nepriklausomai nuo KTL.

Centrosomų specifinių veiksnių sąveika su Pol II

Stabilus Pol II ryšys su centrosomomis mitozės metu nebuvo aprašytas anksčiau masinės spektrometrijos analize ar kitais būdais. Galimas šio įrodymų trūkumo paaiškinimas galėtų būti tai, kad Pol II sąveika su mitozinių ląstelių centrosomomis yra jautri specifiniams gryninimo etapams ir nutrūksta, kai ruošiami ląstelių ekstraktai. Todėl mes paklausėme, ar Pol II ir centrosomų sąveika turi vienodus veiksnius ir ar šie veiksniai gali paaiškinti, kaip Pol II yra įdarbinamas į centrosomas. Mūsų atlikta masinė spektrometrinė „Pol II“ sąveikos analizė (žr. Metodus) atskleidė keletą didelių kompleksų kaip tarpininkas, integratorius ir proteasomas, taip pat daugybę mažesnių kompleksų ir pavienių veiksnių. Ypatingas mūsų dėmesys sulaukė nekanoninio į R2TP-prefoldiną panašaus komplekso, sudaryto iš PFDN2, PFDN6, UXT, PDRG1, URI, Rpb5, WDR92, RPAP3, PIHD1, RUVBL1 ir RUVBL2 38 (4a pav.). Šis kompleksas reikalingas ne tik RNR polimerazėms surinkti citoplazmoje 39, bet ir yra būtinas mikrotubulų ir verpstės aparato surinkimui mitozinėse ląstelėse 40 . Keli nekanoninio R2TP-prefoldino tipo komplekso subvienetai, įskaitant RUVBL1, RUVBL2 41, 42 ir UXT 43, buvo aprašyti kaip centrosomų sudedamosios dalys ir yra susieti su Pol II mitozinių ląstelių 44 . Galimą funkcinį ryšį tarp Pol II ir centrosomų dar labiau patvirtina neseniai atliktas pasaulinis baltymų sąveikos tyrimas su žinduolių ląstelėmis. Šiame tyrime buvo apibrėžti keli šimtai vadinamųjų baltymų sąveikos bendruomenių, taip pat šių bendruomenių sąveika45 . Įdomu tai, kad veiksnių, turinčių centrosomines funkcijas, bendruomenė parodė didžiausią funkcinę sąveiką su kinetochore specifinių veiksnių bendruomene ir bendruomene, kurioje yra RNR polimerazių subvienetai45. Todėl mes paklausėme, ar nekanoninio į R2TP-Prefoldiną panašaus komplekso komponentų sunaikinimas daro įtaką Pol II asociacijai su mitozinių ląstelių centrosomomis. Tuo tikslu UXT ir RUVBL1 subvienetai buvo numušti iki 10–20% kontrolinių ląstelių, nedarant reikšmingos įtakos Pol IIA ir Pol II0 lygiams ir santykiams (4b pav.). Smulkinimas netrukdė patekti į mitozės ląsteles ir susidaryti metafazės, anafazės ir telofazės ląstelėms. Tai rodo, kad verpstės aparatas ir centrosomos iš esmės veikia mitozines ląsteles (4c pav., DAPI dėmė). Tačiau UXT (arba RUVBL1) signalo praradimas centrosomose buvo nuosekliai lydimas Thr4-P signalo praradimo (4c pav., Papildomas 4 pav.). Šiuo metu negalime diskriminuoti, ar Thr4-P signalų nebuvimas mitozinių ląstelių centrosomose yra vien dėl sutrikdyto Pol II įdarbinimo, ar po UXT / RUVBL1 dvigubo numušimo padaroma didesnė centrosomų žala, užkertanti kelią Pol II įsitraukimui.

Image

( a ) „Pol II“ sąveika. Vulkano diagrama, kurioje pateikiami svarbūs baltymai, sąveikaujantys su rekombinantiniu Rpb1 (αHA), palyginti su kontroliniais (Pes1 ir Bop1). Slenksčiai: Log 2 Slenksčio pokytis ≥ 5; p vertė <0, 01. Nurodomi 12 Pol II subvienetų (raudonos) ir 11 nekanoninio R2TP-Prefoldino tipo komplekso (žalio) subvienetai. Duomenys pagrįsti trimis biologiškai nepriklausomais replikatais. ( b ) „Western blot“ ekstraktų iš HeLa ląstelių analizė praėjus 48 valandoms po to, kai siRNR sunaikino RUVBL1 ir UXT. GAPDH3 tarnavo kaip pakrovimo valdymas. c ) „Thr4-P“ (6D7, raudona) ir „RUVBL1 / UXT“ (žali) signalai, lokalizuoti kiekvienoje mitozės fazėje. Parodyti metafazių ir anafazinių chromosomų tipiniai vaizdai. UXT (žalios) ir Thr4-P specifinės (raudonos) mAb imunofluorescenciniai vaizdai HeLa ląstelėse 48 valandas po siRNR numušimo. Kiekvienam eksperimentui buvo ištirta 30 ląstelių; 13% mitozinių ląstelių rodo UXT (arba RUVBL1) signalo praradimą centrosomose kartu su Thr4-P signalo praradimu. Linijinis skenavimas buvo naudojamas RUVBL1, UXT ir Thr4-P specifinių signalų santykiniam lokalizavimui išmatuoti. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

