Stabili deimanto kandžio ryanodino receptoriaus g4946e varianto raiška ir funkcinis apibūdinimas, suteikiantis atsparumą diamido insekticidams | mokslinės ataskaitos

Stabili deimanto kandžio ryanodino receptoriaus g4946e varianto raiška ir funkcinis apibūdinimas, suteikiantis atsparumą diamido insekticidams | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Kalcio kanalai
  • Molekulinė evoliucija

Anotacija

Diamidai, tokie kaip flubendiamidas ir chlorantraniliprolas, priklauso naujai insekticidų cheminei klasei, veikiančiai kaip į konformaciją jautrūs vabzdžių ryanodino receptorių (RyR) aktyvatoriai. Abu junginiai yra užregistruoti naudoti kojoms su lepidopteranu, tokiomis kaip deimantinis kandis, Plutella xylostella , žinomas visame pasaulyje kryžmažiedžių augalų kenkėjas. Manoma, kad šios rūšies pastaruoju metu įgytas atsparumas diamidiniams insekticidams atsirado dėl tikslo vietos mutacijos, suteikiančios aminorūgšties pakaitalą (G4946E), esančią RyR transmembraliniame domene, nors tikslus šios mutacijos vaidmuo dar nežinomas. buvo visiškai pasiryžęs. Norėdami tai išspręsti, klonavome viso ilgio cDNR, koduojančią P. xylostella RyR, ir sukūrėme klonines Sf9 ląstelių linijas, stabiliai ekspresuojančias arba laukinio tipo RyR, arba G4946E variantą, siekdami ištirti rekombinantinio receptoriaus jautrumą flubendiamidui ir chlorantraniliprolui. Mes pranešame, kad abiejų diamidių efektyvumas dramatiškai sumažėjo kloninėse Sf9 ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose G4946E modifikuotą RyR, pateikdami aiškių funkcinių įrodymų, kad G4946E RyR mutacija apsunkina diamido insekticidų surišimą.

Įvadas

Ryanodino receptoriai (RyR) yra tetrameriniai kalcio suaktyvinti kalcio atpalaidavimo kanalai, esantys endoplazminiame retikulume. Jie yra atsakingi už kalcio išsiskyrimo iš vidaus atsargų kontrolę ir visų pirma yra žinomi dėl savo vaidmens sužadinimo-susitraukimo jungime raumenų ląstelėse. Tai yra didžiausi žinomi jonų kanalai, apimantys apie 5000 aminorūgščių kiekviename 1 subvienete. Yra 3 RyR izoformos, būdingos žinduoliams (RyR1–3), bet tik viena bestuburiams, turinčios maždaug 45–47% homologijos su žinduolių analogais (-iais) 2 . RyR daugelį dešimtmečių buvo laikomi gyvybingu insekticidų taikiniu; tačiau keli bandymai sukurti komerciškai sėkmingą junginį, pagrįstą ryanodino, universalaus RyR moduliatoriaus ir gerai žinomo farmakologinio zondo chemine struktūra, galiausiai žlugo dėl nepriimtino toksiškumo lygio netiksliniuose organizmuose 3 . Visai neseniai sėkmingai komercializuota nauja sintetinių RyR aktyvatorių klasė - diamidai (IRAC veikimo būdo klasifikacija - 28 grupės insekticidai 4 ). Pirmą kartą jie buvo pateikti į rinką 2006 m. Išleidus ftalio rūgšties diamidą flubendiamidą (Bayer CropScience) 5, o 2007 m. - antrantino rūgšties diamidą, chlorantraniliprolį (DuPont Crop Protection, JAV) 6 . Nauji chemikalai pasižymėjo dideliu veiksmingumu prieš tokias lepidopteranines rūšis kaip Plutella xylostella ir puikiu toksikologiniu profiliu 7, 8, taip pat neturėjo nustatyto kryžminio atsparumo jokiems kitiems komerciškai prieinamiems junginiams 9 . Nuo jų pristatymo 2006 m. Labai išaugo diamidų pardavimas, šiuo metu užimantis 8% pasaulinės insekticidų rinkos 10, ir per tą laikotarpį šie insekticidai tapo viena iš pagrindinių cheminių priemonių, padedančių kovoti su lepidopteran kenkėjais, dėl jų palankių biologinių, ekologiniai ir toksikologiniai požymiai 6, 11 .

Diamido insekticidai flubendiamidas ir chlorantraniliprolas veikia panašiai ir veikia pailgindami RyR kanalo atidarymą, sukeldami nekoordinuotus raumenų susitraukimus apsvaigusių kenkėjų vabzdžiuose 11, 12 . Dėl jų naujumo gana mažai žinoma apie tai, kaip diamidai sąveikauja su vabzdžių RyR ir kaip pasiekiamas didelis jų insekticidinis specifiškumas. Tyrimai su chimeriniais baltymais (vabzdžių-žinduolių ir vabzdžių-nematodų chimeromis) tiksliai apibrėžė diamido jungimosi vietą transmembraniniame receptoriaus srityje 13, 14 . Tačiau yra vis daugiau įrodymų apie skirtingus diamidus surišančius profilius įvairiose vabzdžių kategorijose 15, 16, 17, kurie rodo, kad rišimo srityje gali būti struktūrinių pokyčių.

Buvo pranešta apie pirmuosius diamido kontrolės gedimus deimantiniam kandžiui P. xylostella - vienam iš žalingiausių kryžmažiedžių augalų kenkėjų, kurio pasauliniai pasėlių nuostoliai siekia 4–5 milijardus dolerių dolerių 18 ir yra labiausiai paplitę iš visų Lepidoptera. visame pasaulyje 19 . Pradiniai pranešimai apie pasipriešinimą buvo pateikti Tailando Bang Bua Thong rajone praėjus vos 18 mėnesių nuo flubendiamido paleidimo. Kitais metais (2010 m.) P. ksilostella atsparumas diamidams buvo praneštas Cebu (Filipinai) ir 2011 m. Yin Ling ir Chang Hwa (Taivanas) bei Pietų Kinijos Guangdžou ir Guandongo provincijose 20 . Po pranešimų apie atsparumą buvo rastas G4946E aminorūgšties pakaitalas (1 pav.) Labai atsparių P. xylostella populiacijų RyR transmembraniniame regione iš Tailando (Bang Bua Thong) ir Filipinų (Sudlon, Cebu) 21. . Vėliau ta pati mutacija buvo nepriklausomai nustatyta diamidams atspariose Kinijos populiacijose 22 . Pririšimo su vietinėmis membranomis, atskirtomis iš atsparių populiacijų, surinktų iš Pietų Kinijos, fluorescenciniu žymeniu pažymėti diamido zondai tyrimai parodė sumažėjusį afinitetą diamidams atspariems asmenims 23 . Tačiau iš esmės nepavyko pateikti įtikinamų funkcinių įrodymų, kad G4946E mutacija suteikia reikšmingą atsparumą tikslui vietoje.

Image

Regionas, kuriame yra pakaitas G4946E (G4900 pozicija paskelbtoje 21 sekoje, prisijungimo numeris JX467684), susieja numatomus membranos apimties domenus TM4 ir TM5. Taip pat parodytos flubendiamido ir chlorantraniliprolio cheminės struktūros. Vaizdas © „Rothamsted Research Ltd.“

Visas dydis

Šiame tyrime pateikiamas viso ilgio P. xylostella RyR klonavimas, apibūdinimas ir sėkminga išraiška. Ląstelių linijos, išreiškiančios receptorius, buvo naudojamos išsamesnei G4946E pakaitalo įtakos receptorių jautrumui diamidų insekticidams ir bendrai kanalų funkcijai analizei.

Rezultatai

P. xylostella funkcinio RyR klonavimas ir apibūdinimas

Klonuotas P. xylostella RyR cDNR šiame tyrime koduoja 5118 aminorūgšties baltymą (NCBI priedas AFW97408), labai panašus į kitus sėkmingai ekspresuojamus vabzdžių RyR, įskaitant Drosophila melanogaster (78, 5%) ir Bombyx mori (91, 5%). 13, 24 . Jis turi visas savybes, aprašytas anksčiau RyR, išskirto iš P. xylostella kituose tyrimuose 25, 26, 27, įskaitant GXRXGGGXGD selektyvumo filtro motyvą transmembraniniame domene ir MIR (212–393), SPRY (664–803, 1091). –1214, 1551–1693) ir RIH domenai (2232–2454) citozoliniame regione. Taip pat yra specifinių lepidopterano aminorūgščių N (4953), N (4955), N (4966), L (4981), L (5012), N (5044), T (5095) padėtyse 28 . Apskritai mūsų laukinio tipo „RyR“ (ROTH WT) versijoje buvo rastas didelis skaičius (daugiau nei 200) tyliųjų SNP (2b pav.). Buvo nustatytos keturios alternatyvios sujungimo vietos, iš kurių trys atitinka anksčiau aprašytas sujungimo vietas IS2, IS3 ir IS10, pateiktas Wang et al. 26, kurie taip pat pranešė apie papildomus septynis sujungimo variantus. Daugybė P. xylostella RyR sekų sulyginimo su kitais vabzdžių RyR rodo, kad koje identifikuotos alternatyvios suskaidymo formos greičiausiai neatspindi vyraujančios receptoriaus formos. Šią hipotezę patvirtina Wang et al paskelbta alternatyvaus sujungimo dažnio ataskaita . 26 Panašus polimorfizmas, susidarantis lepidopteraniniame RyR gene, taip pat buvo aprašytas tabako kirmėlėje Heliothis virescens 29 .

Image

a ) Pilno ilgio P. xylostella RyR surinkimo strategija. Not I restrikcijos vieta, reikalinga galutiniam surinkimui, atsirado iš vektoriaus pJet1.2, naudojamo atskiriems fragmentams klonuoti. ( b ) Subklonuotų P. xylostella WT RyR fragmentų sulyginimas su pradine cDNR nuoroda, rodančia padėtį (juodos vertikalios linijos), atitinkančią atskirus SNP variantus. Apytikslė keturių nustatytų sujungimo vietų A – D vieta yra pažymėta juodomis rodyklėmis. Suskaidymo vietos A, C ir D buvo aprašytos Wang et al. 26, o apie sujungimo vietą B nebuvo pranešta.