Plk1 asocijuojasi su Pol II mitozinėse ląstelėse ir yra Thr4 specifinė kinazė

Pol II CTD modifikacija centrosomose būdinga tuo, kad nėra Tyr1, Ser2, Ser5 ir Ser7 fosforilinimo ir stiprus Thr4 liekanų fosforilinimas, tuo tarpu Pol II mitozinių ląstelių citoplazmoje yra teigiamas visų penkių fosforilinimo ženklų atžvilgiu. Šiuo metu neaišku, kaip pasiekiamas specifinis Pol II fosforilinimas centrosomose. Politras II iš citoplazmos gali būti perkeltas į centrosomas, o Tyr1-P, Ser2-P, Ser5-P ir Ser7-P žymės pašalinamos su centrosomomis susijusiomis fosfatazėmis, išskyrus Thr4-P. Kaip alternatyva, pirmiausia pašalinami visi CTD fosforilinimo ženklai, o vėliau Thr4 specifiškai fosforilinamas centrosomose. Neseniai aprašėme CTD Thr4 liekanų fosforilinimą tarpfazinėse ląstelėse, naudodami Polo tipo kinazę 3 (Plk3) 6 . Plk3 yra ekspresuojamas visose ląstelių ciklo fazėse, tuo tarpu kitų Plk šeimos narių raiška apsiriboja M faze, kur jie vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant M fazės progresiją. Plk1, pagrindinė Plk šeimos sudedamoji dalis, mitozės metu yra susijęs su centrosomomis ir viduriniu kūnu (5a pav., Papildomas 5a pav.). Norėdami ištirti galimą Pol II sąveiką su Plk1 mitozinėse ląstelėse, atlikome bendrus IP eksperimentus. Specifiniai Plk1 mAb nusodino nedidelę dalį nokodazoliu apdorotų ląstelių Pol II00 formos (5b pav., Hashtag), ir atvirkščiai, Thr4-P specifinis mAb nusodino Plk1 (5b pav., Žvaigždutės). Po II ir Plk1 ryšys nebuvo stebimas po imuninio nusodinimo su Pol2 su Ser2-P, Ser5-P ir Ser7-P specifiniais mAb (duomenys nepateikti). Toliau ištyrėme, ar Plk1 yra CTD Thr4 specifinė kinazė. Hipofosforilinta Pol IIA forma buvo imunoprecipifuota ir išgryninta mAb 1C7, kuris atpažįsta tik nemodifikuotą CTD. Rekombinantinis Plk1 (Proqinase Freiburg) fosforilino Pol IIA specifiškai ties Thr4 liekanomis ir sukėlė poslinkį į Pol II0 formą (5c pav.), Panašiai, kaip aprašyta anksčiau Plk3 6 . „Plk1“ ir „Plk3“ ne fosforilino CTD likučius Ser2, Ser5 ir Ser7 (duomenys nepateikti). Pabrėžtina, kad CTD Thr4 liekanų fosforilinimas in vitro Plk1 ir Plk3 nepakeitė Pol IIA į II00 formą. Manome, kad tolesnės, šiuo metu nežinomos modifikacijos prisideda prie Thr4 fosforilinto Pol II0 perėjimo į II00 formą in vivo .

Image

( a ) Plk1 (žalios) ir Thr4-P (6D7; raudonos) dažymas kartu HeLa ląstelėse. Parodytas metafazių chromosomų reprezentacinis vaizdas. Linijų skenavimas išmatavo Plk1 ir Thr4-P specifinių signalų santykinę lokalizaciją. Svarstyklės, 5 μm. ( b ) HeLa ląstelės buvo sinchronizuotos su nokodazoliu (20 ng / ml) 8 valandas, o mitozinės ląstelės buvo surinktos naudojant purtymo metodą. Imunoprecipitacijos (IP) eksperimentai su antikūnais prieš Plk1 ir CTD-Thr4-P (6D7) iš HeLa ląstelių suplaktų ekstraktų. Imuniniai krituliai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę su nurodytais antikūnais. SN, supernatantas; IgG, triušio serumas, izotipo kontrolė. Žvaigždutės, maišos žymės ir taškai nurodo atitinkamai Plk1, Thr4-P ir sunkiosios grandinės juostas. ( c ) Imunosistemintas Pol IIA iš HeLa ląstelių ekstraktų buvo naudojamas kaip substratas Plk1 ir Plk3, ir buvo analizuojamas Western blot analize naudojant mAb, būdingus Thr4-P arba nemodifikuotam CTD (1C7). WCE, visos ląstelės ekstraktas.