Visas dydis

Pereinamai išreikštų RyR kanalų funkcinė analizė

Spodoptera frugiperda Sf9 ląstelės, transformuotos P. xylostella ryanodino receptoriais, buvo užpiltos FURA2, fluorescenciniu Ca 2+ indikatoriumi, ir veikiamos kofeinu (30 mM), po to sekamos didelės flubendiamido arba jo šiek tiek vandenyje tirpesnio analogo flubendiamido sulfoksido ( 3 pav.). Sf9 ląstelės, ekspresuojančios ROTH WT arba G4946E RyR, sugebėjo reaguoti į pakartotinį kofeino vartojimą, tai parodo trumpas viduląstelinės Ca 2+ koncentracijos padidėjimas, išmatuotas per 72 valandas po transfekcijos. Flubendiamido sulfoksidas taip pat parodė grįžtamą kalcio išsiskyrimo suaktyvinimą ląstelėse, ekspresuojančiose ROTH WT RyR. Priešingai, ROTH WT RyR ląstelių veikimas flubendiamidu lėmė visam laikui padidėjusį Ca 2+ lygį ir panaikino bet kokį tolesnį kofeino suaktyvinimą eksperimento metu, kuris rodo receptoriaus pritvirtinimą nuolat atviroje būsenoje. Sf9 ląstelės, ekspresuojančios G4946E RyR variantą, nepastebėjo jokio kalcio išsiskyrimo, veikiant flubendiamidui (3 pav.). Labiau vandenyje tirpus analogas, flubendiamido sulfoksidas, taip pat nesukėlė kalcio išsiskyrimo (duomenys nepateikti). Be to, skirtingai nuo ROTH WT RyR ląstelių, G4946E variantas išliko jautrus kofeinui po veikimo flubendiamidu. Kontrolinėse neperkeltose ląstelėse ir ląstelėse, veikiančiose tik Cellfectin, kofeinas ir diamidai nesugebėjo sukelti tokio atsako.

Image

Fluorescencijos santykiai, išmatuoti laikui bėgant, atliekant vieną kalcio išsiskyrimo eksperimentą, naudojant Fura-2 AM Sf9 ląstelėse, pereinamai ekspresuojančiose ( a ) WT konstrukciją ir ( b ) G4946E variantą, praėjus 72 val. Po transfekcijos. Atskiri WT konstrukcijos grafikai rodo tų pačių ląstelių (n = 8) vidutinius ± standartinius paklaidų atsakus į 30 mM kofeino 1a, 30 μM flubendiamido sulfoksido 2a, 10 μM flubendiamido 3a ir 30 mM kofeino 4a . Taikant flubendiamidą panaikinamas tolesnis kofeino atsakas. Atskirose G4946E konstrukto plokštėse parodytas tų pačių ląstelių (n = 8) vidutinis ± standartinis klaidų atsakas į 30 mM kofeino 1b, 10 μM flubendiamido 2b ir 30 mM kofeino 3b. Skirtingai nei WT konstrukcijoje, flubendiamido panaudojimas nepanaikina tolesnio kofeino sukelto kalcio išsiskyrimo, o tai rodo sumažėjusį flubendiamido jungimosi prie G4946E konstrukcijos afinitetą.

Visas dydis

Tritiu pažymėti ryanodino jungimosi eksperimentai su izoliuotais Sf9 ląstelių mišinių membranų preparatais, pereinamai ekspresuojančiais ROTH WT arba G4946E RyR, davė Bmax ir Kd reikšmes 2447 ± 425 dpm (244, 9 ± 42, 5 fmol / mg) ir 12, 89 ± 4, 5 nM WT ir 2671. ± 401 dpm (267 ± 40 fmol / mg) ir 14, 69 ± 4, 18 nM G4946E variantui (4 pav.). Abiejų konstrukcijų Kd vertės buvo didesnės, nei stebint triušio skeleto raumenų RyR (2, 04 ± 0, 12 nM) ir H. virescens RyR (3, 82 ± 0, 39 nM) vietinius preparatus, kurie taip pat turi daug aukštesnes B max reikšmes; 4, 57 ± 0, 32 pmol / mg (triušis) ir 2, 41 ± 0, 17 pmol / mg ( H. virescens ) 30 . Tačiau atliekant skirtingus H. virescens natūralių membranos preparatų tyrimus, atitinkama Kd reikšmė buvo 13, 9 ± 3, 8 nM, todėl ją galima palyginti su Sf9 išreikštomis P. xylostella RyRs, o B max reikšmės buvo tarp 1–1, 5 pmol / mg 31. . Akivaizdžius Kd ir B max skirtumus nuo tų, apie kuriuos pranešta kituose tyrimuose, greičiausiai būtų galima paaiškinti skirtingomis eksperimento sąlygomis. Akivaizdu, kad G4946E mutacija nedaro jokio reikšmingo poveikio P. xylostella RyRs gebėjimui surišti ryanodiną, nes tiek Kd, tiek B max vertės yra panašios.

Image

G4946E pakaitalas neturi jokio ryškaus poveikio ryanodino jungimosi galimybėms.

Visas dydis

Stabiliai išreikštų RyR kanalų funkcinė analizė

Pavieniai Sf9 ląstelių klonai, stabiliai ekspresuojantys laukinio tipo (Sf9-wtRyR) arba G4946E (Sf9-mRyR) RyR kanalą, buvo išskirti po kelių klonų atrankos ciklų. Tarpląsteliniai kalcio signalai, kuriuos sukėlė 30 mM kofeino Sf9-wtRyR, greitai padidėjo iki maksimumo, greičiau nei per vieną minutę po vartojimo, ir po to sumažėjo iki pradinio lygio (5 pav.). Kalcio signalų, kuriuos sukelia milimolinės kofeino koncentracijos, laikinas pobūdis buvo panašus į tuos, kurie išmatuoti anksčiau izoliuotuose H. virescens neuronuose 31 . Tai galima paaiškinti sarko- / endoplazminio retikulumo kompensaciniais kalcio pasisavinimo mechanizmais, ypač Ca 2+ -ATPazės (SERCA) 32, 33 . Ilgesnė kofeino sukeltų kalcio pereinamųjų elementų Sf9-wtRyR ląstelėse laiko skalė, palyginti su izoliuotais H. virescens neuronais, gali reikšti, kad jaudinančios ląstelės, tokios kaip neuronai ir raumenų ląstelės, gali tiksliau sureguliuoti tarpląstelinę kalcio koncentraciją, nei gali. Sf9 ląstelės, neturinčios specifinių RyR papildomų baltymų.