Visas dydis

Toliau atlikome „Plk1“ numušimo eksperimentus įvairiose ląstelių linijose, norėdami paklausti, ar Plk1 yra atsakingas už Thr4 fosforilinimą mitozinėse ląstelėse. „Plk1“ numušimas (papildomas 5b pav.) Pasirodė esąs labai toksiškas, o didžioji ląstelių dalis buvo atsiskyrusi nuo ląstelių indų praėjus 24 valandoms po Plk1 specifinių siRNR transfekcijos. Likusios lipnios ląstelės buvo fiksuotos ir mikroskopiškai ištirtos prometafazinės ir metafazinės ląstelės. Šiose ląstelėse Plk1 signalų praradimas centrosomose buvo nuosekliai lydimas Thr4-P signalo praradimo (papildomas 5c pav.). Vėlgi, mes negalime atmesti galimybės, kad Thr4-P signalų nebuvimą centrosomose po to, kai sunaikinamas Plk1, sukelia tinkamo centrosomų susidarymo ir Pol II įtraukimo į centrosomas problemos. Tačiau visi mūsų duomenys patvirtina, kad Plk1 yra Pol II sąveikaujanti Thr4 specifinė CTD kinazė.

CTD Thr4 mutantai slopina tinkamą M fazės progresavimą

Specifinio Thr4 fosforilinto Pol II jungimasis mitozinių ląstelių centrosomose yra ryškus. Todėl mes paklausėme, ar CTR heptado pakartojimuose esantys Thr4 likučiai gali atlikti specifinę mitozės funkciją, reikalingą ląstelių progresavimui per M fazę. Norėdami atsakyti į šį klausimą, mes ištyrėme Pol II mutantų grupę sąlygiškai indukuojamoje Raji B ląstelių sistemoje. „Pol II“ mutantai pakeitė „Ser2“, „Thr4“ arba „Ser5“ liekanas alaninu arba „Thr4“ serinu heptaduose pakartoja 4–51 (6a pav.). 6 kontrolė buvo „Con48“ mutantas, kuriame yra bendro sutarimo pakartojimų. Pol II mutantų ekspresija buvo indukuojama 24 valandas. Ląstelės buvo plaunamos, surenkamos ant stiklinių stiklelių, naudojant citospin centrifugavimą, fiksuojamos ir dažomos DAPI ir γ-tubulino bei Thr4-P specifinėmis mAb. Vėliau ląstelės buvo atidžiai tikrinamos, ar nėra ląstelių, perėjusių nenormalią mitozę ar citokinezę.

Image

KT mutantų fenotipas buvo tiriamas žmogaus B ląstelių linijoje Raji po CTD mutantų ekspresijos. Tetraciklino sukeltos ( a ) rekombinantinių Rpb1 CTD mutantų ekspresijos pašalinimas. b ) γ-tubulino (žalios spalvos) ir DNR (DAPI) signalų imunofluorescenciniai vaizdai praėjus 24 valandoms po indukcijos. c ) Nustatytas normalių ir nenormalių ląstelių, turinčių poliploidinius ar lobentinius branduolius, procentas. Duomenys gauti iš trijų eksperimentų; n = 450, ląstelių, ištirtų kiekvienam mutantui, skaičius. Klaidų juostos žymi standartinius nuokrypius. d ) HA mAb leidžia vizualizuoti rekombinantinio Pol II pasiskirstymą ląstelėse (raudona). Rodyklės rodo stiprų Pol II praturtėjimą dviem skirtingais židiniais, simetriškai metafazės ląstelėse esančio kondensuoto chromatino atžvilgiu. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

Atlikdami analizę, mes išskyrėme tris ląstelių kategorijas: (I) normalios ląstelės, turinčios vieną, taisyklingos formos branduolį, ir nenormalios ląstelės, turinčios arba (II) du ar daugiau branduolių (poli branduolius), arba (III) ląstelės, turinčios stipriai apnuogintus branduolius. (lobuliniai branduoliai) (6b pav.). II ir III fenotipai yra susiję su M fazės defektais. Laukinio tipo Raji ląstelės, ekspresuojančios tik endogeninį Pol II, rodė apie 10% nenormalių II ir III kategorijų ląstelių. Nenormalių ląstelių dalis padidėjo iki ~ 15% po mutanto Con48 ekspresijos ir iki ~ 20% ir ~ 25% po mutantų Ser2 / Ala arba Ser5 / Ala ekspresijos. Didžiausia nenormalių ląstelių dalis nustatyta po mutantų Thr4 / Ser (~ 39%) ir Thr4 / Ala (~ 55%) ekspresijos (6c pav., Papildomas 6 pav.). Visos rekombinantinės polimerazės turi taškinę mutaciją, suteikiančią atsparumą α-amanitinui, ir jų ekspresija, išskyrus Con48, negali išlaikyti ląstelių gyvybingumo esant α-amanitinui 6 . Čia atlikti eksperimentai nesant α-amanitino, o stebimas fenotipas yra sukeliamas per daug ekspresuojant ir jungiant mutantą Pol II prie centrosomų (6d pav.). Mutantų Thr4 / Ala ir Thr4 / Ser ekspresija, kurią sukelia iki šiol sunkiausias fenotipas M fazės ląstelėse ir paveikta mitozė bei ląstelių citokinezė. Kadangi visi Ser2 / Ala, Ser5 / Ala, Thr4 / Ala ir Thr4 / Ser mutantai turi sunkų globalų fenotipą genų transkripcijai tarpfazinėse ląstelėse, jei ląstelės kultivuojamos esant α-amanitinui 3, 6, manome, kad M fazėms būdingą Thr4 / Ala ir Thr4 / Ser mutantų fenotipą nesukelia šių mutantų transkripcijos defektas. Labiau tikėtina, kad M fazei būdingą fenotipą sukelia CTD fosforilinimo Thr4 trūkumas pasibaigus Pol II į centrosomas.

Diskusija

Tyrus CTD fosforilinimo būsenas žinduolių M fazės ląstelėse, nustatyta Thr4 fosforilintos Pol II forma, kuri yra susijusi tik su centrosomomis ir viduriniu kūnu. Iki šiol žinoma, kad Pol II funkcija M fazės ląstelėse yra apribota telomerinių ir centromerinių sekų transkripcija. Šių sekų transkripcija yra susijusi su Ser2 ir Ser5 fosforilinta Pol II CTD forma ir yra būtina tinkamai kinetochorinei funkcijai 30, 31 .

Ypatingai Thr4-P modifikuotos Pol II formos radimas M fazės ląstelių centrosomose ir viduriniame kūne yra stulbinantis. Fizinis Pol II buvimas centrosomose ir viduryje buvo patvirtintas įvairiais Pol II specifiniais mAb. Signalus buvo galima aptikti trims skirtingiems mAb, specifiškiems Thr4-P, mAb 8WG16, atpažįstančiam nemodifikuotą CTD, ir mAb, specifiniam Pol II subvienetui Rpb3. Pol II jungimasis prie centrosomų mitozės metu buvo papildomai patvirtintas HA pažymėtu rekombinantiniu Rpb1. Pol II CTD centrosomose ir viduriniame kūne iš esmės nebuvo fosforiluotas Tyr1, Ser2, Ser5 ir Ser7 liekanose, kurios yra būdingos transkripciniu būdu sujungto Pol II modifikacijose tarpfazinėse ląstelėse. Antrasis M fazės ląstelių požymis yra nauja Pol II, Pol II00, didelės molekulinės masės forma, kuri fosforilinama ties Thr4 liekanomis, bet ne kitose CTD fosfoakceptorių vietose. Nors labai tikėtina, kad Pol II00 forma yra subfrakcija, susijusi su M fazės ląstelių centrosomomis ir vidurio kūnu, tiesioginio šios prielaidos įrodymo vis dar nėra. Taip pat nėra aiški Pol II00 formos molekulinio poslinkio priežastis ir tai, ar poslinkio priežastis yra CTD ar kitų Rpb1 dalių modifikacija. Svarbu tai, kad CT II nereikia tvirtinant Pol II prie centrosomų. Tai atitinka prielaidą, kad nekanoninio R2TP-Prefoldino tipo komplekso subvienetai gali būti naudojami rekrutuojant ir (arba) rišant Pol II į centrosomas. Molekuliniam mechanizmui, pagrindžiančiam Pol II įdarbinimą į centrosomas, ateityje reikės atlikti papildomus tyrimus.

Jei centrosomose ir viduriniame kūne nėra šabloninės DNR, reikalingos transkripcijai, kyla klausimas: kokia yra išskirtinai Thr4 fosforilinto Pol II molekulinė paskirtis centrosomose ir viduryje? CTD daugiausia sudaro Tyr, Ser, Thr ir Pro liekanos ir, atsižvelgiant į aminorūgščių sudėtį, priklauso mažo sudėtingumo (LC) baltymų domenų šeimai. Į LC baltymų šeimos steigėjus įeina Fused in Sarcoma (FUS), Ewing Sarcoma (EWS) ir Bazelio transkripcijos faktorius 15 (TAF15), kurie visi uostamiesčio domenai su daugybe pakartotinių aminorūgščių motyvo (S / G) Y ( S / G) 46 . Baltymai su LC domenais gali sudaryti stabilius fibrininius tinklus ir pereiti skysčio-skysčio fazėse. LC domenai lieka nestruktūruoti skaiduliniuose tinkluose ir tikriausiai stabilizuojami dėl daugybės silpnų Tyr likučių sąveikų. LC domenų, kuriuose yra baltymų, skystos ir skystos fazės atskyrimo reiškinys sulaukė didelio dėmesio, nes jis gali paaiškinti trumpalaikį ir stabilų ląstelių granulių susidarymą. Keletas naujausių publikacijų pateikė įrodymų, kad Pol II KTD gali sudaryti agregatus su kitais LC baltymais hidrogeliuose ir skystuose lašeliuose ir kad ši agregacija kontroliuojama atliekant CTD 47, 48, 49 fosforilinimą .