Image

Sf9 ląstelės, ekspresuojančios laukinio tipo ryanodino receptorius, buvo apdorotos 0, 1% (tūrio / tūrio) DMSO (galutinė koncentracija), 30 mM kofeino 0, 1% DMSO, 1 μM flubendiamido sulfoksido arba 1 μM chlorantraniliprolo 0, 1% DMSO (galutinis). konc.). Buvo išmatuota kalcio-Fluo8 komplekso fluorescencija kaip laiko funkcija.

Visas dydis

Priešingai nei kofeinas, insekticidai diamidai chlorantraniliprolas ir flubendiamido sulfoksidas sukėlė padidėjusią tarpląstelinę kalcio koncentraciją, kuri išliko matavimo laikotarpiu. Tai gali būti paaiškinta mechanistine hipoteze, kad diamidai pirmiausia jungiasi su kalciui laidžia RyR konformacine būsena ir stabilizuoja atvirą kanalą dėl žemos diamido-RyR komplekso nanomolinės pusiausvyros disociacijos konstantos 34 .

Išmatuojant integruotus kalcio signalus kaip diamido koncentraciją, buvo gautos būdingos dozės ir atsako kreivės, iš kurių buvo apskaičiuotos akivaizdžios flubendiamido sulfoksido ir chlorantraniliprolo EC50 koncentracijos (6 pav.). Šios vertės parodo efektoriaus koncentraciją, sukeliančią pusę maksimalių integruotų kalcio signalų ląstelėse. Fliubendiamido sulfoksido EC50 buvo 245 nM ± 46 nM (standartinė paklaida), o chlorantraniliprolo EC 50 buvo 17 nM ± 2 nM (standartinė paklaida). Reikėtų pažymėti, kad EC50 vertes lemia ne tik junginio afinitetas RyR, bet ir jų buvimas tarpląsteliniame taikinyje, kurį veikia jų fizikinės ir cheminės savybės.

Image

Kalcio dažų (Fluo8) fluorescencija buvo matuojama po ( a ) flubendiamido sulfoksido arba ( b ) chlorantraniliprolo uždėjimo kaip laiko funkcija. Integruotos fluorescencijos signalai buvo nubraižyti pagal efektoriaus koncentracijos logaritmą. Duomenų suderinimas ir EC50 skaičiavimai buvo atlikti su programinės įrangos paketu „SigmaPlot v13“.

Visas dydis

Abiejų diamidų efektyvumas smarkiai sumažėjo Sf9-mRyR ląstelėse, ekspresuojančiose G4946E RyR. G4946E RyR buvo galima išmatuoti visą chlorantraniliprolio dozės ir reakcijos kreivę, iš kurios buvo apskaičiuota 3715 nM ± 776 nM (standartinė paklaida) EC50 vertė. Ribotas flubendiamido sulfoksido tirpumas, kai koncentracija viršija 20 μM, neleido išmatuoti išsamių dozės ir atsako kreivių, todėl tikslios EC50 vertės nebuvo įmanoma nustatyti apytiksliai> 20 000 nM.

Rezultatai rodo, kad chlorantraniliprolas turėjo maždaug dviem laipsniais mažesnį poveikį P. xylostella RyR kanalui su G4946E pakaitalu, tai rodo, kad drastiškai sumažėjo receptoriaus afinitetas diamidui ir labai tikėtina, kad G4946E pakeitimas yra atsakingas už stebimas P. xylostella atsparumas diamidams.

Diskusija

Diamidiniai insekticidai, tokie kaip chlorantraniliprolas ir flubendiamidas, yra nauja insekticidų klasė, neseniai įvesta į rinką siekiant kontroliuoti platų žolėdžiažolių kenkėjų vabzdžių, ypač „Lepidoptera“ rūšies, kiekį. Dėl per didelio priklausomybės nuo diamondback kandžių naudojimo diamidiniais insekticidais atsirado greitas atsparumo vystymasis, ypač Azijoje, kur šių junginių lauko veiksmingumas dabar yra labai susilpnėjęs. Buvo nustatyta, kad iš Filipinų ir Tailando 2012 m. Surinktos lervos yra daugiau nei 200 kartų atsparios tiek chlorantraniliprolui, tiek flubendiamidui, palyginti su jautriomis padermėmis 21 . Kiekvienoje iš atsparių padermių nesinoniminės mutacijos, kurios abiem atvejais lemia baltymo pakaitą glicinu ir glutamo rūgštimi (G4946E). To paties aminorūgščių pakaitalo nepriklausoma evoliucija labai konservuotame RyR kanalo regione, C-galo membraną apimančiame domene, dviejuose geografiškai atskirtuose atspariuose P. xylostella kamienuose, aiškiai rodo priežastinį ryšį su atsparumu diamidui . Vėliau ta pati mutacija buvo nepriklausomai nustatyta P. xylostella iš Kinijos lauko populiacijose, 303–658 kartus atsparioje chlorantraniliprolei 23 . Neseniai atliktas genotipo tyrimas 35 patvirtino visuotinę G4946E mutacijos buvimą dešimtyje skirtingų šalių, kuriose insekticidais diamidais beveik nepavyko suvaldyti deimantinių kandžių populiacijų. Ši reikšminga koreliacija dar labiau paryškina galimą šios taikinio vietos mutacijos vaidmenį suteikiant atsparumą diamidams.