Taip pat dabar yra įrodymų, kad baltymai, turintys LC domenus, atlieka specifines mitozės funkcijas. Kinematochoros funkcijai ir chromosomų suderinimui 50 reikalingas evoliuciškai konservuotas LC baltymas BuGZ. „BuGZ“ patiria fazinį perėjimą, kad būtų palengvintas abiejų mitozinių suklinių ir su jais susijusių komponentų surinkimas 51 . Šiuo metu mitozinių ląstelių suklio matricos sudėtis ir struktūrinis pobūdis yra mažai apibrėžti, tačiau yra vis daugiau įrodymų, kad verpstės matrica sudaro tikrą apibrėžto baltymų tinklo struktūrą. Bendras su verpstės matrica susijusių baltymų bruožas yra tas, kad jie išlaiko savo vietinį vientisumą išardydami mikrotubules 51, 52, 53, 54 . Darant prielaidą, kad mitozinėse ląstelėse yra verpstės matrica, koks galėtų būti jos pastatymo pradžios taškas (-ai)? Centromerai ir centrosomos yra centrinės mitozinių ląstelių struktūros, reguliuojančios chromosomų atskyrimą ir tinkamą atskyrimą. Šiame procese svarbų vaidmenį gali atlikti Pol II jungimasis prie centrosomų. Pol II gali prisijungti prie centrosomų, galbūt naudodamas nekanoninio R2TP-Prefoldino tipo komplekso subvienetus. Neseniai atliktas artimas žmogaus centrosomų baltymų kaimynystės žemėlapis, naudojant nuo artumo priklausomą biotinilizacijos metodą, atskleidė centrosomų periferinių baltymų grupę, vadinamą Tz1, turinčią daugybę nekanoninių R2TP-Prefoldino tipo 55 komplekso subvienetų. Pagunda spėlioti, ar Pol II yra įdarbintas šiam specifiniam centrosomų baltymų spiečiui, kuris funkciškai koordinuoja ir reguliuoja mikrotubulų augimą. Centrosomose CTD galėjo būti specifiškai fosforilinamas ties Thr4 liekanomis, naudojant Plk1, ir ši struktūra gali prisidėti prie stabilios verpstės matricos susidarymo (7 pav.). PolD, fosforilinto ties CTD Thr4 liekanomis, koncentracija gali veikti kaip pradinis taškas, kuriuo pradedama CTD sąveika su kitais LC domeno baltymais, kurie padeda formuoti verpstės aparatą mitozinėse ląstelėse.

Image

( a ) Pol II yra verbuojamas į mitozinių ląstelių centrosomas ir vėliau Plk1 fosforilinamas prie CTD Thr4 liekanų, kad būtų skatinama tinkama M fazės eiga. ( b ) Pol II Thr4 / Ala mutanto pritraukimas į centrosomas sutrikdo M fazės progresiją.

Visas dydis

Šį modelį patvirtina pastebėjimas, kad Thr4 / Ala ir Thr4 / Ser mutantai pasižymi sunkiu mitozės defektu. Abu mutantai gali nesugebėti sukurti ir prižiūrėti tinkamo veleno aparato. Iš esmės Pol II CTD Thr4 mutantai gali sukelti M fazės defektus, taip pat paveikdami tinkamą mitozės specifinių genų ekspresiją interfazės metu. Tačiau šis scenarijus neatrodo tikėtinas, nes išskirtinis Thr4 liekanų fosforilinimas CTD vyksta tik M fazės ląstelėse ir yra susijęs su fiziniu Pol II ryšiu su centrosomomis ir viduriniu kūnu. Apibendrinant, mūsų rezultatai apibūdina pagrindinę CTD funkciją ląstelių progresavimui per M fazę, kuri greičiausiai nėra susijusi su Pol II transkripciniu aktyvumu. Šiuo metu nežinoma, ar CTD yra platforma, palengvinanti agregaciją su kitais baltymais, pvz., LC baltymais, ir tokiu būdu palaikanti suklio matricos sukūrimą, todėl verta atlikti papildomus tyrimus.

Metodai

Ląstelių linijos

HeLa, H1299 ir HepG2 ląstelės buvo inkubuotos DMEM terpėje, papildytoje 10% veršelio vaisiaus serumo (FCS), 100 V / ml penicilino, 100 μg / ml streptomicino ir 2 mM L-glutamino (DMEM, Gibco) 37 ° C ir 8 ° C temperatūroje. % CO 2 . Raji ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% FCS, 100 V / ml penicilino, 100 μg / ml streptomicino ir 2 mM L-glutamino (Gibco / Invitrogen), esant 37 ° C ir 5% CO2. Stabiliai transfekuotos Raji ląstelių linijos buvo gautos ir palaikomos atrenkant G418 (Sigma) 3, 56 . Tetraciklino sukeltų ląstelių linijų pašalinimas rekombinantiniam Rpb1 ekspresuoti.

Antikūnai

Monokloniniai antikūnai (mAb), būdingi Rpb1 (Pol 3.3), nemodifikuotiems CTD (1C7), hemagliutinino (HA) žymenims (3F10, Roche), Pol II CTD (8WG16) ir skirtingiems CTD fosforilinimams (3E10, 3E8, 4E12)., 6D7, 1G7, 3D12) buvo naudojami kaip aprašyta anksčiau, 3, 4, 6 . Žiurkės mAb 4H2 (IgG2a) prieš CTD-Thr4-P buvo gautas, kaip aprašyta anksčiau 3 . Imunizacijai mes panaudojome CTD specifinius Thr4 specifinius fosfopeptidus (YSPT P SPSYSPTSPSC), sujungtus su ovalbuminu (Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelbergas, Vokietija). WDR43 (1B8; IgG2b) (neskelbti duomenys), Pes1 (pescadillo1; 8E9; IgG1) ir Nog1 (1D8; IgG2a) specifiniai antikūnai yra kontroliniai izotipai, aprašyti kitur 57, 58 . Afinitetu išgryninti antikūnai, naudojami šiame darbe, buvo šie: Rpb3 (Bethyl Laboratories; A303–771A), Plk1 (Abcam; ab47867), γ-tubulinas (Sigma; T6557), α-tubulinas (Sigma; T6199), β-aktinas ( Sigma; A2066), normalaus triušio IgG (Santa Cruz; sc-2027), H3Ser10P (aktyvusis motyvas; 39253), RUVBL1 (Proteintech; 10210–2-AP) ir UXT (Abcam; ab77483).

CTD mutantų klonavimas

Rekombinantinės CTD konstrukcijos buvo sukurtos iš esmės, kaip aprašyta anksčiau 56, ir perkeltos į tetraciklinu reguliuojamą ekspresijos vektorių. Trumpai tariant, pUC19-CTD, modifikuotas taip, kad 3 pakartojime būtų NheI vieta, buvo suskaidytas NheI ir Sty I, į kuriuos į vieną pusę buvo įvesti sintetiniai ryšininkai su trijų heptadų seka su, pvz., Ser7 / Ala mutacijomis. Į jungtuvus įtraukti Nhe I izoschizomerai ( Avr II ir Spe I) leido nuosekliai klonuoti multimetrus iš ( Nhe I - Cla I) atgal į tą patį vektorių ( Spe I - Cla I), todėl kiekviename žingsnyje kartojasi dvigubai. . „ Spe I“ sujungimas su „ Nhe I“ koduoja „Thr-Ser“, leisdamas sklandžiai prisijungti ir išplėsti kartotinius multimetrus. Visos sugeneruotos konstrukcijos buvo sekvenuotos.

Imunofluorescencinė mikroskopija

HeLa, H1299 ir HepG2 ląstelės buvo užaugintos ant dangtelio 24 valandas, naudojant DMEM / 10% FCS pilną terpę. Norėdami uždėti 8WG16 mAb ir Rpb3 polikloninį antikūną, ląstelės pirmiausia buvo permeiluojamos 0, 1% TritonX-100 15 minučių kambario temperatūroje (RT), 5 minutes plaunamos PBS ir fiksuojamos 3, 7% arba 2% paraformaldehido (PFA). kambario temperatūroje atitinkamai 5 min. Visų kitų antikūnų atveju ląstelės iš pradžių buvo fiksuotos 2% PFA kambario temperatūroje 5 minutes, po to permeabilizuotos 0, 15% TritonX-100 15 minučių kambario temperatūroje. Visi mėginiai buvo blokuojami 1% BSA 30 minučių ir inkubuojami su atitinkamu pirminiu antikūnu per naktį 4 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos PBS, 0, 15% TritonX-100 10 minučių kambario temperatūroje, užblokuotos 1% BSA 7 minutes ir inkubuotos su Cy3 konjuguotu ožkos anti-žiurkės imunoglobulinu (Dianova) ir ožkos „Alexa Fluor 488“ prieš pelių imunoglobulinu (molekuliniu). Zondai) tamsoje 45 min. Ląstelės vėl plaunamos PBS, turinčiomis 0, 15% TritonX-100, dažytos 4 ', 6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI) (Sigma) ir pritvirtintos ant plokštelių, naudojant fluorescencinę laikančiąją terpę (Dako). Konfokalinė mikroskopija atlikta Leica LSCM SP2 fluorescenciniu mikroskopu. Vaizdai buvo nufotografuoti naudojant objektyvų HCX PL APO 63 × 1.4 ir apdoroti naudojant „Image J 1.37 V“ programinę įrangą ir papildomą RGB profilį. Fluorescencinė mikroskopija atlikta Axiovert 200 M mikroskopu. Mastelio juostos buvo apskaičiuojamos taip:

Image

B = paveikslo ilgis μm

P = (512 pikselių × vokselio dydis), μm

Jei paveikslo legendose nenurodyta kitaip, kiekviename eksperimente buvo išanalizuota> 30 ląstelių.