Radioligandų surišimo su tritijuoto flubendiamido dariniu [ 3 H] PAD1 tyrimai, naudojant P. xylostella krūtinės ląstos mikrosominių membranų preparatus iš jautrių ir atsparių (Filipinų) padermių 35, pateikė papildomų įtikinamų įrodymų, susijusių su RyR G4946E mutacija tiek su diamidu, tiek su jo specifiniu surišimu. nuo koncentracijos priklausoma alosterinė [3H] ryanodino jungimosi moduliacija 17, 34 . Priešingai nei jautriam kamienui, kurio Kd ir B max reikšmės yra 2, 7 ± 0, 23 nM ir 8, 3 ± 0, 19 pmol mg −1, Filipinų padermės prisotinimas tritijuoto flubendiamido analogu nebuvo pasiektas, o reikšminga pusiausvyros kinetika negalėjo būti nustatyta. apskaičiuota, teigiant, kad G4946E mutacija suteikia tikslo vietoje atsparumą diamidų insekticidams. Ryanodino jungimosi stimuliacijos Filipinų padermėse EC50 vertės buvo mažiausiai 100 kartų didesnės, atitinkamai flubendiamido ir chlorantraniliprolo atsparumo santykiai buvo> 450 ir 159. Abipusiai Filipinų kamieno, homozigotinio G4946E, kryžiai su jautriu laboratoriniu kamienu davė F1 palikuonius su diamidei jautriu fenotipu, kas rodo autosominį, recesyvinį paveldėjimo būdą. Vėliau atlikti kryžminimai su tėvų linijomis parodė beveik monogeninį paveldėjimą dėl diamido atsparumo Filipinų kamienui. Duomenys, pateikti šiame tyrime, kai mes tiesiogiai tyrėme diamidų insekticidų prisijungimą prie rekombinantinių RyR baltymų, dabar vienareikšmiškai pateikia aiškių funkcinių įrodymų, kad G4946E RyR mutacija labai apsunkina diamido insekticidų jungimąsi ir yra atsakinga už atsparų fenotipą, kurį demonstruoja atsparus P. ksilostella kamienai.

G4946E pakaitalo žemėlapio parinkimas neseniai paskelbtame didelės raiškos (uždaro būvio) triušio RyR1 kanalo 36, 37 kristalų struktūroje rodo, kad ši liekana WT P. ksilostella kanale gali veikti kaip glicino vyris sąsajoje tarp transmembraninio, apimančio S4. spiralės ir S4-S5 jungiamojo domeno (1 pav.), todėl likučių pokyčiai šioje padėtyje greičiausiai turės didelę įtaką S5 ir S6 sraigtų, valdančių kanalo porų atidarymą ir uždarymą, judėjimui ir turi tiesioginį trankymą. apie poveikį diamidų insekticidų prisijungimui prie receptorių. Neseniai buvo pranešta apie tris papildomus taškų pakeitimus (E1338D, Q4594L ir I4790M) P. xylostella RyR iš lauko populiacijos, surinktos iš Yunnan provincijos, Kinijos 38 (atitinka likučius E1333, Q4548, I4744 kanale, išreikštame šiame dabartiniame dokumente), atsparumas diamidiniams insekticidams yra iki 2128 kartų didesnis. Įrodyta, kad I4790M pokytis (esantis viduryje išilgai „RyR S2“ spiralės) gali būti arti G4946 liekanos „RyR 35“ 3D struktūroje, todėl šie du liekanos gali apibrėžti diamido surišimo vietą receptoriuje. Izoleucino liekana 4790 padėtyje yra būdinga Lepidoptera, nes ji yra metioninas visuose kituose vabzdžiuose, voruose ir erkutėse, leucinas nematoduose ir cisteinas žinduolių RyRs, todėl ši liekana gali būti atsakinga už skirtingą P. xylostella ir kiti vabzdžių RyR kanalai į flubendiamido ir chlorantraniliprolo chemikalus 16, 17 .

Chlorantraniliprolas ir flubendiamidas taip pat buvo plačiai naudojami pomidorų lapų kasyklai „ Tuta absoluta“ (Lepidoptera: Gelechiidae), invaziniam pomidorų pasėlių kenkėjui, greitai plintančiam visame pasaulyje, valdyti. T. absoluta populiacijoje, kilusioje iš Sicilijos (Italija), buvo nustatytas aukštas chlorantraniliprolio ir flubendiamido atsparumas, atitinkamai iki 2, 414 ir 1742 kartus, o tai rodo panašų šios rūšies nejautrumą taikinio vietoje 39 . Neseniai buvo pranešta apie kryžminį atsparumą tarp flubendiamido ir chlorantraniliprolio mažesnėms arbatos tortriksams - Adoxophyes honmai 40, kurių atsparumo santykis yra atitinkamai 105 ir 77, 2. Nors atsparių asmenų santykinis aktyvumas gali skirtis tarp dviejų aktyviųjų medžiagų, galiausiai rezultatas yra nepakankama lauko kontrolė. Šiuo metu daugumoje šalių atsparios populiacijos vis dar yra gana lokalizuotos, o daugelyje augalininkystės sričių vis dar išliks jautrios populiacijos. Todėl reikia didelių pastangų valdymo pastangų, kad būtų apsaugota diamido chemija, kaip naudinga kenkėjų kontrolės priemonė, ypač per ateinančius kelerius metus pristatant papildomus gamintojus, konkuruojančius parduoti kelis prekės ženklus, turinčius skirtingus diamido aktyvius elementus. Pripažinta, kad norint išspręsti šią kylančią problemą, reikės suderintos ir suderintos vabzdžių stebėjimo programos, kad būtų galima anksti nustatyti diamido toleranciją populiacijose, kartu naudojant tinkamą insekticidų rotaciją su skirtingais veikimo būdais 41 . Ląstelių linijos, stabiliai išreiškiančios RyR variantus, sukurtos šiame tyrime, taip pat suteikia galimybę atlikti didelio našumo priešpriešinį cheminių bibliotekų patikrinimą ieškant junginių, įveikiančių atsparumą.

Metodai

Chemikalai

Visi savarankiški chemikalai, naudojami bakterinėms terpėms paruošti, buvo įsigyti iš bendrovės „Sigma“. Visų aktyvių junginių skiedimui naudojamas DMSO buvo analitinio lygio (grynumas ≥ 99%) ir tiekiamas „Sigma“. [3H] ryanodiną (savitasis aktyvumas 2 TBq mmol −1 ) tiekė „PerkinElmer“. Flubendiamidas, flubendiamido sulfoksidas ir chlorantraniliprolas buvo techninio lygio (grynumas> 98%), tiekiami įmonėje („Bayer CropScience“) ir buvo įsigyti kaip analitinis standartas atitinkamai iš „Fluka Chemicals“ (Buchs, Šveicarija). Analitinio laipsnio kofeinas buvo iš ReagentPlus® (Sigma).

P. xylostella padermės

Diamidams jautrus P. xylostella laboratorinis štamas (ROTH), iš pradžių surinktas JK, daugiau nei 40 metų buvo auginamas ant kininių kopūstų augalų ( Brassica rapae Spp ) kontroliuojamomis aplinkos sąlygomis. Atsparios (G4946E) padermės palaikymas ir seka aprašyti kitur 21 .

RNR ekstrakcija ir cDNR sintezė

Bendra RNR buvo išgaunama iš 35 mg greitai sušaldytų P. xylostella lervų, naudojant EZNA® Mollusc RNR rinkinį (Omega Bio-Tek, GA, JAV), laikantis gamintojo nurodymų. CDNR sintezei panaudoti 4 μg visos RNR, 100 pmol Oligo (dT) 25 pradmens ir 2 μl dNTP (10 mM) su 200 U RevertAid premium (Thermo) atvirkštinės transkriptazės 20 μl reakcijose. CDNR sintezės reakcijos buvo inkubuojamos 55 ° C temperatūroje 1 valandą.

P. xylostella RyR klonavimas

Iš pradžių 3 maži (maždaug 500–1000 bp) RyR fragmentai buvo amplifikuoti PGR, naudojant išsigimusius pradmenų porus, pagrįstus šilkaverpių B. mori RyR seka (NCBI registracijos numeris XM_004924859.1). Tada buvo suprojektuoti genų specifiniai pradmenys (remiantis informacijos apie seką, gautą iš šių fragmentų), ir du dideli fragmentai, apimantys maždaug 7 kb tarpus tarp 3 pradinių fragmentų, buvo amplifikuoti, klonuoti ir sekvenuojami. Kraštutiniai 5 ′ ir 3 ′ receptoriaus galai buvo gauti per RACE.

Pilno ilgio RyR ORF surinkimui keturi persidengiantys fragmentai (F1-F4) buvo amplifikuoti PGR ir klonuoti (2a pav.). Atskirų klonų sekvenavimas kiekvienam iš keturių fragmentų atskleidė, kad RyR, gautas iš ROTH padermės, yra polimorfinis, turintis reikšmingų vieno nukleotido polimorfizmų (SNP) tarp klonų ir alternatyvų sujungimo vietos kintamumą (2b pav.). Dėl didelio SNP skaičiaus Pvu I restrikcijos vieta turėjo būti modifikuota atgal į F2 fragmentą, parinktą surinkti į viso ilgio ORF. Norint paruošti „RyR G4946E“ variantą, glutamo rūgštis (E) buvo įvesta į F4 fragmentą prieš galutinį viso ilgio ORF surinkimą. Pradinis viso ilgio ROTH WT ir G4946E RyR varianto surinkimas buvo pasiektas tuo pat metu sujungiant 4 iš anksto suskaidytus fragmentus F1-F4 (vienodo svorio santykiu) į vektorių pcDNA 3.1 (-), tarp Not I ir Kpn I plazmidžių daugybinio klonavimo vietos (MCS). Galutinai surinktas ORF buvo 15357bp, koduojantis 5118 aminorūgšties baltymą. Su G4946E diamido atsparumu susijęs pakaitalas 21 yra aminorūgščių padėtyje G4900 išreikštoje P. xylostella kanalo versijoje . Tada viso ilgio ORF buvo perkeltas į ekspresijos vektorių pIZ / V5-His, iš anksto modifikuotą konstruojant Nru I vietą 695 padėtyje pasroviui nuo MCS, V5 epitopo viduje. Viso ilgio RyR ORF buvo išpjaustytas iš pcDNA 3.1 (-) plazmidės, naudojant Not I ir Pme I, ir sujungtas į modifikuotą pIZ V5 / His tarp Not I ir Nru I vietų.

Degeneracinės PGR amplifikacijos buvo atliktos naudojant gradientinį PGR ir REDtaq pagrindinį mišinį (Sigma) 25 μl reakcijose, susidedančiose iš 12, 5 μl pagrindinio mišinio, 2 μl kiekvieno išsigimusios grunto (20 mM), 1 μl cDNR ir vandens. Važiavimo dviračiu sąlygos buvo 95 ° C 2 minutes, po to: 35 ciklai 95 ° C temperatūroje 20 s, 45–50 ° C 45 s ir 72 ° C 3 minutės, o galutinė prailginimo trukmė 72 ° C 5 minutes.