Imuninis nusėdimas (IP)

Mitozinių ląstelių praturtinimas buvo atliktas taip: HeLa ląstelės (70% santakumas) 8 h buvo sinchronizuojamos su nokodazoliu (Sigma; 20 ng / ml), o mitozinės ląstelės buvo surinktos suplakant. HeLa ląstelės (4 × 106) buvo lizuotos 200 μl IP buferio (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 1% NP-40 (Roche), 1 × PhosSTOP (Roche), 1 × proteazės inhibitoriaus kokteilis („Roche“) 20 min ant ledo. Visi mėginiai buvo sonikuoti ant ledo, naudojant „BRANSON Sonifier 250“ (15 sek. Įjungimas, 15 sek. Išjungimas, 50% darbo jėga) ir centrifuguoti 15 500 sūkių per minutę 15 min., Esant 4 ° C temperatūrai. Supernatantas inkubuotas. su antikūnais sujungtais baltymų G / A-sepharose (1: 1) granulėmis (2, 5 μg antikūnų 4 valandas 4 ° C temperatūroje, po to du kartus plaunant 1 ml IP buferio) sukama rotacijos būdu per naktį. Rutuliukai šešis kartus plaunami Natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezei (SDS-PAGE) baltymai buvo naudojami kaip substratas kinazės tyrimui in vitro arba baltymai buvo virinami nuo sepharose granulių Laemmli buferyje, kuriame yra 8 M karbamido. 6D7 antikūno prieš CTD-Thr4-P, G / A-sepharose granulės efektyvumas 1 h prieš inkubavimą buvo inkubuotas su tiltiniu antikūnu (Dianova; AffiniPure anti-rat) 1 val. RT. y antikūnų surišimas.

Kinazės tyrimas in vitro

Endogeninis Pol II buvo imuniškai išvalytas iš HeLa sveikų ląstelių ekstraktų, naudojant antikūną, atpažįstantį nemodifikuotą CTD (1C7). 10 μl su substratu sujungtų baltymų Sepharose G granulių buvo inkubuotos su 40 μl kinazės buferio B (50 mM Hepes (pH 7, 9), 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 200 μM EGTA, 100 μM EDTA, 1 mM DTT, 200). μM ATP, 1 μg BSA ir 200 ng rekombinantinės kinazės) 30 ° C temperatūroje 30 min. Specifinis tiekėjo (Proqinase, Freiburg) kinazės aktyvumas, išreikštas pmol / μg × min., Buvo: Plk3 (131), Plk1 (152). Pridedamas Laemmli buferis (6 kartus) ir mėginiai inkubuojami 5 minutes 95 ° C temperatūroje, po to atliekama Western blot analizė.

RNR trukdžiai

Sintetiniai trumpai trukdantys RNR (siRNR) oligonukleotidai (Eurofins / MWG) buvo pernešti į ląsteles naudojant oligofektaminą (Invitrogen). Dieną prieš transfekciją HeLa ląstelės buvo pasėtos 100 000 ląstelių / duobučio tankumu 6 duobučių plokštelėse. SiRNR oligonukleotidas (100 nM), praskiestas 150 μl Opti-MEM (Invitrogen), buvo inkubuotas su 3 μl oligofektamino (Invitrogen) 25 minutes kambario temperatūroje, tada sumaišytas su 600 μl Opti-MEM. Transfekcijos mišinys pridedamas prie ląstelių ir inkubuojamas 6 valandas. Buvo panaudotos šios siRNR sekos:

Liuciferazė: 5′-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3 ′;

žmogaus Plk1: 5′-AGACCUACCUCCGGAUCAAdTdT-3 ′;

žmogaus RUVBL1: 5′-UGGCGUCAUAGUAGAAUUAAUdTdT-3 ′;

žmogaus UXT: 5′-CUGGACCAUCGAGACAAGGUAdTdT-3 ′.

Vakarų dėmės

Baltymų mėginiai buvo imami po apdorojimo Laemmli buferiu, kuriame yra 8 M karbamido. Baltymai, prilygstantys 100 000 ląstelių, buvo perkelti į juostą ir prieš perkeliant į nitroceliuliozę („GE Healthcare“) paveikti SDS-PAGE.

Membranos buvo inkubuotos su afinitetu išgrynintais, su hrp konjuguotais antriniais antikūnais prieš žiurkę (Sigma), pele (Promega) ar triušiu (Promega) ir vizualizuojamos sustiprinta chemiliuminescencija. Rpb1 (Pol 3.3 ir 1C7) specifiniai mAb ir įvairūs CTD fosforilinimai (3E10, 3E8, 4E12) buvo praskiesti 5% neriebaus sauso pieno tirpale (0, 1% Tween PBS) 1:10 skiedžiant. Žiurkių mAb 6D7, 1G7, 4H2 prieš CTD-Thr4-P buvo praskiestos 2% ECL Advance blokuojančio agento tirpalu (GE Healthcare) (0, 1% Triton X-100 PBS) 1:10 skiedžiant.