Pradinėse ilgo fragmento PGR amplifikacijose (25 μl) buvo naudojamas ilgo nuotolio PGR mišinys (Thermo) ir susideda iš 2, 5 μl reakcijos buferio, turinčio MgCl2, 1 μl cDNR, 1 μl dNTP (10 mM), 0, 5 μl kiekvieno pradmens (20 mM). ir 2, 5 U fermentų mišinio. Važiavimo dviračiu sąlygos buvo 94 ° C 2 minutes, po to: 35 ciklai 94 ° C temperatūroje 10 s, 50 ° C 20 s, 68 ° C 25 minutės, po to paskutinis 68 ° C pratęsimas 15 min.

5 ′ ir 3 ′ RACE naudojo „First Choice® RLM RACE“ rinkinį („Ambion®-Life Technologies“) pagal gamintojo protokolą.

RyR fragmentai (F1-F4) galutiniam surinkimui buvo amplifikuoti naudojant pfu korektūros polimerazę (Promega) 25 μl reakcijose, susidedančiose iš 2, 5 μl reakcijos buferio, turinčio MgCl2, 1 μl cDNR, 1 μl dNTP (10 mM), 0, 5 μl kiekvieno pradmenis (20 mM) ir 1, 5 U fermento. Važiavimo dviračiu sąlygos buvo 95 ° C 2 minutes, po to sekė 35 ciklai: 95 ° C 10 s, 50 ° C 20 s, 68 ° C 20 minučių ir galutinis pratęsimas 68 ° C temperatūroje 10 min.

Visų klonavimo etapų pradmenų sekos yra parodytos 1, 2 ir 3 lentelėse. Visi PGR amplifikuoti fragmentai buvo vizualizuoti 1% (m / t) agarozės geluose ir išgryninti naudojant „QiaQuick®“ gelio ekstrahavimo rinkinį (Qiagen), laikantis gamintojo vadovas prieš pradedant naudoti.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Visi PGR amplifikuoti fragmentai buvo surišti į pJET 1.2 bukas galo vektorių (CloneJET klonavimo komplekto (Thermo) dalis) pagal rinkinio protokolą. Laikydamiesi gamintojo nurodymų, visoms restrikcijos dalims buvo naudojami „Fastdigest®“ restrikcijos fermentai („Thermo“). Viso ilgio ligacijos į pcDNA 3.1 (-) ir pIZ / V5-His buvo atliktos 30 μl reakcijų metu, naudojant 3 μl 10x ligavimo buferio ir 10 U T4 DNR ligazės (Thermo) 2 valandas kambario temperatūroje. Visos plazmidės buvo transformuotos į XL-10 gold E. coli (Agilent), išgautos ir auginamos 30 ° C temperatūroje, kad būtų sumažintas galimas plazmidės pertvarkymas. Perkėlimo laipsnio plazmidiniai preps buvo gauti naudojant Plasmid maxi prep plus rinkinį (Qiagen) pagal gamintojo instrukcijas. Visos mutagenezės reakcijos buvo atliktos naudojant Quikchange II mutagenezės rinkinį (Agilent) pagal rinkinio vadovą (mutagenezės pradmenys parodyti 4 lentelėje).

Pilno dydžio lentelė

Sf9 transfekcijos ir membranų paruošimas

Sf9 ląstelės (gyvybės technologijos) buvo laikomos Sf-900 II SFM (Gibco-life technologies) terpėje, kurioje nėra serumo, be antibiotiko, 30 ml suspensijos kultūrose (purtant 115 aps./min.) Pastovioje 27 ° C temperatūroje. Transkripcijai naudojamos ląstelės buvo sėjamos į 60 mm ląstelių kultūros lėkšteles (Corning ® ) po 2 x 106 ląstelių viename inde 3 ml Sf-900 II SFM ir paliekamos prisitvirtinti 1 val. Ląstelės buvo transfekuojamos naudojant 3 μg plazmidinės DNR, 15 μl Cellfectin II reagento (Life technologijos) ir 5 μl PLUS ™ stipriklio (Life technologijos) reagento kiekviename inde, vadovaujantis gamintojo protokolu.

Norėdami paruošti membraną, transfekuotos ląstelės buvo surinktos 48 valandas po transfekcijos, naudojant fosfato buferiniu tirpalu (PBS), ląstelės suskaičiuotos ir vėl suspenduotos hipoosmoziniame buferyje (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7, 4), kurio koncentracija 2 × 10 6 ląstelių viename ml. Tada ląstelės buvo homogenizuotos ir centrifuguotos 1500 g 15 minučių 4 ° C temperatūroje, kad būtų pašalintos ląstelių nuosėdos. Supernatantas buvo pašalintas, centrifuguotas 100 000 g 1 valandą 4 ° C temperatūroje, o membranos nuosėdos vėl suspenduotos 0, 4 M sacharozės, 20 mM HEPES tirpale (20 μl 2 x 106 ląstelių). Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bradfordo reagentą (Bio-Rad), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, atsižvelgiant į galvijų serumo albumino (BSA) standartus.