Masių spektrometrija

3x108 Raji ląstelės buvo lizuojamos lizės buferiu (50 mM Tris-HCL, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 1% NP-40 (Roche), 1 x PhosStop (Roche), 1 x proteazės kokteilis (Roche)) 30 min ant ledo. Mėginiai buvo sonifikuoti (Sonifier 250 BRANSON, 3 × 20 ciklų, 7 išėjimas, 70 darbo ciklas) ir inkubuojami purtiklyje 1 h 4 ° C temperatūroje. Vėliau mėginiai buvo centrifuguoti (10500 g, 15 min.) Ir supernatantai per naktį inkubatoriuje inkubuojami su antikūnais sujungtomis sepharose G granulėmis (CTD fosforilinimo specifinių antikūnų mišiniu). Karoliukai tris kartus plaunami lizės buferiu ir virinami 2x laemmli buferiu (95 ° C, 8 min.). Imuniniai nusėdę baltymai buvo atskirti elektroforeze geliu, dažyti Coomassie, o juostos išpjaustytos ir suvirškintos, kaip aprašyta anksčiau 59, 60 su nedideliais pakeitimais. Masės spektrometrijos analizei mėginiai buvo sušvirkšti naudojant Ultimate 3000 HPLC sistemą (LC pakuotės) ir atjungti nuo vandens gėlą C18 mikro kolonėlėje (300 μm id × 5 mm, supakuoti su C18 PepMap ™, 5 μm, 100 Å, LC). Pakuotės). Po to nudruskytas mėginys buvo atskirtas 15 cm analitinės kolonėlės C18 mikro kolonėlėje (75 μm ID, įpakuotos su ReproSil-Pur C18-AQ 2, 4 μm iš Dr. Maisch) su 40 min gradientu nuo 5 iki 60% acetonitrilo 0, 1% skruzdžių rūgštyje. . Nuotekos iš HPLC buvo tiesiogiai purškiamos į LCQ „Orbitrap“ masės spektrometrą („Thermo Fisher Scientific“). MS instrumentas buvo valdomas nuo duomenų priklausomu režimu, kad būtų galima automatiškai persijungti tarp visiško nuskaitymo MS ir MS / MS gavimo. Tyrimo metu visiško skenavimo MS spektrai (nuo m / z 300–2000) buvo gauti „Orbitrap“ su skiriamąja geba R = 60 000, esant m / z 400 (kaupiant tiesinei jonų gaudyklei 500 000 „tikslinę vertę“). Šeši intensyviausi peptido jonai, kurių įkrovos būsenos yra nuo 2 iki 4, paeiliui buvo išskirti iki tikslinės vertės 10 000 ir suskaidyti tiesinėje jonų gaudyklėje susidūrimo sukeltą disociaciją (CID). Visi suskaidymo spektrai buvo užfiksuoti priemonės LTQ dalyje. Atliekant visus matavimus naudojant Orbitrap detektorių, vidiniam kalibravimui, kaip aprašyta 61 punkte, buvo naudojami 3 aplinkos oro jonų masės jonai. Tipiškos MS sąlygos buvo: purškimo įtampa, 1, 5 kV; nėra apvalkalo ir pagalbinių dujų srauto; pašildytos kapiliarų temperatūra, 200 ° C; normalizuota CID energija 35%; įjungimas q = 0, 25; įjungimo laikas = 30 ms.

Baltymams identifikuoti ir kiekybiškai iBAQ nustatyti buvo naudojamas maksimalus 1.3.0.5. Maksimalios sąlygos buvo: Duomenų bazė, ipi.HUMANv3.68; MS tol, 10 ppm; MS / MS tol, 0, 5 Da; Peptidas FDR, 0, 1; Baltymai FDR, 0, 01 min. peptido ilgis, 5; Kintamos modifikacijos, oksidacija (M); Fiksuotos modifikacijos, karbamidometilas (C); Peptidai baltymų kiekiui nustatyti, skustuvai ir unikalūs; Min. peptidai, 1; Min. santykio skaičius, 2. iBAQ vertės buvo transformuotos log2, trūkstamos vertės buvo pakeistos pastovia verte, ir ANOVA atlikta DANTE R pakuotėje, R x64 2.15.3.

Papildoma informacija

Prieigos kodai : Masinės spektrometrijos proteomikos duomenys buvo perduoti „ProteomeXchange Consortium“ per PRIDE partnerių saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD: PXD003459.

Kaip cituoti šį straipsnį : Hintermair, C. et al . Specifinis treonino-4 fosforilinimas ir RNR polimerazės II KTD funkcija vykstant M fazei. Mokslas. Rep. 6, 27401; „doi“: 10.1038 / srep27401 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.