Kalcio išsiskyrimo tyrimai

Kalcio išsiskyrimo Sf9 ląstelėse, transfekuotose P. xylostella RyR, buvo naudojami dažai „Fura 2-AM“ („Life technologies“, CA, JAV). Maždaug 2, 5x105 neperkeltų SF9 ląstelių buvo leista 1 valandą prisitvirtinti prie poli-L-lizinu padengtų apvalkalų (Sigma, MA, JAV), o po to transfekuojamos naudojant „Cellfectin ™ II“. Po transfekcijos 24, 48, 72 ir 96 valandas ląstelės buvo užpiltos 1 mM kalcio jautriais dažais Fura 2-AM. Ląstelės buvo paliktos inkubuoti 27 ° C temperatūroje 45–60 minučių, po to 3 kartus plaunamos 500 μl šviežios nepapildytos Sf-900 II terpės. Prieš vaizdavimą, dangteliai su Fura 2 pakrautomis ląstelėmis buvo dedami į standartinį Ringerio tirpalą. Visi vaizdai buvo atlikti naudojant „Axio Vert.A1“ mikroskopą su LD Plan-Neo Fluar × 20 / 0, 4 objektyvu (Zeiss, Oberkochen, Vokietija), matuojant sužadinimo santykį esant 340/380 nm (kalcio neturintis / su kalciu surištas indikatorius). 180 ms ir fiksuoti spinduliuotę esant 510 nm mažiausiai 60 sekundžių. Ląstelės, esančios ant dangtelio, buvo dedamos į maždaug 0, 5 ml tūrio perfuzijos kamerą, pritvirtintą prie mikroskopo scenos, kuri buvo sujungta su peristaltiniu pompu, užtikrinant nuolatinį skysčių mainą (srautas 3 ml / min.). Tiriamieji tirpalai buvo užpilami naudojant 3–5 sekundžių pertraukėlius per stiklinį u-vamzdelį. Eksperimentai buvo užregistruoti naudojant „VisiView ®“ programinę įrangą („Visitron Systems“, Puchheim, Vokietija), o skaitmeniniai duomenys buvo analizuojami naudojant „Microsoft Excel 2010“ ir „SigmaPlot v.12“ („Systat Software“). Duomenys buvo normalizuoti naudojant lygtį: R / R 0, kur R yra fluorescencijos santykio reikšmė, užregistruota atskirais laiko taškais, o R 0 yra vidutinis fluorescencijos santykis, apskaičiuotas per pirmąsias 5 sekundes prieš pridedant agonistą. Individualizuotų ląstelių normalizuotos amplitudės reakcijos buvo apskaičiuotos įvertinant didžiausią reikšmę, atimtą iš bazinio lygio (R max –R 0 = ∆R max ) ir normalizavus lygtį: ∆R max / R 0 . Galutiniai amplitudės duomenys buvo pateikti kaip vidutinė visų ląstelių vertė atskirame eksperimente ir standartinis vidurkio nuokrypis.

[ 3 H] Ryanodino surišimas

Įrišimo reakcijos buvo išdėstytos 96 šulinėlių plokščio dugno mikrotitravimo plokštelėje, kurios bendras tūris buvo 250 μl kiekvienoje duobutėje. Reakcijas sudarė arba 25 μg membranos paruošimo, [3H] ryanodinas (koncentracija 0, 01–40 nM) ir 2 μl DMSO rišančiame buferyje, kuriame yra 0, 01% Pluronic (1, 5 M KCl, 10 mM ATP, 1, 38 mM CaCl 2, 10). mM HEPES, pH 7, 4) arba 25 μg membraninio paruošimo, [3H] ryanodinas (0, 01–40 nM), 2 μl ryanodino DMSO (galutinė koncentracija 10 μM) 0, 01% Pluronic. Reakcijos buvo inkubuojamos kambario temperatūroje 2 valandas. Tada 96 mėginiai buvo įpilti į 96 šulinėlių filtrų plokšteles, iš anksto apdorotas 50 μl 0, 1% polietilenimino, naudojant 96 šulinėlių plokštelių kombainą (Brandel, MD, JAV). Tada kiekvienas filtras su surištomis membranomis 3 kartus buvo plaunamas 250 μl plovimo buferio (150 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7, 4) ir paliekamas per naktį kambario temperatūroje, kad išdžiūtų. Tada kiekvienas plokštelės šulinys buvo užpildytas 50 μl MicroScint ™ -O. („PerkinElmer“, MA, JAV) ir filtro plokštelę, įkeltą į „TopCount NXT ™“ mikrotinklelio scintiliacijos skaitiklį (PerkinElmer, MA, JAV) .Specifinės rišimosi ir rišimo kinetikos vertės (pusiausvyros disociacijos konstanta K d ir surišimo talpa / receptoriaus tankis B max) ) buvo apskaičiuoti naudojant „GraphPad Prism v5.5“ („GraphPad“, CA, JAV).

Stabilių ląstelių linijų pasirinkimas

Ląstelės buvo transfekuojamos, kaip aprašyta aukščiau, ir praskiedimo metodu, iš esmės kaip aprašyta gamintojo vadove (Invitrogen), buvo atrinktos 300 μg ml −1 zeocino. Po kelių iš eilės vykusių klonų atrankos etapų, zeocinui atsparių ląstelių klonų funkcinė RyR ekspresija buvo patikrinta matuojant kalcio fluorescenciją.

Kalcio fluorescencijos matavimai

Kalcio dažų fluorescencija buvo išmatuota naudojant Fluo8 užpildytas ląsteles naudojant FLIPR Tetra instrumentą (Molecular Devices) 384 mikrotitrų plokštelių formatu. 1, 5 x 10 4 ląstelės kiekviename šulinyje buvo apdorotos kintamos efektorinių junginių koncentracijos, turinčios 80 μl tiroido buferio, kuriame yra 0, 1% DMSO (galutinė koncentracija), tūris, iš esmės laikantis nustatytų protokolų, pateiktų su „Fluo8 No-Wash“ kalcio tyrimo rinkiniu ( Molekuliniai prietaisai). Žadinimo ir emisijos bangų ilgiai buvo nustatyti atitinkamai 490 nm ir 525 nm.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.